Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2012-08-22T12:52:26Z No. of bitstreams: 1 TESE COMPLETA Guilherme P P Zolini.pdf: 5332439 bytes, checksum: 59494ecd480af09a4c7fc97891dfd358 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-08-22T12:52:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE COMPLETA Guilherme P P Zolini.pdf: 5332439 bytes, checksum: 59494ecd480af09a4c7fc97891dfd358 (MD5) / FIOCRUZ - Fundação Oswaldo Cruz (PAPES IV / PAPES V) CPqRR – Centro de Pesquisa René Rachou CNPq – Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG – Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais INCTV – Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Vacinas / Este trabalho foi realizado no laboratório de Imunopatologia do Centro de Pesquisa René Rachou (CPqRR) e no Laboratório de Vírus (Labvirus) da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG). Os herpesvirus possuem genoma DNA e são envelopados. Aproximadamente 70% dos adultos já tiveram contato com Herpes Simplex tipo 1 (HSV-1). O HSV-1 causa úlceras ou até mesmo lesões mais graves como encefalite, e após a infecção, o vírus comumente fica latente e pode ser ou não reativado. Células do sistema immune inato, através dos “Receptores do Tipo Toll” (TLRs), reconhecem “padrões moleculares associados a patógenos” (PAMPs) orquestrando a resposta imune contra o vírus. Quando ativados, TLRs iniciam uma cascata de sinalização que culmina na ativação de genes relacionados à defesa imune inata (óxido nítrico-NO, citocinas e quimiocinas). Outros estudos do grupo mostraram que animais nocautes (KO) para TLR9 ou TLR2/9 apresentam alta mortalidade na infecção por HSV-1, ao contrário dos C57BL/6 selvagens (WT) e TLR2KO, que são capazes de controlar o vírus. Objetivamos pesquisar a interrelação na expressão dos TLRs 1, 2, 3, 6, 7 e 9 em animais TLR2 KO, TLR9 KO e TLR2/9 KO infectados por HSV-1 e principais citocinas, células e mecanismos imune celulares contra infecção por HSV-1. No presente trabalho camundongos WT, TLR2KO, TLR9KO e TLR2/9KO foram infectados via intranasal com 106 u.f.p. de HSV-1, e seus controles receberam PBS. A eutanásia dos animais foi realizada no 5º dia após infecção (dpi), que previamente já foi demonstrado ser o pico da infecção neste modelo, e então gânglios trigêmeos (TG) e cérebros foram coletados. A expressão de TLRs 1, 2, 3, 6, 7 e 9 foi avaliada por PCR em Tempo Real. Camundongos WT infectados apresentaram diferença significativa na expressão destes TLRs comparados com seus respectivos controles no TG, mas não no cérebro. Nos KOs, houve aumento da expressão dos TLRs tanto nos TGs (mas com níveis mais moderados comparado aos WT) quanto nos cérebros. Também foi avaliada a expressão de gp91phox, p22phox e iNOS. A expressão de iNOS em C57BL/6 WT infectados foi maior que nos outros grupos, mas o mesmo não ocorreu para gp91phox, p22phox. Adicionalmente, foi mensurada a produção de NO por macrófagos intraperitoneais, através da reação de Griess, que demonstrou maior produção por macrófagos WT, comparados aos grupos TLR KOs. Ensaios de histopatologia e imunofluorescência demonstraram maior celularidade nos TGs infectados, além de confirmar a presença de CD8, macrófagos, e aumento da produção de iNOS nos C57BL/6 WT infectados, o que não ocorreu com os camundongos TLRs KO. Em ensaio de sobrevivência com C57BL/6 WT, CCL3 KO, CD8 KO, RAG KO e iNOS KO a importância das células T e do iNOS foi confirmada, uma vez que CD8 KO, RAG KO e iNOS KO tiveram 0% de sobrevida. Camundongos C57BL/6 WT, RAG KO, CCL3 KO e iNOS KO tiveram seus TGs analisados por PCR em tempo real para verificar a expressão do gene viral VP-16 e MCP-1, iNOS, IP-10, Rantes e TNF-_ no 5º dpi. Estes dados indicaram a relevância de iNOS e das célúlas T na resposta inata contra o HSV-1, uma vez que os RAG KO foram irresponsivos à expressão das citocinas, enquanto os iNOS KO apresentaram uma resposta exacerbada das mesmas. Ensaio de citometria indicou que IFN_ produzido pelas células T CD8, nos TGs, e produzido pelas células T CD4 e Natural Killer (NK), nos linfonodos regionais, são um possível mecanismo de controle contra a infecção de HSV-1 dos animais WT infectados. Hipotetizamos que a expressão coordenada de TLRs reflete na orquestração eficiente do sistema imune inato, através da produção equilibrada de quimiocinas e citocinas e da atividade imune celular adequada, com produção de NO por macrófagos e ação de células T CD8, T CD4 e NK controlando a infecção por HSV-1. / This work was carried out in the Immunopathology laboratory of the Centro de Pesquisa René Rachou (CPqRR) and Virus laboratory (Labvirus) of the Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG). Herpes viruses have DNA genome and are enveloped. Approximately 70% of adult people have had contact with the Herpes Simplex Virus type 1 (HSV-1). After infection, HSV-1 cause cold sores, or more serious injuries such as encephalitis, and after infection, the virus usually become latent and may be reactivated or not. Cells of innate immune system recognize the “pathogen associated molecular patterns” (PAMPs) through “Toll Like Receptors” (TLRs), orchestrating the immune response against the virus. When activated, TLRs start a signalization cascade that culminates in the activation of genes related to the innate immune defense (NO, cytokines and chemokines). Previous research from our group demonstrated that knockout (KO) mice to TLR9 and TLR2/9 showed high mortality after HSV-1 infection, unlike C57BL/6 wild type (WT) and TLR2KO, which were able to control the virus. Research aimed in interrelation of the expression of TLRs 1, 2, 3, 6, 7 and 9 in TLR2 KO, TLR9 KO and TLR2 / 9 KO mice infected with HSV-1 and the main cytokines, cells and cellular immune mechanisms against infection by HSV-1. In this work, TLR2KO, TLR9KO, TLR2/9KO and C57BL/6 WT mice were intranasally infected with 106 p.f.u. of HSV-1, and their respective controls received PBS. Mice euthanasia was at the 5th day post infection (dpi), previously showed to be the viral multiplication peak in our model, and