Made available in DSpace on 2016-05-02T13:55:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Anamara Pereira-dissertacao.pdf: 389525 bytes, checksum: 922d90f0f23895fadffc69b9c910db8f (MD5) Previous issue date: 2012-10-25 / Fundacao de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / The objective was to evaluate and compare the effects of genetic group of the donor and climatic variables on results of in vitro embryo production in cattle donors. 2313 results of follicular aspiration were used, which 961 in females of the subspecies Bos taurus taurus and 1352 from donors in the subspecies Bos taurus indicus. The management regime of the animals was the semi-confinement, and the mineral supplementation was ad libitum. The follicular punctures were performed by the same technician, with intervals of at least thirty days. We used ultrasound equipped with intravaginal microconvex sector transducer 5 to 7.5 MHz. All follicles larger than 3 mm were identified and punctured. The cumulus oocyte complexes (COCs) recovered were transferred to plates containing culture medium 60x15mm flush where DPBS were selected, counted and sorted based on their morphological appearance. After their arrival at the laboratory of Biotran Company, the oocytes were transferred to plates where they remain until complete maturation period of 24 hours. The semen used in vitro fertilization (IVF) was thawed at 35°C and evaluated for motility and vigor. IVF was performed after 18 hours in a controlled atmosphere incubator. After seven days of fertilization, the embryos were evaluated in each group. Donors of zebu had higher average recovery of viable and total oocytes and of embryo production in relation to taurus respectively (6.9 vs. 13.2, 11.6 vs. 20.4 and 1.6 vs. 4.0, P <0.05). Whereas genetic groups together will reveal differences in embryo production and total conversion of viable oocytes embryos at different times of the year, only the best conversion trend of embryos in winter (24.37 ± 1.85) compared to summer (20.84 ± 1.57). The average total conversion of oocytes was higher in embryo zebu (23.5 vs. 30.6 - P <0.0001). Conversions differed in all months (P <0.05) between taurus and zebu cattle, except in the month of May. In taurus females, conversion rates behaved similarly throughout the year, no differences were observed. We conclude that zebu cows produce more total and viable oocytes than the taurus cows, and that the production of embryos is higher in zebu cows, not only because of the increased production of oocytes, but also because of the best conversion rate. There was no seasonal variation in the production of viable and total oocytes and embryos in cows of European origin. Zebu cows produce fewer embryos during the colder periods of the year, especially in the months of April and May. / Objetivou-se comparar a distribuição dos resultados da PIVE ao longo dos meses do ano em doadoras de diferentes grupos genéticos bovinos. Foram utilizados 2.309 resultados de aspirações foliculares, sendo 960 em fêmeas das subespécies Bos taurus taurus e 1349 em doadoras das subespécies Bos taurus indicus. O regime de manejo dos animais foi o semiconfinamento, e a suplementação mineral ad libitum. Utilizou-se aparelho de ultrassonografia, equipado com transdutor setorial microconvexo intravaginal de 7,5 MHz. Todos os folículos com diâmetro superior a 3 mm foram identificados e puncionados. Os Complexos Cumulus Oócitos (CCOs) recuperados foram transferidos para placas de cultivo 60x15mm contendo meio DPBS Flush onde foram selecionados, contados e classificados com base em seu aspecto morfológico. Os oócitos iniciaram seu desenvolvimento in vitro (Maturação, Fertilização e Cultivo), em situações que simulam artificialmente todos os processos biológicos do aparelho reprodutor da fêmea doadora bovina. As doadoras zebuínas apresentaram maior recuperação média por OPU de oócitos viáveis, totais e produção de embriões em relação aos taurinos respectivamente (6,9 vs 13,2; 11,6 vs 20,4 e 1,6 vs 4,0 ; P<0,05). Considerando os grupos genéticos em conjunto, foram observadas diferenças na produção de embriões totais e na conversão de oócitos viáveis a embriões nas diferentes épocas do ano, apenas tendência à melhor conversão de embriões no inverno (24,4 ± 1,8) em relação ao verão (20,8 ± 1,6). A taxa média total de conversão de oócitos em embriões foi maior em zebuínas (23,5 vs 30,6 - P<0,0001). As conversões diferiram em todos os meses (P<0,05) entre zebuínos e taurinos, exceto no mês de maio. Nas fêmeas taurinas, as taxas de conversão se comportaram de maneira semelhante ao longo do ano, não sendo observadas diferenças. Conclui-se que vacas zebuínas produzem mais oócitos viáveis e totais que vacas europeias, que a produção de embriões é maior em vacas zebuínas, não somente pela maior produção de oócitos, mas também pela melhor taxa de conversão. Não houve variação sazonal na produção de oócitos viáveis e totais e embriões nas vacas de origem europeia. Vacas zebuínas produzem menos embriões nos períodos mais frios do ano, principalmente nos meses de abril e maio.

