Les cellules souches adultes assurent le renouvellement des cellules différenciées, un mécanisme indispensable à la régénération des organes soumis au vieillissement et aux agressions extérieures. Des cellules souches ont été identifiées dans les tubules de Malpighi (TM) qui assurent les fonctions rénales chez la Drosophile. Ces cellules souches rénales (CSR) proviennent à l'origine de précurseurs des cellules souches intestinales (CSI) qui migrent et colonisent les TM pendant la métamorphose. Nous montrons que le facteur de transcription shavenbaby (svb) est exprimé au sein des CSR. Svb est connu pour contrôler la morphogenèse épidermique durant le développement de la Drosophile tandis que son homologue chez l'Homme, OvoL, est impliqué dans la transition épithélio-mésenchymateuse et est dérégulé dans certains cancers. Nous avons découvert que la principale fonction de svb au sein des CSR est de prévenir l'apoptose. En effet, la perte de fonction de svb, spécifiquement au sein des CSR adultes, induit leur disparition progressive et cet effet est abolit par l'expression d'inhibiteurs d'apoptose. Tout comme dans l'épiderme, nous avons pu observer que la fonction de svb est supportée par sa maturation protéolytique induite par les gènes polished-rice et ubr3. De plus, nous démontrons que Svb interagit avec Yorkie (Yki) un membre de la voie de signalisation Hippo, connue pour contrôler le nombre de CSI. Ce complexe Svb/Yki régule l'expression de l'inhibiteur apoptotique DIAP1 afin de maintenir un nombre normal de CSR. Ces travaux ont donc permis d'identifier un nouveau membre de la voie de signalisation Hippo et de découvrir un mécanisme inattendu de protection des cellules souches contre la mort cellulaire qui pourrait expliquer leur capacité de résistance à l'apoptose. / Throughout adult life, homeostasis of fundamental functions requires cell renewal to compensate for tissue damage and cell death. The renal (Malpighian) tubules in Drosophila are responsible for excretion of metabolic waste like kidney in vertebrates. Although Malpighian tubules are thought to be very stable during development, evidence of adult cell renewal have been showed and stem cells identified. Renal and nephric stem cells (RNSC) derived from intestinal stem cell precursors that colonize Malpighian tubules during metamorphosis. We showed that the gene shavenbaby (svb) which encodes a transcription factor belonging to the OVO-Like family (OVOL) is expressed in RNSCs. In vertebrates, OvoL factors act as guardian of epithelial integrity, while in Drosophila, Svb is well identified for its role in epidermal cell shape remodeling. The transcriptional activity of Svb requires its proteolytic processing mediated by the SmORF peptides Pri encoded by the polished-rice gene. Here, we show that this processing occurs also in RNSC and that the main function of svb in these cells is to protect them from apoptosis. Svb loss of function induces a progressive disappearance of RNSC that can be rescued by blocking programmed cell death. At the molecular level, we found that Svb physically interacts with Yorkie, the downstream effector of the hippo pathway to favor the expression of the inhibitor of apoptosis DIAP1. To conclude, our work identified a new member of the hippo pathway and uncovered an additional way to protect stem cell from apoptosis that may explain their capacity to resist apoptosis.

La morphogenèse des tissus dans les organismes multicellulaires est très importante pour le développement et certaines pathologies. La morphogenèse tissulaire est dirigée par des forces bio-mécaniques générées par des moteurs moléculaires tels que la myosine et transmis via le cytosquelette et les structures d'adhésion à l'intérieur et entre les cellules. La contractilité de la myosine, souvent en mode oscillatoire, a été étudiée principalement au niveau du domaine apical des cellules épithéliales au cours du développement mais très peu au niveau de leur domaine basal. L'oscillation de la myosine basale est importante pour le contrôle de l'élongation du tissu durant l'oogenèse chez la Drosophile. Bien que la voie Rho1-ROCK-myosin-MBS soit connue pour contrôler l'activité de la myosine, le mécanisme précis de ce contrôle n'a pas été élucidé. Le but de mon projet de thèse est de répondre à deux questions : Quels sont les facteurs en amont de cette voie ? Comment cette voie de signalisation crée et maintient l'oscillation de la myosine ? 1) Contrairement à ce qui est déjà connu, Je me suis intéressé à l'effet des adhésions cellule-cellule et cellule-matrice dans le contrôle des voies de signalisation gouvernant l'oscillation de la myosine basale. Les adhésions cellule-matrice, mais pas les adhésions cellule-cellule, sont positivement corrélées avec l'intensité et la polarité dorso-ventrale de la myosine, indiquant que les adhésions cellule-matrice pourraient être les facteurs en amont de la voie Rho1-myosine. Les adhésions cellule-matrice régulent positivement l'activité de Rho1 près des jonctions et gouvernent les flux de ROCK et myosine à l'intérieur du domaine median, contrôlant ainsi l'élongation du tissu. D'une autre manière, les adhésions cellule-cellule affectent indirectement les flux de ROCK and myosine en contrôlant la distribution subcellulaire de ROCK et du réseau d'actomyosine. L'inhibition des adhésions cellule-cellule, qui a un effet mineur sur l'élongation du tissu, provoque la redistribution des adhésions cellule-matrice et des filaments F-actin entrainant le chargement de la myosine à différentes positions. 