then trigeminal ganglia (TG) and brain were collected. The expression of TLRs 1, 2, 3, 6, 7 and 9 were measured by Real Time PCR. Infected WT mice showed significant increase in the expression of these TLRs compared to respective controls in TG, but not in brain.KOs mice had increased expression of TLRs in TG (but in more moderated levels compared to WT) and in the brains. The expression of gp91phox, p22phox and iNOS were also measured. iNOS expression in infected C57BL/6 WT was higher than in other groups, that not occurs to gp91phox, p22phox. In addition, NO production by intraperitoneal macrophages was measured through Griess reaction, that demonstrated a more pronounced production by WT macrophages, compared to TLR KOs groups. Histopathology and immunofluorescence assays demonstrated higher cellularity in infected TG, and besides confirmed the CD8 and macrophages presence and increase of iNOS production in infected C57BL/6 WT, what did not occurred with TLR KO mice. In survival assay with C57BL/6 WT, CCL3 KO, CD8 KO, RAG KO and iNOS KO, we showed the importance of the T cells and iNOS, because CD8 KO, RAG KO and iNOS KO had 0% of survival. C57BL/6 WT, RAG KO, CCL3 KO and iNOS KO mice had their TG analyzed by Real Time PCR, to verify the expression of viral gene VP-16 and MCP-1, iNOS, IP-10, Rantes and TNF-_ in 5th dpi. These data show us that iNOS and T cells are important in innate responses against HSV-1, once RAG KO were irresponsive to cytokines expression, while iNOS KO showed an excessive response to cytokines expression. The cytometry assay indicated that IFN_ produced by T CD8 cells, in the TG, and by T CD4 and Natural Killer cells (NK), in region lymph nodes, are a possible mechanism to control HSV-1 infection of WT infected mice. We hypothesize that coordinated expression of TLRs leads to an efficient orchestration of the innate immunity system, through cytokines and chemokines stable production and proper cellular immune activity, with NO production by macrophages and T CD8, T CD4 e NK cells action controlling HSV-1 infection.

Made available in DSpace on 2016-04-12T12:49:26Z (GMT). No. of bitstreams: 2 alexandre_silva_ioc_dout_2015.pdf: 3064215 bytes, checksum: 17baa3c62b9ecd7cb85bea746669aba0 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O vírus Herpes simplex 1 (HSV-1) é um vírus neurotrópico, responsável por manifestações, como herpes labial, ceratoconjuntivite e encefalite herpética (HSE). A HSE apresenta incidência anual de 1-4 casos/milhão de habitantes, podendo causar nível reduzido de consciência, crise convulsiva e déficit motor. Além disso, pode causar sequelas como afasia, amnésia e dificuldades cognitivas, motoras ou sensoriais A HSE pode ser mais grave e exacerbada em indivíduos co-infectados com HIV/HSV-1, principalmente em grupos de comportamento de risco. Atualmente, o tratamento da HSE com antivirais anti-herpéticos apresenta elevada toxicidade, efeitos colaterais metabólicos e resistência ao antiviral. Uma alternativa aos tratamentos atuais é o uso de pequenas moléculas de RNA de interferência (siRNA) como inibidoras da replicação viral. Os objetivos desse estudo foram (1) avaliar a prevalência da infecção por HSV em 283 homens que fazem sexo com homens (HSH) de Campo Grande, Mato grosso do Sul e (2) utilizar o siRNA anti-HSV-1 conjugado com RVG-9R (siRNA:RVG-9R anti-HSV-1) para avaliar o tratamento da HSE in vivo. Inicialmente foi avaliado o perfil epidemiológico por sorologia e fatores de risco para infecção por HSV no grupo HSH. Posteriormente, foi avaliada a infecção por HSE em camundongos BALB/c inoculados com diferentes diluições da cepa HSV-1 EK pela análise dos sinais clínicos da HSE, IFN-\03B3 e replicação do HSV-1. Por fim, o tratamento com a molécula siRNA:RVG-9R anti-HSV-1 foi avaliado pela cinética da inibição da replicação viral, número de doses administradas e tratamento do siRNA:RVG-9R anti-HSV-1 combinado com aciclovir no modelo experimental da HSE Além disso, foi realizada a análise dos sinais clínicos da HSE, mortalidade e inibição da replicação viral. A soroprevalência do grupo HSH foi de 85,2% e fatores de risco como idade, nível educacional, baixa renda, práticas sexuais frequentes, uso de drogas e infecção por HIV foram associados com HSV. Animais infectados com HSV-1 EK em modelo experimental de HSE apresentaram sinais clínicos da HSE, alta mortalidade, aumento na concentração de IFN-\03B3 e replicação do HSV-1 no cérebro e gânglio trigeminal (TG). Na avaliação do tratamento com siRNA, animais tratados com duas doses de siRNA:RVG-9R anti-HSV-1 apresentaram tempo de sobrevivência prolongado, redução dos sinais clínicos da HSE e inibição da replicação viral no cérebro em 67,7% e TG em 85,7%. Além disso, animais tratados com siRNA:RVG-9R anti-HSV-1 combinado com aciclovir demonstraram redução dos sinais clínicos da HSE e 100% de sobrevivência, bem como inibição da replicação viral no cérebro de 83,2% e TG de 74,5%. Em conclusão, ocorreu alta prevalência do HSV e de coinfecção HIV/HSV, o que pode aumentar a possibilidade de infecções severas da HSE no grupo HSH, facilitando a manifestação clínica. Além disso, a molécula siRNA:RVG-9R anti-HSV-1 se mostrou bastante eficaz no tratamento da HSE, possibilitando a redução dos sinais clínicos de HSE, aumento de sobrevivência e inibição da replicação do HSV-1 em camundongos. Esses resultados demonstram que o siRNA pode ser utilizado como terapia antiviral alternativa no tratamento da HSE / Herpes simplex virus 1 (HSV-1) is a neurotropic virus responsible for clinical manifestations as herpes labialis, keratoconjunctivitis and herpetic encephalitis (HSE). Herpetic encephalitis (HSE) presents an annual incidence of 1-4 cases/million of inhabitants and causes reduced level of consciousness, convulsive crisis and motor deficit. Besides that, HSE can cause sequels as aphasia, amnesia and motor, cognitive or sensory difficulties. HSE can be more severe and exacerbate in individuals co-infected with HIV/HSV-1, especially in risk behavior group. Nowadays, HSE treatment with antiherpetic antivirals