Orientador: Anthony César de Souza Castilho / Resumo: A fim de mimetizar melhores condições do sistema in vivo, um meio de cultura mais proximo à composição do fluido do oviduto foi criado, denominado fluido ovidutal sintético (SOF), este foi formulado com base na análise bioquímica do oviduto das ovelhas. In vivo os momentos finais de maturação oocitária ocorrem em contato com o FO, já in vitro a maturação oocitária é realizada com protocolos de maturação 24h sem nenhuma alteração no meio de maturação. Portanto, o presente estudo investigou o impacto do meio de cultivo SOF durante as últimas quatro horas da maturação in vitro (MIV) e seus efeitos sobre a progressão meiótica e taxa de produção embrionária. Para tanto, os CCOs foram recuperados de ovário de vacas abatidas e maturados in vitro, nos seguintes grupos: SFB/ SFB; SFB/ SFB+SOF; BSA/BSA; BSA/BSA+SOF, todos submetidos há uma troca total de meio nas últimas quatro horas de maturação, adicionando o meio SOF de acordo com os grupos citados anteriormante. Os CCOs maturados foram fertilizados e cultivados em atmosfera e umidade controlada até o estágio de blastocisto (7 e 8 dias após a fertilização). A análise estatística foi realizada transformando os dados em arcoseno e as médias foram comparadas pelo teste T usando JMP (software JMP, SAS Institute Cary, NC). Diferenças significativas foram consideradas quando p≤ 0,05. O resultado obtido mostrou que o tratamento com SOF não tem efeito na progressão da meiose (p= 0,5944). Entretanto, quando analisamos as taxas embrionárias e... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The oviduct and its secretion, the ovidutal fluid (OF), promote an adequate environment for the final maturation of the oocyte, sperm training, fertilization, transport and initial development of the embryo. In this context, in order to mimic better conditions of in vivo mechanisms, a culture medium similar to the composition of the oviduct fluid, called synthetic ovidutal fluid (SOF), was formulated based on biochemical analysis of the oviduct of sheep. Specifically, regarding the importance of OF for the final maturation of the oocyte in cattle, only the last four hours of oocyte maturation occur in the oviduct, which therefore pemits a new strategy of oocyte maturation in vitro (MIV) in the bovine species. Therefore, the present study aimed to investigate the impact of SOF culture medium during the last four hours of IVM and its effects on the meiotic progression and embryonic production rate. Therefore, the COCs were recovered from ovaries of slaughtered and matured cows in vitro, in base medium (composed of 199 MCT with Earles salts supplemented with pyruvate, amicacin, BSA, follicle stimulating hormone and luteinizing hormone, and another group in 199 MCT medium with Earles salts supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), pyruvate, both in moist atmosphere at 5% CO2 for 20 hours (4 replicates with 20 COCs/group). In the last four hours of maturation, the medium was completely changed by adding the SOF medium. Matured COCs were fertilized and cultivated in a control... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

O desenvolvimento embrionário é o resultado de uma sequência controlada de eventos modulados por sinais ambientais e mecanismos intracelulares. Em Hymenoptera, esse processo tem um caráter especial devido ao sistema de determinação do sexo (Haplodiploide). Neste sistema, os ovos fecundados se desenvolvem em fêmeas (diploides) e os ovos não fecundados em machos (haploides). Assim, eventos importantes, como a ativação do ovo e transição materno-zigótica, eventos iniciais da embriogênese, são elementos-chave para compreender o desenvolvimento de ambos os tipos de embriões. Ativação do ovo é um evento complexo acionado em resposta a estímulos externos, necessários para o início da embriogênese. Em abelhas a ativação ovo ocorre independentemente da fecundação e parece ser desencadeado durante a passagem pelo trato reprodutivo da mãe. Além disso, se o ovócito não for fecundado ele irá se desenvolver em um organismo haploide. No entanto, se o ovo recebe o espermatozóide até 30 minutos depois da ativação, o ovo se desenvolve em um organismo diploide. Em Drosophila, a ativação do ovo é também idependente da fecundação. O estímulo inicial que desencadeia o desenvolvimento é devido tensões mecânicas sofridas pelo ovócito durante a ovulação pela passagem através do trato reprodutivo. Neste modelo, o primeiro sinal de ativação inclui a ativação da via dependente de cálcio. Moléculas maternas que são incorporados no ovócito durante ovogênese, atuam durante a ativação do ovo, bem como no início da embriogênese. Os eventos iniciais da embriogênese também são caracterizados pela ausência de altos níveis de transcrição zigótica. As moléculas depositadas atuam na ativação do ovo, quebrando a dormência da divisão celular permitindo a ocorrência do início do desenvolvimento embrionário. Mas, o embrião em desenvolvimento gradualmente degrada e substitui essas moléculas herdadas da mãe, em um processo conhecido como transição materno-zigótica. Nosso principal objetivo foi o entendimento da comunicação entre as moléculas herdadas e as recém produzidas durante os primeiros passos do desenvolvimento de Apis mellifera. Para alcançar nosso objetivo, 16 bibliotecas de RNAseq (mRNA e miRNA) foram construídas utilizando amostras de RNA total de embriões diploides e haploides de diferentes idades e ovócitos maduros. A análise do transcriptoma mostrou que existem genes diferencialmente expressos entre os dois tipos de embriões já em 1 h de desenvolvimento. Além disso, nossa análise permitiu a identificação de mRNAs e miRNAs maternos e zigóticos, além de processos com que estas moléculas se relacionam. As análises mostraram também que um mesmo miRNA pode atingir diferentes mRNAs em cada tipo de embrião, na mesma fase de desenvolvimento. Além disso, um mesmo gene pode ser diferentemente regulado nos dois tipos de embriões. Por exemplo, broad/GB48272, que é classificado como materno em embriões dipoides é regulado por quatro miRNAs diferentes e em embriões haploides é classificado como zigótico, regulado por apenas um miRNA. Análise das bibliotecas de RNAseq e hibridação in situ mostrou o padrão de expressão de zelda em embriões jovens de abelhas. Zelda é um ativador chave do genoma zigótico em Drosophila e regula eventos importantes na embriogênese se ligando a um motivo conservado, TAGteam. Em A. mellifera, encontramos um motivo TAGteam putativo que tem sido relacionado à transcrição zigótica precoce. Além disso, a hibridização in situ e PCR mostraram três primiRNAs (ame-mir-375-3p, ame-mir-34-5p e ame-mir-263b-5p) que se expressam durante a clivagem. A presença de pri-miRNAs evidenciou a início da transcrição zigótica durante a clivagem. Em suma, podemos dizer que este é o primeiro trabalho em Apis mellifera a descrever os eventos de iniciais do desenvolvimento embrionário comparando embriões haploides e diploides usando os recentes protocolos de bioinformática e os avanços da biologia molecular. / Embryonic development is the result of a precisely controlled sequence of events modulated by environmental signals and intracellular mechanisms. In Hymenoptera, this process takes a special character due the sex-determination system (haplodiploidy). In this system, fertilized eggs develop in females (diploid) and unfertilized eggs in males (haploid). Thus, important events such as egg activation and maternal-zygotic transition, events of the early embryogenesis are key elements to understand the development of both types of embryos. Egg activation is a complex event triggered in response to external stimuli and necessary for the onset of embryogenesis. In honeybees egg activation occurs independently of fertilization and seems to be triggered during the passage through mother\'s reproductive tract. Furthermore, if the egg is not fertilized it will develop into haploid organism. However, if the egg receives the sperm up to 30min after activation, this egg develops into a diploid organism. In Drosophila, the egg activation is also fertilization independent. Initial stimulus that triggers the development is due mechanical stresses suffered by the egg during ovulation and passage through the reproductive tract. In this model, the first activation signal includes activation of calciumdependent pathway. Maternal molecules that are incorporated into the oocyte during ovogenesis, act during egg activation, as well as in early embryogenesis. Early embryogenesis events are also characterized by absence of high levels of zygotic transcription. The deposited molecules drive egg activation, breaking cell division dormancy permitting the beginning of embryonic development. But, the developing embryo gradually degrades and substitutes these mother-inherited molecules, in a process known as mother-to-zygote transition. Our main objective was the understanding of the deep crosstalk among the inherited molecules and the newly ones produced during the first steps of Apis mellifera embryogenesis. To achieve our objective 16 deep sequenced RNA (mRNA, miRNA) libraries were constructed using different age diploid and haploid embryos, and mature oocytes. Genome-wide transcriptome analysis was performed and interactive regulatory networks were constructed. Our analysis permitted the identification of maternal and zygotic mRNAs and miRNAs and related processes. Based on expression profiles of mRNAs and miRNAs in mature oocytes and haploid and diploid embryos of 2, 6 and 18-24 h of development, we constructed integrative regulatory networks (miRNA:mRNA) showing that the same miRNA could target different mRNAs in each type of embryo, in the same phase of development. As example we cite broad/GB48272, which is classified as maternal in diploid embryos and regulated by four different miRNAs. However, in haploid embryos it is zygotic and regulated by only one miRNA. Analysis of RNAseq and in situ hybridization showed the expression pattern of zelda in early honeybee embryos. Zelda is a key activator of Drosophila early zygotic genome and regulates important events in early embryogenesis binding to TAGteam motif. In A. mellifera, we found a putative TAGteam motif that has been implicated in early zygotic transcription. Moreover, in situ hybridization and PCR assay showed three pri-miRNAs (ame-mir-375-3p, ame-mir-34-5p and ame-mir-263b-5p) expressed during cleavage. The presence of pri-miRNAs is the first evidence of early zygotic transcription during cleavage. In short, we could say that this is the first work on Apis mellifera describing the early embryonic developmental events comparing haploid and diploid embryos using modern bioinformatics tools and advanced molecular analysis.

As biotécnicas da reprodução animal, amplamente difundidas no Brasil, tem possibilitado maior controle em relação à transmissão de agentes patogênicos, porém, a transmissão de doenças continua a ser uma preocupação justificável para a busca de melhores meios de controle. O objetivo do trabalho foi o de avaliar a diminuição da replicação viral (BoHV-1 Colorado) em embriões murinos após tratamentos com Produtos Naturais (PN). Trabalhamos com 3 grupos de PN, totalizando 18 tratamentos: Oléos Essenciais (OE) de Chamomilla recutita, Allium sativum, Zingiber officinale, Syzygium aromaticum, Illicium verum Hook f., Punica granatum e Melissa officinalis; Extratos Etanólicos (EE) das mesmas plantas anteriores com acréscimo de Pterodon emarginatus (casca e semente) e Extrato Aquoso (EA) de Própolis e Agaricus blazei. Inicialmente encontramos concentrações não tóxicas em células MDBK (Madin Darby Bovine Kidney) relacionada a cada PN (ampla sintonia) para posteriormente verificarmos as concentrações não tóxicas para os zigotos/embriões murinos (sintonia fina). Após encontrarmos as concentrações não tóxicas, os zigotos foram divididos em quatro grupos: G1 (Controle), G2 (expostos aos vírus BoHV-1 Colorado à 108 TCID50/mL), G3 (expostos aos PN) e G4 (expostos aos vírus e PN). Os grupos foram mantidos a 37,5 ºC em meio TCM199 (100 &mu;L) com 10% de soro fetal bovino em estufa a 5% de CO2 e 95% de umidade. Após 24h, analisamos a taxa de clivagem (Teste Exato de Fisher_p&lt;0,05), a morfologia (por microscopia óptica), a n-PCR e a titulação dos embriões em co-cultura com células MDBK após mais 72h do tratamento com os PN (Teste de Mann Whitney_ p&lt;0,05). Dentre as 18 análises, os embriões murinos tratados com EA de Própolis, EE de Punica granatum e de Pteron emarginatus (Casca) apresentaram resultados satisfatórios: sem alterações morfológicas, taxa de clivagem semelhante aos controles e apesar da constatação da partícula viral junto aos embriões pela n-PCR, houve diminuição da concentração viral após tratamentos com estes extratos, o que sugere interferência destes tratamentos no ciclo viral do BoHV-1 Colorado. / The biotech Animal reproduction widespread in Brazil, has allowed greater control over the transmission of pathogens, however, the disease transmission remains a justifiable concern for the pursuit of the best means of control. The aim of this study was to evaluate the reduction of viral replicarion (Colorado BoHV-1) in murine embryos after treatments with natural products (NP). We work with groups \'3 \'PN, totaling 18 treatments: essential oils (EO) of Chamomilla recutita, Allium sativum, Zingiber officinale, Syzygium aromaticum, Illicium verum Hook f., Melissa officinalis and Punica granatum; ethanol extracts (EE) of the same plants prior to adding Pterodon emarginatus (skin and seed) and Aqueous Extract (EA) Propolis and Agaricus blazei. Initially we find non-toxic concentrations in MDBK (Madin Darby Bovine Kidney) related to each PN (broad line) then we check for the non-toxic concentrations for zygotes / embryos murine (fine tuning). After finding the non-toxic concentrations, zygotes were divided into four groups: G1 (control), G2 (exposed to viruses BoHV-1 at 108 Colorado TCID50/mL), G3 (exposed to PN) and G4 (exposed to viruses and PN .) The groups were maintained at 37.5 °C in TCM199 (100 mL) with 10% fetal bovine serum in an incubator at 5% CO2 and 95% humidity. After 24h, we analyzed the cleavage rate (Exact Test Fisher_p &lt;0.05), morphology (light microscopy), the n-PCR and titration of embryos in co-culture with MDBK cells after 72 h of treatment with more NPs (Mann Whitney_ p &lt;0.05). Among the 18 analyzes, murine embryos treated with EA Propolis, EE Punica granatum and Pteron emarginatus (bark) showed satisfactory results: no morphological changes, cleavage rate similar to controls, and despite the finding of the viral particle with the embryos by n-PCR, decreased the viral concentration after treatment with these extracts, suggesting interference of these treatments in the viral cycle of BoHV-1 Colorado.

