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Nos últimos anos intensificou-se o estudo sobre sistemas criados para veicular princípios ativos, como nanoemulsões, dispersões contendo cristais líquidos e emulsões múltiplas, bem como o emprego de matérias-primas da biodiversidade brasileira na produção destes sistemas, a exemplo dos óleos de andiroba, copaíba, urucum e buriti, cuja fruta amazônica é rica em micro-nutrientes com propriedades anti-oxidante, hidratante e fotoprotetora. Durante o desenvolvimento de novas formulações cosméticas, o potencial de irritação dérmica deve ser investigado antes que o produto seja disponibilizado ao consumidor, a fim de identificar compostos que possam causar reações adversas na pele. O objetivo deste trabalho foi avaliar cientificamente o emprego do óleo de buriti na obtenção de emulsões contendo cristais líquidos, nanoemulsões e emulsões múltiplas estáveis e estudar o possível potencial citotóxico e fotoprotetor destas formulações em culturas de células epidérmicas (fibroblastos e queratinócitos), bem como o potencial irritante em modelo organotípico (HET-CAM). Foi estabelecido como valor de EHL crítico igual a 7,25 e selecionados dois pares de tensoativos (Steareth-2 associado aos Ceteareth- 5 e Ceteareth-20) para produção das macroemulsões contendo cristal líquido pela técnica do diagrama ternário. Os testes preliminares em centrifuga, estresse térmico, microscopia, potencial zeta e o estudo do comportamento reológico permitiram a seleção de uma emulsão de cada diagrama para continuar o estudo, as quais foram submetidas aos testes de estabilidade acelerada. As formulações F29D1 e F51D2 com e sem vitamina E não apresentaram modificações no comportamento reológico, pH e estabilidade física, após serem submetidas às condições de estresse. O método de emulsificação em etapa única se mostrou eficiente na produção de emulsões múltiplas estáveis à centrifugação e estresse térmico, com óleo de buriti e monooleato de sorbitano e PEG-40 castor oil como sistema tensoativo. O estudo de EHL crítico da emulsão múltipla mostrou maior estabilidade do sistema no valor de EHL=9,0. Uma modificação no processo de emulsificação da emulsão múltipla permitiu a obtenção de nanoemulsões estáveis por PIT, cujas temperaturas de inversão de fases foram de 89, 91 e 93°C, para os valores de EHL 9,0; 9,5 e 10,0 respectivamente. Os resultados dos ensaios de citotoxicidade mostraram que as emulsões formuladas com óleo de buriti e tensoativos comerciais se mostraram não irritantes à pele devido aos escassos efeitos citotóxicos que provocaram às monocamadas de fibroblastos 3T3 e queratinócitos HaCat, sendo que a adição de vitamina E chegou a aumentar a viabilidade celular em alguns casos. As emulsões contendo álcoois graxos etoxilados como sistema tensoativo, se mostraram mais fototóxicas às células quando comparadas as que continham outra classe de tensoativos não iônicos, sendo que todas se mostraram mais fototóxicas quando foram aplicadas em condições de pré-tratamento. Os ensaios também demonstraram que os fibroblastos 3T3 foram mais sensíveis que os queratinócitos HaCat ao efeito da radiação quando tratados com os produtos. O ensaio em membrana corioalantóide auxiliou na identificação dos compostos irritantes e confirmou os resultados obtidos nos ensaios de citotoxicidade e associados podem ser considerados uma ferramenta importante na substituição de animais para avaliação do potencial irritante de produtos cosméticos e farmacêuticos. / In the past few years, more attention has been given to delivery systems, like nanoemulsions, emulsions containing liquid crystals and multiple emulsions, as well as the employment of new raw materials from the Brazilians biodiversity in their production, such as Andiroba, Copaíba, Urucum and Buriti oils. The Buriti is an Amazonian fruit rich in micro nutrients, with antioxidants and photoprotector properties. During the development of new cosmetic formulations, the skin irritation potential must be investigated in order to identify chemicals which might induce adverse skin reactions, previously to human exposition to such substances. The aim of this work was to evaluate the employment of Buriti oil in the production of stable nanoemulsions, emulsions containing liquid crystals and multiple emulsions; and study their cytotoxic and photoprotector potential in epidermal cell culture and irritancy potential in organotypic model (HET-CAM). Two surfactant systems were chosen (Steareth-2 associated to Ceteareth-5 and Ceteareth-20) at the critical HLB value of 7.25 to produce the macroemulsions containing liquid crystals using the ternary diagram technique. Preliminary stability tests such as centrifugation, thermal stress, microscopic analysis, zeta potential and rheological behavior were used to choose one emulsion from each diagram. Subsequently, those emulsions were submitted to accelerated stability