2) J'ai montré que l'oscillation de la myosine basale dépend peu de la tension corticale de l'actomyosine : l'inhibition du chargement de la myosine sur les filaments d'actine n'affecte pas le flux de myosine alors qu'il bloque fortement le cycle périodique des contractions/relaxations de la cellule indiquant que l'oscillation est principalement due à une réaction biochimique plutôt qu'à une tension corticale. Au cours de l'oscillation de la myosine, les protéines Rho1 et leur activité sont principalement distribuées et enrichies au niveau et près des jonctions basales, et le contrôle majeur de cette oscillation est le flux des signaux ROCK qui diffusent des jonctions basales au cortex medio-basal. Ce mouvement de ROCK est initié grâce à une interaction transitoire entre ROCK et Rho1 actif au niveau et près des jonctions basales, conduisant ainsi à l'ouverture et activation de la kinase ROCK. Au cours de ce mouvement, l'activation de ROCK permet l'accumulation et l'amplification des signaux ROCK; Cette amplification entraîne la phosphorylation de la myosine, qui ensuite génère la redistribution dynamique de la phosphatase MBS. Enfin, l'enrichissement des signaux MBS arrête les signaux ROCK et myosine. Dans ces deux études, nous avons construit un outil optogénétique confirmant les différentes étapes de l'oscillation de la myosine basale. L'ensemble de ces résultats démontrent que le mécanisme contrôlant l'oscillation de la myosine basale nécessite une réaction biochimique, et met en évidence deux contrôles diffèrent de cette oscillation par les adhésions cellule-cellule et les adhésions cellule-matrice. / Tissue morphogenesis in multicellular organisms is very important in both development and human disease. Tissue morphogenesis is driven by bio-mechanic force that is normally generated by molecular motors such as myosin and transmitted via cytoskeleton and adhesion structures within and between cells. Myosin contractility, often as an oscillatory pattern, has been studied mainly in apical but less in basal domains of epithelial cells during development. Basal myosin oscillation is important in control of tissue elongation during Drosophila oogenesis. Although a signal cascade (Rho1-ROCK-myosin-MBS) has been known to regulate myosin activity, the detailed controlling mechanism is unclear. My project is aimed to address two questions: first, what is the upstream factor of this signal cascade? Second, how does this signal cascade create and maintain basal myosin oscillation? For this first question, I am interested in the effect of cell-cell and cell-matrix adhesion in control of this signal cascade governing basal myosin oscillation. Cell-matrix adhesion (Integrin and Talin), but not cell-cell adhesion (E-cadherin), is positively correlated with the intensity and Dorsal-ventral (DV) axis polarity of basal myosin oscillation, indicating that cell-matrix adhesion might be the upstream control of Rho1-myosin signal cascade. Cell-matrix adhesion positively regulates the Rho1 activity near junction and governs the pulsed ROCK and myosin signals within basal-medial domain, thus strongly controlling tissue elongation. Differently, cell-cell adhesion indirectly affects the ROCK and myosin pulses through controlling the subcellular distribution of ROCK and actomyosin network. Inhibition of cell-cell adhesion results in the redistribution of cell-matrix adhesion and F-actin filaments leading to different position of myosin loading, which plays minor effect on tissue elongation. For the second question, I unraveled that basal myosin oscillation is barely dependent on actomyosin cortical tension: inhibition of myosin loading to F-actin filament seems not to affect basal pulsatile myosin flows, while it strongly blocks the periodic cycle of cell contraction and relaxation at basal surface, thus indicating that oscillation is mainly from biochemical reaction rather than cortical tension. This observation highlighted that biochemical reaction is the main control of oscillation occurrence. During basal myosin oscillation, Rho1 proteins and Rho1 activity are mainly distributed and enriched at and near basal junction and the major control of basal myosin oscillation is the flow movement of oscillatory ROCK signals from basal junction to medio-basal cortex. This ROCK flow movement is initiated from the transient interaction of ROCK with active Rho1 at and near basal junction, thus leading to the opening and activation of ROCK kinase capability. During the membrane-medial flow movement, ROCK kinase activity mediates the accumulation and thus the amplification of ROCK signals; this positive signal amplification turns on the phosphorylation of myosin regulatory light chain (MRLC), which governs the dynamic redistribution of MBS. Finally, enriched MBS signals shut off both ROCK and myosin signals. In both study, an optogenetic tool named as LARIAT was built up in vivo to confirm the various status of basal myosin oscillation. Altogether, these results demonstrated two different controls of basal actomyosin signals by cell-matrix adhesion and cell-cell adhesion, and further demonstrated the underlying mechanism of basal myosin oscillation at the biochemical levels.

