Las investigaciones de actividades enzimáticas en la orina de los niños han sido escasas hasta el momento presente. Además, en ocasiones han adolecido de algunos defectos metodológicos, como por ejemplo, haberse realizado sobre la base de un número relativamente escaso de pacientes, emplear criterios diagnósticos poco claros o utilizar métodos que carecían de la necesaria precisión. En 1973, APPEL y cols. efectuaron en 1.973 determinaciones sobre la actividad enzimática urinaria (LDH, Fosfatasas Alcalinas y LAP) en un conjunto de 64 niños. En las últimas líneas de su trabajo invitaban a investigar la LAP durante el curso evolutivo de enfermedades inflamatorias y leucosis en general, y en particular de nefropatías e infecciones urinarias ascendentes. También proponían determinar la LAP urinaria ya durante el ingreso en el Hospital, como un componente más del análisis de orina habitual en los niños. Por tanto, en este trabajo se pretende estudiar la actividad LAP urinaria en la patología nefrourológica infantil más corriente, pero cumpliendo todos los requisitos actualmente admitidos en las determinaciones enzimáticas y evitando los errores ya comentados. Para conseguirlo es preciso: - Trabajar sobre un número relativamente alto de pacientes. - Aclarar adecuadamente los criterios diagnósticos - Especificar los efectos que las maniobras instrumentales pueden tener sobre la actividad enzimática urinaria. - Usar métodos con precisión demostrada y específicos para la enzima. - Emplear un rango de normalidad estadísticamente definido. - Confrontar los datos obtenidos con entidades nosológicas determinadas y perfectamente documentadas. - Dializar previamente la orina para arrastrar los inhibidores. - Investigar la LAP durante el curso evolutivo de enfermedades nefrourológicas y no nefrourológicas. La investigación se ha efectuado cumpliendo en todo momento estos requisitos. Los objetivos perseguidos han sido: 1.- Determinar los valores normales de la LAP-O (X +/- 2s) en los niños sanos de edades comprendidas entre 1 mes y 12 años. Para ello se dividirán en tres grupos de edad creciente y se estudiará la posible diferencia "muy significativa" (p menor de 0,01) entre los sexos. Se unificarán los valores obtenidos calculando los parámetros estadísticos del "grupo normal", que se usará como punto de referencia para determinar las posibles diferencias significativas con los grupos patológicos. 2.- Determinar las variaciones de LAP-O en las enfermedades no nefrourológicas, valorando el aumento de actividad enzimática en la fase aguda de la misma. 3.- Determinar las variaciones de LAP-O en las enfermedades nefrourológicas, estudiando su aumento y la evolución de las cifras a lo largo de la enfermedad. Se discutirá su valor diagnóstico, valor diagnóstico diferencial, valor pronóstico y posibles correlaciones con la LAP-sérica, proteinuria (cantidad y selectividad) y hematuria.

La hiperplasia suprarrenal congénita (HSC) comprende un conjunto de trastornos hereditarios de la esteroidogénesis, causados por la deficiencia de alguna de las enzimas necesarias para la conversión del colesterol en cortisol. El más frecuente es el déficit en 21-hidroxilasa, responsable de cerca del 90% de los casos de HSC. El déficit en 21-hidroxilasa es una enfermedad hereditaria autosómica recesiva, causado por una alteración genética en el gen CYP21B que codifica la enzima.Esta enfermedad presenta un espectro muy amplio de manifestaciones clínicas; desde formas severas que se presentan al nacimiento, en las que la virilización puede ir o no acompañada de un síndrome pierde sal, hasta formas más leves en que los signos de virilización se presentan más tardíamente. La incidencia de las formas clásicas de este déficit, oscila alrededor de 1:10.000-15.000 nacimientos, mientras la de las formas no clásicas se ha estimado en 1:1.000 en la población blanca, con marcadas variaciones étnicas.El objetivo ha sido la caracterización clínica, biológica y genética de la HSC por déficit en 21-hidroxilasa de una población de la Comunitat Autònoma de Catalunya, con el fin de poder realizar un diagnóstico etiológico concluyente y establecer el consejo genético familiar completo.Han colaborado 53 familias (106 cromosomas no emparentados) con al menos un hijo diagnosticado de HSC por déficit en 21-hidroxilasa, siendo el total de individuos estudiados de 214. De este total, 71 son pacientes que según los síntomas clínicos fueron clasificados en: 13 SW; 5 SV y 53 NC; 102 son progenitores y 41 son hermanos de dichos pacientes, ninguno de ellos clínicamente afecto.Para la determinación de la función hormonal se practicó una prueba de estimulación con corticotropina (test de ACTH), con valoración de las concentraciones plasmáticas de 17-hidroxiprogesterona antes y tras 30 minutos de la inyección. La determinación de los antígenos de Clase I y Clase II del Sistema HLA, se realizó mediante la técnica de Microlinfocitotoxicidad. El análisis genético consistió en la detección de grandes reordenamientos mediante la técnica de "Southern blot", y la detección de nueve de las mutaciones puntuales más comunes mediante el diseño de una nueva metodología en la que se emplean dos estrategias según la mutación a detectar: ganancia o pérdida de al menos una diana de restricción en el producto de PCR amplificado a partir de DNA genómico o creación de una diana de restricción por amplificación (ACRS-PCR) y posterior digestión con una enzima de restricción apropiada.El test de ACTH se confirma como fiable, ya que no se observaron falsos positivos ni falsos negativos en los valores obtenidos de 17-hidroxiprogesterona post estimulación. El nomograma de 17-hidroxiprogesterona proporciona un patrón hormonal que facilita, en la mayoría de los casos, el diagnóstico de las distintas formas de presentación clínica del déficit. No se observó la presencia del antígeno HLA-Bw47 en ninguno de los grupos analizados. Las formas no clásicas se encuentran significativamente asociadas al haplotipo HLA-B14-DR1, mientras que las formas clásicas al antígeno HLA-B5(w51).La metodología utilizada para el análisis molecular del gen ha permitido detectar la mutación causal en el 89,62% de los cromosomas afectos, evaluados globalmente, consolidándose ésta como altamente efectiva en el diagnóstico de esta patología. Las mutaciones más frecuentes observadas han sido: Intrón 2 (50%) en SW; Intrón 2 (50%) y I172N (16,6%) en SV y V281L (61,5%) en NC. El análisis de los pedigrees ha permitido diagnosticar veintiséis formas crípticas y revelar en dos casos la presencia de mutaciones originadas de novo. La concordancia hallada entre el genotipo y el fenotipo ha sido del 97,2%, de ahí, que las predicciones desde el genotipo han de ser hechas todavía con gran cautela.

