Nos últimos anos intensificou-se o estudo sobre sistemas criados para veicular princípios ativos, como nanoemulsões, dispersões contendo cristais líquidos e emulsões múltiplas, bem como o emprego de matérias-primas da biodiversidade brasileira na produção destes sistemas, a exemplo dos óleos de andiroba, copaíba, urucum e buriti, cuja fruta amazônica é rica em micro-nutrientes com propriedades anti-oxidante, hidratante e fotoprotetora. Durante o desenvolvimento de novas formulações cosméticas, o potencial de irritação dérmica deve ser investigado antes que o produto seja disponibilizado ao consumidor, a fim de identificar compostos que possam causar reações adversas na pele. O objetivo deste trabalho foi avaliar cientificamente o emprego do óleo de buriti na obtenção de emulsões contendo cristais líquidos, nanoemulsões e emulsões múltiplas estáveis e estudar o possível potencial citotóxico e fotoprotetor destas formulações em culturas de células epidérmicas (fibroblastos e queratinócitos), bem como o potencial irritante em modelo organotípico (HET-CAM). Foi estabelecido como valor de EHL crítico igual a 7,25 e selecionados dois pares de tensoativos (Steareth-2 associado aos Ceteareth- 5 e Ceteareth-20) para produção das macroemulsões contendo cristal líquido pela técnica do diagrama ternário. Os testes preliminares em centrifuga, estresse térmico, microscopia, potencial zeta e o estudo do comportamento reológico permitiram a seleção de uma emulsão de cada diagrama para continuar o estudo, as quais foram submetidas aos testes de estabilidade acelerada. As formulações F29D1 e F51D2 com e sem vitamina E não apresentaram modificações no comportamento reológico, pH e estabilidade física, após serem submetidas às condições de estresse. O método de emulsificação em etapa única se mostrou eficiente na produção de emulsões múltiplas estáveis à centrifugação e estresse térmico, com óleo de buriti e monooleato de sorbitano e PEG-40 castor oil como sistema tensoativo. O estudo de EHL crítico da emulsão múltipla mostrou maior estabilidade do sistema no valor de EHL=9,0. Uma modificação no processo de emulsificação da emulsão múltipla permitiu a obtenção de nanoemulsões estáveis por PIT, cujas temperaturas de inversão de fases foram de 89, 91 e 93°C, para os valores de EHL 9,0; 9,5 e 10,0 respectivamente. Os resultados dos ensaios de citotoxicidade mostraram que as emulsões formuladas com óleo de buriti e tensoativos comerciais se mostraram não irritantes à pele devido aos escassos efeitos citotóxicos que provocaram às monocamadas de fibroblastos 3T3 e queratinócitos HaCat, sendo que a adição de vitamina E chegou a aumentar a viabilidade celular em alguns casos. As emulsões contendo álcoois graxos etoxilados como sistema tensoativo, se mostraram mais fototóxicas às células quando comparadas as que continham outra classe de tensoativos não iônicos, sendo que todas se mostraram mais fototóxicas quando foram aplicadas em condições de pré-tratamento. Os ensaios também demonstraram que os fibroblastos 3T3 foram mais sensíveis que os queratinócitos HaCat ao efeito da radiação quando tratados com os produtos. O ensaio em membrana corioalantóide auxiliou na identificação dos compostos irritantes e confirmou os resultados obtidos nos ensaios de citotoxicidade e associados podem ser considerados uma ferramenta importante na substituição de animais para avaliação do potencial irritante de produtos cosméticos e farmacêuticos. / In the past few years, more attention has been given to delivery systems, like nanoemulsions, emulsions containing liquid crystals and multiple emulsions, as well as the employment of new raw materials from the Brazilians biodiversity in their production, such as Andiroba, Copaíba, Urucum and Buriti oils. The Buriti is an Amazonian fruit rich in micro nutrients, with antioxidants and photoprotector properties. During the development of new cosmetic formulations, the skin irritation potential must be investigated in order to identify chemicals which might induce adverse skin reactions, previously to human exposition to such substances. The aim of this work was to evaluate the employment of Buriti oil in the production of stable nanoemulsions, emulsions containing liquid crystals and multiple emulsions; and study their cytotoxic and photoprotector potential in epidermal cell culture and irritancy potential in organotypic model (HET-CAM). Two surfactant systems were chosen (Steareth-2 associated to Ceteareth-5 and Ceteareth-20) at the critical HLB value of 7.25 to produce the macroemulsions containing liquid crystals using the ternary diagram technique. Preliminary stability tests such as centrifugation, thermal