Orientador: Joaquim Mansano Garcia / Coorientador: Fábio Morato Monteiro / Banca: Gisele Zoccal Mingoti / Banca: Ricarda Maria dos Santos / Resumo: As suplementações de bovinos com fontes de ácidos graxos poliisaturados (AGPs) são formas de aumentar o nível energético das dietas, além de possuir efeito na reprodução dos ruminantes. Tendo em vista o exposto idealizouse o presente trabalho com o objetivo de avaliar as condições reprodutivas do pósparto, número de folículos, quantidade de oócitos totais, de viáveis e a PIVE de doadoras primíparas da raça Nelore (Experimento 1) e multíparas da raça Holandesa (Experimento 2) suplementadas com dieta rica em AGPs protegido (Megalac-E®, principalmente de n-6) e não protegido (Linhaça, principalmente de n- 3) durante o pré e pós-parto. No experimeto 1 as doadoras Nelore foram divididas aleatoriamente em 3 grupos, sendo que o grupo controle apresentou 7 fêmeas, o segundo grupo, com 8 animais que foram suplementados com uma fonte de gordura protegida contendo 100g/doadora/dia de Megalac-E® e o terceiro grupo com 7 fêmeas suplementadas com uma fonte de gordura não protegida contendo 1kg/doadora/dia de torta de linhaça. As dietas foram fornecidas por 30 dias pré-parto e 75 dias pós-parto. Estes animais foram submetidos à OPU nos dias 30, 45, 60 e 75 pós-parto. No experimento 2 as doadoras Holandesa foram divididas aleatoriamente em 3 grupos, sendo que o grupo controle apresentava 6 fêmeas, o segundo grupo, com 5 animais que foram suplementados com uma fonte de gordura protegida contendo 100g/doadora/dia de Megalac-E® no pré-parto e 300g/doadora/dia no pós-parto e o terceiro grupo com 5 fêmeas suplementadas com uma fonte de gordura não protegida contendo 1kg/doadora/dia de torta de linhaça no pré-parto e 1,5kg/doadora/dia no pós-parto. As dietas foram fornecidas por 30 dias pré-parto e 60 dias pós-parto. Estes animais foram submetidos à OPU nos dias 30, 45 e 60 pós-parto... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The supplementation of cattle with sources of polyunsaturated fatty acids (PUFA) are ways to increase the energy level of the diet, in addition to having effect on reproduction. The aim of this study were to evaluate the reproductive conditions of the postpartum, number of follicles, aspirates oocytes, amount of viable oocytes and the IVPE of the Nelore primiparous donors (Experiment 1) and Holstein multiparous donors (Experiment 2) supplemented with rich diet in protected PUFA (Megalac-E®) and non-protected (Linseed) during pre and postpartum. In experiment 1 Nelore donors were divided into three groups, the control group with 7 animals, the second group, with 8 animals were supplemented with a source of protected fat contains 100g/donor/day of Megalac-E® and the third group with 7 animals supplemented with a source of unprotected fat contains 1kg/donor/day linseed. The diets were fed for antepartum thirty days and postpartum seventy-five days. These animals were submitted to OPU on days 30, 45, 60 and 75 postpartum. In Experiment 2 Holstein donors were divided into three groups, the control group with 6 animals the second group, with 5 animals were supplemented with a source of protected fat contains 100g/donor/day of Megalac-E® in pre-partum and 300g/donor/day in postpartum and the third group with 5 animals supplemented with a source of fat unprotected contains 1kg/donor/day linseed pre-partum and 1.5 kg/donor/day in postpartum. The diets were fed for antepartum thirty days and postpartum sixty days. These animals were submitted to OPU on days 30, 45 and 60 postpartum. The recovered oocytes from both experiments were selected and the viable oocytes were submitted to procedures of the IVPE. The data from both experiments were analyzed by the method of least squares using variance analysis... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima / Coorientador: Aline Costa de Lucio Prado / Banca: Lúcia Galvão de Albuquerque / Banca: Beatriz da Costa Aguiar Alves Reis / Resumo: Doses de sêmen enriquecidas com espermatozoides portadores do cromossomo X são utilizadas na inseminação artificial (IA) e na produção in vitro de embriões (PIVE). Todavia ensaios de campo, utilizando este tipo de sêmen, demonstraram redução na taxa de prenhez, que pode ser justificada pelas injúrias espermáticas durante o processo de sexagem, além de alterações no DNA, interferindo na expressão de genes paternos, afetando o desenvolvimento embrionário e acarretando perda gestacional após 90 dias. Assim, os objetivos desse trabalho foram: comparar a taxa de clivagem e de blastocistos produzidos in vitro utilizando sêmen convencional e sêmen com espermatozoides sexados por citometria