tests. The formulations F29D1 and F51D2, containing or not Vitamin E, did not present modifications in their physical stability, pH and rheological behavior after being exposed to the stress conditions. The emulsification method by one step demonstrated to be an efficient methodology to attain multiple emulsions containing Buriti oil, Sorbitan monooleato and PEG-40 castor oil as surfactant system. This system remained stable even after centrifugation and thermal stress. At a critical HBL of 9.0, the multiple emulsions showed major stability. A single modification performed on the emulsification method of the multiple emulsion allowed the production of stable nanoemulsions by PIT method. The phase inversion temperatures were identified as 89, 91 e 93°C, for the emulsions at HLB values equal to 9.0, 9.5 and 10.0, respectively. The results of the cytotoxicity assays showed that the emulsions containing Buriti oil and commercial surfactants are non-irritant to skin due to their low cytotoxic effects in the 3T3 and HaCat cell monolayers. The addition of vitamin E not only decreased the toxicity of the products, but also increased the cellular viability. The emulsions containing ethoxylated fatty alcohol as surfactant systems showed to be more phototoxic to the cells than those prepared with another class of non ionic surfactant. All the emulsions demonstrated to be more phototoxic when applied on the cells during pre-treatment condition, moreover the 3T3 fibroblasts demonstrated to be more sensitive to the majority of products than the HaCat, after exposed to UV radiation. The hens egg test-chorioallantoic membrane has collaborated the identification of irritant chemicals and confirmed the results obtained on the cytotoxicity assays. Those assays associated should be considered a valuable tool to evaluate irritancy potential of cosmetics and pharmaceutical products.

No presente estudo, foi inicialmente padronizada uma PCR para detecção do DNA viral da semente de Parvovírus Canino utilizado na vacina brasileira Imunovet® (VR-953TM), tendo como alvo o gene VP2. O produto de PCR foi submetido ao seqüenciamento a fim de caracterizar geneticamente a semente vacinal. A seguir, foi padronizada uma reação de PCR em tempo real (RT-PCR) para detecção de um fragmento de 119 pb do gene VP2, a qual foi empregada para avaliar a cinética de replicação da amostra vacinal do CPV em diferentes métodos e tempos de cultivo celular. A correlação entre os resultados do título infeccioso das amostras virais e o número de cópias obtido na RT-PCR foi avaliado pelo Coeficiente de Correlação de Pearson. A PCR padronizada apresentou uma sensibilidade analítica de 457 DICC50/mL. O seqüenciamento do produto de PCR revelou que a amostra vacinal é do tipo CPV-2. A RT-PCR padronizada apresentou uma sensibilidade analítica de 1030 cópias de DNA/mL e uma boa especificidade analítica, pois não detectou o DNA de Adenovírus canino tipos 1 e 2 e Herpesvírus Equino tipo 1. A RT-PCR exibiu Coeficientes de Variação de triplicatas intra-ensaio de 0,43% e inter-ensaio de 0,29%. O Coeficiente de Correlação de Pearson entre o título infeccioso das amostras virais e o número de cópias obtido na RT-PCR foi de 0,55, considerado moderadamente positivo. Considerando que a região alvo da RT-PCR padronizada apresentou 100% de identidade com 93,52% (159/170) das amostras pesquisadas no GenBank pelo BLAST, a RT-PCR padronizada sugere ter um potencial uso no diagnóstico. / In this study, was originally a standard PCR for detection of viral DNA from the canine parvovirus vaccine seed used in Brazilian Imunovet® (VR-953TM), targeting the VP2 gene. The PCR product was subjected to sequencing to genetically characterized the vaccine seed. Then, a reaction was standardized real-time PCR (RT-PCR) to detect a fragment of 119 bp VP2 gene, which was used to evaluate the growth kinetics of the CPV vaccine sample in different methods and cell culture times. The correlation between results of the infectious titre and the number of copies obtained in RT-PCR was evaluated by Pearsons correlation coefficient. The standardized PCR showed an analytical sensitivity of 457 TCID50/mL. The sequencing of the PCR product showed that the vaccine sample is CPV type 2. The standardized RT-PCR showed an analytical sensitivity of 1030 DNA copies/mL and a good analytical specificity, it does not detect the DNA of canine adenovirus type 1 and 2 and equine herpesvirus type 1. The RT-PCR showed coefficients of variation intra-assay triplicates of 0,43% and inter-assay of 0,29%. The Pearsons correlation coefficient between the titre of infectious viral samples and the number of copies obtained in RT-PCR was 0,55, considered moderately positive. Whereas the target region of the standardized RT-PCR showed 100% identity with 93,52% (159/170) of samples surveyed in Genbank by BLAST, the standard RT-PCR suggests a potential diagnostic use.