Comprendre comment l’expression des gènes est régulée spécifiquement dans chaque tissu et de manière dynamique au cours du temps demeure une étape centrale de notre compréhension de l’organogénèse. L’identification des éléments cis-régulateurs de la transcription de manière tissu-spécifique peut permettre de comprendre les règles logiques d’organisation du réseau de gènes régulateur et aussi d’identifier de nouveaux acteurs (facteurs de transcription notamment). L’analyse de marques de chromatine (H3K27ac et H3K4me3) spécifiquement dans les cardioblastes (104 cellules) au cours de la différentiation a permis l’identification en masse de régions cis-régulatrices de la transcription. Via une approche d’apprentissage, de nouvelles régions régulatrices spécifiques des cardiomyocytes ainsi que 2 nouveaux facteurs de transcription (bagpipe, hamlet) ont été identifiées. L’alignement multiple des régions régulatrices suggère que les régions associées à H3K27ac dans les cellules cardiaques durant ces étapes de l’organogénèse partagent une séquence consensus. Ces nouveaux éléments régulateurs viennent compléter le réseau de gène régulateur au cours des étapes tardives de la cardiogénèse. / Understanding how gene expression is spatio-temporally regulated remains a crucial step in our understanding of organogenesis. Identification of transciptional cis-regulatory elements in a tissu-specific manner could allow to understand logical rules leading regulatory network organisation and to identify new actors (in particular transcription factors). Analysis of chromatin marks (H3K27ac and H3K4me3) specifically in cardiac cells (104 cells) during differentiation allowed the identification of transcriptional cis-regulatory regions. Via a machine learning approach, new cardiac specific regulatory regions and two transcription factors (bagpipe and hamlet) have been identified. Multiple sequence alignment of regulatory regions suggests that regions associated to H3K27ac in cardiac cells during these steps of organogenesis share a consensus sequence. These new regulatory elements integrate and complete the gene regulatory network underlying late steps of cardiogenesis.

La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) ou maladie de Steinert est la maladie génétique neuromusculaire la plus commune avec une incidence de 1/8000 à travers le monde. Cette maladie multisystémique touche particulièrement les muscles squelettiques (myotonie, faiblesse et perte musculaires) et le coeur qui présente des symptômes variés comme des troubles de la conduction et des arythmies. La DM1 est causée par une expansion instable de répétitions CTG dans la région 3’ non traduite du gène DMPK. Les individus sains possèdent entre 5 et 37 répétitions CTG tandis que les patients DM1 portent entre 50 et plusieurs milliers de répétitions. Il est bien établi que les expansions de répétitions non codantes forment des foci dans les noyaux musculaires où elles séquestrent le facteur d'épissage MBNL1. Toutefois, l'implication de la stabilisation et l'accumulation de CUGBP1 hyperphosphorylé par la PKC dans la maladie est un sujet controversé dans la communauté DM1. Dernièrement, en plus de la rupture de l'équilibre entre MBNL1/CUGBP1, plusieurs mécanismes ont été mis en cause dans la pathogenèse de la DM1. Parmi eux, l'expression perturbée de facteurs de transcription, la maturation altérée de miARNs, l'activation de kinases... chacune de ces altérations menant au final à une perturbation du transcriptome. Afin d'étudier l'effet de la toxicité des répétitions sur les phénotypes et lestranscriptomes, nous avons généré trois lignées de Drosophile inductibles et site-spécifiques exprimant 240, 600 et 960 répétitions de triplets. Nous avons travaillé en parallèle sur une lignée atténuée pour mbl (orthologue de MBNL1) et deux lignées gain de fonction bru -3 (orthologue de CUGBP1). Exprimées dans les muscles somatiques, les répétitions CTG conduisent à une mobilité réduite, le fractionnement des fibres musculaires, une réduction de leur taille et une altération du processus de fusion des myoblastes de manière dépendante de Mbl et Bru-3. En outre, l'expression des répétitions cause une hypercontraction musculaire dépendante de Mbl et due à un mauvais épissage de dSERCA. L'analyse transcriptionnelle comparative réalisée sur les muscles larvaires des différentes conditions pathologiques montre que l'atténuation de mbl reproduit 70-82% des dérégulations transcriptomiques des larves DM1 alors que le gain de fonction bru-3 représente 32-53% des altérations transcriptomiques des lignées DM1. Ainsi Mbl est un facteur clé des dérégulations observées dans les muscles somatiques des lignées DM1. Au contraire, les analyses physiologiques effectuées sur les coeurs adultes suggèrent que Bru-3 est un facteur clé dans la mise en place des phénotypes cardiaques. En effet, d'une part, l'atténuation de mbl dans le coeur cause une cardiomyopathie dilatée, un symptôme rarement diagnostiqué chez les patients. D'autre part, les lignées gain de fonction bru-3 et DM1 présentent de la fibrillation qui évolue avec l'âge ou la taille des répétitions vers un phénotype qui rappelle l'insuffisance cardiaque chez les patients. / Myotonic Dystrophy Type 1 (DM1) or Steinert's disease is the most common genetic neuromuscular disorder affecting 1 out of 8000 people worldwide. This multisystemic disease affects particularly the skeletal muscles (myotonia, muscle weakness and wasting) and the heart, which can exhibit various symptoms