de fluxo e verificar a existência de diferenças na expressão de genes relacionados ao reconhecimento da gestação (AKR1B1, PTGS1, PTGS2, mPGES-1, mPGES-2, TNF-α) em embriões produzidos in vitro utilizando os dois tipos de sêmen. Os embriões bovinos foram produzidos por fecundação in vitro, quarenta e oito horas após a fecundação foi avaliada a taxa de clivagem, e no sétimo dia após a fecundação foi avaliada a taxa de blastocisto. Posteriormente esses blastocistos foram submetidos à extração de RNA para a avaliação da expressão gênica. Não foi observada diferença significativa (P>0,05) para as taxas de clivagem e blastocisto entre os grupos experimentais. Em relação ao padrão de expressão, a citometria de fluxo não alterou os níveis de transcritos dos genes AKR1B1, PTGS1, PTGS2, mPGES-2 e TNF-α sugerindo que embriões produzidos com espermatozoides sexados por citometria de fluxo não possuem alterações prejudiciais em genes envolvidos no reconhecimento da gestação. Porém o gene mPGES-1 foi 4,54 vezes menos expresso nos embriões produzidos com espermatozoides sexados por citometria de fluxo, sugerindo a possibilidade de ocorrência de perda gestacional, pois estudos ... / Abstract: Doses of semen enriched with carriers of X chromosome sperm are used in artificial insemination (AI) and in embryos produced in vitro (PIVE). However, field studies using this type of semen demonstrated a reduction in pregnancy rate, which can be justified by injuries during sperm sexing and alterations in DNA, interfering with the expression of paternal genes affecting embryonic development and resulting in pregnancy loss after 90 days. The aims of this study were to compare the cleavage and blastocyst rates produced in vitro using conventional semen and sexed semen by flow cytometry, and check differences in the expression of genes related to pregnancy recognition (AKR1B1, PTGS1, PTGS2, mPGES-1, mPGES-2, TNF-α ) in embryos produced in vitro using the two types of semen. Bovine embryos were produced by in vitro fertilization, forty eight hours after fertilization the cleavage rate was evaluated, and on the seventh day after fertilization the blastocyst rate was performed. Subsequently, these blastocysts were subjected to RNA extraction for evaluation of gene expression. No significant differences (P>0.05) for cleavage and blastocyst rates between the experimental groups were observed. Related to the expression pattern, the flow cytometry did not alter the transcript levels of AKR1B1, PTGS1, PTGS2, mPGES-2 e TNF-α genes, suggesting that embryos produced with sexed semen by flow cytometry do not have detrimental changes in genes involved in pregnancy recognition. However the mPGES-1 gene was expressed 4,54 times less in embryo produced with sexed semen by flow cytometry, suggesting the possibility of pregnancy loss, since studies suggest that are required levels of expression of mPGES for maintenance and recognition of pregnancy / Mestre

O desenvolvimento de biotecnologia de embriões em animais de produção é prejudicado por perdas no primeiro trimestre da gestação, idade em que o intestino primitivo está sendo estabelecido. O estudo das proteínas contidas no intestino primitivo nesta fase inicial da gestação pode aumentar o conhecimento sobre as vias moleculares envolvidas no desenvolvimento embrionário normal e em perdas de embriões, assim como a sua participação na organogênese e diferenciação celular. Intestino primitivo de embriões de bovinos a partir dos 39 SD ± 4 dias de desenvolvimento (variando de 33 a 45 dias) foram coletados em um matadouro local. As amostras foram processadas e agrupadas para análise proteômica shotgun label-free usando MudPIT (Multidimensional Protein Identification Technology). Análise funcional e de via foram feitas usando FatiGO (www.babelomics.org); Pathway Express (http://vortex.cs.wayne.edu/ ontoexpress) para identificar as ontologias relevantes e vias canônicas ou não-canônicas representada pelas proteínas expressas no Intestino primitivo. Um total de 74 proteínas ou sequências randômicas foram identificadas, correspondentes a 30 proteínas específicas expressas pelo Intestino primitivo bovino. Das 30 proteínas únicas, 21 proteínas foram utilizadas na ontologia e análise de vias. As análises mostraram um enriquecimento de ontologias relacionadas com a ligação (N = 5); atividade catalítica (N = 6); organela intracelular (N = 6). Houve um enriquecimento de ontologias associado às modificações do citoesqueleto; processo de diferenciação celular (N = 3), a migração celular (N = 4) e no metabolismo celular (N = 6). Além disso, a via e a análise de rede mostraram um enriquecimento de vias de comunicação