A isquemia e reperfusão (IR) é a principal causa de insuficiência renal aguda. Evidências mostram a participação de linfócitos T e células dendríticas (DC) na lesão por IR. Entretanto, os mecanismos envolvidos não estão claros. A enzima heme oxigenase (HO)-1 está relacionada à diminuição de respostas inflamatórias. Neste trabalho, investigamos a participação de linfócitos T CD4+ e DC na proteção da lesão por IR induzida pela HO-1. Injetamos em camundongos um indutor de HO-1 (Hemin), e realizamos a IR. Avaliamos a lesão pela uréia e creatinina no soro, a expressão de citocinas por RT-PCR, nível de proteínas por bioplex e perfil celular por FACS. Observamos que a HO-1 protegeu da lesão por IR. A diminuição de INFg com a HO-1 sugeriu uma menor ativação de linfócitos T. No entanto, a transferência de células CD4+ tratadas com Hemin não apresentou diferença. Vimos que a HO-1 alterou o fenótipo das DC após IR e suprimiu a produção de TNFa pelas mesmas. Concluímos que a proteção pela HO-1 é capaz de modular a resposta inflamatória de DC, diminuindo o TNFa. / The ischemia and reperfusion (IR) is the main acute kidney injury. Evidences have shown the role of CD4+ T cells and dendritic cells (DC) in the IR injury. However, the mechanisms involved in the participation of these cells are not clear. The heme oxygenase (HO)-1 enzyme is associated to decrease in inflammatory responses. In this work, we investigated the role of CD4+ T cells and DC in renal injury protection induced by HO-1. We injected in mice a HO-1 inducer (Hemin), and we did the IR. Renal injury was evaluated by serum levels of urea and creatinine, cytokines expression by RT-PCR, proteins level by bioplex and cell profile by FACS. We observed that HO-1 lead to IR injury protection. The IFNg decrease with HO-1 suggested less T cells activation. However, transfer of hemin treated CD4+ cells did not differ from the other group. We observed that HO-1 altered DC phenotype after IR and suppressed TNFa production by these cells. We concluded that the protection by HO-1is able to modulate DC inflammatory response, diminishing TNFa.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2018. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAPDF). / A doença de Chagas afeta cerca de 8 milhões de pessoas ao redor do mundo e cerca de um terço dessas desenvolve as formas graves da doença, sendo o maior caso de cardiomiopatia causada na América Latina e também está entre o maior causador de mortes dentro das doenças tropicais negligenciadas. Mesmo sendo conhecida há 111 anos, os mecanismos que desenvolvem a patologia continuam um enigma, principalmente se tratando de estudos em humanos. Apesar disso, hoje é indiscutível o papel da resposta imune do hospedeiro frente ao agente etiológico, o Trypanosoma cruzi, no controle da infecção ou na sua disseminação, além dos mecanismos desencadeados na fase inicial da doença serem determinantes para o estabelecimento de uma fase crônica. Uma das primeiras células imunes a interagir com este patógeno são as céluls dendríticas (DCs), as quais são responsáveis por intermediar uma resposta imune não específica para uma específica e que possui uma função determinante dentro da patologia.. Este trabalho então visa uma análise da resposta inicial que é desencadeada em DCs frente ao T. cruzi a partir da validação de genes que foram vistos como diferencialmente expressos no trancriptoma realizado da interação inicial ente DCs e T. cruzi após 12h. Alguns desse genes modulados diferencialmente sob ação do patógeno foram o ligante da superfamília de fator necrose tumoral, membro 18 (TNFSF18), ligante 9 de quimiocina com motivo C-X-C (CXCL9) e peptidase específica de ubiquitina 18 (USP18), que possuíram sua expressão aumentada sob infecção. Essa superexpressão constatada por RNA-seq, foi