like conduction disturbances and arrhythmia (auricular fibrillation and flutter). DM1 is caused by an unstable CTG repeat expansion in the 3' non-translated region of the DMPK gene. In healthy individuals, the number of CTG repeats ranges from 5 to 37 whereas DM1 patients carry from 50 to thousands repeats. It is well established that when expanded non-coding repeats aggregate into foci within muscle nuclei and sequester the MBNL1 splicing factor. However, the involvement of the stabilization and accumulation of CUGBP1 following PKC hyper-phosphorylation in the disease is a controversial matter in the DM1 community. Lately, in addition to the disruption of the balance between MBNL1/CUGBP1, several mechanisms were identified as part of the DM1 pathogenesis. Among them, transcription factors perturbations, altered maturation of miRNA, kinases activation… each of them leading eventually to transcriptomic alterations. In order to investigate the effect of toxic repeat expression on phenotypic and transcriptomic alterations, we generated three inducible site-specific Drosophila lines expressing 240, 600 and 960 triplet repeats. We worked in parallel on a mbl (MBNL1 orthologue) knocked-down line and two bru-3 (CUGBP1 orthologue) gain of function lines. When expressed in somatic muscles, CTG repeats lead to altered motility, fiber splitting, reduced fiber size and affected myoblast fusion process in a Mbl and Bru-3 dependent manner. In addition, toxic repeats cause fiber hyper-contraction in a Mbldependentmanner due to dSERCA mis-splicing. Comparative transcriptional profiling performed on larval muscles of different conditions show that mbl attenuation reproduces 70-82% of DM1 transcriptomic deregulations whereas bru-3 gain of function represents 32-53% of transcritomic alterations. Thus Mbl appears as a key factor of transcripts deregulations observed in DM1 muscles. On the contrary, physiologic analyses performed on adult hearts suggest that Bru-3 is a key factor for cardiac phenotypes. Indeed, on one hand, mbl attenuated flies display dilated cardiomyopathy, a symptom barely diagnosed in patients. On the other hand, bru-3 gain of function line and DM1 lines display fibrillation, which evolves withage or repeat size into a phenotype reminiscent of heart insufficiency in patients.

Les insectes ont développé un système chimiosensoriel gustatif leur permettant de discriminer les stimuli sensoriels indispensables à leur survie et à leur reproduction. Afin d’être efficace, le système gustatif doit être sensible et permettre une élimination rapide des molécules sensorielles afin d’éviter la saturation des récepteurs et ainsi assurer la détection et l’intégration des signaux chimiosensoriels. Présentes dans l’espace péri-récepteur, les enzymes du métabolisme des xénobiotiques (EMX), impliquées principalement dans la détoxication des organismes, pourraient avoir un rôle central dans la modification et/ou l’arrêt du signal sensoriel en catalysant la biotransformation de ces molécules et en favorisant leur élimination.Afin d’analyser l’implication des EMX dans les processus chimiosensoriels, nous avons centré notre étude sur le rôle potentiel des Cytochromes P450 (CYP), dans la perception et le métabolisme de la caféine chez Drosophila melanogaster. Nous avons identifié plusieurs CYP dont l’expression est fortement modulée dans les organes sensoriels et dans le corps par la caféine. L’inhibition ciblée de l’expression de certains CYP dans les neurones sensoriels provoque une perturbation de la perception de la caféine, mettant ainsi en évidence le rôle crucial de ces enzymes dans les mécanismes chimiosensoriels. En parallèle, nous avons caractérisé le métabolisme de la caféine chez la drosophile puis, nous avons mis en évidence l’implication directe de CYP6d5 dans la dégradation de la caféine en théobromine.L’ensemble de ces travaux montre pour la première fois, l’implication directe des cytochromes P450 dans les mécanismes de perception sensorielle et dans le métabolisme de la caféine chez la drosophile. / Insects have developed a gustatory system, allowing them to detect sensory molecules essential to their survival and their reproduction. In order to be efficient, the gustatory system must be sensitive, allowing a rapid elimination of sensory molecules in order to avoid the receptor saturation and insuring the detection and the integration of chemosensory signals.Located in the peri-receptor environment, xenobiotic metabolizing enzymes (EMX), mainly implicated in detoxification, could have a crucial role in the modulation of the sensory signal by catalyzing the biotransformation of sensory molecules and promoting their elimination.To analyze the involvement of XME in chemosensory processes, we focused our project on the putative role of Cytochromes P450 (CYP) in caffeine sensory perception and metabolism in Drosophila melanogaster. We identified several CYP, which the expression is strongly modulated in sensory organs and in the body by caffeine. The specific-targeted silencing of some CYP expression in sensory neurons leads to an alteration of caffeine perception, revealing the crucial role of these enzymes in chemoperceptive processes. In parallel, we characterized the caffeine metabolism in Drosophila, and highlighted a direct involvement of CYP6d5 in the degradation of caffeine into theobromine. This work shows for the first time, a direct implication of cytochromes P450 in sensory perception mechanisms and in the metabolism of caffeine in Drosophila.