stress, microscopic analysis, zeta potential and rheological behavior were used to choose one emulsion from each diagram. Subsequently, those emulsions were submitted to accelerated stability tests. The formulations F29D1 and F51D2, containing or not Vitamin E, did not present modifications in their physical stability, pH and rheological behavior after being exposed to the stress conditions. The emulsification method by one step demonstrated to be an efficient methodology to attain multiple emulsions containing Buriti oil, Sorbitan monooleato and PEG-40 castor oil as surfactant system. This system remained stable even after centrifugation and thermal stress. At a critical HBL of 9.0, the multiple emulsions showed major stability. A single modification performed on the emulsification method of the multiple emulsion allowed the production of stable nanoemulsions by PIT method. The phase inversion temperatures were identified as 89, 91 e 93°C, for the emulsions at HLB values equal to 9.0, 9.5 and 10.0, respectively. The results of the cytotoxicity assays showed that the emulsions containing Buriti oil and commercial surfactants are non-irritant to skin due to their low cytotoxic effects in the 3T3 and HaCat cell monolayers. The addition of vitamin E not only decreased the toxicity of the products, but also increased the cellular viability. The emulsions containing ethoxylated fatty alcohol as surfactant systems showed to be more phototoxic to the cells than those prepared with another class of non ionic surfactant. All the emulsions demonstrated to be more phototoxic when applied on the cells during pre-treatment condition, moreover the 3T3 fibroblasts demonstrated to be more sensitive to the majority of products than the HaCat, after exposed to UV radiation. The hens egg test-chorioallantoic membrane has collaborated the identification of irritant chemicals and confirmed the results obtained on the cytotoxicity assays. Those assays associated should be considered a valuable tool to evaluate irritancy potential of cosmetics and pharmaceutical products.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA15MA177.pdf: 755005 bytes, checksum: d47e1b3be9b01d28494b49fd777da7f7 (MD5) Previous issue date: 2015-07-20 / The nanostructured calcium phosphate bioceramics have shown importance in bone repair biomaterials for its chemical and crystallographic similarity with bone tissue crystalline structure, increasing their relevance in orthopedics, dentistry and bone healing. These biomaterials have interconnected microporous nanostructure, made of thin grains and micropores, which favor their use as synthetic matrix in recuperation of injure bone. In vitro cell culture is a value tool for studying the mechanisms whereby biomaterials can cause adverse reactions in cell level, indicating their potential use at medical practice. The aim of this study was to evaluate the biocompatibility of porous calcium phosphate bioceramics with different morphology of grains and microporous by MTT assay, cell growth curve and cell-material interaction study by scanning electron microscope (SEM). The cell-material interaction study by SEM showed fibroblasts adhesion and proliferation in the biomaterials surface. In the results of MTT assay and cell growth curve it was found that the tested biomaterials were biocompatible, making them suitable candidates as bone substitutes. The biomaterial composed by 80% TCP-β/20% HA (1,67M/1100 °C/2h) showed cell viability less than 70% and descendant growth curve, indicating certain level of cytotoxicity / As biocerâmicas nanoestruturadas de fosfato de cálcio tem se destacado na área de biomateriais de reconstituição óssea pela sua semelhança química e cristalográfica com a apatita óssea do esqueleto humano, reforçando sua importância na ortopedia, odontologia, fixação de implantes e reparação do tecido ósseo. Estes biomateriais apresentam micro e nanoestruturas microporosas interconectadas, formada por finos grãos e microporos, características estas que favorecem seu uso como matriz sintética na recuperação de tecido ósseo lesado. O cultivo de células in vitro é uma valiosa ferramenta para se estudar os mecanismos pelos quais os biomateriais podem produzir reações adversas em nível celular, indicando seu potencial para uso na prática médica. Este trabalho teve como objetivo avaliar a biocompatibilidade das cerâmicas porosas de fosfato de cálcio em condições diferenciadas de morfologia de grãos e de microporos por meio do teste de citotoxicidade MTT, análise da curva de crescimento celular e estudo da interação célula-material por microscopia eletrônica de varredura (MEV). A análise da interação célula-material por MEV mostrou a adesão e proliferação dos fibroblastos na superfície das diferentes biocerâmicas de fosfato de cálcio testadas. Nos resultados obtidos por meio do ensaio colorimétrico MTT e curva de crescimento constatou-se que os biomateriais testados se mostraram biocompatíveis, possuindo grande potencial como substitutos ósseos. O biomaterial composto por 80% TCP-β/20% HA (1,67M/1100 °C/2h) apresentou viabilidade celular abaixo de 70% e curva de crescimento descendente, demonstrando grau de citotoxicidade