confirmada neste estudo através de RT-qPCR após um processo de padronização e escolha de critérios rigorosos para garantir a qualidade da interpretação dos dados e poder comparar com veracidade os dados provenientes de duas metodologias distintas. Ficou comprovado então que a expressão gênica dessa interação patógeno-hospedeiro poderia ser atestada por RT-qPCR, viabilizando estudos posteriores de outros genes e também em uma população amostral maior, permitindo assim analisar a resposta inicial de forma mais abrangente. Isso tornará possível garimpar genes que tenham um papel fundamental na infecção e estuda-los com mais profundidade. Também é importante ressaltar que não necessariamente um aumento de expressão de transcrito reflete no nível proteico, como foi aferido neste trabalho ao mensurar algumas citocinas como IFN-γ, TNF, IL-6, IL-4, IL-10, IL-2 e IL-12, em que houve aumento de expressão de TNF sob infecção que condiz com seu nível de transcrito detectado, porém IL-10 que também foi supraregulado a nível transcricional, não possuía o mesmo comportamento a nível proteíco, tendo uma regulação importante e decisiva na expressão pelo hospedeiro. / Chagas disease affects around 8 million people worldwide and about one-third of them develops severe forms of the disease, being the largest case of cardiomyopathy caused in Latin America and also among the largest cause of death within neglected tropical diseases. Even though it has been known for 111 years, the mechanisms that develop pathology remain an enigma, especially when it comes to studies in humans. Despite this, the role of the host immune response to the etiologic agent, Trypanosoma cruzi, in the control of the infection or its dissemination is indisputable, besides the mechanisms triggered in the initial phase of the disease are determinant for the establishment of a chronic phase. One of the first immune cells to interact with this pathogen is the dendritic cells (DCs), which are responsible for being a mediator between a less specific immune response to a more specific and that has a determining function within the pathology. This work then aims an analysis of the initial response that is triggered in DCs against T. cruzi from a transcriptome performed from the initial interaction between DCs and T. cruzi after 12h. Some of these genes differentially modulated under the action of the pathogen were the tumor necrosis factor, member 18 (TNFSF18), CXC (CXCL9) motif chemokine ligand 9 and ubiquitin 18 specific peptidase (USP18), which had their expression considerably infection. This overexpression verified by RNA-seq was confirmed in this study through RT-qPCR after a process of standardization and selection of strict criteria to guarantee the quality of data interpretation and to be able to compare data from two different methodologies. It was then proved that the differential gene expression obtained in the transcriptome, a robust but more expensive and inaccessible technique, could be attested by RT-qPCR, allowing further studies of other genes and also in a larger sample population, thus allowing an analysis of the initial response in DCs by the T, I crossed more comprehensively in order to mine genes that have a fundamental role in the infection and study them in more depth. It is also important to note that not necessarily an increase in transcript expression reflects at the protein level, as measured in this work when measuring some cytokines such as IFN-γ, TNF, IL-6, IL-4, IL-10, IL-2 and IL-12, in which there was an increase in expression of TNF under infection that matches its detected level of transcript, but IL-10, which was also supraregulated at the transcriptional level, did not have the same behavior at the protein level, having an important and decisive regulation in expression by the host.