Les acides aminés ont de nombreuses fonctions dans l’organisme en plus de leur rôle comme constituants élémentaires des protéines. Ils peuvent par exemple servir de neurotransmetteur ou de signal pour l’activation de voies de signalisation intracellulaires. Leur passage à travers la membrane plasmique est facilité par des transporteurs de la famille des protéines SLC. Les transporteurs hétérodimériques d’acides aminés HAT appartiennent aux SLC. Les HAT sont constitués d’une chaîne légère SLC7 assurant la spécificité de transport et d’une chaîne lourde SLC3 impliquée dans l’adressage du complexe protéique à la membrane. Ma thèse a porté sur l’étude du rôle d’un homologue de SLC7 chez la drosophile, Minidiscs (Mnd), dans le fonctionnement du système nerveux. Mnd appartiendrait aux transporteurs du système L, principalement connus pour leur rôle dans la prolifération cellulaire. Mes travaux de thèse ont permis de mettre en évidence la localisation de Mnd dans le cerveau de drosophile dans certains neurones (corps pédonculés, neurones dopaminergiques) et dans certaines cellules gliales (glie corticale). La présence de Mnd dans le cerveau semble intervenir dans la modulation de certains comportements, tels que le réflexe de géotaxie négative. Ces travaux ont aussi montré que, comme les HAT de mammifères, Mnd s’associe de façon covalente à un partenaire protéique. Les expériences de transport semblent par ailleurs confirmer l’appartenance de Mnd au système L.Ces résultats suggèrent que Mnd est probablement impliqué dans la régulation de l’activité neuronale et donc dans le fonctionnement du système nerveux, ce qui n’avait encore jamais été décrit pour un transporteur du système L. / Amino acids have many functions in the body in addition to their role as basic constituents of proteins. They can for example serve as a neurotransmitter or signal for the activation of intracellular pathways. Carriers of the SLC protein family facilitate their path through the plasma membrane. The heterodimeric amino acid transporters HAT belong to SLC proteins. HAT are composed of a light chain SLC7 ensuring the specificity of transport and a heavy chain SLC3 involved in the addressing of the protein complex to the plasma membrane. My thesis focused on studying the role of a SLC7 homologue in drosophila, Minidiscs (Mnd), in the functioning of the nervous system. Mnd might belong to system L carriers, mainly known for their role in cell proliferation. My thesis work led to highlight the location of Mnd in the drosophila brain in some neurons (mushroom bodies, dopaminergic neurons) and some glial cells (cortical glia). The presence of Mnd in the brain seems to be involved in the modulation of some behaviors such as negative geotaxis reflex. This work also showed that, as for mammal HAT, Mnd is associated covalently to a protein partner. Transport experiments seem also to confirm the belonging of Mnd to the system L. These results suggest that Mnd is probably involved in the regulation of neuronal activity and thus in the functioning of the nervous system, which had never been described for a system L carrier.

Les gènes Hox codent des facteurs de transcription à homéodomain (HD). Bien que ce dernier reconnaisse des séquences similaires in vitro, les protéines Hox achèvent des fonctions hautement spécifiques in vivo. Des séquences protéiques en dehors de l’HD influencent la spécificité d’action des protéines Hox par le recrutement de cofacteurs, dont le mieux caractérisé est Extradenticle (Exd) chez la drosophile. Des travaux récents au sein de notre équipe ont démontré la contribution fonctionnelle de trois motifs de AbdA, aussi bien dans des fonctions Exd-dépendantes qu’à des fonctions Exd-indépendantes. Mon travail de thèse a porté sur la caractérisation de la contribution des motifs protéiques de AbdA dans la sélection puis dans la régulation des gènes cibles en utilisant une approche combinée ChIPseq/RNAseq, dans un contexte Exd-indépendant. Le code ADN identifié nous a renseigné sur la présence d’inputs transcriptionnels additionnels. Ces derniers correspondant à des facteurs de transcription déjà connus, leur présence dans un complexe protéique avec AbdA a été démontrée par des analyses de spectrométrie de masse. Un second volet de mon travail de thèse a été l’identification de modifications post-traductionnelles pouvant rendre compte d’un mécanisme de régulation de l’activité des protéines Hox. Des analyses prédictives in silico, confirmées par des approches biochimiques et des analyses in vivo ont démontré la SUMOylation de AbdA. Ces résultats préliminaires posent les bases pour des travaux futures qui auront pour objectif d’identifier les résidus d’AbdA SUMOylés et d’élucider le rôle de cette modification dans la régulation de l’activité de la protéine AbdA. / Hox genes encode homeodomain-containing transcription factors (HD). Although the HD binds to similar DNA sequences in vitro, Hox proteins display a high functional specificity in vivo. Protein motifs outside of the HD influence Hox specificity through recruiting additional cofactors, with the best characterized being Extradenticle (Exd in Drosophila). Recent evidence from our group has uncovered the functional contribution of AbdA intrinsic motifs to AbdA Exd-dependent functions as well as AbdA Exd-independent functions. My PhD work has aimed to characterize the contribution of AbdA motifs to target gene selection and regulation using a combined approach of ChIPseq/RNAseq in an Exd-independent context. The DNA code identified provides us with new insights about additional transcriptional inputs from additional DNA-binding proteins lying in the vicinity of AbdA recognition sites. Mass spectrometry analysis establishes the occurrence of these additional DNA binding proteins in a multi-protein complex with AbdA. Deciphering the involvement of post-translational modifications in the regulation of Hox protein activity was another aspect of my PhD work. In silico predictive analysis, followed by biochemical approaches and in vivo assays reveal the potential for SUMOylation of AbdA as a potentially important regulatory component of AbdA activity. These preliminary results set the bases for further work aimed at identifying SUMOylated residues on AbdA and the functional relevance of such post-translational modification on AbdA activity regulation.