Estudos preliminares visando a identificação de possíveis agentes virais associados à síndrome multissistêmica do definhamento dos suínos (SMDS) revelaram uma possível associação inversa entre a presença de TTSuV1 e a ocorrência da SMDS. Com base neste achado, foi formulada a hipótese de que o TTSuV1 poderia ser capaz de inibir a multiplicação do PCV2, impedindo assim o desenvolvimento da SMDS. Buscando esclarecer esta questão, seria necessário desenvolver um sistema eficiente de replicação para este vírus, até o presente ainda não disponível. Em vista disso, foi desenvolvido um método de detecção de infecções por TTSuV em cultivos celulares para a avaliação de possíveis linhagens a serem potencialmente utilizadas para isolamento e multiplicação destes vírus. Genomas de TTSuVs foram detectados em células de linhagem de origem suína e não suína assim como em um dos lotes de tripsina. Os soros utilizados como suplemento para o meio de cultivo não apresentaram genomas de TTSuV. Desta forma, o lote de tripsina contaminado pode ser considerado uma importante fonte de contaminação, principalmente em células de origem não suína. Com o objetivo de avaliar uma possível associação entre os TTSuVs e a ocorrência da SMDS, a frequência de detecção e quantificação de genomas de TTSuV1 e TTSuV2 em tecidos e soros de suínos com e sem SMDS foram determinadas. A análise feita nos diferentes tecidos de suínos revelou uma aparente correlação inversa entre a presença do genoma de TTSuV1 e a ocorrência da SMDS. Quanto ao TTSuV2 em tecidos de suínos com e sem a SMDS, nenhuma diferença estatística foi observada. A distribuição do genoma de TTSuV1 e TTSuV2 nos diferentes tecidos examinados não revelou um órgão alvo específico. A frequência de detecção e a carga viral de TTSuV1 e 2 nas amostras de soro de suínos com e sem a SMDS não apresentaram diferença significativa. No entanto, a carga viral de TTSuV2 foi mais alta do que a carga viral de TTSuV1 nos soros de todos os grupos de animais estudados. Estes resultados indicam uma alta frequência de detecção de ambas as espécies de TTSuV em amostras de tecidos e soros de suínos com e sem a SMDS. / Preliminary studies aiming the identification of possible viral agents associated with the postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) revealed a possible negative association between TTSuV1 and occurrence of PMWS. Based on this finding was hypothesized that TTSuV1 might be able to inhibit the PCV2 multiplication, preventing the development of PMWS. To better clarify this, would be require an efficient system of replication for this virus, which has not been reported in the literature. In view of this, a method for detection of TTSuV infections in cell culture was developed to assess possible cell lineages to be potentially used for virus isolation and multiplication. TTSuV genomes were detected in cell lineages of porcine and nonporcine origin as well as a batch of trypsin. Sera used as media supplement was not found to contain TTSuV genomes. Thus, the contaminated batch of trypsin can be considered an important source of contamination, especially in cells of non-porcine origin. In order to evaluate a possible association between the TTSuVs and the occurrence of PMWS, the frequency of detection and quantification of TTSuV1 and TTSuV2 genomes in tissues and sera from pigs with and without PMWS were determined. The analysis in the different tissues of pigs reveal an apparent inverse correlation between the frequency of detection of TTSuV1 genomes and the occurrence of PMWS. Regarding TTSuV2 in tissues of PMWS and non-PMWS-affected animals no significant differences was observed. The distribution of TTSuV1 and TTSuV2 genomes in tissues did not reveal any particular target organ. The frequency of detection and viral load of TTSuV1 and TTSuV2 in sera samples were no significant statistically among animals PMWS-affected and healthy pig. The mean of TTSuV2 viral load was significantly highest than TTSuV1 in sera of all groups studied. These results indicate a high frequency of detection of both TTSuV species in tissues and sera samples from PMWS-affected and healthy pig.