O nervo vago exerce um papel importante na regulação da homeostase, e seus ramos eferentes emitem sinais capazes de atenuar a resposta inflamatória através da via do reflexo inflamatório. Nossa hipótese foi de que esta via pode também alterar a função das células dendríticas (DCs), uma vez que estas células possuem receptores colinérgicos e podem ser reguladas pelas citocinas inflamatórias. Sendo assim, DCs esplênicas e DCs geradas a partir de células precursoras da medula óssea de animais vagotomizados unilateralmente foram analisadas quanto aos marcadores fenotípicos CD11c e MHC-II e as moléculas co-estimuladoras CD80 e CD86. As DCs derivadas da medula óssea ainda foram avaliadas quanto a função fagocítica, a apresentação de antígenos, bem como, a produção de citocinas do cocultivo destas com linfócitos de camundongos OT-II. Um ensaio de reação de hiperensibilidade tardia (DTH) para se avaliar a resposta imune celular também foi realizado, mas não mostrou alterações significantes. A análise dos marcadores fenotípicos revelou um aumento da expressão de CD80 em DCs esplênicas de animais vagotomizados unilateralmente, mas não houveram alterações nas DCs derivadas da medula óssea. A avaliação da capacidade fagocítica revelou uma diminuição significante em DCs derivadas da medula óssea de animais vagotomizados unilateralmente enquanto no ensaio de proliferação de linfócitos OTII não houve efeito significante. Entre as citocinas avaliadas, a IL-6 e IFN-ϒ se apresentaram aumentadas nos animais vagotomizados unilateralmente. Portanto, o presente trabalho foi capaz de evidenciar que as DCs também estão sujeitas à modulação do sistema nervoso parassimpático, e que, uma vez moduladas, estas células são capazes de exercer influências sobre outras células do sistema imunológico. / The vagus nerve plays an important role in the regulation of homeostasis and its efferent branches emit signals capable of attenuating the inflammatory response via the inflammatory reflex. Our hypothesis was that this pathway may also alter the function of dendritic cells (DCs), since these cells have cholinergic receptors and can be regulated by the inflammatory cytokines. Thus, splenic DCs and DCs generated from bone marrow precursor cells unilaterally vagotomized animals were analyzed for phenotypic markers CD11c and MHC-II and co-stimulatory molecules CD80 and CD86. The bone marrow-derived DCs were also evaluated for phagocytic function, antigen presentation, as well as the production of cytokines such co-culture with lymphocytes from mice OT-II. A delayed type hypersensitivity test (DTH) twas also performed to evaluate the cellular immune response was also performed, but showed no significant changes. The analysis of phenotypic markers showed increased CD80 expression in splenic DCs from unilaterally vagotomized animals but there were no changes in bone marrow-derived DCs. The evaluation of phagocytic ability showed a significant decrease in DCs from unilaterally vagotomized animals while in the OT-II lymphocyte proliferation assay there was no significant effect. Among the cytokines evaluated, IL-6 and IFN-ϒ were increased in unilaterally vagotomized animals. Therefore, this study was able to demonstrate that DCs are also subject to modulation of the parasympathetic nervous system, which, once modulated, these cells are able to exert influence on other cells.

Os efeitos do estresse, que são fatores constantes e componentes importantes na vida de um indivíduo, provocam alterações sobre o sistema imunológico. Nossa hipótese foi de que o estresse agudo de contenção aplicado em três sessões em dias alternados pode alterar a expressão de marcadores de membrana e a função de células dendríticas (DCs) de camundongos Balb/c. Investigar os efeitos do estresse sobre as DC nos pareceu relevante uma vez que estas são importantes elementos de ligação entre as respostas imune inata e adaptativa, ou seja, são células apresentadoras de antígenos altamente especializadas com uma capacidade única para ativar linfócitos T. Inicialmente, foram realizados experimentos comportamentais e dosagens de hormônios relacionados à resposta ao estresse, a fim de caracterizar e validar o modelo de estresse agudo por contenção utilizado. Em seguida, DCs esplênicas e DCs geradas a partir de células precursoras da medula óssea foram analisadas quanto a expressão de marcadores fenotípicos CD11c, MHC-II, CD80, CD86, CD40 e CCR-7. O modelo de estresse agudo de contenção mostrou-se capaz de produzir alterações no comportamento e de ativar o eixo HPA e o SNS. A análise dos marcadores fenotípicos revelou um aumento da expressão de CD40 em DCs esplênicas de animais estressados, porém, não houve alterações nas DCs derivadas da medula óssea. O ensaio de proliferação demonstrou uma alteração na função de DCs na proporção de 1:1 no co-cultivo com esplenócitos. O presente trabalho, portanto, demonstrou que o estresse agudo de contenção, realizado em três sessões em dias alternados, é capaz de alterar alguns parâmetros relacionados ao fenótipo e à função de DCs esplênicas. / The effects of stress which are constant factors and important components in an individual\'s life cause changes on the immune system. Our hypothesis was acute restraint stress in three sessions on alternate days can change the expression of membrane markers and the function of dendritic cells (DCs) in BALB/c mice. Evaluate the effects of stress on the DC seemed to be relevant since these are important elements linking innate and adaptive immune responses, i,e., cells are highly specialized antigen-presenting with a unique capacity to activate T cells. First of all, behavioral assessment and dosages of hormones related to stress response were conducted to characterize and to validate the model of acute restraint stress. Then, splenic DCs and DCs generated from bone marrow were analyzed for expression of phenotypic markers CD11c, MHC-II, CD80, CD86, CD40 and CCR-7. The model of acute restraint stress changed the behavior and activate the HPA axis and the SNS. The analysis of phenotypic markers revealed an increased expression of CD40 on splenic DCs from stressed animals, however, there were no changes in BM-dDCs. The proliferation assay showed a change in the function of DCs in the coculture with splenocytes in a ratio of 1:1. Therefore, the present study indicated that acute restraint stress, conducted in three sessions on alternate days, is able to change some parameters related to the phenotype and function of splenic DCs.