Apesar da melhoria no sistema de produção e cultivo dos embriões in vitro, cerca de 60% dos oócitos que entram no sistema, não atingem o estágio de blastocisto e a qualidade dos embriões obtidos é bastante variável quando comparadas com embriões produzidos in vivo. Este bloqueio pode ser afetado por íons inorgânicos, tampões, aminoácidos e composição da atmosfera gasosa. Partindo-se da premissa que há influência da mitocôndria sobre a ativação da morte celular programada levou-nos a formular a hipótese que ausência de fragmentação nuclear nos embriões antes das 72 hpi está relacionada com a ausência do potencial de membrana mitocondrial e a inibição da OXPHOS pela utilização de bloqueadores leva a manutenção de baixos níveis de potencial de membrana mitocondrial e baixas taxas de fragmentação nuclear nos embriões. Embriões foram produzidos in vitro mediante maturação durante 22 horas, fecundação e cultivo 18 horas após a inseminação (hpi). Decorridas 24hpi realizou-se o cultivo com 0% de oxigênio, a fim de bloquear o processo de OXPHOS. Após 48 hpi realizou-se o feeding do meio de cultivo (SOF) com inibidores da OXPHOS (antimicina A e/ou oligomicina, cianeto de potássio) em diferentes doses. O número de embriões 8 células foi determinado às 80 hpi, mesmo momento em que foram realizadas as técnicas de JC-1 e TUNEL. Verificou-se as 168 hpi o efeito dos tratamentos no desenvolvimento embrionário. Os resultados obtidos com a inibição da OXPHOS após 48 hpi com oligomicina e/ou antimicina A nas doses utilizadas não alterou a capacidade do embrião atingir o estádio de 8 células. Entretanto, esta inibição inviabilizou o desenvolvimento até o estádio de blastocisto. O tratamento com KCN permitiu o desenvolvimento até o estádio de 8 células e a blastocisto em taxas semelhantes ao controle. A inibição do cultivo na ausência do O2 inviabilizou o processo de cultivo. Já os resultados obtidos quanto ao &#936;mm e TUNEL evidenciam que os tratamentos dos embriões antimicina e/ou oligomicina levaram a um aumento do &#936;mm e fragmentação nuclear na maioria dos embriões testados. Portanto, não foi possível testar a hipótese de que o &#936;mm é necessário para o estabelecimento da MCP, todavia, foi observada uma correlação positiva entre &#936;mm e fragmentação nuclear. / Although in vitro embryo production has been improved in the last 2 decades, about 60% of the oocytes do not reach the blastocyst stage and embryo quality is very variable when compared with in vivo produced embryo. This developmental block can be affected by inorganic ions, buffers, aminoacids and gaseous atmosphere composition. The knowledge that there influence of mitochondria on the activation of the programmed cellular death led to formulate the hypothesis that nuclear fragmentation absence in embryos before 72 post insemination is related with absence of mitochondrial membrane potential and OXPHOS blockage by inhibiting agents, would cause the maintenance of low levels of mitochondrial membrane potential and low rates of embryo nuclear fragmentation. Embryos were cultured in vitro for 18 hours post insemination (hpi) and after 24 hpi, they were submitted to 0% oxygen culture, in order to block the OXPHOS process. At 48 hpi, feeding was performed with SOF medium containing OXPHOS inhibitors (antimycin A and/or oligomycin, potassium cyanide) in different concetrations. The numbers of 8 cell embryos were estimated at 80 hpi, the same moment that they were submitted to JC-1 probes and TUNEL for mitochondrial membrane potential and DNA damages evaluation, respectively. At 168 hpi the effect of the treatments was verified on embryonic development. The results obtained with the OXPHOS inhibition after 48 after hpi using oligomycin and/or antimycin A did not modify embryo capacity to reach 8 cell stage. However, this inhibition prevented development to the blastocyst stage. KCN treatment allowed development up to the 8 cell stage and blastocyst similar to controls. The absence of O2 prevented embryo development. The &#936;mm and TUNEL results showed that antimycin and/or oligomycin treatment increased &#936;mm and nuclear fragmentation in the majority of the embryos tested. In conclusion, it was not possible to test the hypothesis that &#936;mm is necessary to the establishment of MCP, but a positive correlation between &#936;mm and nuclear fragmentation was observed.