entre células, tais como junções comunicantes e tight e as vias de adesão focal. Além disso, as vias envolvidas no movimento celular (por exemplo, vias de regulação do citoesqueleto de actina e a migração transendotelial de leucócitos) foram extremamente enriquecimento no grupo de proteínas expressas pelo Intestino primitivo bovino. Nossos resultados sugerem que as células do intestino primitivo tem alto perfil migratório e são compostas de células não totalmente diferenciadas, com alto metabolismo celular. A migração e a diferenciação destas células poderiam determinar o destino do embrião em desenvolvimento. Além disso, a compreensão da função e interação de proteínas expressas pelo embrião normal fornecerá informações sobre o impacto das biotecnologias reprodutivas no desenvolvimento do embrião durante a implantação e placentação. / The development of embryo biotechnology in farm animals is hampered by embryo losses in first trimester of gestation, period in which the primitive gut is being established. The study of proteins contained in the primitive gut at this early stage of pregnancy may increase the knowledge about the molecular pathways involved in normal embryonic development and loss of embryos, as well as their involvement in organogenesis and cell differentiation.primitive gut from bovine embryos on day 39 SD± 4 of development (ranging from 33 to 45 days) were collected at a local slaugtherhouse. The samples were processed and pooled for label-free shotgun proteomics analysis using MudPIT (Multidimensional Protein Identification Technology) tandem MSE acquisition. Functional and pathway analysis using FatiGo (www.babelomics.org); Pathway Express (http://vortex.cs.wayne.edu/ ontoexpress) and Ingenuity Pathway Analysis (www.ingenuity.com) were used to identify relevant ontologies and canonical or noncanonical pathways represented by the expressed proteins in the primitive gut. A total of 74 protein sequences were identified corresponding to 30 unique proteins expressed by the bovine primitive gut. out of 30 unique proteins, 21 proteins were used on the ontology and pathway analysis. The ontology analysis showed an enrichment of ontologies related to binding (N=5); catalytic activity (N=6); intracellular organelle (N=6). There was an enrichment of ontologies associated to cytoskeleton modifications; cell differentiation process (N=3); cellular migration (N=4) and cell metabolism (N=6). Furthermore, the pathway and the network analysis showed an enrichment of cell-to-cell communication pathways such as gap and tight junction, and focal adhesion pathways. In addition, pathways involved in cellular movement (regulation of actin cytoskeleton and leukocyte transendothelial migration) were extremely enrichment in the group of proteins expressed by the bovine primitive gut. Our results suggested that the cells from primitive gut have high migratory profile and are composed of not fully differentiated cells with high cellular metabolism. The proper migration and differentiation of these cells would dictate the fate of the developing embryo. Moreover, understanding the function and interaction of proteins expressed by normal embryo will give clues of the impact of the reproductive biotechnologies in embryo development during the window between implantation and placentation.

In recent years, in dairy cattle, while it was observed a gradual increase in productivity, a decrease occurred in the reproductive efficiency. Several factors, such as increased incidence of diseases, higher susceptibility to heat stress and increase of dry matter intake, have been awarded as possible causes for the decrease in fertility. Increased dry matter intake is associated with increased liver blood flow, which is associated with an increase in liver metabolism of steroid hormones. Given the high metabolism of steroid hormones in high producing dairy cows, six studies were carried out, which in this thesis are divided in three chapters, involving hormone supplementation in lactating dairy cows. The first study aimed to increase the synchronization rate of dairy cows submitted to a fixed time artificial insemination (FTAI) estradiol (E2)/progesterone (P4)-based protocol. For this purpose, two experiments were performed, the first (n = 44 cows) compared a 2.0 vs 3.0 mg of estradiol benzoate (EB) associated to a P4 implant at the beginning of the protocol. The second experiment (n = 82 cows) performed presynchronization with GnRH prior to the onset of a FTAI protocol to produced different follicular development stages at the time of E2/P4: emergence vs. dominance. Daily ultrasound and hormone evaluations were performed. Other four