O desenvolvimento dos sistemas de produção de embriões por fecundação in vitro (FIV) ou transferência nuclear com células somáticas (TNCS) em diversas espécies animais, em especial a bovina, acarretou na manifestação de anormalidades de desenvolvimento in vivo, com a placenta sendo considerada o fator determinante no aparecimento destes distúrbios durante a gestação. A hipótese geral deste trabalho é de que alterações na formação da placenta, decorrentes das manipulações embrionárias in vitro, resultam em elevadas perdas no terço inicial e em anormalidades fetais e placentárias no terço final da gestação, incluindo um crescimento compensatório dos fetos por uma perda da capacidade de regulação da restrição placentária, elevando o fluxo total de nutrientes no sentido materno-fetal. Sendo assim, este estudo foi dividido em Capítulos, buscando-se avaliar os efeitos de algumas variáveis biológicas e técnicas na produção de embriões in vitro por TNCS, e de comparar o desenvolvimento de prenhezes estabelecidas com embriões produzidos in vivo (Controle), in vitro por fecundação (FIV) e in vitro por transferência nuclear (TNCS), pela avaliação de dados morfométricos, morfológicos e bioquímicos coletados em distintos momentos da gestação. No Capítulo 1, o desenvolvimento in vitro de embriões clonados foi comparado entre células somáticas de duas fêmeas geneticamente distintas (Nelore vs. Crioula Lageana), e entre três intervalos de confluência celular, estabelecidos previamente ao procedimento de clonagem, do mesmo animal. As melhores taxas foram obtidas com a utilização de células da fêmea Nelore, e da utilização de células com elevada confluência em cultivo. No Capítulo 2, comparou-se o efeito de dois intervalos de fusão-ativação e da agregação ou não de embriões no momento do cultivo, no desenvolvimento in vitro e in vivo destes embriões clonados. A agregação dos embriões e um maior intervalo entre fusão-ativação promoveram um incremento na produção de blastocistos. Contudo, estes não se apresentaram mais desenvolvidos ou com melhor qualidade, e também não influenciaram nas taxas de prenhez ou de manutenção das mesmas. No Capítulo 3, prenhezes dos grupos Controle, FIV e TNCS foram comparadas pela avaliação de dados morfométricos e bioquímicos coletados em distintos momentos da gestação. Este experimento demonstrou que as diferenças entre os grupos experimentais ocorreram desde as análises iniciais, com os grupos in vitro apresentando menores taxas de prenhez, e com o grupo TNCS tendo as maiores perdas gestacionais. As imagens obtidas por ultrasonografia aos 51 dias revelaram conceptos in vitro retardados em seu desenvolvimento, mas com um crescimento compensatório posterior, já que as prenhezes produzidas in vitro, e especialmente as do grupo TNCS, sustentaram não só maiores conceptos e com maiores anormalidades aos 225 dias de gestação, como também apresentaram um maior acúmulo de substratos energéticos no sistema fetal, particularmente de frutose no alantóide. No Capítulo 4, foram comparados os resultados de produção de embriões clonados e do estabelecimento de prenhezes em um período de produção de 28 meses, divididos em três momentos. A compilação dos períodos de rotinas de trabalho em clonagem bovina demonstrou o efeito da experiência e da aquisição de competência técnica sobre os resultados de produção in vitro de embriões por TNCS, com repercussão direta no desenvolvimento in vivo posterior. / The in vitro production (IVP) of embryos by in vitro fertilization (IVF) or somatic cell nuclear transfer (SCNT) in many species, especially in cattle, is usually associated with abnormalities during in vivo development, with the placenta being implicated as the determining factor in the appearance of the disturbances during gestation. The general hypothesis of this study is that alterations in placenta formation, as a consequence of early in vitro embryo manipulations, results in high gestation losses during the first trimester and fetal and placental abnormalities in the last trimester of gestation, including the occurrence of a compensatory fetal growth due to a reduced placental-fetal growth-restricting effect, which increases the total materno-fetal nutrient flux in late pregnancy. This study aimed to evaluate some of the biological and technical effects on the IVP of embryos by SCNT, and also to compare the development of pregnancies established with embryos produced either in vivo (Control), or in vitro by in vitro fertilization (IVF) or by nuclear transfer (SCNT), by the evaluation of morphometric, morphologic and biochemical data collected at distinct time points in gestation. In Chapter 1, the in vitro development of cloned embryos was compared between somatic cells of two genetically different females (Nelore vs. Crioula Lageana), and between three cell confluence intervals, established prior to the cloning procedure of the same animal. The best results were achieved using cells from the Nelore female and also with cells on the highest confluence level on culture. In Chapter 2, the effects of two fusion-activation intervals and the use or not of embryo aggregation during in vitro culture were compared by evaluating the in vitro and in vivo developmental potential of resulting embryos. The embryo aggregation and a higher fusion-activation interval promoted an improvement in blastocyst yield. However, those embryos were neither more advanced in development nor better in morphological quality, having no influence on subsequent pregnancy rates or pregnancy losses. In Chapter 3, Control, IVF and SCNT pregnancies were compared by the evaluation of morphometric and biochemical data collected at distinct moments in gestation. This experiment demonstrated that differences occurred between the three groups of embryos from the beginning of the analyses; the in vitro-produced groups had lower pregnancy rates, with the SCNT group showing the highest pregnancy losses. The analyses of the sonograms on Day 51 of pregnancy revealed a growth retardation pattern for the in vitro concepti, having a compensatory development up to late pregnancy, as in vitro-derived pregnancies, special in the SCNT group, sustained heavier concepti with a wider spectrum of abnormalities on day 225 of gestation. In addition, the SCNT pregnancies demonstrated a greater accumulation of substrates in the fetal system, particularly fructose on the allantoic fluid. Finally, in Chapter 4, results obtained from a retrospective analysis of bovine embryo production by cloning and subsequent pregnancy rates were compared between three equal periods within a range of 28 months. The comparison of the bovine cloning procedures during the three time periods demonstrated the impact of the technical skills and competence on the overall efficiency of in vitro embryo production by SCNT, and subsequent in vivo development.