No presente estudo, foi inicialmente padronizada uma PCR para detecção do DNA viral da semente de Parvovírus Canino utilizado na vacina brasileira Imunovet® (VR-953TM), tendo como alvo o gene VP2. O produto de PCR foi submetido ao seqüenciamento a fim de caracterizar geneticamente a semente vacinal. A seguir, foi padronizada uma reação de PCR em tempo real (RT-PCR) para detecção de um fragmento de 119 pb do gene VP2, a qual foi empregada para avaliar a cinética de replicação da amostra vacinal do CPV em diferentes métodos e tempos de cultivo celular. A correlação entre os resultados do título infeccioso das amostras virais e o número de cópias obtido na RT-PCR foi avaliado pelo Coeficiente de Correlação de Pearson. A PCR padronizada apresentou uma sensibilidade analítica de 457 DICC50/mL. O seqüenciamento do produto de PCR revelou que a amostra vacinal é do tipo CPV-2. A RT-PCR padronizada apresentou uma sensibilidade analítica de 1030 cópias de DNA/mL e uma boa especificidade analítica, pois não detectou o DNA de Adenovírus canino tipos 1 e 2 e Herpesvírus Equino tipo 1. A RT-PCR exibiu Coeficientes de Variação de triplicatas intra-ensaio de 0,43% e inter-ensaio de 0,29%. O Coeficiente de Correlação de Pearson entre o título infeccioso das amostras virais e o número de cópias obtido na RT-PCR foi de 0,55, considerado moderadamente positivo. Considerando que a região alvo da RT-PCR padronizada apresentou 100% de identidade com 93,52% (159/170) das amostras pesquisadas no GenBank pelo BLAST, a RT-PCR padronizada sugere ter um potencial uso no diagnóstico. / In this study, was originally a standard PCR for detection of viral DNA from the canine parvovirus vaccine seed used in Brazilian Imunovet® (VR-953TM), targeting the VP2 gene. The PCR product was subjected to sequencing to genetically characterized the vaccine seed. Then, a reaction was standardized real-time PCR (RT-PCR) to detect a fragment of 119 bp VP2 gene, which was used to evaluate the growth kinetics of the CPV vaccine sample in different methods and cell culture times. The correlation between results of the infectious titre and the number of copies obtained in RT-PCR was evaluated by Pearsons correlation coefficient. The standardized PCR showed an analytical sensitivity of 457 TCID50/mL. The sequencing of the PCR product showed that the vaccine sample is CPV type 2. The standardized RT-PCR showed an analytical sensitivity of 1030 DNA copies/mL and a good analytical specificity, it does not detect the DNA of canine adenovirus type 1 and 2 and equine herpesvirus type 1. The RT-PCR showed coefficients of variation intra-assay triplicates of 0,43% and inter-assay of 0,29%. The Pearsons correlation coefficient between the titre of infectious viral samples and the number of copies obtained in RT-PCR was 0,55, considered moderately positive. Whereas the target region of the standardized RT-PCR showed 100% identity with 93,52% (159/170) of samples surveyed in Genbank by BLAST, the standard RT-PCR suggests a potential diagnostic use.

Estudos preliminares visando a identificação de possíveis agentes virais associados à síndrome multissistêmica do definhamento dos suínos (SMDS) revelaram uma possível associação inversa entre a presença de TTSuV1 e a ocorrência da SMDS. Com base neste achado, foi formulada a hipótese de que o TTSuV1 poderia ser capaz de inibir a multiplicação do PCV2, impedindo assim o desenvolvimento da SMDS. Buscando esclarecer esta questão, seria necessário desenvolver um sistema eficiente de replicação para este vírus, até o presente ainda não disponível. Em vista disso, foi desenvolvido um método de detecção de infecções por TTSuV em cultivos celulares para a avaliação de possíveis linhagens a serem potencialmente utilizadas para isolamento e multiplicação destes vírus. Genomas de TTSuVs foram detectados em células de linhagem de origem suína e não suína assim como em um dos lotes de tripsina. Os soros utilizados como suplemento para o meio de cultivo não apresentaram genomas de TTSuV. Desta forma, o lote de tripsina contaminado pode ser considerado uma importante fonte de contaminação, principalmente em células de origem não suína. Com o objetivo de avaliar uma possível associação entre os TTSuVs e a ocorrência da SMDS, a frequência de detecção e quantificação de genomas de TTSuV1 e TTSuV2 em tecidos e soros de suínos com e sem SMDS foram determinadas. A análise feita nos diferentes tecidos de suínos revelou uma aparente correlação inversa entre a presença do genoma de TTSuV1 e a ocorrência da SMDS. Quanto ao TTSuV2 em tecidos de suínos com e sem a SMDS, nenhuma diferença estatística foi observada. A distribuição do genoma de TTSuV1 e TTSuV2 nos diferentes tecidos examinados não revelou um órgão alvo específico. A frequência de detecção e a carga viral de TTSuV1 e 2 nas amostras de soro de suínos com e sem a SMDS não apresentaram diferença significativa. No entanto, a carga viral de TTSuV2 foi mais alta do que a carga viral de TTSuV1 nos soros de todos os grupos de animais estudados. Estes resultados indicam uma alta frequência de detecção de ambas as espécies de TTSuV em amostras de tecidos e soros de suínos com e sem a SMDS. / Preliminary studies aiming the identification of possible viral agents associated with the postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) revealed a possible negative association between TTSuV1 and occurrence of PMWS. Based on this finding was hypothesized that TTSuV1 might be able to inhibit the PCV2 multiplication, preventing the development of PMWS. To better clarify this, would be require an efficient system of replication for this virus, which has not been reported in the literature. In view of this, a method for detection of TTSuV infections in cell culture was developed to assess possible cell lineages to be potentially used for virus isolation and multiplication. TTSuV genomes were detected in cell lineages of porcine and nonporcine origin as well as a batch of trypsin. Sera used as media supplement was not found to contain TTSuV genomes. Thus, the contaminated batch of trypsin can be considered an important source of contamination, especially in cells of non-porcine origin. In order to evaluate a possible association between the TTSuVs and the occurrence of PMWS, the frequency of detection and quantification of TTSuV1 and TTSuV2 genomes in tissues and sera from pigs with and without PMWS were determined. The analysis in the different tissues of pigs reveal an apparent inverse correlation between the frequency of detection of TTSuV1 genomes and the occurrence of PMWS. Regarding TTSuV2 in tissues of PMWS and non-PMWS-affected animals no significant differences was observed. The distribution of TTSuV1 and TTSuV2 genomes in tissues did not reveal any particular target organ. The frequency of detection and viral load of TTSuV1 and TTSuV2 in sera samples were no significant statistically among animals PMWS-affected and healthy pig. The mean of TTSuV2 viral load was significantly highest than TTSuV1 in sera of all groups studied. These results indicate a high frequency of detection of both TTSuV species in tissues and sera samples from PMWS-affected and healthy pig.

