Orientador: Valeria Helena Alves Cagnon Quitete / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T03:06:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Candido_EduardoMarcelo_M.pdf: 2021632 bytes, checksum: c32f4899f92da0ea4334a35bb6183a5a (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: O uso prolongado de álcool provoca alterações nocivas ao sistema reprodutor masculino. Atualmente, sabe-se que o estroma é fundamental para a manutenção da homeostase epitélio-estromal da glândula prostática, estando associado a lesões nesse órgão. Assim, o presente trabalho teve como objetivo analisar as alterações morfofuncionais do epitélio secretor e do estroma prostático ocorridas no lobo ventral, bem como a interação epitélio-estromal, associadas à ingestão crônica e à abstinência de álcool. Um total de 30 ratos (10 Wistar e 20 UChB) foram divididos em três grupos experimentais: controle que recebeu água; alcoolista que recebeu etanol diluído a 10º G.L.; e o abstinente que recebeu etanol diluído a 10º G.L. por 120 dias. Após esse período, o grupo abstinente voltou a receber água pura sem etanol. Os três grupos experimentais foram sacrificados após 150 dias de tratamento. Posteriormente, retirou-se a próstata ventral, a qual foi submetida às técnicas de microscopias de luz, eletrônica de transmissão e varredura, imunohistoquímica e dosagem de testosterona sérica associados a parâmetros estereológicos. Os resultados mostraram que os animais alcoolistas apresentaram redução do volume celular epitelial, ocorrência de neoplasia intraepitelial prostática, evaginações epiteliais, hipertrofia estromal e presença de células inflamatórias no estroma prostático. Apesar dos sinais de recuperação epitelial nos animais abstinentes, mantiveram-se as alterações estromais. Assim, pode-se concluir que o etanol é um agente indutor de alterações tanto no epitélio secretor, como no estroma prostático, caracterizando desequilíbrio do microambiente estromal desse órgão, o que certamente o predispõe a processos patológicos / Abstract: Long-term alcohol treatment has negative effects on prostatic stromal-epithelial interaction. Thus, the aim of the present study was to analyze the histochemical, immunohistochemical and ultrastructural alterations that occur in the prostatic stroma and epithelium of rats submitted to chronic alcohol ingestion and alcohol abstinence, as well as to establish the relationship between these changes and prostatic diseases. Thirty male rats (10 Wistar and 20 UChB rats) were divided into three experimental groups: the control group received tap water, the alcoholic group received ethanol diluted to 10º G.L. for 150 days, and the abstinent group received the same liquid diet as the alcoholic group up to 120 days of treatment and only tap water for 30 days thereafter. At the end of treatment, all animals were sacrificed and the ventral lobe of the prostate was removed and processed for histochemical, immunohistochemical and ultrastructural analyses. In addition, plasma testosterone levels were measured. The results showed prostatic intraepithelial neoplasia, infolding of the epithelium towards the stroma, stromal hypertrophy and the presence of inflammatory cells in alcoholic animals. In the abstinent group, alterations were noted mainly in the stromal area. In conclusion, ethanol triggers alterations in prostatic epithelial and stromal compartments, affecting the stromal microenvironment and predisposing the organ to pathological processes / Mestrado / Anatomia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Grado de Doctora en Ciencias biomédicas / Tissue-tissue interaction is essential to drive morphogenesis and contributing to the final shape of tissues and organs. The interaction between muscles and tendons during the establishment of the muscle-skeletal system is a great model to study this problem. During Drosophila melanogaster metamorphosis a group of cells of the dorsal thorax (notum) epithelium, specialized as tendon cells, attach to the developing Indirect Flight Muscles (IFMs). Likewise, epithelial cells anchor to the cuticle exoskeleton through apical projections. Both interactions enable the adaptation of notum epithelium to mechanical strain generated by muscle contraction, by modulating its mechanoresponse. However, scarce evidence exists about how muscle-tendon interaction contributes to the final shape of the notum. Thus, we hypothesized that the interaction between IFMs and tendon cells plays a role in notum epithelium morphogenesis. Geometric morphometric analysis of adult thorax shape shows that interfering with muscle development results in dorsal thorax deformation, however, the absence of muscles does not affect,collective-epithelial movement of the epithelium towards anterior during notum morphogenesis, suggesting that early cellular mechanisms such as cell division, rearrangements and cell delamination are not altered. Conversely, force distribution along epithelium plane changes in muscle depletion condition during notum morphogenesis, displaying anisotropic tendency in tendon-cell and midline domains. Further, impairing muscle-contraction does not affect adult thorax shape compared with wild-type conditions, indicating that muscle function as a structural support for thorax epithelium. On the other hand, the ability of notum epithelium to adapt to the mechanical strain during IFMs contraction