En aquest treball s'han desenvolupat dos mètodes simples i ràpids pel cultiu de les cèl·lules epitelials de les tres regions de l'epidídim de Sus domesticus. Un es basa en el cultiu de fragments del túbul epididimari intactes durant 8 dies. L'altre mètode es basa en el cultiu de fragments del túbul epididimari digerits amb col·lagenasa que, després de 7 dies, donen lloc a la formació d'una monocapa de cèl·lules epitelials epididimàries que adquireixen el 90-100% de confluència després de 12-16 dies en cultiu. Aquestes cèl·lules es mantenen viables durant més de 60 dies en cultiu i no s'observa proliferació de cèl·lules no epitelials. Per determinar el nivell de conservació de les característiques epididimàries en els cultius s'ha analitzat l'estructura cel·lular, l'activitat de síntesi i secreció proteica, i el manteniment i maduració dels espermatozoides en cocultiu. / In this work, we have developed two simple and quick methods for the culture of boar epididymal epithelial cells. The first one involves the culture of intact epididymal tubule fragments during 8 days. The second one involves the culture of epididymal tubule fragments digested with collagenase that, after 7 days in culture, allows the formation of an epididymal epithelial cell monolayer that reached 90-100% confluence after 12-16 days. These epididymal epithelial cells monolayers were maintained in vitro for more than 60 days and overgrowth of non-epithelial cells was not observed. To estimate the level of preservation of epididymal characteristics in these cultures we have focused on cell morphology, protein secretion activity, and sperm preservation and maturation.

Submitted by Aelson Maciera (aelsoncm@terra.com.br) on 2017-10-06T18:08:45Z No. of bitstreams: 1 DissACP.pdf: 6605106 bytes, checksum: c63dcdec106579e271edaa4dc5a8bdcf (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (bco.producao.intelectual@gmail.com) on 2017-11-28T12:14:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissACP.pdf: 6605106 bytes, checksum: c63dcdec106579e271edaa4dc5a8bdcf (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (bco.producao.intelectual@gmail.com) on 2017-11-28T12:14:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissACP.pdf: 6605106 bytes, checksum: c63dcdec106579e271edaa4dc5a8bdcf (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-28T12:26:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissACP.pdf: 6605106 bytes, checksum: c63dcdec106579e271edaa4dc5a8bdcf (MD5) Previous issue date: 2017-02-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Nowadays, cancer is one of the most feared diseases, affecting each day more and more people worldwide. The importance of new cancer treatment researches is very clear since the ones that has been used are not very effective and may lead to drug resistance, implying in a constant dose increasing which can lead to toxicity issues. Collateral effects and the instability generated in the patient’s organism are also reasons why the necessity of discovering new cancer treatments is imminent. A treatment alternative that has aroused interest is the use of monoclonal antibodies as immunotherapics, since they act by stimulating the patient’s immune system neutralizing the tumor cells in a very efficient and specific way. This kind of antibody can be produced by culturing hybrid animal cells, better known as hybridoma, under strictly controlled conditions so they can be studied and used in human beings. For this reason, the major goal of this project was the production of murine monoclonal antibodies using hybridoma cell culture in order to stablish an efficient culture methodology for hybridomas PC-61 or DTA1 producers of monoclonal antibodies anti-CD25 and anti-GITR, respectively, with high quality and enough amounts using Fetal Bovine Serum (FBS) free medium to, in the future, carry out animal model studies of their potential as therapeutic agents for cancer treatment. Both hybridomas were cultivated on a small scale with RPMI medium and addition of SFB, for comparative purposes and only one was selcted for the second step. The sequential adaptation methodology test, consisted in a gradual percent’s reduction of medium with serum at the same time that increase the percentage of commercial medium without serum, and was selected the medium without SFB in which the hybridoma was better adapted. After was carried out on a laboratory scale in a system type spinner flask (500 ml) with the commercial medium selected in the previous step, in controlled conditions of temperature (37 ° C) and pH (7.2). Based on analyzes of cell culture results, amino acid consumption and monoclonal antibodies quantification , SFM commercial medium SFB-free provided better results for culturing the PC-61 hybridoma, allowing the pilot scale culture reached even higher cell