Submitted by Cássia Santos (cassia.bcufg@gmail.com) on 2016-01-21T10:48:19Z No. of bitstreams: 2 Tese - Vanessa de Sousa Cruz Pimenta - 2015.pdf: 2458021 bytes, checksum: 1c3e073ac4b90d92b9cf962f0d6d5d4b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-01-21T11:27:29Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Vanessa de Sousa Cruz Pimenta - 2015.pdf: 2458021 bytes, checksum: 1c3e073ac4b90d92b9cf962f0d6d5d4b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-21T11:27:29Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Vanessa de Sousa Cruz Pimenta - 2015.pdf: 2458021 bytes, checksum: 1c3e073ac4b90d92b9cf962f0d6d5d4b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2015-03-27 / Osteosarcoma is the most diagnosed primary bone cell tumor in dogs and humans. The need for more effective drugs with less intense collateral effect has triggered the development of plant-derived, natural-source chemotherapeutics. This study aimed to verify β lapachone intracellular effects on canine osteosarcoma cultured cells, as well as identify action mechanisms related to its antiproliferative properties. Cells were obtained from a cell line bank, sub cultivated and subjected to treatment with different β lapachone concentrations, followed by tetrazolium reduction, Tripan Blue dye exclusion assay, clongenic survival assay, Annexin V-FITC and propidium iodine double-labeling, JC-1 dye labeling and cell cycle kinetics analysis. The group treated with β lapachone for 72 hours showed the lowest cell viability, 27,74%, and the most conspicuous citotoxic effect, 64,81%, at 0,3 μM concentration; lower IC50, 0,180 μM and also the lowest cell growth - 0,50%- following treatment with 1,0 μM concentration. No statistical difference for cell proliferation was verified between concentrations after β lapachone exposure.Early apoptosis was the most frequent type of cell death considering all groups. It was less frequent in the 24-hour group treated with 0,1 μM (4,26 %) and more frequent in the 72-hour group treated with 1,0 μM (85,89 %). Mitochondrial depolarization was dose-dependent. Cell growth inhibition was carried out through cycle block at G0/G1 phase, according to exposure time. β lapachone was shown to have antiproliferative and cytotoxic effects, to induce apoptosis and to block cell cycle at G0/G1 phase on canine osteosarcoma cells. / O osteossarcoma é o tumor maligno das células ósseas primitivas mais diagnosticado em cães e humanos. A necessidade de medicamentos mais efetivos, com menor consequência adversa, tem gerado esforços para o desenvolvimento de agentes quimioterápicos compostos por plantas e outras fontes naturais. O objetivo deste estudo foi verificar os efeitos intracelulares da β lapachona sobre células do osteossarcoma canino de cultura estabelecida, bem como identificar mecanismos de ação que possam explicar suas propriedades citotóxicas. Células de osteossarcoma canino foram obtidas do banco de linhagens celulares, subcultivadas e submetidas ao tratamento com a β lapachona, de acordo com as diferentes concentrações. Os resultados foram obtidos por meio do método de exclusão do corante azul de tripan, pelo método deredução do tetrazólio, pelo ensaio de sobrevivência clonogênica, pelo ensaio de dupla marcação com Anexina V-FITC e Iodeto de Propídio, pelo ensaio de marcação com o corante JC-1 e pela análise da cinética do ciclo celular. O grupo tratado com 0,3 μM de β lapachona apresentou melhor regressão da viabilidade celular (80,27% / 24h; 47,41% / 48h e 35,19% / 72h) e maior progressão da citotoxicidade (19,73% / 24h; 52,59% / 48h e 64,81% / 72h). O menor IC50 (0,180 μM) ocorreu no grupo tratado por 72 horas. O crescimento celular após o tratamento foi menor de acordo com o aumento da concentração e tempo de exposição, apresentando 0,50% de fração de sobrevivência na concentração de 1,0 μM. Não houve diferença estatística entre as concentrações, para a proliferação celular após o tempo de exposição à β lapachona.A apoptoseinicial foi o tipo de morte celular mais frequente em todos os grupos. Foi menor no grupo de 24 horas tratado com 0,1 μM (4,26 %) e maior no grupo de 72 horas tratado com 1,0 μM (85,89 %). A despolarização mitocondrial ocorreu de maneira dose dependente, caracterizando a apoptose intrínseca. A inibição do crescimento das células ocorreu pelo bloqueio do ciclo na fase G0/G1 conforme o tempo de exposição. Nas células de osteossarcoma canino, a β lapachona possui efeitos citotóxicos, induz apoptose intrínsecae promove o bloqueio do ciclo celular na fase G0/G1.