Introdução: O fator de transcrição FOXP3 está aumentado em pacientes com rejeição aguda do transplante renal, mas a sua influência na função e sobrevida do enxerto ainda não é clara. O objetivo deste estudo foi correlacionar a expressão gênica e protéica de FOXP3 com os desfechos do enxerto renal, e avaliar a sua associação com células apresentadoras do antígeno em biópsias do enxerto renal. Métodos: Foram avaliados 91 receptores de transplante renal submetidos à biópsia do enxerto por disfunção aguda ou crônica, classificados pela histologia de Banff. O RNAm de FOXP3 foi analisado por PCR em tempo real, e a proteína de FOXP3 e as células dendríticas CD83+ (CDs) por imuno-histoquímica. Todas as análises foram feitas em tecidos fixados em formalina e incluídos em parafina. A magnitude de expressão de FOXP3 foi estabelecida por curva ROC. A função e a sobrevida do enxerto em 5 anos pós-transplante foram avaliados, assim como fatores preditores de perda do enxerto. Resultados: A correlação da expressão intra-enxerto do gene e da proteína de FOXP3 foi positiva e significativa (r=0.541, p<0.001). Tanto o RNAm quanto a proteína de FOXP3 estavam aumentados em pacientes com rejeição aguda (RA), em comparação com aqueles sem rejeição (SR) (p=0,039 e p<0,001, respectivamente) ou fibrose intersticial/atrofia tubular (FI/AT) (p=0,035 e p=0,034, respectivamente). Níveis elevados do RNAm de FOXP3 (≥ 2,36 log10 RNAm) ou da proteína (≥ 2,5 células FOXP3+/mm2) não se correlacionaram com variáveis demográficas ou do transplante, mas pacientes com FOXP3 RNAm elevado tiveram maiores taxas de filtração glomerular estimada (TFGe) e uma tendência de variação positiva da TFG ao final do seguimento. O número de CDs CD83+ tendeu a ser maior nas biópsias com FI/AT em comparação com SR (p=0,065), mas não na RA. Pacientes com alta expressão de FOXP3 apresentaram maior número de CDs CD83+ na biópsia: 0,86 (0,25-4,0) vs. 0,44 (0-1,12) células/mm2, p=0,032. A sobrevida cumulativa do enxerto em 5 anos não foi influenciada pela expressão do RNAm de FOXP3 (p = 0,69, log-rank test). Na análise de regressão Cox, RNAm e proteína de FOXP3 não foram preditores independentes da perda do enxerto, somente maior TFGe foi fator protetor contra perda do enxerto. Conclusões: Este estudo mostra que a análise molecular de FOXP3 em tecido parafinado do enxerto renal é possível, uma vez que o RNAm e proteína correlacionaram-se positiva e significativamente. Como esperado, houve uma expressão aumentada de FOXP3 em biópsias com RA. Bióspias com alta expressão de FOX3 tiveram maior densidade de células dendríticas. Nesta coorte, o FOXP3 não foi associado à melhor função ou sobrevida do enxerto renal. / Background. The transcription factor FOXP3 is increased in acute rejection in renal transplant recipients, but its influence in graft function and survival is not clear yet. The aim of this study was to correlate FOXP3 gene and protein expression with graft outcomes, and to evaluate its association with antigen presenting cells in kidney graft biopsies. Methods. We assessed 91 kidney transplant recipients undergoing allograft biopsy for acute or chronic dysfunction, classified by Banff histology. FOXP3 mRNA was analyzed by real-time PCR, and FOXP3 protein and dendritic cells (CD83+ DCs) by immunohistochemistry. All analyzes were done in formalinfixed, paraffin-embedded tissue. The magnitude of FOXP3 expression was established by the receiver operating characteristics (ROC) curve. Graft function and survival at 5 years post transplantation were assessed, as well as independent predictors of graft loss. Results. Intra-graft