experiments are described in the second (n = 1070 cows) and third (n = 1498 cows) chapter, which have been developed to evaluate the effect of P4 supplementation after ovulation in lactating dairy cows. In general, these studies evaluated the effect of supplementation on the corpus luteum (CL) development and function, mRNA abundance for interferon stimulated genes (ISG), on fertility of cows subjected to AI after estrus detection or FTAI protocol, or to embryo transfer. Increasing the EB dose from 2.0 for 3.0 mg did not improve emergence wave synchronization. In fact, it induced luteolysis in a larger number of cows. Altering the stage of the estrous cycle of the cows at the beginning of the E2/P4-based FTAI protocol did not improve synchronization of wave emergence. Post ovulation P4 supplementation did not affect CL development and function, and did not increase the mRNA abundance for ISG. Cows subjected to AI after estrus detection or after an E2/P4-based FTAI protocol did not have increased fertility. However when P4-supplemented cows were subjected to a GnRH-based FTAI protocol there was an improvement in the fertility of about 8%. Thus, we can concluded that regardless of the EB dose or stage of the estrous cycle at beginning of the E2/P4-based FTAI protocol, still there are cows that fail to have a synchronized emergence of a new wave and/or to ovulate at the end protocol. Additionally, depending on the protocol used, P4 supplementation may increase the fertility of dairy cows, but compromises the fertility when embryos are transferred. / Nos últimos anos, em rebanhos leiteiros, foi observado um aumento acentuado da produtividade acompanhado de uma diminuição da eficiência reprodutiva das vacas lactantes. Diversos fatores, como o aumento da incidência de doenças, da suscetibilidade ao estresse térmico e da ingestão de matéria seca, têm sido atribuídos como possíveis causas para esse decréscimo na fertilidade. Aumento da ingestão de matéria seca está associado maior fluxo sanguíneo hepático, que por sua vez está relacionado com aumento da metabolização hepática de diversas moléculas, entre elas os hormônios esteroides. Tendo em vista o alto metabolismo destes hormônios nas vacas leiteiras, foram realizados seis estudos, que na presente tese estão divididos em três capítulos, envolvendo suplementação hormonal em vacas leiteiras lactantes. O primeiro capítulo teve como objetivo aumentar a taxa de sincronização de vacas leiteiras ao protocolo de inseminação artificial em tempo fixo (IATF) à base de estradiol (E2)/progesterona (P4). Para isso foram realizados dois experimentos, sendo o primeiro (n = 44 vacas) utilizando dose de 2.0 ou 3.0 mg de benzoato de estradiol (BE) associado a um dispositivo de P4, no início do protocolo. No segundo (n = 82 vacas), foi realizada uma pré-sincronização com GnRH para iniciar o protocolo de IATF em diferentes estágios foliculares: recrutamento vs. dominância. Avaliações ultrassonográficas e dosagens hormonais foram feitas. Outros 4 experimentos, descritos no segundo (n = 1070 vacas) e no terceiro (n = 1498 vacas) capítulo, foram desenvolvidos para avaliar o efeito da suplementação de P4 após a ovulação em vacas leiteiras. Nesses estudos, foram avaliados os efeitos desta suplementação na formação e função do corpo lúteo (CL), na expressão de genes estimulados por interferon (ISG), na fertilidade de vacas submetidas a IA, através da observação de estro ou de protocolo de IATF, e em receptoras de embrião. A dose de 3.0 mg de BE, além de não aumentar a taxa de sincronização da emergência de uma nova onda folicular, induziu luteólise em um maior número de vacas que a dose de 2.0 mg. Independente da fase do ciclo estral, no início do protocolo a base de E2/P4, houve falhas na indução na sincronização da emergência e de ovulação. A suplementação com P4 após a ovulação não alterou a formação e função do CL, mas também não aumentou a expressão de ISG. Vacas submetidas a IA após detecção de estro ou submetidas à IATF em protocolos a base de E2/P4 não apresentaram aumento na fertilidade, no entanto quando submetidas ao protocolo de IATF à base de GnRH foi observado em torno de 8% de incremento de fertilidade. Contudo, receptoras de embrião suplementadas com P4 tiveram menor fertilidade. Assim, concluiu-se que independente da dose de EB ou do momento do ciclo estral em que se inicia o protocolo de IATF à base de E2/P4 há falhas de emergência de uma nova onda e/ou de ovulação ao final do protocolo. Além disso, dependendo do protocolo utilizado, a suplementação com P4 pósovulação pode aumentar a fertilidade de vacas submetidas à IATF, contudo compromete a fertilidade de receptoras de embrião.