La drosophile se défend contre les infections microbiennes par un ensemble de réponses immunitaires très efficaces comme la synthèse de peptides antimicrobiens. L’expression de ces peptides antimicrobiens est contrôlée par deux voies indépendantes : la voie Toll et la voie IMD. La voie IMD est activée par PGRP-LC, une protéine de la famille PGRP (Peptidoglycan Recognition Protein). PGRP-LF est un régulateur négatif spécifique de la voie IMD. Il a été proposé que cette protéinepourrait agir spécifiquement au niveau du récepteur PGRP-LC, en séquestrant le ligand peptidoglycane (PGN) et en empêchant son accès à PGRP-LC. Mon travail de thèse a été de résoudre la structure des deux domaines PGRP de PGRP-LF, LFz et LFw, dans le but de caractériser le mécanisme de régulation par cette protéine.J’ai exprimé le domaine LFz dans des cellules S2 et le domaine LFw dans des bactéries. J’ai résolu la structure cristallographique de LFz à la résolution de 1.72Å et celle de LFw à la résolution de 1.94Å. Les structures de LFz et LFw montrent qu’elles ne possèdent pas la crevasse de liaison classique des PGRP, et ne peuvent pas interagir avec le PGN. J’ai confirmé ces résultats structuraux par des étudesbiochimiques de liaison des ces domaines à du PGN insoluble. L’aspect de régulation par PGRP-LF, par une séquestration du PGN, n’est donc valide. J’ai cloné et exprimé dans des cellules S2 les protéines PGRP-LCx et PGRP-LCa (partenaire du complexe activateur de la voie IMD) dans le but d’étudier leur interaction avec PGRP-LF. J’ai mis en évidence, par des analyses de résonnance plasmonique de surface, une interaction entre PGRP-LF et PGRP-LCx en absence et en présence duPGN. Ces données nous permettent de proposer un modèle dans lequel PGRP-LF assure la régulation négative de la voie IMD par compétition avec PGRP-LCa pour la liaison au récepteur PGRP-LCx. / The fruit fly defends itself against microbial infections by a set of highly effective immune responses that involve the synthesis of antimicrobial peptides. The expression of these antimicrobial peptides is controlled by two independent pathways: the Toll pathway and the IMD pathway. The IMD pathwayis activated by PGRP-LC, a protein of the PGRP family (Peptidoglycan Recognition Protein). PGRPLF is a specific negative regulator of the IMD pathway. It has been proposed that this protein specifically acts at the receptor PGRP-LC, by sequestering peptidoglycan (PGN) and preventing its access to PGRP-LC. My thesis work aims to solve the structure of the two PGRP domains of PGRPLF, LFz and LFw, in order to characterize the mechanism of regulation by this protein. I have expressed the LFz domain in S2 cells and the LFw domain in bacteria. I have solved the crystalstructure of LFz at 1.72 Å resolution and that of LFw at 1.94Å resolution. Structures of LFz and LFw show they do not possess the classical binding cleft found in others PGRP, and cannot interact with the PGN. I have confirmed these structural results with biochemical studies of binding of these domains with insoluble PGN. The model of regulation by PGRP-LF, by a sequestration of PGN, is no longer valid. I have cloned and expressed in S2 cells PGRP-LCx and PGRP-LCa proteins (partners of theactivating complex of the IMD pathway) in order to elucidate whether there is direct interaction between PGRP LF and one of two isoforms of PGRP-LC. I have demonstrated, through Surface Plasmon Resonance analysis, an interaction between PGRP-LF and PGRP-LCx. Actually, PGRP-LF regulates negatively the IMD pathway by competing with PGRP-LCa to bind to the PGRP-LCx receptor.