Las frutas y sus derivados (especialmente zumos y néctares) y como principal bebida alcohólica el vino, tienen una gran importancia económica y social en los países mediterráneos. La definición de los parámetros de calidad aromática es de gran interés tanto para los organismos legislativos como para las empresas productoras. El objetivo principal de este trabajo ha sido la caracterización aromática de bebidas derivadas de fruta. Para eso, primero hay que establecer un método analítico que sea adecuado para el control de calidad, por tanto tiene que ser rápido, fácil, económico y respetuoso con el medio ambiente. En la elaboración de los derivados de fruta se utilizan de forma habitual enzimas pectolíticos, lo que supone una modificación de la composición en polisacáridos y, dado el papel de estos en la retención de los compuestos volátiles, esto puede afectar a la percepción. Por tanto el segundo objetivo ha sido estudiar la influencia de los polisacáridos sobre la composición volátil.Después de una revisión detallada se ha escogido como método analítico la Microextracción en Fase Sólida (SPME) con la fibra de PDMS. Esta técnica se ha aplicado a zumos y néctares de albaricoque, melocotón y pera de distinto origen (convencional y biológico). Se ha identificado un amplio perfil aromático y a partir de estos resultados se ha establecido la capacidad discriminante del método ya que a partir de los compuestos volátiles se han separado las muestras según la fruta y además según el tipo de producción. También se ha aplicado el método a dos cavas (vino espumoso de calidad elaborado en una región determinada) de distinto tiempo de envejecimiento. Se han ensayado dos fibras, la PDMS y, la más novedosa de DVB-CAR-PDMS. El método de SPME con la fibra de triple recubrimiento, permite discriminar los cavas según un parámetro mucho más exigente como son los meses de rima. Para estudiar la influencia de los polisacáridos sobre la composición volátil es necesario determinar la composición en polisacáridos según su peso molecular, mediante un método ventajoso para ser utilizado rutinariamente. El método escogido ha sido la cromatografía de gel permeación (GPC). La capacidad discriminante de este método se ha demostrado en zumos y néctares comerciales, diferenciando entre el origen convencional y biológico de estos zumos y, en mostos de uva diferenciando entre extractos que provienen de vides con distinta producción (kg/ha). Finalmente, los dos métodos han sido aplicados a zumos de albaricoque, melocotón y pera elaborados en el laboratorio de los cuales se han obtenido tres tipos: los control (sin tratamiento enzimático), un segundo zumo al que se ha aplicado un enzima para facilitar la extracción y finalmente un tercer grupo al que se ha aplicado un enzima para clarificar. La composición en polisacáridos varía en función de la fruta estudiada e incluso de la variedad, pero en general los enzimas incrementan la composición en polisacáridos de menor peso molecular. Se han identificado numerosas familias químicas en el perfil volátil obtenido por SPME y fibra DVB-CAR-PDMS y al estudiar el efecto de los enzimas sobre los volátiles, el tratamiento parece ser útil para los zumos de albaricoque dando lugar a zumos más ricos en terpenos y norisoprenoides (de sabor agradable); mientras que parece no favorecer aromáticamente los zumos de melocotón y pera ya que disminuyen las lactonas y los ésteres de decadienoato que son los compuestos impacto de estas frutas, respectivamente. / Fruits and its derivatives have a great social and economic importance in the Mediterranean Countries. The present study aims at the identification of characteristic volatile compounds in fruit derived beverages using a rapid, easy, economic and respectful with the environment method. The influence of the polysaccharides to the volatile compounds was also examined.Solid Phase Microextraction (SPME) using PDMS fibers was the technique established for this study. This extraction method was applied to different commercial juices and nectars, such as apricot, peach and pear, which were processed in an organic and conventional way. A wide range of chemical families were obtained and although the discriminate capacity was checked. Using the same method two different aging series of cava (Spanish sparkling wine) were analyzed. The technique employed was able to differentiate the analyzed cavas according to the ageing time.In order to study the influence of polysaccharides to the volatile composition, Gel Permeation Chromatography (GPC), a molecular weight method, was used. GPC showed a high discriminate capacity not only in grapes of different yields (kg/ha) and different maturation indexes but also in juices and nectars of different origins and production processes, conventional and organic.Finally, the SPME and GPC methods were applied to apricot, peach and pear juices elaborated in the laboratory. After two enzymatic treatments applied during the manufacture of the fruit juices, the behavior of volatile compounds was described. Chemical families, never before identified in these fruits, were found. The enzymes used for the clarification and extraction of fruit juices modified the polysaccharides, and as a result of that the volatile composition. In apricot the enzymes enhanced some varietal compounds, such as terpenes and norisoprenoids. In contrast to apricot, the amount of lactones and decadienoate esters, the character impact compounds of peach and pear, didn't get favored by the enzymes used.