presents elevated toxicity, metabolic side effects and antiviral resistance. An alternative to current treatments is the use of of small interference RNA (siRNA) as inhibitors of viral replication. The aim of this study was (1) to evaluate the prevalence of HSV infection in 283 men who has sex with men (MSM) from Campo Grande, Mato Grosso do Sul and (2) to utilize siRNA anti-HSV-1 conjugated with RVG-9R (siRNA:RVG-9R anti-HSV-1) to evaluate HSE treatment in vivo. At first was evaluated the epidemiological profile by serological testing and risk factors of HSV infection in MSM. After that, was evaluated the HSE infection of BALB/c mice inoculated with different dilutions of HSV-1 EK strain by assessment of HSE clínical signs, IFN-\03B3 and HSV-1 replication. At last, siRNA:RVG-9R anti-HSV-1 treatment was evaluated by kinetics of viral replication inhibition, number of administered doses and treatment with siRNA:RVG-9R anti-HSV-1 combined with acyclovir in HSE experimental model. Besides that, was performed the analysis of HSE clínical signs, mortality and viral replication inhibition The seroprevalence of MSM group was of 85.2% and risk factors as age, education level, low income, frequently sexual practices, drug use and HIV infection were associated with HSV. Animals infected with HSV-1 EK in HSE experimental model presented HSE clínical signs, high mortality, high mortality, increase of IFN-\03B3 concentration and HSV-1 replication in brain and trigeminal ganglia (TG). When evaluating siRNA treatment, animals treated with two doses of siRNA:RVG-9R anti-HSV-1 showed prolonged survival time, reduction of HSE clínical signs and viral replication inhibition in brain (67.7%) and TG (85.7%). Also, animals treated with siRNA:RVG-9R anti-HSV-1 combined with acyclovir demonstrated reduction of HSE clínical signs and survival of 100%, as well as viral replication inhibition in brain (83.2%) and in TG (74.5%). In conclusion, occurred high prevalence of HSV and HIV/HSV co-infection, which can increase the possibility of HSE severity infections on HSH group and facilitate the clínical manifestation. Besides that, the molecule siRNA:RVG-9R anti-HSV-1 demonstrated to be quite effective on HSE treatment, enabling HSE clínical signs reduction, increase of survival and HSV-1 replication inhibition in mice. These results demonstrate that siRNA can be utilized as alternative antiviral therapy on HSE treatment

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:25:37Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-12-04Bitstream added on 2014-06-13T18:53:47Z : No. of bitstreams: 1 sakamoto_kp_me_araca.pdf: 546031 bytes, checksum: 6e34a6b9bbf11432d68486ead636a2f8 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A Leishmaniose visceral é uma enfermidade que possui uma grande variabilidade de manifestações clínicas, em humanos como em cães. Cães cronicamente infectados podem desenvolver desordens neurológicas, contudo, há poucos relatos que caracterizam as lesões e elucidam a patogenia da leishmaniose cerebral canina. Considerando a imunossupressão associada à leishmaniose visceral e que os patógenos oportunistas Toxoplasma gondii e Neospora caninum podem colaborar para a ocorrência de lesões no sistema nervoso central de cães naturalmente infectados por Leishmania chagasi, as populações de linfócitos B (CD79+) e T (CD3+) foram avaliadas no tecido nervoso de cães portadores de leishmaniose visceral e que possuem soropositividade para T. gondii e N. caninum. Lesões inflamatórias, caracterizadas por acúmulos de células mononucleares compostos principalmente por linfócitos T CD3+ predominaram em diversas regiões encefálicas dos cães infectados (P = 0,0012). Linfócitos B CD79+ foram detectados em pequena intensidade, não havendo diferença entre os grupos (P = 0,3604). Os resultados obtidos sugerem que a co-presença de leishmaniose visceral, toxoplasmose e neosporose é importante para o agravamento das lesões encefálicas, e que a imunossupressão gerada pela infecção por Leishmania não somente favorece a infecção por outros patógenos, mas colabora com esses, ocasionando lesões mais severas no tecido nervoso / Visceral leishmaniasis is a disease with great variability regarding the clinical manifestations, in humans as in dogs. Chronically infected dogs may develop neurological disorders, however, there are few reports that characterise the lesions and make clear the pathogenesis of the canine cerebral leishmaniasis. Considering the immunossupression associated to visceral leishmaniasis and that the opportunist pathogens Toxoplasma gondii and Neospora caninum may collaborate to the occurrence of lesions in the central nervous system of dogs naturally infected by Leishmania chagasi, we evaluated the population of B (CD79+) and T (CD3+ ) lymphocytes in the nervous tissue of dogs with visceral leishmaniasis and with seropositivity to T. gondii and to N. caninum. Inflammatory lesions, characterised by mononuclear cellsaccumulation, composed mainly by CD3+ T lymphocytes predominated in several encephalic regions of the dogs from the infected groups (P=0.0012). CD79+ B lymphocytes were detected in very small intensity and presented no difference among groups (P=0.3604). The results presented herein suggest that the co-presence of visceral leishmaniasis, toxoplasmosis and neosporosis is important for the worsening of the encephalic lesions, and that the immunossupression caused by Leishmania infection not only propitiates the infection by other pathogens, but collaborate with them, causing more severe lesions in the brain