Durant ma thèse je me suis intéressé à trois sujets différents connectés par la méchanotransduction au cours du développement. Mon intérêt principal étant porté sur les impacts évolutifs apportés par la méchanotransduction. Mais qu’est-ce que la méchanotransduction ? C’est la conversion d’un stimulus mécanique en une activité biochimique. Ces mécanismes sont présents dans bien des domaines : motilité des cellules, différentiation cellulaire, création de structures. Durant ma thèse je me suis principalement intéressé aux mécanismes de méchanotransduction liés à l’invagination du mésoderme chez la drosophile. Ce mouvement est l’un des tous premiers mouvements morphogénétique et fait partie d’une étape clé du développement qu’est la gastrulation mécanisme commun à toutes les espèces animales. Dans un premier temps je me suis focalisé cette invagination du mésoderme chez la Drosophile. Cette invagination est générée par des accumulations apicales de myosine qui vont entrainer une constriction apicale des cellules. Mon premier travail a été de comprendre et de modéliser ce mouvement en me basant sur le travail effectué dans le laboratoire. En effet il a été prouvé que les contraintes mécaniques entrainent directement l’invagination du mésoderme : par une indentation sur le mésoderme d’embryons incapables de réaliser une invagination on arrive à restaurer cette dernière. La modélisation que j’ai réalisée permet de montrer la plausibilité de réaliser un couplage bio-mécanique afin d’expliquer la formation de cette invagination. Le modèle est composé d’une chaine de cellules couplées mécaniquement entre elles par des jonctions adhérentes. Les cellules sont excitées individuellement par une force sinusoïdale leur taille va donc être modifiée. Grace au couplage certains comportements collectifs vont apparaitre. Pour les cellules associées à certaines conditions génétiques une fois que la taille seuil sera dépassée, la cellule va générer une force de constriction. Comme la cellule se constricte elle va déformer les cellules voisines qui seront plus à même de franchir la taille pallier. Une invagination globale va s’en suivre. Ce modèle reproduit quantitativement la dynamique de constriction des apex et permet de vérifier la possibilité d’obtenir une invagination à partir d’interactions mécaniques entre les cellules. Il permet met aussi en évidence l’importance de l’étude des comportements collectifs qui permettent par différents couplages. Dans une seconde partie j’ai effectué le parallèle entre l’invagination du mésoderme de la drosophile et l’initiation de l’épibolie du poisson zèbre en se focalisant sur le rôle de contraintes mécaniques développées par ces premiers mouvements morpho-génétiques. Ces premiers mouvements vont déterminer la création des différents feuillets et notamment la différentiation des cellules du mésoderme. Ces deux espèces montrent des mécanismes de méchanotransduction communs avec la phosphorylation de la beta-catenin (b-cat) Y667. Cette phosphorylation entraine l’expression de gènes twist (Drosophile) et notail (Danio rerio) nécessaire aux mouvements morphogénétiques. Les expériences réalisées consistent à bloquer les mouvements par l’intermédiaire de drogues (pour le poisson zèbre) ou de mutations (pour la Drosophile) et exercer une déformation mécanique sur les embryons. En l’absence de contraintes mécaniques la betacatenin n’est plus phosphorylée, de ce fait on elle n’est plus présente dans les noyaux ce qui entraine une perte d’expression des gènes twi ou notail. Avec une déformation mécanique alors que les mouvements sont bloqués nous arrivons à réactiver la phosphorylation de la βcat et ré induire l’expression des gènes. Ma contribution majeure pour ces expériences a été la mise en place d’un système magnétique permettant de mimer les mouvements de l’épibolie. (...) / In this thesis, I first focused on the testing of the hypothesis of the mechanotransductive activation of the apical accumulation of Myosin-II (Myo-II) that leads to Drosophila embryos mesoderm invagination, in response to the active cell apex pulsations preceding gastrulation in the mesoderm. This hypothesis was proposed on the basis of previous experiments realized in my host lab, having consisted in the rescue of mesoderm invagination in pulsation and invagination defective mutants, in response to a simple mechanical indent of the mesoderm. Here I demonstrated quantitatively the plausibility of such mechanical trigger of the active apical accumulation of Myo-II leading to subsequent mesoderm invagination, in response to the mechanical strains developed by the endogenous pulsative movements of mesoderm cell apexes, in silico. In a second part, I tested experimentally the role of the mechanical strains developed by the very first morphogenetic movements of zebrafish (Danio rerio) and Drosophila embryos, in the early specification of mesoderm cells identity. Specifically, to test this hypothesis, I developed magnetic biophysical tools to mimic the epiboly morphogenetic movements in epiboly defective zebrafish embryos. We found the beta-catenin (B-cat) Y667 phosphorylation as the common mechano-transductive pathway involved in earliest mesoderm genes expression notail and twist respectively, in response to the very first morphogenetic movements of embryogenesis in both species, epiboly and mesoderm invagination, respectively. This allowed to suggest such mechanotransduction pathway as conserved from the last common ancestor of both species, namely the last common ancestor of bilaterians, therefore possibly involved in the origins of mesoderm emergence in the ancestor, which represents a currently important opened question of evo-devo. In a third part, I developed experiments of mechanical indent of Drosophila embryos germ cells, and demonstrated the production of generational heritable developmental defects induced on at least 3 generations. These experiments suggest accidental mechanical perturbation of germ cells as a putative new motor mode of heritable modulations in the genetic developmental program of embryogenesis, with the molecular mechanism underlying such transmission being currently in progress.