La present Tesi Doctoral es presenta com una agrupació de quatre publicacions que resumeixen el treball realitzat al Departament de Genètica de la Facultat de Biologia de la Universitat de Barcelona. El principal objectiu és la caracterització funcional de les regions estructurals de la isoforma muscular de l’enzim deubiquitinat USP25, inicialment definides amb eines bioinformàtiques. A més a més, es pretén fer un estudi de noves interaccions moleculars tipus proteïna-proteïna per la cerca de nous substrats o reguladors enzimàtics. La cèl•lula eucariota posseeix, entre altres, un sistema senyalitzador intracel•lular basat en una família de pèptids, el representant dels quals és la ubiquitina. Aquest sistema presenta diferents categories funcionals, entre elles, els enzims deubiquitinants, un centenar a l’espècie humana. Aquests enzims hidrolitzen l’enllaç que uneix la ubiquitina als seus precursors o substrats, mantenint així l’homeostasi d’aquest pèptid dins la cèl•lula. Una alteració de la seva funció pot portar diferents conseqüències depenent de la via metabòlica que es vegi afectada, doncs suposa una desregulació estequiomètrica dels substrats ubiquitinants respecte els no ubiquitinats. L’enzim deubiquitinant USP25 es va descriure en el grup d’investigació d’aquesta tesi durant la cerca de nous gens relacionats amb la síndrome de Down. Un cop caracteritzat funcionalment com una proteasa específica d’ubiquitina, els estudis d’expressió van mostrar l’existència de tres isoformes proteiques, una d’elles, USP25m, restringida al teixit muscular i cardíac. Tenint en compte que en el fenotip dels pacients amb síndrome de Down, entre altres trets, hi ha deficiència cardiovascular i atonia muscular, els esforços del grup es van centrar en la descripció i anàlisi d’aquesta isoforma. Els primers estudis van mostrar la seva situació citosòlica, l’expressió correlativa amb la diferenciació de cèl•lules musculars i la relació específica amb diverses proteines del sarcòmer. En el treball realitzat per la present Tesi Doctoral, s’han caracteritzat funcionalment diferents regions reguladores descrites a nivell bioinformàtic, així com també s’ha analitzat la seva implicació fisiológica a la funció d’USP25m. A més a més, mitjançant un estudi de cerca de nous interactors proteics, s’ha trobat una nova molècula que pertany a la mateixa via senyalitzadora i que es relaciona de manera específica amb USP25m, la lligasa d’ubiquititna MKRN1 (makorin 1) Mitjançant l’ús de diferents construccions amb delecions i mutacions puntuals de la proteïna que afecten a les regions d’interès, s’ha arribat a diferents conclusions, entre elles, que USP25m és monoubiquitinat i té la capacitat d’autodeubiquitinar-se. La monoubiquitinació en regula la seva activitat enzimàtica i es proposa un mecanisme de regulació basat en la conjugació alternativa de SUMO (una altra molècula de la família de la ubiquitina) i ubiquitina, en el mateix residu aminoacídic, la lisina 99 (Lys99). Els dominis d’unió a ubiquitina regulen el reconeixement de substrat i afavoreixen la monoubiquitinació. USP25m oligomeritza dins la cèl•lula i es troba present en diferents formacions proteiques d’elevat pes molecular. S’ha comprovat la relació específica amb la nova lligasa MKRN1 i es suggereixen diferents escenaris moleculars on poden trobar-se inclosos els dos pèptids / The main aim of the present PhD work, titled “Structural domains and new protein interactions of the deubiquitinating enzyme USP25”, is the functional characterisation of the structural domains of the muscle isoform of USP25, USP25m, as well as the analysis of new protein‐protein interactions. The ubiquitin‐proteasome pathway is widely known as the preferential system to get ride of old or non‐functional proteins. Recently, it has become more apparent that this is not the only function. Ubiquitin (Ub) and all ubiquitin–like (UbLs) molecules acted as regulatory tags involved in different cellular events as subcellular localization, enzyme activation, DNA repair, etc. The intricate Ub‐signalling networks require a tight regulation of both conjugation and deconjugationprocesses, which are controlled by ubiquitin ligases and deubiquitinating enzymes (DUBs), respectively. USP25 is a DUB described while looking for novel genes involved in Down syndrome phenotype. First studies showed that it encoded three alternative protein isoforms, one of them, muscle specific. This muscle isoform, USP25m, is a cytosolic protein, upregulated during myogenesis that interacts in a specific manner with different sarcomeric proteins. Using an “in silico” approach, we were able to identify different structural domains, among them three ubiquitin binding domains (UBDs), and we aimed to characterise its role on USP25m function. By generating a collection of deletion and punctual mutants of the regions of interest, we conclude that USP25m is monoubiquitinated and that the UBDs modulate this modification. The preferential site for monoubiquitination is lysine 99 (K99), a residue that has been reported to undergo sumoylation (SUMO conjugation, being SUMO an UbL). According to our results, mutation of the K99 residue diminishes the deubiquitinating function, proposing a mechanistic model for USP25m regulation based on alternative conjugation of Ub and SUMO on the same residue, K99. Futhermore, while