Este projeto foi desenvolvido no Laboratório de Patologia Experimental do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA), com a aprovação da Comitê de Ética em Pesquisa do HCPA e com apoio financeiro parcial do Fundo de Incentivo à Pesquisa e Eventos do HCPA (FIPE). O experimento 1, chamado de projeto piloto, teve como objetivo implementar a técnica de IHQ para identificar a Listeria monocytogenes (L.m.), utilizando anticorpo policlonal antilisteria monocytogenes (Biodesig ). Vários testes foram realizados para acertar a diluição (1:1000) que foi diferente da preconizada pelo fabricante. Os blocos de parafina, de dez placentas provenientes de parto prematuro ou aborto foram utilizados para os cortes histológicos e a preparação das lâminas para a coloração Hematoxilina e Eosina (HE) e imunoistoquímica (IHQ). As lâminas foram identificadas por números para resguardar a identidade das pacientes. O resultado do HE mostrou alterações inflamatórias em oito placentas e L. m. foi identificada pelo IHQ em cinco dessas placentas. O objetivo do 2º experimento foi identificar a L. m. em tecido nervoso cerebral de ruminantes, utilizando a técnica implementada no projeto piloto. O material utilizado neste trabalho foi cedido pelo Setor de Patologia Veterinária do Departamento de Patologia da Universidade Federal de Santa Maria. Os casos estudados (2 ovinos, 1 caprino e 2 bovinos) tinham suspeitas clínicas diversas e as necropsias dos animais evidenciaram aspectos sugestivos da doença. Os cinco casos foram confirmados pelo IHQ, comprovando a importância da utilização desta técnica para o diagnóstico da listeriose no SNC de ruminantes. O 3º experimento objetivou identificar a L. m. em placentas encaminhadas ao Serviço de Patologia do HCPA no ano 2000. Da mesma forma que no experimento 1, as lâminas foram identificadas por números. Após o levantamento realizado nos registros dos exames anatomopatológicos (AP) deste setor, observou-se que 714 AP eram de placentas provenientes de aborto, parto prematuro e nascimento a termo examinados naquele período. Foram sorteados 254 AP para análise através de HE, revelando que 148 desses AP apresentavam alterações inflamatórias (corioamnionite, vilite e deciduite). Os blocos destas placentas foram utilizados para fazer as lâminas e realizar IHQ. A consulta aos prontuários dos casos com alterações inflamatórias permitiu observar que um deles tinha a confirmação bacteriológica de L. m. na placenta, tornando-se este o controle positivo. O controle negativo foi selecionado entre aqueles sorteados que não apresentavam alterações inflamatórias. A presença de L. m. foi identificada em 33,78% das placentas analisadas pela técnica IHQ. Corioamnionite e vilite foram as alterações inflamatórias que mostraram diferença estatística significativa nas placentas positivas. L. m. estava presente nas placentas de 1º, 2º e 3º trimestres gestacionais. A idade das gestantes, casos de aborto e/ou parto prematuro não mostraram diferença estatística significativa com a presença ou ausência de L. m. nas placentas. Abortos habituais ocorreram em pacientes com ou sem L. m. no tecido placentário. Conclusão: a técnica de imunohistoquímica pode ser utilizada para confirmar o diagnóstico histopatológico de listeriose em placentas e tecido nervoso central de ruminantes. / This project was developed at the Pathology Experimental Laboratory of Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA), after approval by the local Research Ethics Committee, and received partial financial support from the Research Incentive Fund (FIPE) of HCPA. The first experiment (or pilot scheme) aimed at implementing the immunohistochemistry (IHC) technique for the identification of Listeria monocytogenes (L.m.), by way of anti-listeria polyclonal antibody (Biodesign ). Several tests were performed in order to find the correct dilution (1:1000), which was different from that which had been recommended by the manufacturer. Paraffin-embedded blocks of placentas obtained from premature birth or abortion were used for the histological sections, and the slides were prepared for hematoxylin-eosin (HE) staining and immunohistochemistry. The slides were labeled with numbers in order to preserve patient anonymity. The result of HE staining revealed inflammatory disorders in eight placentas and L.m. was identified by IHC in five of them. The aim of the second experiment was to identify L.m. in the brain tissue of ruminants by employing the technique implemented in the pilot scheme. The material used in this study was provided by the Division of Veterinary Pathology of the Department of Pathology of Universidade Federal de Santa Maria. The animals studied (2 sheep, 1 goat and 2 cows) exhibited several clinical suspicions and the necropsy results were suggestive of the disease. The five cases were confirmed by IHC, highlighting the importance of this technique to the diagnosis of listeriosis in the CNS of ruminants. The aim of the third experiment was to identify L.m. in placentas and abortion specimens that had been referred to the Division of Pathology of HCPA in year 2000. As with the first experiment, the slides were numbered. After surveying the registries of pathoanatomical exams (PAs), we noted that 714 PAs corresponded to placentas, obtained from abortion, premature delivery and full-term birth, examined during that period. Two hundred fifty- four PAs were randomly selected (drawn out) for HE staining, and 148 of these PAs showed evidence of inflammatory disorders (chorioamnionitis, villitis and deciduitis). The blocks of these placentas were used for preparing the slides and carrying out IHC. The analysis of medical records in the cases with inflammatory disorders allowed us to observe that one of the records contained bacteriological confirmation of L.m. in the placenta (positive control). The negative control was chosen among the drawn-out PAs that did not present inflammatory disorders. L. m. was detected in 33.78% of the placentas analyzed by IHC. Chorioamnionitis and villitis showed significant statistical difference in the positive placentas. L. m. occurred in the 1st, 2nd and 3rd trimesters of pregnancy. The age of pregnant women, the cases of abortion and/or premature births were not statistically different as to the presence or absence of L. m. in the placentas. Habitual abortions occurred in patients with or without L. m in the placental tissue. Conclusion: Immunohistochemistry may be used to confirm the histopathological diagnosis of listeriosis in placentas and brain tissue of ruminants.