becomes crucial to maintain the shape and integrity of the tissue. Notum epithelium lacking Chascon, a scaffold/adaptor protein involved in cytoskeleton organization upstream of Jbug/Filamin, displays epithelium deformations and impaired collective-epithelial movement during morphogenesis. Interestingly, IFMs ablation rescues backward epithelial movement associated with chascon knockdown condition, resembling wild-type phenotype, although it affects tissue-movement velocity and the ability of tendon cells to guide collective cell movement. Since notum epithelium anchors apically to the cuticle we tested whether Chascon is required for this interaction. We found that chascon knockdown in tendon cells results in epithelial detachment from the cuticle during muscles shortening stage, supporting the role of Chascon in cell adhesion and collective epithelial-cell movement. Additionally, we observed an increased anisotropy at tendon cell domains in absence of Chascon after muscle shortening, indicating the great unbalance in mechanical homeostasis after muscle pulling under this condition. Since muscle-tendon interaction is required for tendon cell differentiation in embryos we tested whether muscle was required for the expression of chascon and dumpy, a membrane protein responsible for exoskeleton-epithelium attachment, which along with Chascon is enriched in tendon cell domains during terminal differentiation. We found no significant differences in mRNA levels of chascon and dumpy, between animals lacking muscles versus wild type during muscle shortening, suggesting a muscle-independent alternative regulation of chascon and dumpy expression. Our results support the notion that Chascon is required for tension-adaptation response of notum epithelium during muscle-contraction, ensuring collective-epithelial cell movement through regulation of tendon-cell attachment to the cuticle. We suggest that Chascon, along with a multi-protein complex, regulate the mechano-response of tendon-cells during muscle contraction, by enabling collective-epithelial cell movement under mechanical load due to muscle development. Finally, these analyses will contribute to a better understanding of the role of tissue-tissue interaction in tissue morphogenesis and differentiation.

En este trabajo de tesis nos concentramos en dos compo-nentes principales del sistema endógeno de defensa, impli-cados en el contexto de las enfermedades neurodegenerativas de la retina: la línea de defensa antioxidante, y las citoquinas de estrés. En el capitulo I, investigamos si los antioxidantes zeaxantina (ZEA), luteína (LUT), y β-caroteno (BC), los principales carotenoides de la dieta, protegen a los fotorre-ceptores del estrés oxidativo y si esa protección es sinérgica con la impartida por el ácido docosahexaenoico (DHA). Reali-zando cultivos neuronales puros de retinas de rata, encon-tramos que los pretratamientos con DHA, ZEA, LUT y BC redujeron la muerte de los fotorreceptores inducida por dos tipos de agentes oxidantes, paraquat (PQ) y peróxido de hi-drógeno (H2O2). Además de este efecto, ZEA y LUT incre-mentaron la diferenciación de los fotorreceptores, aumen-tando la expresión de opsina y promoviendo el desarrollo de procesos característicos de fotorreceptores maduros. Nues-tros resultados sugieren que las xantófilas ZEA y LUT junto al DHA podrían ser importantes factores ambientales que contri-buyen a la promoción de la supervivencia y diferenciación de los fotorreceptores. En el capitulo II, utilizamos los cultivos neuronales puros de retina de rata para estudiar el efecto protector directo de la neurocitoquina de estrés, el factor inhibidor de la leucemia (LIF), sobre fotorreceptores sujetos al estrés oxidativo inducido por PQ. Observamos que el pretrata-miento con LIF redujo la muerte celular y disminuyó la expresión de opsina en los cultivos, en una forma dependiente de la concentración. LIF activó la vía de señalización gp130/STAT3, lo que sugiere que este modelo es una poten-te herramienta para facilitar el estudio de los mecanismos que dirigen los efectos en la protección y en la diferenciación de LIF en los fotorreceptores de la retina. En el capítulo III investigamos mecanismos endógenos de neuroprotección de fotorreceptores in vivo en ratones usando un modelo de precondicionamiento con ciclos de luz/oscuridad (PC), seguido por exposición a daño agudo por luz (LD). Trabajos previos en el laboratorio del Dr. Ash demostraron que El PC induce la expresión de LIF y la activación de la vía gp130/STAT3. Aquí demostramos que el PC con luz moderada, previo al LD resultó en casi completa protección funcional y morfológica de los fotorreceptores. Estudiamos si el mecanismo de esta protección involucra la disminución en la acumulación de productos de oxidación. Hallamos que LD induce la oxidación de ADN en fotorreceptores. El PC previo redujo la oxidación de ADN como parte de la respuesta endógena de neuropro-tección inducida por este modelo. En el capítulo IV, investiga-mos si la activación de STAT3 inducida por LIF altera la actividad biológica de las células del epitelio pigmentado de la retina (RPE) in vivo. Generamos modelos de ratones knock-out para específicamente delecionar STAT3 o gp130 en el RPE, en la retina, o en ambos retina y RPE y realizamos inyecciones intravítreas de LIF en estos modelos. Establecimos que LIF regula negativamente la expresión y actividad de la