Inadequate uterine environment is one of the main causes of pregnancy failure in cattle. Progesterone (P4) supplementation during early diestrus may either induce a receptive uterine status or shorten luteal lifespan and reduce fertility. Regulation that leads to either outcome is currently unclear. In this thesis, four studies were conducted to test the main hypothesis that the pre-implantational conceptus plays a major role on preventing P4-luteolytic effects in Bos indicus beef cows, due the supplementary P4. In a fifth study the importance of the uterine luminal milieu on the establishment of pregnancy was evaluated. P4 was supplemented by injecting 150 mg of long acting injectable P4 (iP4) on 3 days post-ovulation. In the last study, uterine luminal flushings were performed on days 1, 4 and/or 7 post-estrus, aiming to deplete the uterine milieu. In this thesis, we evidenced that uterus played a key role on determining the iP4-luteolytic response. In this sense, first study revealed that higher uterine exposure to estradiol (E2) during pre-ovulatory period prevented P4-luteolytic effect, but did not increase overall pregnancy outcome. Further analysis, revealed that optimal uterine estradiol exposure is required for beneficial effects of iP4. Cows with large preovulatory follicle or with small follicle, but exposed to the exogenous estradiol presented higher pregnancy rates. Next, we demonstrated that iP4 hindered CL formation, but this had a minor impact on iP4-induced luteolysis. About half of iP4 supplemented cows presented early luteolysis, which occurred by day 15 post-ovulation. Role of the embryo to inhibit iP4-induced early luteolysis relied on its capability to establish pregnancy. In the third study, we demonstrated that iP4-inhibition of growth of the first-wave dominant follicle was related to early luteolytic onset, and this was independent of number of waves in the cycle (two vs. three). Three-wave cycles favored embryonic capacity to inhibit early luteolysis. In the fourth study, we failed to demonstrate that P4 supplementation supported embryonic survival. This was despite of the transfer of 5 embryos to each recipient cow to maximize embryonic signaling. In the last study we disturbed the composition of the uterine environment and negatively affected, but did not abolish, embryonic survival. Overall, from the results obtained in the course of this thesis, we conclude that variability in fertility rates after P4 supplementation, are in part attributable to the complexity of uterine function programming by sex steroids, rather than caused by the incidence of early luteolysis. Furthermore, we highlighted that a sub-optimal composition of the uterine environment is a major contributor to embryonic losses in beef cattle. / Um ambiente uterino deficiente é uma das principais causas de falha gestacional em bovinos. A suplementação com progesterona (P4) durante o diestro inicial estimula a receptividade uterina, mas também pode encurtar a fase luteal, prejudicando a fertilidade. Os fatores que levam a um dos dois resultados não são claros. Nesta tese, quatro estudos foram conduzidos para testar a hipótese principal de que o concepto pré-implantacional bloqueia o efeito luteolítico antecipado causado pela P4 suplementar. Em um quinto estudo, avaliou-se a importância do ambiente uterino no estabelecimento da gestação. A suplementação com P4 foi realizada pela administração de 150 mg de P4 injetável (iP4) de longa ação 3 dias após a ovulação. No último estudo, lavados uterinos foram coletados nos dias 1, 4 e/ou 7 após o estro, com o objetivo de depletar o ambiente uterino. Nestes estudos, o útero desempenhou um papel crucial na determinação da resposta luteolítica da iP4. O primeiro experimento demonstrou que a exposição uterina a maiores concentrações de estradiol (E2) durante o período pré-ovulatório bloqueou efeito luteolítico da iP4, mas não resultou em incremento na taxa de prenhez. Análises complementares revelaram que a suplementação de iP4 teve efeito positivo na fertilidade quando houve uma ótima exposição do útero ao E2 pré-ovulatório. Vacas com maiores folículos pré-ovulatórios ou com pequenos folículos, mas suplementadas com estradiol exógeno, apresentaram maiores taxas de prenhez. A exposição sub-ótima ou exagerada ao E2 foi deletéria ao efeito embriotrófico da P4. Em seguida, demonstramos que a iP4 prejudicou o desenvolvimento luteal, porém, esse não foi o principal fator relacionado com a antecipação da luteólise. Aproximadamente metade das vacas suplementadas com iP4 apresentaram luteólise precoce, que ocorreu no dia 15 após a ovulação. O efeito do embrião sobre o processo luteolítico antecipado foi dependente da sua capacidade de estabelecer a gestação. No terceiro estudo, verificamos que a redução do desenvolvimento do folículo dominante da primeira onda esteve associado à ocorrência de luteólise precoce, e isso foi independente do número de ondas no ciclo (dois vs. três). No entanto, ciclos de três ondas favoreceram a capacidade embrionária de inibir a luteólise precoce. No quarto estudo, nós não evidenciamos um efeito embriotófico da iP4 reduzindo a mortalidade embrionária, mesmo quando 5 embriões foram transferidos para cada receptora, com objetivo de maximizar a sinalização embrionária. No último estudo, a composição do ambiente uterino foi alterada por lavagens uterinas e isso afetou negativamente a prenhez, porém não aniquilou as chances de sobrevivência embrionária. A partir dos resultados obtidos nessa tese, concluímos que a variabilidade nas taxas de fertilidade após a suplementação com P4 é, em grande parte, determinada pela complexidade na programação da função uterina pelos hormônios ovarianos, em vez de ser causada pela incidência de luteólise precoce. Além disso, concluímos que uma composição sub-ótima do ambiente uterino é um dos principais contribuintes para as perdas embrionárias em bovinos de corte.