FOXP3 gene and protein expression were significantly correlated (r=0.541, p<0.001). Both FOXP3 mRNA and protein were increased in patients with acute rejection (AR) as compared to those with no rejection (NR) (p=0.039 and p<0.001, respectively) or interstitial fibrosis/tubular atrophy (IF/TA) (p=0.035 and p=0.034, respectively). FOXP3-RNAmhigh (≥ 2.36 log10RNAm ) or FOXP3-proteinhigh (≥ 2.5 FOXP3+ cells/mm2) did not correlate with demographic or transplant variables, but patients with FOXP3-RNAmhigh had higher glomerular filtration rates (GFR) and tended to have a positive delta of GFR at last follow up. CD83+ DCs tended to be increased in biopsies with IF/TA as compared to NR (p=0.065), but were not associated to AR. Patients with FOXP3-RNAmhigh had more CD83+ DCs on biopsy: 0.86 (0.25-4.0) vs. 0.44 (0-1.12) cells/mm2, p=0.032. The cumulative 5-year graft survival of these renal allografts was not influenced by FOXP3 mRNA expression (p=0.69, log-rank test). Neither FOXP3 mRNA or protein were predictors of graft survival, only higher eGFR at biopsy was a protective factor against graft loss. Conclusions: This study gives support for performing FOXP3 molecular analysis in archival tissue of renal graft biopsies, where FOXP3 mRNA and protein had a good correlation. As expected, there was an increased FOXP3 expression in biopsies with AR, and biopsies with FOXP3-RNAmhigh associated with greater number of dendritic cells. In this cohort, FOXP3 was not associated with better renal graft outcomes.

Identificamos em 12 pacientes deficientes de CD40L uma incidência de infecções fúngicas de 83%, incluindo os primeiros casos de paracoccidioidomicose (PCM) e aspergilose. As células dendríticas imaturas (DCs) dos pacientes apresentaram expressão reduzida das moléculas HLA-DR, CD80 e CD86 e as DCs maduras (mDCs) pulsadas com os fungos P. brasiliensis ou C albicans apresentaram baixa expressão das moléculas HLA-DR e CD80. As mDCs dos pacientes secretaram baixa concentração de IL-12 e alta de IL-10. Nas co-culturas das mDCs com os linfócitos autólogos, observamos que a produção de IFN-<font face=\"Symbol\">g foi reduzida e a produção de IL-4 e IL-5 foi aumentada. Após tratamento com CD40L solúvel os defeitos observados foram revertidos. Os neutrófilos dos pacientes falharam na atividade fungicida em resposta ao P. brasiliensis, reduzida produção de H2O2 e sinalização via TLR1/TLR2 e TLR2/TLR6 foram observadas. Falhas na resposta de DCs e neutrófilos sugerem que esses são mecanismos imunopatológicos subjacentes à suscetibilidade às infecções fúngicas em pacientes deficientes de CD40L. / We identified 12 CD40L-deficient patients with an incidence of fungal infections of 83%, including the first case of paracoccidioidomycosis and aspergillosis. The immature DCs (iDCs) from the patients present reduced protein expression of HLA-DR, CD80 and CD86 and mature DCs (mDCs) pulsed with P. brasiliensis (mDCs) presented low expression of HLA-DR and CD80 molecules The mDCs from the patients secreted low levels of IL-12 and high of IL-10. In co-cultures of mDCs and autologous T lymphocytes we found low production of IFN-<font face=\"Symbol\">g and high production of IL-4 and IL-5. After treatment with soluble CD40L, the defects were reversed. The neutrophils from these patients showed impaired fungicidal activity in response P. brasiliensis and low production of H2O2. Additionally defective TLR1/TLR2 and TLR2/TLR6 signaling were observed. Failure in DCs and neutrophils responses are imunophatological mechanisms underlying the suscetibility to fungal infections in CD40L-deficient patients.