seeking new protein interactions of USP25m we identified Makorin Ring finger protein 1 (MKRN1), which belongs to an ubiquitin ligase family, as a putative interactor. We were capable of characterise its interaction and propose different cellular scenarios were they could interact. / The main aim of the present PhD work, titled “Structural domains and new protein interactions of the deubiquitinating enzyme USP25”, is the functional characterisation of the structural domains of the muscle isoform of USP25, USP25m, as well as the analysis of new protein‐protein interactions. The ubiquitin‐proteasome pathway is widely known as the preferential system to get ride of old or non‐functional proteins. Recently, it has become more apparent that this is not the only function. Ubiquitin (Ub) and all ubiquitin–like (UbLs) molecules acted as regulatory tags involved in different cellular events as subcellular localization, enzyme activation, DNA repair, etc. The intricate Ub‐signalling networks require a tight regulation of both conjugation and deconjugationprocesses, which are controlled by ubiquitin ligases and deubiquitinating enzymes (DUBs), respectively. USP25 is a DUB described while looking for novel genes involved in Down syndrome phenotype. First studies showed that it encoded three alternative protein isoforms, one of them, muscle specific. This muscle isoform, USP25m, is a cytosolic protein, upregulated during myogenesis that interacts in a specific manner with different sarcomeric proteins. Using an “in silico” approach, we were able to identify different structural domains, among them three ubiquitin binding domains (UBDs), and we aimed to characterise its role on USP25m function. By generating a collection of deletion and punctual mutants of the regions of interest, we conclude that USP25m is monoubiquitinated and that the UBDs modulate this modification. The preferential site for monoubiquitination is lysine 99 (K99), a residue that has been reported to undergo sumoylation (SUMO conjugation, being SUMO an UbL). According to our results, mutation of the K99 residue diminishes the deubiquitinating function, proposing a mechanistic model for USP25m regulation based on alternative conjugation of Ub and SUMO on the same residue, K99. Futhermore, while seeking new protein interactions of USP25m we identified Makorin Ring finger protein 1 (MKRN1), which belongs to an ubiquitin ligase family, as a putative interactor. We were capable of characterise its interaction and propose different cellular scenarios were they could interact.

Saccharomyces cerevisiae posseeix dues glutatió transferases (GST) anomenades Gtt1i Gtt2, amb capacitat de conjugar una molècula de glutatió amb el substrat estàndarCDNB. Aquests dos enzims no són clasificables dins de les classes convencionalsdescrites en base a l'estructura de les GST d'eucariotes superiors, encara que guardencerta similitud estructural amb els membres de la classe Zeta. En aquesta memòria esdescriu la caracterització de tres GST de classe Omega en S. cerevisiae anomenadesGto1, Gto2 i Gto3, codificades respectivament per les ORFs YGR154c, YKR076w iYMR251w. Els enzims d'aquesta classe no tenen activitat sobre CDNB, però són activescom tiol oxidoreductases i posseïxen activitat dehidroascorbat reductasa i dimetilarsenatreductasa. La primera d'elles, Gto1, és peroxisomal i posseïx un senyal de localitzacióde tipus PTS1 en la regió C-terminal. Aquest senyal és reconeguda pel transportadorperoxisomal Pex5, que facilita la seva internalizació en aquest organul. D´altre banda,Gto2 i Gto3 tenen localització citoplàsmica. Els gens GTO de S. cerevisiae s'induïxenper estrès oxidativu però amb patrons distints per als tres gens. La dependènciad'aquesta expressió dels factors de trascripció Yap1, Msn2 i Msn4 es relaciona amb lapresència de seqüències YRE i STRE en els promotors dels gens GTO. El mutant Dgto1és sensible a l'agent oxidant diamida i té una concentració intracel· lular de glutatiómenor que la soca silvestre. Aquest fenotip es relaciona amb que el triple mutant Dgtt2Dgtt1 Dgto1 sigui sensible al cadmi, indicant que les tres GST Gtt1, Gtt2 i Gto1intervenen en la detoxificació d'aquest metall. Altre fenotip rellevant és la dificultat delmutant Dgto1 per a créixer en medis de cultiu amb àcid oleic com única font de carboni,indicant que les funcions peroxisomals en el mutant estan afectades. L'absència deGTO1 en S. cerevisiae causa així mateix el descens en l'expressió de gens involucratsen la via de síntesi de cisteïna i metionina. Com a conseqüència, el mutant Dgto1 creixamb dificultat en absència de treonina, serina o lisina. La manca de GTO1 en S.cerevisiae impedeix que utilitzi eficientment la cisteïna o la cistationina com úniquesfonts de sofre, manifestant defectes en la transulfuració, procés que permet la síntesi demetionina a partir de cisteïna. Això suggereix que Gto1 podria estar regulant l'activitatcistationina b-liasa de Str3 mitjançant la seva activitat tiol oxidoreductasa, atès que Str3també és peroxisomal. Atès que la cisteína 387 de Str3 és important per a la sevaactivitat biològica i està conservada en les cistationina b-liasas d'altres espècies defongs, aquest residu podria ser diana de Gto1 per a la regulació de l'estat redox de laproteïna Str3RESÚMENSaccharomyces cerevisiae posee dos