O objetivo deste estudo foi avaliar a viabilidade in vitro e in vivo de embriões bovinos reconstruídos com oócitos enucleados em Metáfase II e núcleos de células somáticas (fibroblastos) fetais e adultas. Para tanto, oócitos de ovários colhidos em matadouro foram maturados in vitro por 17 horas e enucleados pela remoção do primeiro corpúsculo polar (CP) e da região do oolema contendo a placa metafásica. Como núcleo doador, foram utilizados fibroblastos de orelha de vaca da raça Nelore e de feto colhido em abatedouro. Para a reconstrução dos embriões, cada célula doadora de núcleo, após indução à G0, foi inserida sob a zona pelúcida de cada oócito enucleado e o complexo citoplasma receptor - núcleo doador (CCN) fundido e ativado por eletrofusão (2 pulsos de 4 KV/cm durante 20µs). Após ativação elétrica, cada CCN foi incubado em solução de ciclohexemide (10µg/ml) e citocalasina D (2,5µg/ml) por 1 hora e, em seguida, em solução de ciclohexemide (10µg/ml) por mais 4 horas. Os embriões reconstruídos e ativados, assim como os fecundados in vitro (controle), foram co-cultivados em monocamada de células da granulosa e TCM 199 acrescido de 10% de SFB por 7-9 dias. Após o co-cultivo por 7-9 dias, parte dos embriões (controle e reconstruídos) foi fixada e corada para determinação do número de células e parte transferida para receptoras. Um total de 668 embriões foram reconstruídos com célula fetal e 569 com fibroblasto adulto. Após eletrofusão, 212 embriões reconstruídos com célula fetal e 181 com célula adulta fundiram e 32 (15,1%) e 30 (16,6%) atingiram o estádio de blastocisto, respectivamente. O número médio de células dos blastocistos foi 129,3, 101,3 e 114,3, respectivamente, para célula fetal, adulta e embriões FIV (controle), não havendo diferença estatística significante entre os grupos (P<0,05). Após a transferência de 18 blastocistos de célula fetal e 21 de célula adulta, as taxas de prenhez aos 90 dias foram 16,7% (3) e 19% (4), respectivamente, não havendo diferença estatística significante entre os grupos (P<0,05). A primeira prenhez com célula fetal deu origem a um bezerro saudável, aos 290 dias, pesando 34kg. Uma das receptoras morreu aos 229 dias de gestação em conseqüência de hidroalantóide e outra abortou aos 252 dias. As prenhezes de embriões reconstruídos com célula adulta ainda estão em andamento. Estes resultados indicam que fibroblastos fetal e adulto podem ser usados como doadores de núcleo com semelhantes taxas de desenvolvimento in vitro e in vivo. / The aim of this study was to evaluate the in vitro and in vivo viability of bovine nuclear transferred embryos from metaphase II oocytes and fetal and adult fibroblasts. Oocytes from ovaries collected at slaughterhouse were matured in vitro for 17 hours and enucleated after aspiration of first polar body (PB) and small volume of cytoplasm containing metaphase plate. Fibroblasts from Nelore cow and foetus collected at slaughterhouse were used as nuclei donor. In Nuclear Transfer, each nuclei donor cell, after serum starvation, was inserted under the zona pellucida of the each enucleated oocyte and the enucleated oocyte- nuclei donor cell complexes were electrofused and activated (2 pulses of 4KV/cm for 20µs). After electrical activation, the couplets were incubated in TCM199 plus 10% FCS supplemented with cycloheximide (10µg/ml) and cytochalasin D (2.5µgml) for 1 hour and cycloheximide alone for further 4 hours. The activated reconstructed embryos, as well as IVF embryos (control group), were co-cultured with granulosa cells in TCM 199 + 10% FCS for 7–9 days. After co-cultured, part of embryos (control and reconstructed) was fixed and the number of cells counted and part was transferred into recipients. A total of 668 couplets were reconstructed from fetal and 569 from adult fibroblasts. After electrofusion, 212 (fetal cells) and 181 (adult cells) embryos got fused and 32 (15.1%) and 30 (16.6%) reached blastocyst stage, respectively. The blastocyst cell number means were 129.3, 101.3 and 114.3, respectively, for fetal, adult and IVF (control) embryos. There was no significant difference (P<0.05) in the number of cells of blastocysts among the groups. After transferring 18 (fetal cells) and 21 (adult cells) blastocysts, pregnancy rates at day 90 were 16.7% (3) and 19% (4), respectively. There was no significant difference (P<0.05) between pregnancy rates. The first pregnancy from fetal cells delivered a healthy male calf at day 290, weighting 34kg. One of the remaining recipients died with hydrallantois at day 229 and the other aborted at day 252. The pregnancies of adult cells reconstructed embryos are still in course. These results indicated that fetal and adult fibroblasts could be used as nuclei donor, with similar rates of in vitro and in vivo developments.