A produção in vitro de embriões é uma biotecnologia bastante difundida mundialmente. O Brasil, em 2015, foi responsável por aproximadamente 67% dos embriões bovinos produzidos in vitro no mundo (PERRY, 2014). Embora essa tecnologia seja bastante utilizada, é de grande interesse para o mercado desenvolver estratégias que levem ao maior aproveitamento dos oócitos obtidos e compreender os mecanismos, dentro do ambiente folicular, que determinam a competência oocitária. O microambiente folicular é fundamental para o crescimento e a aquisição da competência oocitária, tornando o oócito apto a desenvolver-se e manter o embrião até a transição materno embrionária. Para tanto, os componentes foliculares - células da granulosa, células do cumulus, oócito e líquido folicular - precisam trabalhar em unidade, visto que possuem uma relação de interdependência. Dentro dos mecanismos de comunicação existentes no ambiente folicular estão as vesículas secretadas por células, chamadas vesículas extracelulares, que foram descritas no líquido folicular, contendo material bioativo como proteínas, lipídios e RNAs, incluindo os microRNAs. Contudo, os componentes do ambiente folicular podem refletir na qualidade do oócito que será produzido e a hipótese geral deste trabalho é de que os miRNAs presentes no ambiente folicular regulam vias de sinalização importantes para o desenvolvimento oocitário e que os miRNAs e ou RNAs mensageiros presentes nas células foliculares podem ser explorados como importantes ferramentas para o diagnóstico da qualidade oocitária. O primeiro estudo determinou perfis transcricionais de miRNAs em células da granulosa, em complexos cumulus-oócito e em vesículas extracelulares derivadas destas células e também do fluido folicular. Além de conhecer a origem e o papel dos miRNAs no ambiente folicular, estes perfis de expressão indicaram a regulação no ambiente folicular da via de sinalização da PI3K-Akt. No segundo estudo, componentes desta via de sinalização foram então determinados em células foliculares associadas a oócitos de alta ou baixa competência ao desenvolvimento. Os resultados demonstram que a ativação da via PI3K-Akt em células foliculares correlaciona-se à maior competência oocitária; de modo oposto, a menor atividade desta via nas células foliculares está relacionada à reduzida competência oocitária. Nos estudos três e quatro, um conjunto de experimentos foram realizados para determinar o perfil de microRNAs e RNAs mensageiros em células do cumulus associadas a oócitos de alta ou baixa competência ao desenvolvimento. Buscou-se esclarecer alguns dos mecanismos responsáveis pela melhor qualidade oocitária e levar a identificação de biomarcadores de qualidade oocitária permitindo o avanço e o desenvolvimento de novas ferramentas para intensificar a produção in vitro de embriões bovinos. Por fim, estes resultados demonstram respostas integradas entre oócitos e células foliculares durante o desenvolvimento folicular e o processo de aquisição de competência oocitária e identificaram marcadores de qualidade oocitária. / In vitro embryo production of is a widespread biotechnology worldwide. In 2015 Brazil was responsible for approximately 67% of bovine embryos produced in vitro in the world (PERRY, 2014). Although widely used, to develop strategies that lead to better use of oocytes and understand the mechanisms (in follicular microenvironment) that determine oocyte competence is of great interest to national market. The follicular microenvironment is fundamental for oocyte growth and acquisition of competence, making the oocyte able to develop and maintain the embryo until the embryonic maternal transition. For this end, the follicular components - granulosa cells, cumulus cells, oocytes and follicular fluid - need to work in unity, since they have arelation of interdependence. Within the mechanisms of communication existing within the follicular environment are vesicles secreted by cells, called extracellular vesicles, which were described in follicular fluid, containing bioactive material such as proteins, lipids and RNAs, including microRNAs. The components of follicular environment may reflect the quality of the oocyte that will be produced and the general hypothesis of this work is that the miRNAs present in the follicular environment regulate signaling pathways important for oocyte development and that the miRNAs and/or messenger RNAs present in the follicular cells can be explored as important tools for the diagnosis of oocyte quality. The first study determined profiles of miRNAs in granulosa cells, cumulus-oocyte complexes and extracellular vesicles derived from these cells and also in follicular fluid. In addition, by knowing the origin and role of miRNAs in the follicular environment, the expression profiles indicated the PI3K-Akt signaling pathway regulation in the follicular environment. In the second study, components of this signaling pathway were then determined in follicular cells associated with oocytes of high or low developmental competence. The results demonstrated that the activation of the PI3K-Akt pathway in follicular cells correlates with increased oocyte competence; conversely, the lower activity of this pathway in follicular cells is related to reduced oocyte competence. In studies three and four, experiments were performed to determine the profile of microRNAs and messenger RNAs in cumulus cells associated with oocytes of high or low developmental competence. Aiming to clarify some of the mechanisms responsible for the best oocyte quality that lead to the identification of oocyte quality biomarkers, allows the advancement and development of new tools to intensify the in vitro production of bovine embryos. Finally, results obtained demonstrate integrated responses between oocytes and follicular cells during follicular development and give new insights to the study of oocyte competence acquisition process and identified oocyte quality markers.