glutatión transferasas (GST) denominadas Gtt1 yGtt2 con capacidad de conjugar una molécula de glutatión con el sustrato estándarCDNB. Estas dos enzimas no son clasificables dentro de las clases convencionalesdescritas con base en la estructura de las GST de eucariotas superiores, aunqueguardan cierta similitud estructural con las de clase Zeta. En esta memoria se describela caracterización de tres GST de clase Omega en S. cerevisiae denominadas Gto1,Gto2 y Gto3, codificadas por las ORF YGR154c, YKR076w y YMR251w. Las enzimasde esta clase no tienen actividad sobre CDNB, pero son activas como tioloxidoreductasa y poseen actividad dehidroascorbato reductasa y dimetilarsenatoreductasa. La primera de ellas, Gto1, es peroxisomal y posee una señal de localizaciónde tipo PTS1 en la región C-terminal. Dicha señal es reconocida por el transportadorperoxisomal Pex5, que facilita su internalización en este organelo. Por otra parte, Gto2y Gto3 tienen localización citoplásmica. Los genes GTO de S. cerevisiae se inducen porestrés oxidativo pero con patrones distintos para los tres genes. La dependencia de estaexpresión de los factores de trascripción Yap1, Msn2 y Msn4 se relaciona con lapresencia de secuencias YRE y STRE en los promotores de dichos genes. El mutanteDgto1 es sensible al agente oxidante diamida y tiene una concentración intracelular deglutatión menor que la cepa silvestre. Este fenotipo se relaciona con que el triplemutante Dgtt1 Dgtt2 Dgto1 sea sensible al cadmio, indicando que las tres GST Gtt1,Gtt2 y Gto1 intervienen en la detoxificación de este metal. Otro fenotipo relevante es ladificultad del mutante Dgto1 para crecer en medios con ácido oleico como única fuentede carbono, indicando que las funciones peroxisomales en dicho mutante estánafectadas. La ausencia de GTO1 en S. cerevisiae causa así mismo el descenso en laexpresión de varios genes involucrados en la vía de síntesis de cisteína y metionina.Como consecuencia, el mutante Dgto1 crece con dificultad en ausencia de treonina,serina o lisina. La ausencia de Gto1 en S. cerevisiae impide que utilice eficientementela cisteína o la cistationina como únicas fuentes de azufre, manifestando defectos en latransulfuración, proceso que permite la síntesis de metionina a partir de cisteína. Ellosugiere que Gto1 podría estar regulando la actividad cistationina b-liasa de Str3mediante su actividad tiol oxidoreductasa, dado que Str3 también es peroxisomal.Dado que la cisteína 387 de Str3 es importante para su actividad biológica y estáconservada en las cistationina b-liasas de otras especies de hongos, este residuopodría ser diana de Gto1 para la regulación del estado redox de la proteína Str3.SUMARYSUMMARYSaccharomyces cerevisiae contains two glutathion transferases (GST) named Gtt1 andGtt2, which are enzymes with glutathione conjugating activity with the standard substrateCDNB. These two enzymes are not classified into the conventional classes that havebeen established based on the structure of mammalian GST, although they keep certainstructural similarity with Zeta class members. In this report, we describe thecharacterization of three S. cerevisiae Omega class GST named Gto1, Gto2 and Gto3,coded by ORFs YGR154c, YKR076w and YMR251w, respectively. The enzymes ofthis class do not exhibit activity with CDNB but they are active as tiol oxidoreductases,dehydroascorbate reductases and dimetilarsonate reductases. The first of them, Gto1,is located at the peroxisome and is targeted to this organelle throught a C-terminalPTS1-type sequence. This sequence is recognized by the peroxisomal transporterPex5 that facilitates peroxisomal import. On the other hand, Gto2 and Gto3 are at thecytosol. The GTO genes of S. cerevisiae are induced by oxidative stress, although theexpression patterns are different for the three genes. The expression of GTO genesdepends on Yap1, Msn2 and Msn4 transcription factors and correlates with thepresence of YRE and STRE sequences in the promoters of these genes. The absenceof GTO1 causes a hipersensitivity to the oxidant diamide in S. cerevisiae and reducesthe intracelular concentration of glutathione, compared with the wild type stain. Thisphenotype is related to cadmium sensitivity of the Dgtt1 Dgtt2 Dgto1 triple mutant,indicating that Gtt1, Gtt2 and Gto1 participate in the response to cadmium toxicity.Another rellevant phenotype of S. cerevisiae cells lacking GTO1 is the growth defectwith oleic acid as the sole carbon source, indicating that the peroxisome funtions areaffected in the mutant. This mutant also grows defficiently in the absence of threonine,serine or lysine in the growth medium. Lack of GTO1 function also affects negativelythe expression of several genes involved in methionine and cisteine sinthesis. As aconsecuence, the Dgto1 mutant shows defective growth in a medium with cisteine orcistationine as the sole sulfur source as a consequence of defective trasulfuration, aprocess that allows methionine synthesis from cisteine. This suggests that Gto1 couldregulate the cystathionine b-lyase activity of Str3 through its thiol oxidoreductaseactivity, since Str3 is also peroxisomal. As the cysteine 387 residue of Str3 is importantfor the biological activity of this protein and is conserved in fungal species, this residuecould be a target of Gto1 for the regulation of the redox state of Str3.