A análise da expressão da enzima indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO), envolvida na regulação da resposta imune, em vacinas de células dendríticas (DCs) como imunoterapia para tratamento de indivíduos HIV+, pode fornecer informações sobre o perfil dessas células e auxiliar o aperfeiçoamento das técnicas atualmente utilizadas. A avaliação da expressão de IDO, por citometria de fluxo, foi realizada em monócitos e DCs de indivíduos sadios e HIV+. A expressão do RNAm de IDO foi analisada por PCR e a capacidade das DCs em estimular linfoproliferação e apresentar antígenos de HIV a linfócitos autólogos foi avaliada por ensaio de cocultivo. DCs ativadas de indivíduos HIV+ demonstraram expressão mais elevada de IDO tanto em relação às DCs imaturas quanto em relação às DCs dos indivíduos sadios. DCs foram capazes de induzir resposta proliferativa e polifuncional de linfócitos autólogos. Nossos resultados sugerem uma expressão diferencial de IDO entre indivíduos sadios e HIV+, indicando um importante papel da enzima no controle da resposta imune e na patogênese da AIDS. / The evaluation of indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) levels, a regulatory enzyme, in the context of DCs vaccines as a therapeutic alternative for the HIV+ patients, can bring information about DCs profiles that can improve current techniques of vaccine production. IDO expression was evaluated by flow cytometry in monocytes and DCs from healthy subjects and HIV+ patients. Expression of IDO mRNA was performed by real-time PCR and the ability in stimulate lymphoproliferation and presenting HIV antigens to autologous lymphocytes was evaluated in coculture assays. Comparison between immature and activated DCs showed an increased IDO expression in activated DCs in patients group. DCs derived from HIV+ patients showed an increased IDO expression when compared to healthy donors. DCs were able to induce lymphofoproliferation and polyfunctional response in autologous lymphocytes. Our results suggest a differential expression of IDO between health subjects and HIV+ patients, indicating an important role of IDO in the control of the immune response and in the HIV pathogenesis.

Tese de Mestrado Integrado. Bioengenharia. Área de Especialização de Biotecnologia Molecular. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2012

Doctor en Ciencias Biomédicas / Melanoma es la neoplasia cutánea más agresiva, con una incidencia ascendente a pesar de numerosos esfuerzos de prevención. En la actualidad existen diversas estrategias de tratamiento, sin embargo, no todos los pacientes responden a ellas. En nuestro laboratorio se ha ensayado una inmunoterapia basada en células dendríticas (DCs) maduradas con un lisado de líneas celulares de melanoma (TRIMEL), que ha incrementado hasta 3 veces la sobrevida en pacientes que desarrollan una respuesta inmunológica de hipersensibilidad retardada (DTH+). Hasta la fecha no se han desarrollado avances en el estudio de la fracción no peptídica de este lisado ni de su capacidad de activar células iNKT, capaces de reconocer antígenos glicolipídicas en contexto CD1d. Hipótesis: Células iNKT infiltran tumores de pacientes con melanoma avanzado y son capaces de ser activadas in vitro por células dendríticas utilizadas en inmunoterapia antitumoral. Objetivo General: Determinar el rol en pacientes con melanoma de células iNKT infiltrantes de tumor y activadas por células dendríticas maduradas ex vivo utilizadas en inmunoterapia antimelanoma. Métodos: Se determinaron células iNKT infiltrantes de tumor mediante inmunofluorescencia y se correlacionó su presencia en lesiones de melanoma primario en todos los estadios según Breslow con la sobrevida de la enfermedad. Se evaluó la capacidad de las fracciones glicolipídica y proteica de TRIMEL para inducir maduración en células dendríticas. Para este fin, las fracciones se obtuvieron mediante gradiente de densidad con MTBE (Metil-terbutil-éter) y se usaron para estimular DCs generadas en base a rhIL-4 y GM-CSF. En estas condiciones se evaluó la presencia de diversas moléculas de superficie y la producción