densities than in the standard medium with addition of FBS. / O câncer é uma das doenças mais temidas da atualidade, e atinge cada vez mais pessoas em todo o mundo. A importância de pesquisas sobre novos tratamentos na luta contra o câncer é clara e consensual, uma vez que os que vem sendo utilizados, não são muito eficientes, causam resistência à medicação utilizada o que implica na utilização de doses crescentes que por sua vez podem gerar problemas de toxicidade. Os efeitos colaterais e a instabilidade gerada no organismo do paciente, também são fatores da necessidade de pesquisar novos caminhos para o tratamento do câncer. Uma das alternativas de tratamento que tem despertado interesse é a utilização de anticorpos monoclonais (mAbs) como imunoterápicos, os quais agem estimulando o próprio sistema imune do paciente neutralizando a ação das células tumorais de forma eficiente e específica. A produção de tais anticorpos pode ser feita mediante o cultivo de células animais híbridas, mais conhecidas como hibridomas, sobre condições estritamente controladas para que possam ser estudados e utilizados em humanos. Por essa razão definiu-se como objetivo desse trabalho a produção anticorpos monoclonais murinos por meio de cultivo de hibridomas com a finalidade de estabelecer uma metodologia eficiente de cultivo dos hibridomas PC-61 ou DTA1 secretores dos mAbs anti-CD25 e antiGITR respectivamente, com qualidade e em quantidades suficientes utilizando meios livres de soro fetal bovino (SFB), para a seguir efetuar estudos em modelo animal de seu potencial como agentes terapêuticos no tratamento de câncer. Os dois hibridomas foram cultivados em pequena escala utilizando meio RPMI-1640 e adição de SFB, para fins comparativos e somente um foi selecionado para a próxima etapa. O teste da metodologia de adaptação sequencial, onde houve a redução gradativa da porcentagem de meio RPMI-1640 com 10% de SFB e o aumento da porcentagem de meio comercial sem SFB, e foi selecionado o meio livre de SFB em que o hibridoma melhor se adaptou. Posteriormente foi realizado o cultivo do hibridoma em escala laboratorial em sistema de frasco agitado biorreator do tipo Spinner (500 mL) com o meio livre de SFB selecionado na etapa anterior, sob condições bem controladas de temperatura (37ºC), pH (7,2). Com base nas análises dos resultados dos cultivos celulares, metabolismo de aminoácidos e quantificação de mAbs, o meio comercial SFM livre de SFB proporcionou melhor resultados para o cultivo do hibridoma PC-61, permitindo que o cultivo em escala laboratorial atingisse densidades celulares ainda maiores que no meio padrão com adição de SFB. Como consequência desse vasto crescimento celular em quantidades abundantes de mAbs foram conseguidas para iniciar num futuro próximo ensaios em modelos animais.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:43:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 FernandaGA_DISSERT.pdf: 1532248 bytes, checksum: 8b25b3bf5e0afc796607cf138b0a9885 (MD5) Previous issue date: 2013-02-14 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Dental pulp stem cells have been widely investigated because of their ability to differentiate into both dental and non-dental cells, with potential use in therapies involving tissue engineering. The technique of cell cryopreservation represents a viable alternative for the conservation of these cells, since it stops reversibly, in a controlled manner, all of cell biological functions in an ultra low temperature. The present study aimed to evaluate, using in vitro experiments, the influence of a cryopreservation protocol on the biologic acti vity of stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHED). Cells obtained from the pulp of three deciduous teeth on end-stage exfoliation or with indicated extraction were expanded in α-MEM culture medium supplemented with antibiotics and 15% fetal bovine serum. At second subculture (P2), a group of cells were submitted to cryopreservation for 30 days in 10% DMSO diluted in fetal bovine serum, at -80? C, while the remind cells continued under normal conditions of cell culture. Cell proliferation was evaluated in both groups (not cryopreserved or cryopreserved) by Trypan blue stain essay at intervals of 24, 48 and 72h after plating. Cell cycle analysis of SHEDs submitted or not to the cryopreservation protocol was performed in the same intervals. Events related to cell death were studied by Annexyn V and PI expression under flow cytometry at the intervals of 24 and 72h. The presence of nuclear morphological changes was evaluated by DAPI staining at 72h interval. It was observed that both groups exhibited an upward cell proliferation curve, without considerable changes in cell viability throughout the experiment. The distribution of cell in the cell cycle phasis was consistent