La migration cellulaire joue un rôle essentiel dans le développement des organismes multicellulaires et dans certaines pathologies comme le cancer, où elle permet la formation de métastases. Le trafic vésiculaire est un régulateur clé de la migration cellulaire, notamment en contrôlant la localisation de protéines impliquées dans la migration telles que les intégrines, les cadhérines et les récepteurs transmembranaires. En particulier, notre laboratoire a montré que l'endocytose contrôle l'orientation et la communication cellulaire durant la migration cellulaire collective. Notre hypothèse est que d'autres événements du trafic vésiculaire pourraient aussi être impliqués dans ce type de migration. Ainsi, le but de cette thèse a été de déterminer la fonction des petites GTPases Arf, importantes pour la formation de vésicules et le tri de cargo dans ces vésicules et de leurs régulateurs dans la migration cellulaire collective. Un modèle pour étudier la migration cellulaire collective est les chambres d’œufs de Drosophila melanogaster. En effet, lors de l’ovogénèse, des cellules folliculaires appelées cellules de bordure migrent à travers les cellules nourricières pour atteindre l’ovocyte. Conformément à notre hypothèse, un fort défaut de migration est observé lorsque les Arfs sont déplétées spécifiquement dans les cellules de bordure. De plus, un constat similaire est observé après la déplétion de certains régulateurs des Arfs (ArfGAPs et ArfGEFs). Notamment, nous avons démontré que l’ArfGAP Drongo et sa fonction d'activation de l’activité GTPase sont essentielles pour le détachement initial des cellules de bordure du tissu folliculaire. Drongo promeut le détachement en contrôlant la localisation de la myosine phosphatase afin de réguler l’activité de la myosine II à l’arrière des cellules. De plus, nous avons montré que Drongo agit sur l’Arf de classe III (Arf51F) de manière antagoniste à l’ArfGEF Steppke pour déplacer la myosine phosphatase de l’arrière du groupe de cellules. D’un autre côté, nous avons aussi démontré qu’une autre GAP, ArfGAP1, contrôle la directionnalité de migration. Cette ArfGAP agit potentiellement en régulant la localisation de certains déterminants de la migration tels que l’E-cadhérine et les récepteurs tyrosine kinase. Ainsi, nos recherches ont démontré un rôle essentiel des Arfs ainsi que des rôles spécifiques de deux ArfGAPs dans la migration cellulaire collective. / Cell migration is implicated in various important biological processes, notably it is central for the dissemination of cancer cells. Vesicular trafficking is a key regulator of cell migration, notably by controlling the localisation of proteins involved in migration such as integrins, cadherins and transmembrane receptors. In particular, our laboratory has shown that endocytosis controls orientation and cellular communication during collective cell migration. Our hypothesis is that other events of vesicular trafficking might be implicated in collective cell migration. Thus, the purpose of this thesis was to assess the function of small GTPases Arf, important for vesicle formation and cargo sorting into those vesicles, and their regulators in collective cell migration. A powerful model to study collective cell migration is the migration of follicular cells named border cells during oogenesis in Drosophila melanogaster. Border cells (BCs) detach from the follicle epithelium surrounding the egg chambers and form a small cluster of six to ten cells that migrates invasively between the giant nurse cells that compose the center of the egg chamber, toward the oocyte. Accordingly to our hypothesis, a strong migration defect is observed when the Arfs are depleted specifically in the border cells. Moreover, a similar finding is observed after depletion of some Arfs regulators (ArfGAPs and ArfGEFs). In particular, the ArfGAP Drongo and its GTPase-activating function are essential for the initial detachment of the border cell cluster from the basal lamina. We demonstrated through protein localization and genetic interactions that Drongo controls the localisation of the myosin phosphatase in order to regulate myosin II activity at the back of the cluster and promote border cells detachment. Moreover, we showed that Drongo acts on the class III Arf (Arf51F) antagonistically to the guanine exchange factor Steppke to displace myosin phosphatase from the back of the cluster. On the other hand, we have also demonstrated that the GAP ArfGAP1 controls the directionality of migration. This ArfGAP potentially acts by regulating the localization of certain determinants of migration such as E-cadherin and receptors tyrosine kinase. Thus, our research has demonstrated an essential role for Arfs in collective cell migration and specific contributions of two ArfGAPs in this migration process.