Submitted by Ubirajara Cruz (ubirajara.cruz@gmail.com) on 2017-03-28T15:53:13Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_Elisangela_Madeira.pdf: 846007 bytes, checksum: 5c12f30cc3a07b37c0ca5584d498bd95 (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-03-28T21:00:21Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_Elisangela_Madeira.pdf: 846007 bytes, checksum: 5c12f30cc3a07b37c0ca5584d498bd95 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-28T21:00:21Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_Elisangela_Madeira.pdf: 846007 bytes, checksum: 5c12f30cc3a07b37c0ca5584d498bd95 (MD5) Previous issue date: 2015-03-13 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Os protocolos de vitrificação para produção in vitro de embriões (PIV) bovinos ainda são limitados. Portanto o objetivo desta tese foi identificar um novo protocolo para vitrificação de embriões bovinos PIV. No primeiro estudo (E1), foram determinadas as características de toxicidade do etilenoglicolmonometiléter (EGMME) na solução de vitrificação, com uma pré-exposição dos embriões em soluções contendo EGMME. No primeiro experimento do E1, as taxas de eclosão observadas para embriões expostos a soluções contendo EGMME em concentrações de 5, 10 e 15% durante 5 min a 39°C (30,5, 33,9 e 26,3%, respectivamente) foram semelhantes (P>0,05) à taxa observada para embriões não expostos ao EGMME (46,9%). No segundo experimento do E1, as taxas de eclosão de embriões não expostos a crioprotetores (33,4%) ou expostos ao EGMME a 10 ou 15% (32,9 e 25,1%, respectivamente) foram superiores (P<0,05) à observada para embriões expostos ao etilenoglicol (EG) a 20%,um crioprotetor comumente usado (17.0%). A expressão dos genes Bcl-2 (inibidor de apoptose), Bax (promotor de apoptose) e CCND2 (marcador de proliferação celular) não diferiu entre os grupos (P>0,05). No segundo estudo (E2), o EGMME foi testado em protocolos de vitrificação, em associação com o dimetilsulfóxido (DMSO), com avaliação das taxas de eclosão, da expressão gênica e da implantação dos embriões PIV em fêmeas bovinas previamente sincronizadas. No primeiro experimento do E2, embriões não expostos ao EGMME (controle) foram comparados com cinco tratamentos com exposição a soluções contendo: EG a 20% e DMSO a 20%; EGMME a 20% e DMSO a 15%; EGMME a 15% e DMSO a 15%; EGMME a 15% e DMSO a 20%; e EGMME a 10% DMSO a 20%. As taxas de eclosão não diferiram entre os tratamentos (P>0,05). No segundo experimento do E2, a taxa de eclosão de embriões não vitrificados (63.8%) foi superior (P<0,05) às taxas observadas para embriões vitrificados em soluções contendo EG a 20% e DMSO a 20% (T2) e EGMME a 20% e DMSO 20% (T3) (37.6% e 22.0% respectivamente). As taxas observadas em T2 e T3 foram similares (P>0,05), porém maiores que a taxa de 10.3%observada em T4 (EGMME a 15% e DMSO a 20%). A expressão dos genes BAX (promotor de apoptose) e CCND2 (marcador de proliferação celular) foram semelhantes para todos os grupos (P>0,05), mas a expressão do gene Bcl-2 (inibidor de apoptose) foi inferior no T4 (P<0,05), em comparação com os demais tratamentos. Trinta dias após a implantação dos embriões PIV em T2 e T3, as taxas de prenhez foram de 26,6% para ambos os grupos. Não foram implantados embriões PIV no T4. Esta tese Concluiu se que o EGMME pode ser usado como crioprotetor em protocolos de vitrificação de embriões bovinos PIV, pois não apresentou toxicidade nas concentrações avaliadas. / Vitrification protocols for in vitroproduction (IVP) of bovine embryos are limited. The objective of this thesis was to identify a novel protocols for vitrification of IVP bovine embryos. In the first study (S1), the toxicity characteristics of the Ethylene glycol monomethyl ether (EGMME) were determined after pre-exposure of embryos to solutions containing that cryoprotectant. In the first experiment of S1, hatching rates for embryos exposed to solutions including 5%, 10%and 15% EGMME for 5 min at 39 °C (30.5%, 33.9% and 26.3% respectively) were similar (P<0.05) to those for unexposed embryos (46.9%). In the second experiment of S1, hatching rates for unexposed embryos (33.4%) and for embryos exposed to 10% EGMME (32.9%)and 15% EGMME (25.1%) were greater (P <0.05) than the rate for embryos exposed to 20% ethylene glycol (EG), a commonly used cryoprotectant (17.0%).The expression of the Bcl-2 (inhibitor of apoptosis), Bax (apoptosis promoter) and CCND2 (cell proliferation marker) genes did not differ amongthe groups (P> 0.05). In the second study (S2), EGMME was tested in vitrificationprotocolos, associated with Dimethyl sulfoxide (DMSO), with evaluation of hatching rates, gene expression and implantation vitrified of embryos in previously synchronized cows. In the first experiment of S2, embryos unexposed to EGMME were compared against five treatments with exposure to solutions containing: 20%EG and 20%DMSO; 20% EGMME and 15%DMSO; 15% EGMME and 15% DMSO; 15% EGMME and 20% DMSO; and 10%EGMME and 20% DMSO. Hatching rates were similar across all those treatments (P>0.05). In the second experiment of S2, the hatching rate of non-vitrified embryos (63.8%) was greater (P<0.05) than the rates observed for vitrified embryos conditioned in solutions containing 20% EG and 20% DMSO (T2)and 20% EGMME and 20% DMSO (T3) (37.6% and 22.0%, respectively). The rates of T2 and T3 were similar (P>0.05), but were greater than the 10.3% rate observed for T4 (15% EGMME and 20% DMSO). The expression of the BAX (apoptosis promoter) and CCND2 (cell proliferation marker) genes were similar across treatments (P>0.05). but the Bcl-2 gene (inhibitor of apoptosis) had lower expression in T4 than in the other treatments (P<0.05). Thirty days after implantation of embryos from T2 and T3, pregnancy rates of previously synchronized cows were equal to 26.6% for both groups (no embryos from T4 were used). This thesis concluded thatEGMME can be used as cryoprotectant in vitrificationprotocolos for IVP of cattle embryos because no toxicity was observed at the tested concentrations.

O desenvolvimento dos sistemas de produção de embriões por fecundação in vitro (FIV) ou transferência nuclear com células somáticas (TNCS) em diversas espécies animais, em especial a bovina, acarretou na manifestação de anormalidades de desenvolvimento in vivo, com a placenta sendo considerada o fator determinante no aparecimento destes distúrbios durante a gestação. A hipótese geral deste trabalho é de que alterações na formação da placenta, decorrentes das manipulações embrionárias in vitro, resultam em elevadas perdas no terço inicial e em anormalidades fetais e placentárias no terço final da gestação, incluindo um crescimento compensatório dos fetos por uma perda da capacidade de regulação da restrição placentária, elevando o fluxo total de nutrientes no sentido materno-fetal. Sendo assim, este estudo foi dividido em Capítulos, buscando-se avaliar os efeitos de algumas variáveis biológicas e técnicas na produção de embriões in vitro por TNCS, e de comparar o desenvolvimento de prenhezes estabelecidas com embriões produzidos in vivo (Controle), in vitro por fecundação (FIV) e in vitro por transferência nuclear (TNCS), pela avaliação de dados morfométricos, morfológicos e bioquímicos coletados em distintos momentos da gestação. No Capítulo 1, o desenvolvimento in vitro de embriões clonados foi comparado entre células somáticas de duas fêmeas geneticamente distintas (Nelore vs. Crioula Lageana), e entre três intervalos de confluência celular, estabelecidos previamente ao procedimento de clonagem, do mesmo animal. As melhores taxas foram obtidas com a utilização de células da fêmea Nelore, e da utilização de células com elevada confluência em cultivo. No Capítulo 2, comparou-se o efeito de dois intervalos de fusão-ativação e da agregação ou não de embriões no momento do cultivo, no desenvolvimento in vitro e in vivo destes embriões clonados. A agregação dos embriões e um maior intervalo entre fusão-ativação promoveram um incremento na produção de blastocistos. Contudo, estes não se apresentaram mais desenvolvidos