Diferentes técnicas e metodologias foram utilizadas no estudo do desenvolvimento do sistema nervoso, analisando como modelos experimentais, entre outros, o embrião do \"Gallus domesticus\" e embriões de diferentes anfíbios. Com o advento do microscópio eletrônico de varredura (M.E.V.) pode-se, com certas limitações, efetuar uma análise tridimensional de estruturas biológicas. Portanto, utilizando o M.E.V., neste trabalho apresentamos nossas observações sobre o desenvolvimento inicial do tecto óptico do embrião de \"Gallus domesticus. / Different techniques and methods were used in the study of the development of the nervous system, analyzing how experimental models, among others, the embryo of \"Gallus domesticus\" and embryos of different amphibians. With the advent of the scanning electron microscope (SEM) can be, with certain limitations, make an analysis of three-dimensional structures. Therefore, using the SEM, in this paper we present our observations on the initial development of the embryo optical roof of \"Gallus domesticus.

A síntese dos hormônios esteroides é feita através da ação de um complexo enzimático chamado citocromo P450. As enzimas 3&#946;-HSD (3&#946;-hidroxiesteroide desidrogenase), P450c17 (citocromo P450 17&#945;-hidroxilase/17,20-liase) e P450arom (citocromo P450 aromatase), fazem parte desse complexo e são responsáveis pela síntese dos hormônios progestágenos, andrógenos e estrógenos, espectivamente. Essas enzimas já foram identificadas em inúmeros tecidos, inclusive em embriões em período pré-implantação. Por isso, acredita-se que o blastocisto seja uma fonte de produção de progesterona e estrógeno, hormônios essenciais para implantação e manutenção da gestação. Em roedores, as informações sobre a capacidade esteroidogênica dos embriões são controversas e também restritas apenas a estudos com espécies laboratoriais. Para trazer mais informações sobre a capacidade esteroidogênica em blastocistos de roedores utilizamos o preá (Galea spixii), uma espécie de roedor silvestre encontrada nas regiões de Caatinga e Semiárido do Nordeste brasileiro e muito utilizado na alimentação de famílias de baixa renda como fonte proteica. Diante o exposto, o objetivo deste trabalho é fazer um apanhado histórico sobre os dados publicados a cerca da capacidade dos embriões de diversas espécies de produzir os hormônios esteroides além de identificar e quantificar a expressão das enzimas esteroidogênicas em embriões de preá através das técnicas de imunohistoquímica e PCR em tempo real. As análises morfológicas indicam que o desenvolvimento inicial do preá se assemelha com os demais roedores, porém o tempo de desenvolvimento difere das espécies usadas em laboratório. As marcações da imunohistoquímica foram positivas nos tecidos maternos, mas os embriões não tiveram marcação para nenhuma das três enzimas do estudo. No entanto, os dados obtidos pelo PCR indicam que os genes CYP11, CYP17 e CYP19 foram expressos nos embriões e, portanto, o concepto de G. spixii tem capacidade de produzir hormônios esteroides, assim como visto em várias outras espécies que já foram estudadas / The synthesis of steroid hormones is made through the action of an enzyme complex called cytochrome P450. 3&#946;-HSD (3&#946;-hydroxysteroid dehydrogenase), P450c17 (cytochrome P450 17 &#945;-hydroxylase/17,20-lyase) and P450arom (cytochrome P450 aromatase), are present in this complex and are are responsible for the synthesis of progestins, androgens and estrogens hormones, respectively. These enzymes have been identified in numerous tissues, including embryos in pre-implantation period. Therefore, it is believed that the blastocyst is a source of production of progesterone and estrogen, hormones essential for the implementation and maintenance of pregnancy. In rodents, the information about the steroidogenic capacity of embryos are controversial and confined to studies with laboratory species. To get more information about the steroidogenic capacity in blastocysts of rodents we used the spix yellow-toothed cavy (Galea spixii), a species of wild rodent found in the northeastern of Brazil, and used in the feeding of low-income families as a source of protein. On the above, the aim of this work is to make a historic about the data published about the ability of embryos of various species to produce steroid hormones and identify and quantify the expression of steroidogenics enzymes in embryos of spix yellow-toothed cavy by immunohistochemical and real-time PCR techniques. The morphological analyses indicate that the G. spixii early development resembles other rodents, but development time differs from the species used in laboratory. The immunohistochemical stainning was positive in maternal tissues, but the embryos did not have stainnig for any of the three enzymes of the study. However, the data obtained by PCR indicate that CYP11, CYP17 and CYP19 genes were expressed in embryos and, therefore, the concept of G. spixii has capacity to produce steroid hormones, as seen in several other species that have been studied