with cell proliferation in both groups. There were no nuclear morphological damages in the end range of the experiment. therefore, it is concluded that the proposed cryopreservation protocol is efficient for storing the studied cell type, allowing its use in future experimental studies / C?lulas-tronco da polpa dental humana t?m sido amplamente investigadas em raz?o da sua capacidade de diferenciar-se tanto em c?lulas dentais quanto n?o dentais, com potencial de utiliza??o em terapias envolvendo a engenharia de tecidos. A t?cnica de criopreserva??o celular representa uma alternativa vi?vel para a conserva??o dessas c?lulas, j? que cessa reversivelmente, de forma controlada, todas as suas fun??es biol?gicas em uma temperatura ultra-baixa. O presente estudo teve como objetivo avaliar, atrav?s de experimentos in vitro, a influ?ncia de um protocolo de criopreserva??o na atividade biol?gica de c?lulas-tronco da polpa de dentes humanos d ec?duos esfoliados (SHED). C?lulas obtidas da polpa de tr?s dentes dec?duos em est?gio final de esfolia??o ou com exodontia indicada foram expandidas em meio de cultivo α-MEM suplementado com antibi?ticos e 15% de soro fetal bovino. No segundo subcultivo (P2), um grupo de c?lulas foi submetido a criopreserva??o por 30 dias em DMSO dilu?do a 10% em soro fetal bovino, a 80?C negativos, enquanto o restante seguiu em condi??es normais de cultivo. A prolifera??o celular em ambos os grupos (criopreservado e n?o criopreservado) foi avaliada atrav?s do m?todo de colora??o por azul de Tripan nos intervalos de 24, 48 e 72 horas ap?s o plaqueamento. Nestes mesmos intervalos foi realizada a an?lise do ciclo celular das SHEDs submetidas ou n?o ao protocolo de criopreserva??o. Os eventos relacionados ? morte celular foram analisados atrav?s da express?o de Anexina V e PI em citometria de fluxo, nos intervalos de 24 e 72 horas. A presen?a de altera??es morfol?gicas nucleares foi avaliada atrav?s da marca??o por DAPI no intervalo de 72 horas. Observou-se que ambos os grupos exibiram uma curva de prolifera??o celular ascendente, sem altera??es consider?veis na viabilidade celular ao longo do experimento. A distribui??o das c?lulas nas fases do ciclo celular foi coerente com c?lulas em prolifera??o nos dois grupos. N?o foram observados danos morfol?gicos nucleares no intervalo final do experimento . Deste modo, conclui-se que o protocolo de criopreserva??o proposto ? eficiente para o armazenamento do tipo celular estudado, permitindo a sua utiliza??o em futuros estudos experimentais

Estudos preliminares visando a identificação de possíveis agentes virais associados à síndrome multissistêmica do definhamento dos suínos (SMDS) revelaram uma possível associação inversa entre a presença de TTSuV1 e a ocorrência da SMDS. Com base neste achado, foi formulada a hipótese de que o TTSuV1 poderia ser capaz de inibir a multiplicação do PCV2, impedindo assim o desenvolvimento da SMDS. Buscando esclarecer esta questão, seria necessário desenvolver um sistema eficiente de replicação para este vírus, até o presente ainda não disponível. Em vista disso, foi desenvolvido um método de detecção de infecções por TTSuV em cultivos celulares para a avaliação de possíveis linhagens a serem potencialmente utilizadas para isolamento e multiplicação destes vírus. Genomas de TTSuVs foram detectados em células de linhagem de origem suína e não suína assim como em um dos lotes de tripsina. Os soros utilizados como suplemento para o meio de cultivo não apresentaram genomas de TTSuV. Desta forma, o lote de tripsina contaminado pode ser considerado uma importante fonte de contaminação, principalmente em células de origem não suína. Com o objetivo de avaliar uma possível associação entre os TTSuVs e a ocorrência da SMDS, a frequência de detecção e quantificação de genomas de TTSuV1 e TTSuV2 em tecidos e soros de suínos com e sem SMDS foram determinadas. A análise feita nos diferentes tecidos de suínos revelou uma aparente correlação inversa entre a presença do genoma de TTSuV1 e a ocorrência da SMDS. Quanto ao TTSuV2 em tecidos de suínos com e sem a SMDS, nenhuma diferença estatística foi observada. A distribuição do genoma de TTSuV1 e TTSuV2 nos diferentes tecidos examinados não revelou um órgão alvo específico. A frequência de detecção e a carga viral de TTSuV1 e 2 nas amostras de soro de suínos com e sem a SMDS não apresentaram diferença significativa. No entanto, a carga viral de TTSuV2 foi mais alta do que a carga viral de TTSuV1 nos soros de todos os grupos de animais estudados. Estes resultados indicam uma alta frequência de detecção de ambas as espécies de TTSuV em amostras de tecidos e soros de suínos com e sem a SMDS. / Preliminary studies aiming the identification of possible viral agents associated with the postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) revealed