ou com melhor qualidade, e também não influenciaram nas taxas de prenhez ou de manutenção das mesmas. No Capítulo 3, prenhezes dos grupos Controle, FIV e TNCS foram comparadas pela avaliação de dados morfométricos e bioquímicos coletados em distintos momentos da gestação. Este experimento demonstrou que as diferenças entre os grupos experimentais ocorreram desde as análises iniciais, com os grupos in vitro apresentando menores taxas de prenhez, e com o grupo TNCS tendo as maiores perdas gestacionais. As imagens obtidas por ultrasonografia aos 51 dias revelaram conceptos in vitro retardados em seu desenvolvimento, mas com um crescimento compensatório posterior, já que as prenhezes produzidas in vitro, e especialmente as do grupo TNCS, sustentaram não só maiores conceptos e com maiores anormalidades aos 225 dias de gestação, como também apresentaram um maior acúmulo de substratos energéticos no sistema fetal, particularmente de frutose no alantóide. No Capítulo 4, foram comparados os resultados de produção de embriões clonados e do estabelecimento de prenhezes em um período de produção de 28 meses, divididos em três momentos. A compilação dos períodos de rotinas de trabalho em clonagem bovina demonstrou o efeito da experiência e da aquisição de competência técnica sobre os resultados de produção in vitro de embriões por TNCS, com repercussão direta no desenvolvimento in vivo posterior. / The in vitro production (IVP) of embryos by in vitro fertilization (IVF) or somatic cell nuclear transfer (SCNT) in many species, especially in cattle, is usually associated with abnormalities during in vivo development, with the placenta being implicated as the determining factor in the appearance of the disturbances during gestation. The general hypothesis of this study is that alterations in placenta formation, as a consequence of early in vitro embryo manipulations, results in high gestation losses during the first trimester and fetal and placental abnormalities in the last trimester of gestation, including the occurrence of a compensatory fetal growth due to a reduced placental-fetal growth-restricting effect, which increases the total materno-fetal nutrient flux in late pregnancy. This study aimed to evaluate some of the biological and technical effects on the IVP of embryos by SCNT, and also to compare the development of pregnancies established with embryos produced either in vivo (Control), or in vitro by in vitro fertilization (IVF) or by nuclear transfer (SCNT), by the evaluation of morphometric, morphologic and biochemical data collected at distinct time points in gestation. In Chapter 1, the in vitro development of cloned embryos was compared between somatic cells of two genetically different females (Nelore vs. Crioula Lageana), and between three cell confluence intervals, established prior to the cloning procedure of the same animal. The best results were achieved using cells from the Nelore female and also with cells on the highest confluence level on culture. In Chapter 2, the effects of two fusion-activation intervals and the use or not of embryo aggregation during in vitro culture were compared by evaluating the in vitro and in vivo developmental potential of resulting embryos. The embryo aggregation and a higher fusion-activation interval promoted an improvement in blastocyst yield. However, those embryos were neither more advanced in development nor better in morphological quality, having no influence on subsequent pregnancy rates or pregnancy losses. In Chapter 3, Control, IVF and SCNT pregnancies were compared by the evaluation of morphometric and biochemical data collected at distinct moments in gestation. This experiment demonstrated that differences occurred between the three groups of embryos from the beginning of the analyses; the in vitro-produced groups had lower pregnancy rates, with the SCNT group showing the highest pregnancy losses. The analyses of the sonograms on Day 51 of pregnancy revealed a growth retardation pattern for the in vitro concepti, having a compensatory development up to late pregnancy, as in vitro-derived pregnancies, special in the SCNT group, sustained heavier concepti with a wider spectrum of abnormalities on day 225 of gestation. In addition, the SCNT pregnancies demonstrated a greater accumulation of substrates in the fetal system, particularly fructose on the allantoic fluid. Finally, in Chapter 4, results obtained from a retrospective analysis of bovine embryo production by cloning and subsequent pregnancy rates were compared between three equal periods within a range of 28 months. The comparison of the bovine cloning procedures during the three time periods demonstrated the impact of the technical skills and competence on the overall efficiency of in vitro embryo production by SCNT, and subsequent in vivo development.

The efficiency of superovulation protocols with different levels of progesterone in dairy cows was evaluated on the ovulated follicles rate. Twenty five high producing female were distributed in control group (n = 5), and four treatments with progesterone device (CIDR). Used CIDR for 4 and 5 days, new CIDR for 4 and 5 days (n=5 in each treatment). All cows received a pre synchronization with prostaglandin F2α (PGF) and GnRH. On Day 10 of the estrous cycle started the follicle stimulating hormone (FSH) treatment in nine decreasing doses for 4.5 days. Two applications of PGF were also used along with the 5th and 6th FSH injection. Ovaries were evaluated daily by transrectal ultrasonography to determine the start of the second follicular wave, evaluation of recruitment, follicles growth, also for monitoring the ovulation. Superovulation with used CIDR 4 resulted in a higher ovulation rate between 36-60h after device removal (94.9%, P <0.0001) compared to the control group (49.5%), used CIDR 5 (68.3%), new CIDR 4 (52.8%), or new CIDR 5 (70.6%). Thus, artificial insemination could be performed within 24-36h after removal the used 4 days CIDR. The number of follicles in control cows (38 ± 9.27) was similar (P=0.739) to used CIDR 4 (31.4 ± 6.8), new CIDR 4 (31 ± 4.6), used CIDR 5 (33.4 ± 8.4), or new CIDR 5 (38.6 ± 10.6). Our finds supported the hypothesis that low levels of exogenous progesterone during superovulation were sufficient to allow pulses of luteinizing hormone to enable ovulation induction. / Protocolos de superovulação com diferentes concentrações de progesterona foram avaliados sobre o percentual de folículos ovulados em vacas leiteiras de alta produção. Vinte e cinco fëmeas foram distribuídas em grupo controle (não tratadas; n=5) e quatro tratamentos com uso de dispositivos intravaginais de progesterona (CIDR): CIDR novo ou usado, por 4 ou 5 dias (n=5 em cada tratamento). Todas as vacas receberam prostaglandina F2α (PGF) e GnRH via IM. No Dia 10 (D10) do ciclo estral iniciou o tratamento com hormônio folículo estimulante (FSH) em 9 doses decrescentes, por 4,5 dias. Concomitante com a 5ª e 6ª aplicação de FSH as vacas receberam PGF. Os ovários foram avaliados diariamente por ultrassonografia transretal para determinar o início da segunda onda folicular, o recrutamento e crescimento dos folículos, bem como o monitoramento das ovulações. O CIDR usado por 4 dias resultou em maior percentual de folículos ovulados entre 36 e 60h após a remoção do dispositivo (94,9%; P<0.0001) comparado ao controle (49,5%) e tratamentos: CIDR usado 5 (68,3%), CIDR novo 4 (52,8%) e CIDR novo 5 (70,6%). A inseminação artificial deste protocolo é recomendada entre 24 a 36h após a retirada do CIDR usado por 4 dias. O número de folículos das vacas controle (38±9,27), CIDR usado 4 (31,4±6,8), CIDR novo 4 (31±4,6), CIDR usado 5 (33,4±8,4) e CIDR novo 5 (38,6±10,6) foi similar (P=0.739). Confirma-se a hipótese de que baixo nível de progesterona exógena durante o tratamento com FSH permite pulsos de hormônio luteinizante suficientes para indução da ovulação.