A implantação embrionária determina eventos biológicos de fundamental importância para o desenvolvimento do embrião e para o sucesso da gestação. O fator de inibição de migração de macrófagos (MIF) é uma das muitas citocinas que atuam durante a gestação, desempenhando múltiplas funções biológicas e atividades pró-inflamatórias, em resposta a infecções ou à presença de toxinas bacterianas e estresse. Este estudo investigou a expressão de MIF na interface materno-placentária em condições infecto-inflamatórias simuladas no organismo materno pela administração de LPS de Escherichia coli, período imediatamente após a implantação embrionária. Na primeira etapa foi administrado LPS nas doses de 0,06, 0,1, 0,2 e 0,3 <font face=\"Symbol\">mg/g de peso corporal aos 7,5 dias de gestação e o perfil gestacional foi analisado. Na segunda etapa a dose mais adequada (de 0,1 <font face=\"Symbol\">mg/g) foi administrada e a gestação interrompida 30 minutos, 1, 3 e 6 após. Com esta dose observou-se diminuição o padrão de expressão protéica de MIF durante as 6 horas seguintes ao estímulo com LPS, enquanto que a expressão gênica permaneceu estável, aumentando significativamente apenas após 6 horas de tratamento. / The embryo implantation determines biological events essential for embryo development and the success of pregnancy. The macrophage migration inhibitory factor (MIF) is one of many cytokines that act during pregnancy, playing multiple biological functions and pro-inflammatory activities in response to infection or the presence of bacterial toxins and stress. This study investigated the expression of MIF in the maternal-placental interface in infectious and inflammatory conditions simulated in the mother by the administration of LPS from Escherichia coli, on the period immediately after embryo implantation. In the first step LPS was administered at doses of 0.06, 0.1, 0.2 and 0.3 <font face=\"symbol\">mg / g body weight at 7.5 day gestation and pregnancy profile was analyzed. In the second step the more appropriate dose (0.1 <font face=\"symbol\">mg / g) was administered 30 minutes and stopped pregnancy, 1, 3 and 6 after. At this dose there was a decrease in the pattern of protein expression of MIF during the 6 hours of stimulation with LPS, while the gene expression remained stable, significantly increasing only after 6 hours of treatment.

O arsênio inorgânico, um contaminante ambiental, produz uma série de respostas de estresse em células de mamíferos, incluindo o comprometimento da função mitocondrial, acompanhado por inibição do crescimento celular e carcinogênese. Como previamente identificamos efeitos deletérios do comprometimento da função mitocondrial e dos radicais livres do oxigênio na oogênese, investigamos os efeitos do arsenito na meiose, no desenvolvimento embrionário pré-implantação e na apoptose embrionária em camundongos. Camundongas com 6 semanas de idade foram tratadas com baixa (0,16 mg) ou média dose de arsenito (0,32 mg), por meio de 7 injeções intraperitoneais, 1 a cada 2 dias, durante 14 dias. Os controles foram injetados com solvente. A incidência de anomalias meióticas, caracterizadas por anormalidades do fuso celular e/ou mal alinhamento cromossômico, foi significantemente aumentada tanto nos oócitos in vivo ovulados, como nos in vitro maturados, oriundos dos animais tratados com arsenito. Foram detectadas reduções significativas das taxas de clivagem (24 horas de cultivo), de formação de mórula (72 h) e de desenvolvimento para blastocisto (96 h), nos embriões dos grupos tratados com arsenito. Apesar do número total de núcleos não ter diferido significativamente entre os blastocistos dos grupos controle e de tratamento, a percentagem de núcleos apoptóticos foi significantivamente maior nos blastocistos derivados dos animais tratados com a dose média de arsenito. Estes dados sugerem que o arsenito causa aberrações meióticas, que podem contribuir tanto para o comprometimento do desenvolvimento embrionário pré-implantação, como para a apoptose embrionária. / Inorganic arsenic, an environmental contaminant, produces a variety of stress responses in mammalian cells, including mitochondrial uncoupling accompanied by growth inhibition and carcinogenesis. Because previously we identified detrimental effects of mitochondrial uncoupling, and reactive oxygen species (ROS) on oogenesis, we investigated effects of arsenite on meiosis, early embryo development, and apoptosis in mice. Six-week-old CD-1 mice were treated with either low (0.16mg) or medium (0.32mg) doses of arsenite every two days by 7 intraperitoneal injections for 14 days, and controls were injected with solvent. The incidence of meiotic anomalies, characterized by spindle disruption and/or chromosomal misalignment or spreading, was significantly increased in both in vivo and in vitro treated oocytes. Further, we found a significant decrease in cleavage rates at 24h, morula formation at 72h, and development to blastocyst at 96h in treated groups. Although the total number of nuclei in developed blastocysts did not significantly differ between the treated and control groups, the percentage of apoptotic nuclei was significantly increased in blastocysts derived from the medium dose treated group. These data suggest that arsenite causes meiotic aberrations, which may contribute to decreased cleavage and preimplantation development, as well as increased apoptosis.