a possible negative association between TTSuV1 and occurrence of PMWS. Based on this finding was hypothesized that TTSuV1 might be able to inhibit the PCV2 multiplication, preventing the development of PMWS. To better clarify this, would be require an efficient system of replication for this virus, which has not been reported in the literature. In view of this, a method for detection of TTSuV infections in cell culture was developed to assess possible cell lineages to be potentially used for virus isolation and multiplication. TTSuV genomes were detected in cell lineages of porcine and nonporcine origin as well as a batch of trypsin. Sera used as media supplement was not found to contain TTSuV genomes. Thus, the contaminated batch of trypsin can be considered an important source of contamination, especially in cells of non-porcine origin. In order to evaluate a possible association between the TTSuVs and the occurrence of PMWS, the frequency of detection and quantification of TTSuV1 and TTSuV2 genomes in tissues and sera from pigs with and without PMWS were determined. The analysis in the different tissues of pigs reveal an apparent inverse correlation between the frequency of detection of TTSuV1 genomes and the occurrence of PMWS. Regarding TTSuV2 in tissues of PMWS and non-PMWS-affected animals no significant differences was observed. The distribution of TTSuV1 and TTSuV2 genomes in tissues did not reveal any particular target organ. The frequency of detection and viral load of TTSuV1 and TTSuV2 in sera samples were no significant statistically among animals PMWS-affected and healthy pig. The mean of TTSuV2 viral load was significantly highest than TTSuV1 in sera of all groups studied. These results indicate a high frequency of detection of both TTSuV species in tissues and sera samples from PMWS-affected and healthy pig.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The essential oils obtained from plants used as condiments are an important source of compounds with pharmacologic activity. In the present study, the antiviral activity of the essential oil of Ocimum basilicum L. (basil) and from the monoterpens camphor, 1,8-cineol and timol was tested against the bovine viral diarrhea virus (BVDV), while the essential oil of Rosmarinus officinalis L. (rosemary), Lippia graveolens HBK. (mexican oregano) and Thymus vulgaris L. (thyme) were tested against the feline calicivirus (FCV). The colorimetric test MTT ([3- (4.5-dimetilazol-2-il)-2.5-brometo of difeniltetrazolium]) was applied for the measurement of cytotoxicity, and the antiviral tests were performed by the plaque reduction assay. Three different protocols were applied: a) the virus was incubated with the essential oils or compounds before the inoculation into cells (virucidal assay); b) the cells were treated with the essential oils or compounds prior to virus inoculation; or, c) essential oils and compounds were added to the cells after virus inoculation and maintained for 72 hours. The results were expressed as CC50 (cytotoxic concentration to 50% of the cell culture), IC50 (inhibitory concentration to 50%) and SI (selectivity index = CC50/IC50). The best results were evidenced for the monoterpens camphor (SI=13.88) and the 1,8-cineol (IS=9.05) against BVDV. These results were obtained from the virucidal protocol and these compounds showed also the lower toxicicity towards the bovine kidney cells culture (Madin-Darby bovine kidney cells = MDBK) (CC50 = 4420.12 μg/mL and 2996.10 μg/mL, respectively). Regarding to the tests with FCV, the thyme essential oil showed the best results with SI=8.57 for c treatment. The basil essential oil had a moderate action in the a protocol (SI=6.54) and also for the c protocol (SI=6.86). In addition, the basil essential oil exhibited low levels of cytotoxicity towards the Crandel-Reese feline kidney cells (CRFK), with CC50 of 1300.21 μg/mL. In conclusion, the essential oils and monoterpens examined showed different levels of inhibitory activity on diverse moments of the viral infection. The antiviral activity demonstrated by the essential oils and compounds on BVDV and FCV may suggest a possible action on the hepatitis C virus (HCV) and norovirus (NoVs), respectively; since BVDV ande FCV shows several structural and replicative similarities to HCV and NoVs. / Óleos essenciais obtidos de plantas utilizadas como condimentos constituem uma fonte de compostos com promissoras atividades farmacológicas. No presente estudo, a atividade antiviral do óleo essencial de Ocimum basilicum L. (manjericão) e dos monoterpenos cânfora, 1,8-cineol e timol foi testada frente ao vírus da diarréia viral bovina (BVDV), enquanto que os óleos essenciais de Rosmarinus officinalis L. (alecrim), Lippia graveolens HBK. (orégano mexicano) e Thymus vulgaris L. (tomilho) foram testados frente