de citoquinas. Para evaluar la capacidad de estas DCs de activar células iNKT, desde PBMC se aisló la población CD3+ mediante cell-sorting y cultivadas con distintas DCs generadas. Se analizó la proliferación celular utilizando el ensayo CFSE. También se evaluó la presencia de células iNKT mediante inmunofluorescencia en tacos de parafina de las DTH realizadas a pacientes de inmunoterapia. Resultados: Encontramos infiltración por células iNKT en todos los estadíos de la enfermedad, siendo mayor en Breslow avanzados, sin una correlación con la sobrevida global. Al evaluar la maduración de DCs, esta fue mayor en el grupo estimulada con la fracción peptídica de TRIMEL. DCs estimuladas con la fracción glicolipídica de TRIMEL no mostraron diferencias con la condición no tratada. Al evaluar mediante ensayo de proliferación realizado con CFSE, se evidenció mayor proliferación en la condición tratada con la fracción peptídica. Finalmente, sólo en 1 de 3 pacientes en los que se analizó la presencia de iNKT en las DTH se encontraron estas células. Conclusiones: unificando todos los hallazgos discutidos previamente, células iNKT infiltran tumores de melanoma, las que podrían ser inducidas a proliferar por DCs estimuladas con la fracción peptídica de TRIMEL y de esa forma migrar a sitios inflamados como representan las lesiones DTH. / Melanoma is the most aggressive skin tumor, with a growing incidence worldwide, despite of prevention strategies. Nowadays, there are several new therapies to treat it, however the overall survival continues to be low. Our lab has been studying a Dendritic Cell (DC) based immunotherapy maturated with a melanoma cell lines lysate (TRIMEL), which has increased survival up to 3 times in patients that developed a delayed type hypersensitivity response (DTH+). To this date no studies have been made regarding the non peptidic fraction of this lysate or its capability to activate a subpopulation of T Cells called iNKT cells, characterized by their ability to recognize glycolipids in a CD1d manner. Hypothesis: iNKT Cells infiltrate melanoma patient’s tumors and are capable to be activated in vitro by Dendritic cells Main Objective: To determinate the role of tumor infiltrating iNKT cells activated by matured Dendritic Cells ex vivo used in antimelanoma immunotherapy in melanoma patients Methods: The presence of tumor infiltrating iNKT Cells in primary melanoma in all of Breslow stages was evaluated by expression of TCR Vα24Jα18 by Immunofluorescence microscopy. To evaluate the capability of glycolipid and peptidic TRIMEL fraction to induce DCs maturation, they were isolated from TRIMEL using a MTBE (Metil-terbutil-ether) density gradient. Afterwards, these fractions were used to stimulate DCs generated with a rhIL-4 and GM-CSF protocol and surface molecules expression were assessed, as well as cytokine secretion. To evaluate DCs effectiveness to activate iNKT Cells’ proliferation, CD3+ population was isolated from Buffy Coats using cell-sorting technology and they were cultured with DCs. Proliferation was accessed with CFSE dye assay. Finally, DTH infiltrating iNKT cells were asessed in paraffined embedded samples by immunofluorescence microscopy. Results: We found that iNKT cells infiltrated melanoma tumors in every Breslow stage, with higher infiltration on advanced stages,with no correlation with overall survival. The peptidic fraction of TRIMEL induced higher expression of maturation related surface molecules in addition to cytokine secretion, whereas glycolipidic fraction showed no difference with the untreated condition. iNKT cell had a higher proliferation rate when cultured with DCs treated with the peptidic fraction of TRIMEL. And finally, we found the infiltration of iNKT in 1 of the 3 patients DTH. Conclusions: Taking together all the previous results, iNKT cells infiltrate melanoma Tumors, and they could be induced to proliferate by DCs stimulated with the peptidic fraction of TRIMEL and as well supporting their migration to inflamed tissues like the DTH samples. / 2021