L'objectiu principal d'aquesta Tesi Doctoral va ser avaluar la influència queexercia un període de 2 o 4 setmanes en fred normal (després de l'emmagatzematge encondicions d'atmosfera controlada amb molt baix nivell d'oxigen, durant un períodetotal de 19 i 30 setmanes) sobre la producció de compostos volàtils, la qualitat estàndardi la qualitat sensorial en pomes 'Fuji Kiku® 8' (campanya 2005/06 i 2006/07) i en pomes'Golden Reinders®' (campanya 2006/07 i 2007/08). Després de cada períoded'emmagatzematge, els fruits es van mantenir a 20 ºC durant 1 i 7 dies, dates en lesquals es van realitzar els diferents anàlisis. El segon any de Tesi (campanya 2006/07) esva avaluar també, per a totes dues varietats, l'efecte de 2 dates de collita (situades dinsl'interval comercial de collita a la zona) sobre els paràmetres anteriorment esmentats.Aquell mateix any, es van determinar, a més, les activitats dels enzims lipoxigenasa ihidroperòxid liasa relacionades amb la biosíntesi dels compostos volàtils. Finalment, esva dur a terme un estudi amb la varietat 'Golden Reinders®', en el qual es va realitzar unseguiment setmanal dels diferents paràmetres esmentats al llarg de 28 dies depermanència a 20 ºC (després de l'emmagatzematge en cambra durant 30 setmanes), perpoder així estimar el període de vida útil dels fruits.En general, un període de 4 setmanes en fred després de l'emmagatzematge enatmosfera controlada va ser el tractament més efectiu per aconseguir un increment en laconcentració total de compostos volàtils en la varietat 'Fuji Kiku® 8' (per als dosperíodes de conservació avaluats). El mateix resultat es va observar en la varietat'Golden Reinders®', però només després de curts períodes de conservació (19 setmanes);al cap de 30 setmanes de conservació el període òptim en fred normal per produir aquestaugment va ser de 2 setmanes. Entre els compostos volàtils que van veure augmentadala seva concentració es trobaven aquells compostos considerats característics de l'aromade cada varietat. Aquesta major emissió de compostos volàtils va estar relacionadasobretot amb una major activitat de l'enzim lipoxigenasa (LOX) a la polpa del fruit, enambdues varietats.En relació els paràmetres de qualitat estàndard de les pomes, els períodes enatmosfera de fred normal que es van assajar van provocar un descens dels valors defermesa de polpa i acidesa titulable en ambdues varietats, encara que va ser més notableen el cas de la varietat 'Golden Reinders®'.En totes dues varietats, l'augment en la concentració de compostos volàtils no esva traduir en canvis significatius en el grau d'acceptació organolèptica per part delsconsumidors. A més, l'atribut de sabor (mesurat mitjançant un panell de jutgesentrenats) tampoc es va veure potenciat. En general, les pomes 'Fuji Kiku® 8' no vanpresentar canvis en el perfil sensorial, mentre que les pomes 'Golden Reinders®' vanpresentar un descens en els atributs d'acidesa, fermesa i crocanticitat en ser sotmeses al'emmagatzematge amb un període addicional en fred.La resposta de les dues varietats al període en fred va ser similar en les duescampanyes estudiades; per altra banda, no es va observar una influència de la data decollita sobre aquesta resposta.Pel que fa a l'estimació del període de vida útil de les pomes 'Golden Reinders®',es va obtenir que aquest hauria de situar-se entre 7 i 14 dies (de permanència a 20 ºCdesprés de l'emmagatzematge), moment en què els fruits presentaven un adequat balançentre la concentració de compostos volàtils i els valors dels paràmetres de qualitatestàndard, el que va permetre assolir una satisfactòria acceptació sensorial delsmateixos. / El objetivo principal de la presente Tesis Doctoral fue evaluar la influencia queejercía un periodo de 2 ó 4 semanas en frío normal (tras el almacenamiento encondiciones de atmósfera controlada con muy bajo nivel de oxígeno, durante un periodototal de 19 y 30 semanas) sobre la producción de compuestos volátiles, la calidadestándar y la calidad sensorial en manzanas 'Fuji Kiku® 8' (campaña 2005/06 y2006/07) y en manzanas 'Golden Reinders®' (campaña 2006/07 y 2007/08). Después decada periodo de almacenamiento, los frutos se mantuvieron a 20 ºC durante 1 y 7 días,fechas en las cuales se realizaron los distintos análisis. El segundo año de Tesis(campaña 2006/07) se evaluó también, para ambas variedades, el efecto de 2 fechas derecolección (situadas dentro del intervalo comercial de cosecha en la zona) sobre losparámetros anteriormente citados. Ese mismo año, se determinaron, además, lasactividades de las enzimas lipoxigenasa e hidroperóxido liasa relacionadas con labiosíntesis de los compuestos volátiles. Finalmente, se llevo a cabo un estudio con lavariedad 'Golden Reinders®', en el cual se realizó un seguimiento semanal de losdistintos parámetros mencionados a lo largo de 28 días de permanencia a 20 ºC (despuésdel almacenamiento en cámara durante 30 semanas), para poder así estimar el períodode vida útil de los frutos.En general, un