Submitted by JÚLIO HEBER SILVA (julioheber@yahoo.com.br) on 2017-04-13T17:22:48Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Gabriela Hadler Gabriel - 2017.pdf: 1069284 bytes, checksum: 7c190e383bf6069f54d2eff26158427f (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-04-17T11:13:33Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Gabriela Hadler Gabriel - 2017.pdf: 1069284 bytes, checksum: 7c190e383bf6069f54d2eff26158427f (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-17T11:13:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Gabriela Hadler Gabriel - 2017.pdf: 1069284 bytes, checksum: 7c190e383bf6069f54d2eff26158427f (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-03-09 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Osteosarcoma is the main primary bone tumor, with unfavorable prognosis, high mortality and high incidence of metastases. The treatment of choice is the removal of the tumor associated with combined chemotherapy, whose adverse effects allude to the increasing need to develop new drugs. The plants constitute a large natural reserve of compounds that have medicinal and therapeutic properties, such as lapachol and its derivative, β-lapachone. The aim of this study was to evaluate the cytotoxic effects of β-lapachone in osteosarcoma cells cultured in vitro. Cells were cultured and treated with β-lapachone at different concentrations and times of exposure. Tripan blue exclusion, tetrazolium reduction and cell survival assay methods were performed to evaluate the effects of the compound on the cells. Cells treated with 0,1μM β-lapachone showed lower initial cytotoxicity in the 24h time, whereas those submitted to 1,0μM showed less viability after 72h of treatment. Cytotoxicity increased as the concentration and time of exposure increased. The lowest IC50 (0,148μM) was observed in treated cells for 72h. Cell growth after treatment was lower in the 1.0μl group after 72h and the highest cell growth was observed under a concentration of 0.1μl after 24h. There was no difference between groups for cell proliferation after treatment, and the cell survival fraction was lower after 72h of exposure. It was concluded that β-lapachone has cytotoxic effects on osteosarcoma cells cultured in vitro. / O osteossarcoma é o principal tumor ósseo primário, com prognóstico desfavorável, alta mortalidade e elevada incidência de metástases. O tratamento de escolha é remoção do tumor associada à quimioterapia combinada, cujos efeitos adversos aludem à necessidade crescente de desenvolver novos medicamentos. As plantas constituem grandes reservas naturais de compostos que possuem propriedades medicinais e terapêuticas, como o lapachol e seu derivado, a β lapachona. O objetivo desse estudo foi avaliar os efeitos citotóxicos da β lapachona em células de osteossarcoma cultivadas in vitro. As células foram cultivadas e tratadas com a β lapachona em diferentes concentrações e tempos de exposição. Foram realizados os métodos de exclusão com azul de Tripan, redução do tetrazólio e ensaio de sobrevivência celular para avaliar os efeitos do composto sobre as células. As células tratadas com 0,1μM de β lapachona apresentaram menor citotoxicidade inicial, no tempo de 24h, enquanto aquelas submetidas a 1,0μM apresentaram menor viabilidade após 72h de tratamento. A citotoxicidade aumentou de acordo com o aumento da concentração e tempo de exposição. O menor IC50 (0,148μM) foi observado nas células tratadas por 72h. O crescimento celular após o tratamento foi menor grupo sob concentração de 1,0µl após 72h e o maior crescimento celular foi observado sob concentração de 0,1µl após 24h. Não houve diferença entre grupos quanto à proliferação celular após o tratamento tendo a fração de sobrevivência das células sido menor após 72h de exposição. Concluiu-se que β lapachona apresenta efeitos citotóxicos em células de osteossarcoma cultivadas in vitro.