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000442974-Texto+Completo-0.pdf: 1168003 bytes, checksum: 61a64ae8027da7ef2e5ef378d8f25eb3 (MD5) Previous issue date: 2011 / Breast cancer is an important cause of morbidity and mortality in Brazil and worldwide. New therapeutic strategies have been proposed and one of them is the use of cell therapy with dendritic cells (DCs), however, the literature regarding the real benefit of this approach shows great variability and inability to produce a lasting immunity. In this paper we made a detailed characterization of monocyte-derived dendritic cells (MoDCs) of patients with breast cancer and monocytes that originated them. A lower yield of MoDCs was obtained from patients when compared to age matched healthy controls. Patient MoDCs exhibited decreased expressions of maturation and activation markers. Furthermore, cultures of MoDCs of patients had significantly elevated levels of spontaneous production of IL-6, which is consistent with a pro-tumor phenotype. These differences in molecule expression and cytokine production led us to postulate that the signaling pathways and / or the expression of toll like receptors (TLRs) could be altered.A decrease of TLR9 and TLR2 and an increase in the expression of NFkBp50 was found in MoDCs of patients without stimulation. After stimulation with LPS and CPG the patients did not upregulate expression of MyD88, suggesting a downregulation of the signaling pathways activated by these molecular patterns. The number of monocytes was also were decreased in patients, showing a reduced expression of GM-CSF receptors compared to monocytes of healthy controls. Cytokine production by monocytes from cancer patients was also altered, with an increased production of IL-6, IL-4 and IL-10. TLR2 and TLR9 expression was downregulated in monocytes of patients. Together these data show that monocytes are already altered in patients with cancer, and that will influence the phenotype of DCs differentiated from them. Tumor burden seems to induce a tolerogenic and pro-tumoral phenotype in patients´cells. This finding is important for the development of DC-based cancer immunotherapy. / A neoplasia mamária é uma causa importante de morbidade e mortalidade no Brasil e no mundo. Novas estratégias terapêuticas vem sendo propostas e uma delas é a utilização de terapia celular com células dendríticas (DCs), entretanto, os dados da literatura em relação ao real benefício desta abordagem apresentam grande variabilidade e inabilidade em produzir uma imunidade duradoura. No presente trabalho fizemos uma caracterização detalhada das células dendríticas derivadas de monócitos (MoDCs) das pacientes com câncer de mama e dos monócitos que as originaram. As MoDCs das pacientes são obtidas com um menor rendimento quando comparadas a controles saudáveis pareados por idade, e exibem uma diminuição nos marcadores de maturação e ativação. Além disso, as culturas de MoDCs das pacientes apresentaram altos níveis de IL-6, o que é compatível com um fenótipo pró-tumoral. Essas diferenças na produção de citocinas nos levou a postular que as vias de sinalização e/ou a expressão de toll like receptors (TLRs) poderiam estar alteradas. Observamos uma diminuição de TLR9 e TLR2 e um aumento na expressão de NFkBp50 nas MoDCs das pacientes, sem estímulo. Após estímulo com LPS e CPG as pacientes não aumentaram a expressão de MyD88, sugerindo uma diminuição Ada via de sinalização da resposta a esses padrões moleculares. Quando analisamos os monócitos, eles também estavam diminuídos nas pacientes, e apresentavam uma expressão de receptores para GM-CSF inferior a dos controles saudáveis. A produção de citocinas pelos monócitos das pacientes com câncer também estava alterada com uma produção aumentada de IL-6, IL-4 e IL-10. A frequência de TLR9 e TLR2 estava diminuída nos monócitos das pacientes. Esses dados conjuntamente demonstram que os monócitos já estão alterados nas pacientes com câncer, assim como as DCs diferenciadas a partir deles. O crescimento tumoral parece induzir um fenótipo de tolerância nestas células. Esse dado é de fundamental importância para o desenvolvimento de imunoterapia baseada em DCs.