periodo de 4 semanas en frío después del almacenamiento enatmósfera controlada fue el tratamiento más efectivo para conseguir un incremento en laconcentración total de compuestos volátiles en la variedad 'Fuji Kiku® 8' (para los dosperiodos de conservación evaluados). El mismo resultado se observó en la variedad'Golden Reinders®', pero sólo tras cortos periodos de conservación (19 semanas); alcabo de 30 semanas de conservación el periodo óptimo en frío normal para producir esteaumento fue de 2 semanas. Entre los compuestos volátiles que vieron aumentada suconcentración se encontraban aquellos compuestos considerados característicos delaroma de cada variedad. Esta mayor emisión de compuestos volátiles estuvo relacionadasobre todo con una mayor actividad de la enzima lipoxigenasa (LOX) en la pulpa delfruto, en ambas variedades.Con relación a los parámetros de calidad estándar de las manzanas, los periodosen atmósfera de frío normal que se ensayaron provocaron un descenso de los valores defirmeza de pulpa y acidez titulable en ambas variedades, aunque fue más evidente en elcaso de la variedad 'Golden Reinders®'.En ambas variedades, el aumento en la concentración de compuestos volátiles nose tradujo en cambios significativos en el grado de aceptación organoléptica por partede los consumidores. Además, el atributo de sabor (medido mediante un panel de juecesentrenados) tampoco se vio potenciado. En general, las manzanas 'Fuji Kiku® 8' nopresentaron cambios en el perfil sensorial, mientras que las manzanas 'GoldenReinders®' presentaron un descenso en los atributos de acidez, firmeza y crocanticidadal ser sometidas al almacenamiento con un periodo en frío.La respuesta de ambas variedades al periodo en frío fue similar en las doscampañas estudiadas; por otra parte, no se observó una influencia de la fecha derecolección sobre dicha respuesta.Con respecto a la estimación del período de vida útil de las manzanas 'GoldenReinders®', se obtuvo que éste debería situarse entre 7 y 14 días (de permanencia a 20ºC tras el almacenamiento), momento en el que los frutos presentaban un adecuadobalance entre concentración de compuestos volátiles y valores de los parámetros decalidad estándar, lo que permitió alcanzar una satisfactoria aceptación sensorial de losmismos. / The aim of this PhD thesis was to evaluate the influence of 2 and 4 weeks of coldair storage (after controlled atmosphere storage with very low oxygen levels-ULO, for atotal period of 19 and 30 weeks) on the production of volatile compounds, standard andsensory quality in 'Fuji Kiku® 8' (2005/06 and 2006/07) and 'Golden Reinders®'(2006/07 and 2007/08) apples. After each storage period, fruit were kept at 20 °C for 1and 7 days, before the different analysis were carried out. In the second year (2006/07),the effect of 2 harvest dates (located within the commercial window of the area) on theparameters mentioned above was also evaluated for both varieties. In addition, thelipoxygenase and hydroperoxide lyase activity related to the biosynthesis of volatilecompounds were determined in the same year. Finally, we performed a study with'Golden Reinders®' apples, weekly monitoring the different parameters during 28 daysat 20 °C (after 30 weeks of ULO storage) in order to estimate the shelf-life of the fruit.In general, a period of 4 weeks in cold air after ULO storage was the mosteffective period to increase the total volatile compounds emission in 'Fuji Kiku® 8'apples (for both storage periods). The same pattern was observed for 'GoldenReinders®' apples but only after 19 weeks of storage. After 30 weeks of storage, a 2-week period under cold air was needed to reach the desired increase. Within theseperiods in cold air, an increase in the concentration of those volatile compoundscharacteristic for each variety was observed. This improved emission of volatilecompounds was associated with increased activity of lipoxygenase enzyme in the fruitpulp for both varieties.The standard quality of the fruit was also affected by the cold period which causeda decrease of the flesh firmness and acidity for both varieties, especially in 'GoldenReinders®' apples.For both varieties, the increase in the total emission of volatile compounds wasnot corresponding with significant changes in the consumer's acceptance. In addition,flavour (measured by a trained panel) was not enhanced. In general, the sensory profilefor 'Fuji Kiku® 8' apples was not modified. However, for 'Golden Reinders®' apples theperiod under cold air caused a decrease in the sourness, firmness and crispnessperceived by a trained panel.The response of both varieties to the period in cold air after ULO storage wassimilar over two consecutive seasons and for the different harvest dates.The optimal period at 20 ºC after removal from ULO storage for 'GoldenReinders®' apples, was between 7 and 14 days, when fruit showed the proper balancebetween volatile compounds and standard quality resulting in a satisfactory sensoryacceptance.