O desenvolvimento dos sistemas de produção de embriões por fecundação in vitro (FIV) ou transferência nuclear com células somáticas (TNCS) em diversas espécies animais, em especial a bovina, acarretou na manifestação de anormalidades de desenvolvimento in vivo, com a placenta sendo considerada o fator determinante no aparecimento destes distúrbios durante a gestação. A hipótese geral deste trabalho é de que alterações na formação da placenta, decorrentes das manipulações embrionárias in vitro, resultam em elevadas perdas no terço inicial e em anormalidades fetais e placentárias no terço final da gestação, incluindo um crescimento compensatório dos fetos por uma perda da capacidade de regulação da restrição placentária, elevando o fluxo total de nutrientes no sentido materno-fetal. Sendo assim, este estudo foi dividido em Capítulos, buscando-se avaliar os efeitos de algumas variáveis biológicas e técnicas na produção de embriões in vitro por TNCS, e de comparar o desenvolvimento de prenhezes estabelecidas com embriões produzidos in vivo (Controle), in vitro por fecundação (FIV) e in vitro por transferência nuclear (TNCS), pela avaliação de dados morfométricos, morfológicos e bioquímicos coletados em distintos momentos da gestação. No Capítulo 1, o desenvolvimento in vitro de embriões clonados foi comparado entre células somáticas de duas fêmeas geneticamente distintas (Nelore vs. Crioula Lageana), e entre três intervalos de confluência celular, estabelecidos previamente ao procedimento de clonagem, do mesmo animal. As melhores taxas foram obtidas com a utilização de células da fêmea Nelore, e da utilização de células com elevada confluência em cultivo. No Capítulo 2, comparou-se o efeito de dois intervalos de fusão-ativação e da agregação ou não de embriões no momento do cultivo, no desenvolvimento in vitro e in vivo destes embriões clonados. A agregação dos embriões e um maior intervalo entre fusão-ativação promoveram um incremento na produção de blastocistos. Contudo, estes não se apresentaram mais desenvolvidos ou com melhor qualidade, e também não influenciaram nas taxas de prenhez ou de manutenção das mesmas. No Capítulo 3, prenhezes dos grupos Controle, FIV e TNCS foram comparadas pela avaliação de dados morfométricos e bioquímicos coletados em distintos momentos da gestação. Este experimento demonstrou que as diferenças entre os grupos experimentais ocorreram desde as análises iniciais, com os grupos in vitro apresentando menores taxas de prenhez, e com o grupo TNCS tendo as maiores perdas gestacionais. As imagens obtidas por ultrasonografia aos 51 dias revelaram conceptos in vitro retardados em seu desenvolvimento, mas com um crescimento compensatório posterior, já que as prenhezes produzidas in vitro, e especialmente as do grupo TNCS, sustentaram não só maiores conceptos e com maiores anormalidades aos 225 dias de gestação, como também apresentaram um maior acúmulo de substratos energéticos no sistema fetal, particularmente de frutose no alantóide. No Capítulo 4, foram comparados os resultados de produção de embriões clonados e do estabelecimento de prenhezes em um período de produção de 28 meses, divididos em três momentos. A compilação dos períodos de rotinas de trabalho em clonagem bovina demonstrou o efeito da experiência e da aquisição de competência técnica sobre os resultados de produção in vitro de embriões por TNCS, com repercussão direta no desenvolvimento in vivo posterior. / The in vitro production (IVP) of embryos by in vitro fertilization (IVF) or somatic cell nuclear transfer (SCNT) in many species, especially in cattle, is usually associated with abnormalities during in vivo development, with the placenta being implicated as the determining factor in the appearance of the disturbances during gestation. The general hypothesis of this study is that alterations in placenta formation, as a consequence of early in vitro embryo manipulations, results in high gestation losses during the first trimester and fetal and placental abnormalities in the last trimester of gestation, including the occurrence of a compensatory fetal growth due to a reduced placental-fetal growth-restricting effect, which increases the total materno-fetal nutrient flux in late pregnancy. This study aimed to evaluate some of the biological and technical effects on the IVP of embryos by SCNT, and also to compare the development of pregnancies established with embryos produced either in vivo (Control), or in vitro by in vitro fertilization (IVF) or by nuclear transfer (SCNT), by the evaluation of morphometric, morphologic and biochemical data collected at distinct time points in gestation. In Chapter 1, the in vitro development of cloned embryos was compared between somatic cells of two genetically different females (Nelore vs. Crioula Lageana), and between three cell confluence intervals, established prior to the cloning procedure of the same animal. The best results were achieved using cells from the Nelore female and also with cells on the highest confluence level on culture. In Chapter 2, the effects of two fusion-activation intervals and the use or not of embryo aggregation during in vitro culture were compared by evaluating the in vitro and in vivo developmental potential of resulting embryos. The embryo aggregation and a higher fusion-activation interval promoted an improvement in blastocyst yield. However, those embryos were neither more advanced in development nor better in morphological quality, having no influence on subsequent pregnancy rates or pregnancy losses. In Chapter 3, Control, IVF and SCNT pregnancies were compared by the evaluation of morphometric and biochemical data collected at distinct moments in gestation. This experiment demonstrated that differences occurred between the three groups of embryos from the beginning of the analyses; the in vitro-produced groups had lower pregnancy rates, with the SCNT group showing the highest pregnancy losses. The analyses of the sonograms on Day 51 of pregnancy revealed a growth retardation pattern for the in vitro concepti, having a compensatory development up to late pregnancy, as in vitro-derived pregnancies, special in the SCNT group, sustained heavier concepti with a wider spectrum of abnormalities on day 225 of gestation. In addition, the SCNT pregnancies demonstrated a greater accumulation of substrates in the fetal system, particularly fructose on the allantoic fluid. Finally, in Chapter 4, results obtained from a retrospective analysis of bovine embryo production by cloning and subsequent pregnancy rates were compared between three equal periods within a range of 28 months. The comparison of the bovine cloning procedures during the three time periods demonstrated the impact of the technical skills and competence on the overall efficiency of in vitro embryo production by SCNT, and subsequent in vivo development.