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:42:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 9480742 bytes, checksum: f87c9b2653b911e326eef4b5a0dd87ce (MD5) Previous issue date: 2014-07-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The aim of this study was to evaluate the quality of relationship information over genetic parameters estimates and accuracies of breeding values. Thus, we evaluated the quality by making corrections based on SNPs markers. Variance components were estimated under Bayesian approach via Gibbs sampling. The evaluation of the correct relationship was performed using markers of 3,591 individuals in a population consisting of 12,668 animals. Mendelian conflicts were deflned as conflicts between the progeny and parents markers. Thus, 460 changes were performed, which 54% had a buII or cow on pedigree. We observed, on average, match parent were defined with 75 markers, whiIe no- match parent n was performed with 2,700 markers. Annealing algorithm Molecular coancestry program provided 2,174 new haIf-sibs relationships. We observed that higher quality on pedigree information provided increase in accuracy of breeding values and higher heritability estimates (0.22 i 0.0286), suggesting the possibility of direct selection for tick resistance. We used a 5-fold cross-validation strategy using K-means and random methods to group the animals. The results of cross-validation indicate that higher quality of the pedigree relationships provide higher accuracy. The weaning weight was used to evaluate muItipIe sires progeny (MS) and embryo transfer and in vitro fertilization animals (TEF). We used three strategies to include MS information: genetic groups (GG), bayesian hierarchical method (HIER) and the average numerator relationship matrix (ANRM). The deviance information criteria (DIC) was used as Bayesian measure of fIt, which suggested that HIER strategy provided better fIt when MS information is consider. However, ANRM provided best fit to include TEF animals. We use foster dam information to estimate the maternal genetic and maternal permanent environmental effects when considering TEF animals. We didn't observed statistical difference in variance components and genetic parameters considering information TEF animals, but breeding values showed greater values. Spearman correlations between breeding values were higher for base, animals with certain paternity and MS progeny. However, the use of TEF animals information significantly changed the predicted breeding values. The use of appropriate methodologies to include the information of MS progeny and TEF animals provide most accurate prediction of breeding values and assist in higher rates of genetic gain. / O objetivo desse estudo foi verificar o reflexo da qualidade das informações de parentesco sobre as estimativas de parâmetros genéticos e acurácias das predições de valor genética Dessa forma, foi avaliada a qualidade dessas informações ao realizar correções no pedigree baseadas em marcadores do tipo SNPs. Os componentes de variância foram estimados sob enforque Bayesiano por amostragem de Gibbs. A avaliação da correta definição de parentesco foi realizada utilizando-se informações de marcadores SNPs de 3.591 indivíduos em uma população constituída de 12.668 animais. Os conflitos mendelianos entre as marcas da progênie e dos pais foram utilizados como critério de avaliação de parentesco. Dessa forma, foram realizadas 460 mudanças no pedigree, dentre os quais 54% possuíam um touro ou vaca identificado. Foi observado que, em média, novos relacionamentos genéticos foram definidos com 75 marcas em conflito, enquanto que a rejeição do parentesco foi realizada com 2.700 marcas. O uso do programa Molecular Coancestry para inferência de parentesco a partir de informações de marcadores moleculares proporcionou a definição de 2.174 novos relacionamentos de meio-irmãos. Foi possível observar que as correções de parentesco proporcionaram aumento da acurácia média dos valores genéticos preditos. O aumento na qualidade das informações de pedigree proporcionou a estimação de herdabilidade de maior magnitude (0,22 i 0,0286), sugerindo a possibilidade de seleção direta para a resistência a carrapatos. Foi utilizada uma estratégia de validação cruzada pelo método K-médias e também de forma aleatória, no qual cinco grupos de treinamento foram formados. Os resultados da validação cruzada indicam que maior qualidade nos relacionamentos do pedigree proporcionam maior valor de acurácia. O peso padronizado aos 205 dias foi utilizado para avaliar a inclusão de informações de filhos de reprodutores múltiplos (RM) e de animais oriundos de biotécnicas da reprodução (TEF). Foram avaliadas três estratégias de inclusão dessas informações: grupos genéticos (GG), método hierárquico bayesiano (HIER) e matriz da média dos numeradores dos coeficientes de parentesco (ANRM). O critério de informação da deviance (DIC) foi utilizado como avaliador da qualidade de ajuste e sugeriu que a estratégia HIER proporcionou melhor ajuste ao considerar as informações de RM. Entretanto, o método ANRM apresentou melhor ajuste ao incluir informações dos animais TEF. A inclusão das informações de animais TEF foi realizada pelo uso da informação da receptora para estimação do efeito genético materno e de ambiente permanente materno. Não foi observada diferença estatística nas estimativas de componentes de variância e de parâmetros genéticos ao considerar informações de animais TEF, porém os valores genéticos preditos apresentaram maior magnitude. As correlações de Spearman entre os valores genéticos foram de elevadas magnitudes para os animais fundadores, animais com certeza no parentesco e para os fiIhos de RM. Entretanto, o uso das informações dos animais TEF modificou de forma significativa as predições dos valores genéticos. O uso de metodologias adequadas para incluir a informação de animais com incerteza de paternidade e animais oriundos de transferência de embriões e fertilização in vitro proporcionam a predição de valores genéticos mais acurados e auxiliam em maiores taxas de ganho genético.