L’enzim Carnitina palmitoïltransferasa 1 (CPT1) permet l’entrada dels àcids grassos de cadena llarga a la matriu mitocondrial per tal de ser degradats i utilitzats així com a substrat energètic. El malonil-CoA, primer intermediari en la síntesi d’àcids grassos, és un inhibidor al•lostèric de CPT1, fet que permet una regulació coordinada entre la síntesi i l’oxidació d’àcids grassos en un mateix teixit, evitant així que es donin ambdós processos alhora. Una inhibició específica de CPT1, doncs, és una bona aproximació farmacològica per al tractament de desordres metabòlics que impliquin acumulació d’àcids grassos i resistència a insulina, com la diabetis tipus 2 i l’obesitat. La present tesi doctoral s’ha centrat en l’estudi de la regulació per malonil-CoA dels isotips hepàtic (CPT1A) i muscular (CPT1B) de CPT1, així com en l’estudi de l’isotip més recentment descrit de la proteïna d’expressió en cervell, CPT1C. Per tal d’aprofundir en l’estudi de determinants moleculars de CPT1 que marquen el seu grau d’inhibició per malonil-CoA, s’han realitzat construccions mutants i delecionades dels enzims CPT1A i CPT1B i s’han expressat en el llevat “Pichia pastoris”. Mitjançant l’anàlisi del paràmetre IC50, hem demostrat que la regió aminoterminal de l’enzim CPT1A de rata (residus 1-18) exerceix un efecte dominant sobre les posicions Glu590 i Met593 en determinar la sensibilitat a la inhibició per malonil-CoA. Paral•lament, s’han generat construccions amb la seqüència de l’enzim CPT1 de porc, que presenta una gran diferència en el seu comportament enzimàtic quan es compara amb l’enzim humà, tant l’isotip hepàtic com el muscular. En aquest treball s’ha identificat l’existència d’un determinant negatiu en la posició Glu17 que explica parcialment la menor sensibilitat d’aquest enzim a la inhibició pel malonil-CoA. A més a més, s’ha construït un model 3-D in silico de la CPT1B humana, que permet justificar observacions experimentals mostrades en aquest treball, tot i que no explica encara les diferències en el comportament cinètic entre els isotips hepàtics i musculars de la proteïna. CPT1C és l’isotip descrit més recentment, i encara avui se’n desconeix la seva funció, existeix controvèrsia respecte a la seva distribució subcel•lular i no se n’han descrit els mecanismes que en regulen l’expressió. Els resultats mostrats en aquest treball demostren que CPT1C és una proteïna sense activitat enzimàtica, independentment de la característica extensió C-terminal que presenta respecte els altres isotips. D’altra banda, el patró d’expressió observat del gen Cpt1c no és compatible amb el paper que se li ha atorgat sobre la regulació de la ingesta. A més a més, hem identificat l’expressió d’una isoforma soluble de CPT1C en cervell humà adult, que ofereix una eina útil per a l’obtenció d’un cristall de la regió C-terminal citosòlica de CPT1C. / STRUCTURE-FUNCTION RELATIONSHIP OF CPT1 PROTEINS CPT1 (Carnitine palmitoyltransferase 1) enables the entry of long chain fatty acids into the mitochondrial matrix, in order to be degraded and used as energetic substrate. Malonyl-CoA, the first intermediate in the synthesis of fatty acids, is an allosteric inhibitor of CPT1. Through CPT1 inhibition, it establishes a coordinated regulation between fatty acid synthesis and oxidation, thus preventing that both pathways coexist at the same time. A specific inhibition of CPT1 is therefore a good approximation or the pharmacological treatment of metabolic disorders involving accumulation of fatty acids and nsulin resistance, such as type-2 diabetes and obesity. This thesis has focused on the study of malonyl-CoA regulation of both CPT1A and CPT1B isotypes. In addition, we studied the more recently described isotype of the protein, CPT1C. To gain insight into the study of CPT1 molecular determinants of malonyl-CoA inhibition, mutants of both CPT1A and CPT1B enzymes were expressed in yeast Pichia pastoris. Analysis of the IC50 parameter, demonstrated that the aminoterminal region (residues 1-18) of the rat CPT1A enzyme has a dominant effect over Glu590 and Met593 positions in determining its sensitivity to malonyl-CoA inhibition. We also identified the existence of a negative determinant within the sequence of pig CPT1A (position Glu17), which partially explains the low sensitivity of this enzyme to malonyl-CoA inhibition. In addition, we designed an in silico 3-D model of human CPT1B, which still does not explain the kinetic differences between liver and muscle isotypes of the protein, but justifies some of our experimental data. CPT1C is the more recently described isotype of the protein. Its function still remains unknown, and controversy exists regarding its subcellular distribution and the mechanisms that regulate its expression. Here we show that CPT1C is a protein without enzymatic activity, regardless of its characteristic C-terminal extension, compared to the other isotypes. Moreover, the observed gene expression pattern is not compatible with its given role on the regulation of food intake. In addition, we identified the expression of a soluble isoform of CPT1C in human adult brain, providing a useful tool for obtaining a crystalline structure of the cytosolic C-terminal region of CPT1.

La presència de la química teòrica i computacional està augmentant en quasi tots els camps de la recerca en química. Els càlculs teòrics poden ajudar a entendre millor l'estructura, les propietats i la reactivitat de compostos metàl·lics d'àrees tan diferents com la química inorgànica, organometàl·lica i bioinorgànica. No obstant això, és imprescindible utilitzar la metodologia adequada per obtenir resultats teòrics fiables. Els estudis d'aquesta tesi es poden dividir en dos grups diferents. El primer grup inclou l'estudi teòric del mecanisme de reacció de diversos sistemes que contenen coure i tenen diferents estructures Cun-O2. Aquests estudies s'han dut a terme amb l'objectiu de profunditzar en la natura dels processos oxidants químics i biològics promoguts per sistemes que contenen coure. En la segona part de la tesi, s'estudia la fiabilitat de diferents tècniques utilitzades per estudiar l'estructura electrònica i la reactivitat de sistemes que contenen coure, ferro i altres metalls de transició. / The presence of computational and theoretical chemistry is increasing in chemical research in nearly all fields. Theoretical calculations can help to better explain structure, properties, and reactivity in metallic compounds, in such diverse areas as inorganic, organometallic and bioinorganic chemistry. However, it is essential to use the suitable methodology in order to obtain reliable theoretical results. The studies of this Thesis can be divided into two different groups. The first group includes the theoretical study of the reaction mechanism of several copper-containing systems with different Cun-O2 structures. These studies are carried out with the aim of providing some insight into the nature of the chemical and biological copper-promoted oxidative processes with 1:1 and 2:1 Cu(I)/O2-derived species. In the second part of this Thesis the reliability of different theoretical approaches used to study the electronic structure and reactivity of systems containing copper, iron or other transition metals is evaluated.