Orientador: Alexandrina Sartori / Banca: Maria Terezinha Serrão Peraçoli / Banca: Virmondes Rodrigues / Resumo: A necessidade de uma vacina mais segura e eficaz para a profilaxia da tuberculose (TB) e consenso na comunidade cientifica. A vacina genica contendo o gene da proteina de choque termico de 65 KDa (hsp65) do Mycobacterium leprae, e denominada pVAXhsp65, vem sendo investigada no Brasil. Esta vacina induz imunidade protetora contra a TB experimental em camundongos e cobaias. Como o gene desta vacina codifica uma proteina altamente conservada, existe a preocupacao de que a mesma induza autoimunidade. O objetivo deste trabalho foi, portanto, investigar se esta vacina modula o desenvolvimento da encefalite autoimune experimental (EAE), que e um modelo para estudo de Esclerose Multipla. Esta investigacao foi feita em tres etapas: padronizacao da EAE em ratos Lewis, caracterizacao da resposta imune induzida pela vacina pVAXhsp65 nestes animais e, finalmente, avaliacao do efeito desta vacina nas caracteristicas clinicas e imunologicas da EAE induzida nestes animais. Ratos Lewis femeas imunizados no coxim plantar com 50 Êg de mielina, associada ao Adjuvante Completo de Freund, desenvolveram doenca tipica, caracterizada por perda acentuada de peso, escore clinico elevado e alta producao de IFN-Á e TNF-¿. A imunizacao dos animais com 3 doses de pVAXhsp65 por via intramuscular nao desencadeou resposta imune humoral, entretanto, induziu resposta imune celular, caracterizada pela producao de IFN-Á por celulas esplenicas. Animais previamente vacinados desenvolveram EAE com caracteristicas clinicas e imunologicas similares as observadas em animais nao vacinados. Portanto, este trabalho permitiu padronizar de forma satisfatoria a EAE em ratos Lewis o que permitira a utilizacao deste modelo em futuras investigacoes. Alem disso, constatamos que a imunizacao destes animais com DNAhsp65 nao alterou o desenvolvimento tipico da EAE, ou seja, esta doenca nao se manifestou de forma mais grave ou branda. / Abstract: The development of an effective tuberculosis (TB) vaccine is an urgent priority. A genetic vaccine containing the heat shock protein (hsp65) gene from Mycobacterium leprae (pVAXhsp65) showed prophylactic and therapeutic activity in experimental TB. As anti-hsp65 immune response is present in both, multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), it is important to evaluate if pVAXhsp65 immunization affects EAE development. To test this possibility we first optimized EAE development in female Lewis rats. The best procedure included immunization in the footpad with 50 ìg of myelin associated with Complete Freund Adjuvant. This triggered a typical disease, characterized by significant weight loss, high clinical scores and elevated IFN-ã and TNF-á production. Immunization with pVAXhsp65 induced immune response characterized by absence of anti-hsp65 antibodies but significant IFN-ã production by splenic cells stimulated with recombinant rhsp65. Animals previously immunized with pVAXhsp65 developed an EAE with weight loss, clinical score and immune response very similar to non-immunized rats. This investigation allowed the optimization of a very promising model of multiple sclerosis that will benefit other research projects in our laboratory. In addition, these results showed that immunization of Lewis rats with pVAXhsp65 did not exacerbate or delay EAE development. / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-03-05Bitstream added on 2014-06-13T20:31:22Z : No. of bitstreams: 1 seger_j_me_botfm.pdf: 389931 bytes, checksum: 81c6da647f5f07996792ee710b5e8a1e (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A necessidade de uma vacina mais segura e eficaz para a profilaxia da tuberculose (TB) e consenso na comunidade cientifica. A vacina genica contendo o gene da proteina de choque termico de 65 KDa (hsp65) do Mycobacterium leprae, e denominada pVAXhsp65, vem sendo investigada no Brasil. Esta vacina induz imunidade protetora contra a TB experimental em camundongos e cobaias. Como o gene desta vacina codifica uma proteina altamente conservada, existe a preocupacao de que a mesma induza autoimunidade. O objetivo deste trabalho foi, portanto, investigar se esta vacina modula o desenvolvimento da encefalite autoimune experimental (EAE), que e um modelo para estudo de Esclerose Multipla. Esta investigacao foi feita em tres etapas: padronizacao da EAE em ratos Lewis, caracterizacao da resposta imune induzida pela vacina pVAXhsp65 nestes animais e, finalmente, avaliacao do efeito desta vacina nas caracteristicas clinicas e imunologicas da EAE induzida nestes animais. Ratos Lewis femeas imunizados no coxim plantar com 50 Êg de mielina, associada ao Adjuvante Completo de Freund, desenvolveram doenca tipica, caracterizada por perda acentuada de peso, escore clinico elevado e alta producao de IFN-Á e TNF-¿. A imunizacao dos animais com 3 doses de pVAXhsp65 por via intramuscular nao desencadeou resposta imune humoral, entretanto, induziu resposta imune celular, caracterizada pela producao de IFN-Á por celulas esplenicas. Animais previamente vacinados desenvolveram EAE com caracteristicas clinicas e imunologicas similares as observadas em animais nao vacinados. Portanto, este trabalho permitiu padronizar de forma satisfatoria a EAE em ratos Lewis o que permitira a utilizacao deste modelo em futuras investigacoes. Alem disso, constatamos que a imunizacao destes animais com DNAhsp65 nao alterou o desenvolvimento tipico da EAE, ou seja, esta doenca nao se manifestou de forma mais grave ou branda. / The development of an effective tuberculosis (TB) vaccine is an urgent priority. A genetic vaccine