El género Fabavirus pertenece a la familia Comoviridae e incluye tres especies: Broad bean wilt virus 1 (BBWV-1), BBWV-2 y Lamium mild mosaic virus (LMMV), aunque recientemente se ha propuesto una nueva especie, Gentian mosaic virus (GeMV). Estos virus afectan a un gran número de especies hortícolas y ornamentales y son transmitidos de manera no persistente por unas veinte especies de pulgones. El genoma está formado por dos cadenas de RNA monocatenario de polaridad positiva que se encapsidan separadamente con dos proteínas de cápsida formando viriones isométricos. BBWV-1 y BBWV-2 están distribuidos por todo el mundo. En España se ha encontrado BBWV-1 en cultivos de pimiento de Aragón, Cataluña, Castilla León, C. Valenciana, Murcia, Navarra, País Vasco y La Rioja. Los fabavirus son un grupo viral muy poco estudiado. Al comienzo de esta tesis, sólo se había determinado la secuencia nucleotídica del genoma completo de seis aislados de BBWV-2 procedentes de Extremo Oriente, mientras que no se disponía de ninguna secuencia completa de BBWV-1. Para desarrollar métodos rápidos, sensibles y específicos de detección, diferenciar aislados con secuencias divergentes y evaluar en su caso la efectividad de distintas estrategias de control se consideró necesario obtener la secuencia completa de al menos un aislado de BBWV-1 y secuencias parciales de aislados de distintos países. En esta tesis, se determinó la secuencia nucleotídica completa del genoma del aislado español 1S1 de BBWV-1 y se dedujo su organización genómica. El genoma está formado por dos moléculas de RNA monocatenario de polaridad positiva de 5814 y 3431 nt, respectivamente, con la organización genómica descrita para otros miembros de la familia Comoviridae. Al comparar esta secuencia con la única secuencia disponible de BBWV-1 correspondiente al aislado 1U2 de EEUU (publicado durante el desarrollo de esta tesis), se comprobó que los genomas de ambos aislados eran muy divergentes. / Ferrer Gual, RM. (2008). Caracterización molecular y desarrollo de métodos de diagnóstico del género Fabavirus Evaluación de BTH como método de control [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/8313 / Palancia

La ingeniería tisular es una ciencia que aplica los principios de la ingeniería y las ciencias de la vida para desarrollar sustitutos biológicos que reparen o mejoren la función biológica de un tejido u órgano (según la definición de Langer y Vacanti). Para ello, el enfoque más común se basa en el uso de tres elementos fundamentales las células, las biomoléculas y los scaffolds poliméricos. A pesar de los muchos avances alcanzados, los investigadores de este campo aún nos enfrentamos a importantes retos en la reparación o la sustitución de los tejidos que cumplen predominantemente funciones biomecánicas como es el caso del tejido óseo y el tejido cartilaginoso y en específico el cartílago articular. En este sentido, los materiales tri-dimensionales (scaffolds) desempeñan un papel muy importante. En este contexto, el quitosano es un candidato con un gran potencial, utilizado en una amplia gama de aplicaciones, ya que posee propiedades biológicas únicas, entre las que se incluyen su biocompatibilidad, su biodegradación, su marcada actividad antibacterial, entre otras y además posibilita el desarrollo de materiales en una gran variedad de formas. Es por ello, que el gran reto de este trabajo es el desarrollo de materiales basados en quitosano para la ingeniería tisular, entre los cuales podemos mencionar la formación de mezclas poliméricas de policaprolactona y quitosano, scaffolds implantables de quitosano y el desarrollo de un nuevo modelo de scaffolds inyectables basados en micropartículas entrecruzadas de quitosano. Las mezclas de policaprolactona y quitosano han sido preparadas haciendo uso de la técnica de evaporación de solvente. Se ha estudiado la influencia del componente hidrófilo sobre las propiedades físico-químicas y mecánicas. Por otro lado, se evaluó la respuesta biológica de los materiales en cultivos primarios "in vitro" de condrocitos, llegando a la conclusión de que la hidrofilicidad, en este caso, no está directamente relacionada con la respuesta bi / García Cruz, DM. (2008). Materiales macroporosos biodegradables basados en quitosano para la ingeniería tisular [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/4327 / Palancia