ao calicivírus felino (FCV). O teste colorimétrico com MTT ([3- (4,5-dimetilazol-2-il)-2,5-brometo de difeniltetrazolium]) foi aplicado para a detecção de citotoxicidade, já os testes de atividade antiviral foram realizados através da metodologia de ensaio de redução de placas. Para este, três diferentes protocolos foram aplicados: o vírus foi incubado com os óleos essenciais ou compostos antes da infecção viral (ensaio virucida); as células foram pré tratadas com os óleos essenciais ou compostos antes da inoculação do vírus; ou as células infectadas foram incubadas com esses após as 2 horas de adsorção viral. Os resultados foram expressos como CC50 (concentração citotóxica para 50% do cultivo celular), CI50 (concentração inibitória para 50%) e IS (índice de seletividade = CC50/CI50). Os resultados de atividade frente ao BVDV evidenciaram, no geral, uma boa ação antiviral exercida pelos monoterpenos, sendo que a cânfora (IS=13,88) seguida do 1,8-cineol (IS=9,05) foram os compostos que apresentaram os mais elevados índices de seletividade obtidos no ensaio virucida, bem como a menor toxicidade frente às células de linhagem de rim bovino (Madin-Darby bovine kidney cells = MDBK) (CC50 = 4420,12 μg/ml e 2996,10 μg/ml, respectivamente). Em relação aos testes com FCV, o óleo essencial de tomilho mostrou os melhores resultados, com índice de 8,57 para o tratamento no qual os óleos essenciais foram adicionados às células antes da inoculação viral. Já o óleo essencial de alecrim, além de apresentar uma moderada ação nos ensaios virucida (IS=6,54) e de pós-tratamento (IS=6,86), exibiu baixos níveis de toxicidade em relação às células de linhagem de rim felino (Crandell-Reese feline kidney = CRFK), com CC50 de 1300,21 μg/ml. Dessa forma, conclui-se que os óleos essenciais e monoterpenos em estudo apresentaram algum nível de atividade inibitória em diferentes momentos da infecção viral.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5933.pdf: 2457795 bytes, checksum: b5b6653a532bc7e6c4a9ec2685b55277 (MD5) Previous issue date: 2014-08-15 / Universidade Federal de Minas Gerais / Owing to the broad biochemical, physiological and genetic characterization and the ease of manipulation and cultivation, several proteins with therapeutic and industrial applications are produced by genetically modified Escherichia coli. There is abundant information in the literature about strategies to increase biomass and recombinant protein production by cultivation of E. coli employing stirred and aerated tank bioreactor (conventional type). In contrast, although quite employed in cultivation of filamentous microorganisms, there are just a few studies involving cultivation of E. coli in airlift bioreactor. This reactor offers advantages over conventional one, such as simplicity of construction, reduced risk of contamination and efficient gas-liquid dispersion with low power consumption. However, the lower O2 transfer in airlift bioreactor (bench scale), compared to that achieved in conventional one, justifies the manipulation of temperature, pressure and flow rates of air and O2 in the dissolved oxygen concentration (DOC) control, avoiding decreases in biomass and recombinant protein productivities. In this context, this study aimed to: (i) determine the influence of internal pressure on the gas holdup (ɛ), volumetric O2 transfer coefficient (kLa) and volumetric O2 transfer rate (continue...). / Devido à ampla caracterização bioquímica, fisiológica e genética e à facilidade de manipulação e de cultivo, diversas proteínas com aplicação industrial e terapêutica são produzidas por Escherichia coli geneticamente modificada. Há informações abundantes na literatura sobre estratégias para aumentar a produção de biomassa e de proteínas recombinantes por meio de cultivos de E. coli empregando biorreator tipo tanque agitado e aerado (convencional). Por outro lado, apesar de bastante empregado em cultivos de microrganismos filamentosos, poucos trabalhos envolvendo cultivo de E. coli em reator pneumático tipo airlift são encontrados. Este biorreator apresenta vantagens frente ao convencional, como simplicidade de construção, menor risco de contaminação e eficiente dispersão gás-líquido com baixo consumo de energia. Entretanto, a menor capacidade de transferência de O2 no biorreator airlift em escala de bancada, em relação à alcançada em reator convencional, justifica a manipulação de variáveis como temperatura, pressão e vazões de ar e O2 no controle adequado da concentração de O2 dissolvido (COD), evitando quedas de produtividade de biomassa e de proteína recombinante. Nesse contexto, este trabalho objetivou: (i) determinar a influência da pressão interna sobre a retenção gasosa (ɛ), o coeficiente volumétrico de transferência de O2 (kLa) e a velocidade volumétrica de transferência de O2 (continua...).