containing the heat shock protein (hsp65) gene from Mycobacterium leprae (pVAXhsp65) showed prophylactic and therapeutic activity in experimental TB. As anti-hsp65 immune response is present in both, multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), it is important to evaluate if pVAXhsp65 immunization affects EAE development. To test this possibility we first optimized EAE development in female Lewis rats. The best procedure included immunization in the footpad with 50 ìg of myelin associated with Complete Freund Adjuvant. This triggered a typical disease, characterized by significant weight loss, high clinical scores and elevated IFN-ã and TNF-á production. Immunization with pVAXhsp65 induced immune response characterized by absence of anti-hsp65 antibodies but significant IFN-ã production by splenic cells stimulated with recombinant rhsp65. Animals previously immunized with pVAXhsp65 developed an EAE with weight loss, clinical score and immune response very similar to non-immunized rats. This investigation allowed the optimization of a very promising model of multiple sclerosis that will benefit other research projects in our laboratory. In addition, these results showed that immunization of Lewis rats with pVAXhsp65 did not exacerbate or delay EAE development.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-06Bitstream added on 2014-06-13T19:51:42Z : No. of bitstreams: 1 pezavento_sfgz_me_botfm.pdf: 924376 bytes, checksum: e516f8ff865bbc2e7b75d6fc6e8d7450 (MD5) / A única vacina disponível contra a tuberculose (TB) é o bacilo de Calmette- Guérin (BCG), que é constituída por uma cepa de Mycobacterium bovis vivo atenuado, mas que possui variabilidade de proteção de 0 a 80%. Portanto é necessário o desenvolvimento de novas vacinas para o controle dessa infecção. Dentre as novas formulações profiláticas em teste para TB destacam-se as vacinas gênicas, sendo a DNAhsp65 a vacina investigada por nosso grupo. A DNAhsp65 é uma construção que contém o gene que codifica a proteína de choque térmico de 65KDa do M. leprae. Em virtude da elevada homologia entre a hsp65 micobacteriana e a hsp60 dos mamíferos, pode ocorrer mimetismo antigênico, ou seja, reatividade cruzada entre anticorpos e células T específicas para hsp65 micobacteriana e hsp60 humana. Nesse contexto, nosso grupo tem estudado o possível efeito colateral da DNAhsp65 no desenvolvimento de doenças autoimunes. Neste projeto foi investigado o efeito (proteção, exacerbação ou inocuidade) de diferentes formulações vacinais para TB na encefalite autoimune experimental (EAE). Os objetivos foram caracterizar a resposta imune específica induzida pela DNAhsp65 em ratos Lewis e avaliar o efeito imunomodulador tanto da estratégia clássica de imunização (3 doses de DNAhsp65 por via im) quanto da estratégia prime-boost BCG / DNAhsp65, nas características clínicas, imunológicas e histológicas da EAE. Quanto à imunogenicidade da DNAhsp65, foram testadas duas doses da vacina administradas via intramuscular (100 e 300 μg), sendo que somente a maior dose induziu IgG2b específica para hsp65 e produção de IFN- em cultura de células esplênicas estimuladas in vitro com rhsp65. Para avaliar o efeito da imunização com DNAhsp65 ou do prime-boost BCG /DNAhsp65 no desenvolvimento da EAE, os animais foram previamente imunizados com 3 doses de 300 μg de DNAhsp65 ou... / BCG is the only accepted vaccine against tuberculosis (TB) but its protective ability is very limited. Many new vaccines are therefore being evaluated. Our group has been working with DNAhsp65 that is a genetic construction containing the gene of hsp65 from Mycobacterium leprae. In previous experimental work we demonstrated that both, DNAhsp65 alone or associated with BCG, in a prime-boost regimen, were effective to control TB. A possible deleterious effect related to autoimmunity needed to be tested because hsp65 is highly homologous to the correspondent mammalian protein. In this investigation we tested the effect of a previous immunization with DNAhsp65 alone or associated with BCG in a rat model of multiple sclerosis. Female Lewis rats were immunized with 3 doses of DNAhsp65 or primed with BCG followed by 2 DNAhsp65 boosters. The animals were then immunized with myelin associated with Complete Freund Adjuvant to develop experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). The following parameters were evaluated: weight loss, clinical score, inflammation at the central nervous system (CNS) and immune response against myelin. No deleterious effect was associated with these immunizations schedules. Immunized animals equally lost weight, the clinical scores were similar and inflammation at the CNS did not increase. Interestingly, both procedures determined decreased inflammation in the brain and lumbar spinal cord. This was concurrent with a modulatory effect over cytokine production by peripheral lymphoid organs. Cell cultures from spleen and lymph nodes in vitro stimulated with myelin produced less IFN- and IL-10, respectively. This phenomenon was more clear in rats immunized with the genetic vaccine alone than with the prime-boost strategy. Together the results suggest that these strategies for TB prophylaxis would not accelerate or aggravate MS, being therefore... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA14MA131.pdf: 1544474 bytes, checksum: 4f496b43924d95177e7139e1fc3bca48 (MD5) Previous issue date: 2014-02-25 / This study aimed to investigate the use of immunocytochemistry (ICC) as a quick diagnostic method of rabies, and to perform a retrospective study of positive rabies cases of the Animal Pathology Laboratory (LAPA/CAV) archives, by using immunohistochemistry (IHC). The study was divided into two stages: data collection from the LAPA/CAV archives between 1987 and 2011, through the processing of paraffin embedded samples for histopathology and IHC; and clinical follow-up of susceptible animals between the years of 2012 and 2013, in which naturally dead or euthanized animals were necropsied. Central nervous system samples were collected for immunocytochemistry assessment, in addition to direct immunofluorescence (DIF) and histopathology with hematoxylin and eosin staining. The retrospective study showed that the affected animals ages ranged from 4 months to 10 years. Most frequently reported clinical signs were incoordination of the hind limbs, progressing to decumbency and death in 2-7 days. Northeastern (Vale do Itajaí) and eastern Santa Catarina were the regions with most of the cases submitted to the laboratory. During the clinical follow-up stage 13 animals presented the paralytic form of the disease, and one showed the furious form. The histological alterations observed in both stages of the study consisted of mild to severe perivascular lymphocytic and macrophagic meningoencephalitis, sometimes with foci of gliosis and neuronal necrosis; Negri inclusion bodies were observed in 85% of the retrospective study cases and 88% of the clinically assessed animals. IHC was essential to the diagnosis conclusion in the retrospective study, especially those in which no Negri bodies were found. The ICC was positive in 85,7% (12/14) of the cases, including one animal whose direct immunofluorescence was negative, and also proved to be a fast and easy-to-perform test. Rapid diagnostic techniques are extremely important as they allow for prevention and control measures to be taken quickly / Este trabalho teve como objetivos utilizar a imunocitoquímica (ICQ) como método rápido de diagnóstico para raiva, e realizar estudo retrospectivo de casos positivos de raiva nos arquivos do Laboratório de Patologia Animal (LAPA/CAV), através da imunohistoquímica (IHQ). O estudo foi dividido em duas etapas, levantamento de dados entre os anos de 1987 e 2011 no LAPA/CAV, através de processamento das amostras mantidas em parafina, para histopatologia e imunohistoquímica (IHQ), e acompanhamento clínico de animais suspeitos entre os anos de 2012 e 2013, no qual bovinos mortos naturalmente ou eutanasiados foram necropsiados. Amostras de sistema nervoso central foram coletadas para aplicação de ICQ, além de imunofluorecência direta e histopatologia com coloração de Hematoxilina e Eosina. No estudo retrospectivo observou-se que a idade dos animais afetados variou de quatro meses a 10 anos. Os principais sinais clínicos relatados foram incoordenação dos membros posteriores, evoluindo para decúbito e morte em 2 a 7 dias. As regiões do vale e leste de Santa Catarina foram às com maior numero de casos remetidos ao laboratório. Durante o acompanhamento clínico 13 animais apresentaram a forma paralítica da doença e um bovino apresentou forma furiosa. As alterações histológicas observadas, nas duas etapas do trabalho consistiram em meningonecefalite linfocítica e macrofágica perivascular, variando de leve a acentuada, por vezes com focos de gliose e necrose neuronal; Corpúsculos de inclusão de Negri foram observados em 85% dos casos do levantamento e 88% dos animais acompanhados clinicamente. A IHQ foi essencial para a conclusão do diagnóstico nos casos do estudo retrospectivo, especialmente aqueles em que não foram observadas inclusões de Negri. A ICQ foi positiva em 85,7% (12/14) dos bovinos com raiva, inclusive em um animal cuja IFD foi negativa, além de se mostrar um teste rápido e de fácil execução. Técnicas que buscam o diagnóstico rápido são extremamente importantes, pois permitem que medidas de prevenção e controle possam ser tomadas mais rapidamente

Orientador: Alexandrina Sartori / Coorientador: Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha / Banca: Carlos Henrique Camargo / Banca: Alexandra Ivo de Medeiros / Banca: José Mauricio Sforcin / Banca: Angel Maria Victoriano de Campos Soares / Resumo: A esclerose múltipla (EM) é uma doença desmielinizante que afeta o sistema nervoso central (SNC). A encefalite autoimune experimental (EAE) é o modelo animal mais empregado para investigar mecanismos imunopatogênicos, terapia e efeito de agentes infecciosos na EM. Neste contexto, utilizamos este modelo para avaliar o efeito de cepas produtoras de superantígenos (SAgs) no desenvolvimento da EAE. Para isto, camundongos C57BL/6 foram infectados com cepas distintas de S. aureus e 3 dias após foram submetidos à indução de EAE por imunização com MOG (myelin oligodendrocyte glycoprotein). O efeito das infecções foi avaliado através dos seguintes parâmetros: perda de peso corporal, escore clínico, inflamação do SNC e produção de citocinas por células esplênicas ou isoladas do SNC. A presença de células T CD4+CD25+Foxp3+ (Tregs) foi determinada em alguns experimentos. Os resultados obtidos foram organizados em 3 manuscritos. Na primeira etapa, comparamos 2 cepas de S. aureus quanto às suas habilidades de causar bacteremia, migração para o cérebro e efeito da infecção sobre a fase aguda da EAE. Foram escolhidas as cepas de S. aureus ATCC 51650 que é produtora do superantígeno TSST-1 (TSST-1+) e ATCC 43300 (TOX-) que não produz nenhum tipo de SAg. As 2 cepas causaram bacteremia e atingiram o cérebro, entretanto, só a cepa TOX- causou inflamação local. As 2 cepas reduziram os sintomas clínicos da EAE durante a fase aguda mas a cepa produtora de TSST-1+ determinou efeito mais acentuado. O efeito protetor de ambas foi associado com modulação da produção local e periférica de citocinas. No segundo manuscrito investigamos se o efeito protetor da infecção prévia com S. aureus era mantido na fase crônica da EAE. Constatamos que o efeito protetor perdurou até a fase crônica sendo também caracterizado por menor incidência da doença, menor perda de peso e escores clínicos mais baixos. O efeito da cepa produtora de... / Abstract: Multiple sclerosis (MS) is a demyelinating disease of the central nervous system (CNS). Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a widely accepted model used to investigate immunopathogenic mechanisms, therapy and the effect of infectious agents on MS. In this context, this model was employed to evaluate the effect of S. aureus superantigen (SAg) producer strains on EAE development. For this C57BL/6 mice were infected with distinct S. aureus strains and three days after infection they were submitted to EAE induction by immunization with MOG (myelin oligodendrocyte glycoprotein). The effect of infections was evaluated by body weight loss, clinical score, inflammation of the CNS and cytokine production by spleen cells or CNS cells. The presence of CD4+CD25+Foxp3+ T cells (regulatory T cells) was determined in some experiments. The results were organized into 3 manuscripts. Initially, we compared the ability of 2 S. aureus strains to cause bacteremia, to migrate to the brain and their effect in the acute phase of EAE. The S. aureus strains ATCC 51650 that is a TSST-1 producer (TSST-1+) and ATCC 43300 that does not produce any SAg (TOX-) were used in this work. Both S. aureus strains were capable to cause bacteremia and migrate of the brain, however, only TOX- group caused inflammation in the brain. Both S. aureus strains were able to decrease the severity of EAE during the acute phase, but TSST-1+ strain triggered a more accentuated protective effect. Protective activity of both S. aureus strains was associated with local and peripheral cytokine modulation. In the second manuscript we investigated if the protective effect of the previous infection with S. aureus remained during the chronic disease phase. The results indicated that protection persisted during chronic EAE phase and was characterized by lower disease incidence, smaller body weight loss and also reduced clinical scores. The effect of the TSST-1+ was also more... / Doutor

Orientador: Antonio Carlos Alessi / Coorientador: Noeme Sousa Rocha / Banca: Gisele Fabrino Machado / Banca: Mary Suzan Varaschin / Banca: Rosemeri de Oliveira Vasconcelos / Banca: Luiz Carlos Marques / Resumo: O BoHV-5 é um alfa herpesvírus neurovirulento, que causa meningoencefalite fatal em bezerros. A morbidade é baixa contrastando com uma alta mortalidade, embora alguns animais possam-se recuperar. Varias pesquisas tem sido desenvolvidas para determinar a patogênese deste tipo de doença. No presente trabalho coelhos experimentalmente infectados com o Herpesvírus Bovino 5 (BoHV-5) foram submetidos a análise imuno-histoquímica e molecular, mediante a real time PCR, para descrever a resposta inflamatória em seis diferentes regiões do seu encéfalo. Todos os animais mostraram sinais neurológicos severos e foram eutanasiados vinte dias após a infecção inicial. Microscopicamente foi descrita uma meningoencefalite não supurativa, caracterizada por meningite, manguitos perivasculares mononucleares e malacia, mas não foram observados corpúsculos de inclusão viral. Os linfócitos T constituíram uma alta percentagem das células mononucleares envolvidas na neuroinflamação. Não foram encontradas diferenças significativas na resposta astrocitária quando comparados o grupo experimental e o grupo controle (p > 0,05). A quantificação viral pela qPCR permitiu achar partículas virais em todas as regiões encefálicas, de todos os animais do grupo experimental, sendo diretamente proporcional a quantidade de vírus e a visualização de lesões histológicas no encéfalo dos coelhos, assim como a imunodetecção do BoHV-5 pela imunohistoquímica. É possível suspeitar de um forte envolvimento do sistema imunitário do hospedeiro que fez a maioria dos animais reagir de maneira diferente ante a mesma quantidade do inóculo viral ministrado / Abstract: The BoHV-5 is a neurovirulent alpha herpesvirus, which causes fatal meningoencephalitis in calves. The morbidity is low in contrast with a high mortality, although some animals can heal. Several surveys have been developed trying to better understand the pathogenesis of this type of disease. In this study rabbits experimentally infected with bovine herpesvirus 5 (BoHV-5) were subjected to immunohistochemical and molecular analysis by real time PCR, to describe the inflammatory response in six different regions of his brain. All animals showed severe neurological signs and were euthanized twenty days after the initial infection. Microscopically was described a meningoencephalitis characterized by nonsuppurative meningitis, mononuclear perivascular cuffs and malacia, but were not observed viral inclusion corpuscles. T lymphocytes constituted a high percentage of mononuclear cells involved in neuroinflammation and there were no significant differences in astrocyte response when comparing the experimental and control groups (p> 0.05). The viral quantification by qPCR allowed found viral particles in all brain regions of all experimental animals, being directly proportional to the amount of virus and the visualization of lesions in the brain of rabbits, as well as immunodetection of BoHV-5 by immunohistochemistry. It is possible to suspect a strong engagement of the host immune system that made the majority of animals respond differently compared to the same administered amount of viral inoculum / Doutor