isomerohidrolasa RPE65, componente clave del ciclo visual en el RPE, de manera coordinada con una reducción en la expresión de la rodopsina en los fotorreceptores, para disminuir la síntesis del fotopigmento visual. Dicha regulación se postula como neuroprotectora de la exposición al estrés por luz, o de enfermedades neurodegenerativas de la retina. Estos efectos en la retina y en el RPE fueron independientes y requirieron la activación de la vía de señalización gp130/STAT3 intrínseca de la retina y del RPE, respectivamente. / In this thesis, we focused on two main components of the endogenous defense system implicated in neurodegenerative diseases in the retina: the antioxidant line of defense and stress cytokines.In chapter I, we investigated whether the main carotenoids from the diet:zeaxantin (ZEA), lutein (LUT), and β-carotene (BC), protect photoreceptors from oxidative stress and whether this protection is synergis-tic with that given by docosahexaenoic acid (DHA). By per-forming pure neuronal cultures from rat retinas, we found that pretreatment with DHA, ZEA, LUT and BC reduced photo-receptor apoptotic cell death induced by two types of oxidants, paraquat (PQ) and hydrogen peroxide (H2O2).Also, ZEA and LUT increased the expression of opsin and promoted the development of processes that are characteristic of mature photoreceptors. Our results suggest that the xantho-phylls ZEA and LUT along with DHA could be important envi-ronmental cues contributing to the promotion of photore-ceptor survival and differentiation. In chapter II, we used pure neuronal cultures from rat retinas to study the direct effects of the stress neurocytokine, leukemia inhi-bitory factor (LIF), on photoreceptors exposed to oxidati-ve stress induced by PQ. We observed that pretreatment with LIF reduced photoreceptor cell death and decreased opsin expression in primary retinal neurons, in a dose-de-pendent manner. LIF activated the gp130/STAT3 signaling pathway, which suggests this model as a potent tool that could ease the study on mechanisms involved in the effects induced by LIF on photoreceptor survival and differentiation. In chapter III, we examined endogenous protective mechanisms of photoreceptor in 9 vivo, in mice exposed to a model of preconditioning with cycles of light/darkness (PC) followed by exposure to acute light damage (LD). Previous work in Dr. Ashs laboratory has demonstrated that the primary endogenous neuroprotective response in this model is the upregulation of LIF and increased gp130/STAT3 signaling in photoreceptors. Here, we demonstrated that PC with moderate levels of light prior to LD resulted in almost complete functional and morphological protection of photoreceptors. We studied whether the mechanism mediating this protection involved a reduction in the accumulations of oxidation products. We found that LD induced DNA oxidation in photoreceptors, but the prior treatment with PC decreased such oxidation as a part of the endogenous response induced by this model. In chapter IV, we aimed to investigate whether the activation of STAT3 induced by LIF alters the biological activities of the retinal pigmented epithelium (RPE) in vivo. We generated conditional knock-out mouse models with specific deletion of STAT3 or gp130 in the RPE, in the retina, or in both retina and RPE and we performed intravitreal injections of LIF in these animals. Our studies allowed us to establish that LIF downregulates the expression and activity of the isomerohydrolase RPE65, a key component in the visual cycle in the RPE, which is coordinated with a decrease in the expression of rhodopsin in photoreceptors, to diminish the synthesis of the visual photopigment. This coordinated downregulation is postulated to be neuroprotective in both light stress and in neurodegenerative diseases in the retina. The effects induced by LIF in the retina and the RPE were independent from each other and required the activation of the gp130/STAT3 signaling pathway intrinsic to retina and RPE, respectively.

El queratocono (QC) se trata de una enfermedad corneal caracterizada por un adelgazamiento progresivo de la córnea y ectasia, que conduce a un astigmatismo irregular y finalmente, a una pérdida de la agudeza visual. Aunque existen diferentes modalidades de tratamiento del QC, el único tratamiento que ha demostrado retrasar la progresión del QC es el crosslinking corneal (CXL), con el objetivo de detener la progresión del QC, fortaleciendo las propiedades biomecánicas de la córnea. A pesar de que el CXL estándar o convencional (CXL-S), sigue siendo el "gold standard", con las posibles complicaciones secundarias relacionadas con esta técnica, en la actual tesis se ha demostrado, que la capacidad de la técnica de CXL epi-on (epithelium-on, por sus siglas en inglés) de detener la progresión del QC es similar y comparable, a la técnica de CXL epi-off (epithelium off, por sus siglas en inglés). Además se ha observado que la mayoría de los artículos publicados, comparan diferenes técnicas de CXL en QC. Sin embargo, para optimizar el tratamiento de estos pacientes, es importante establecer una seria de factores predictivos preoperatorios de los cambios visuales tras el CXL, para así elegir la mejor técnica. De esta manera, en la actual tesis se ha comprobado los factores predictivos del cambio visual a tener en cuenta a priori en las córneas sometidas a CXL, epi-on y epi-off, y se ha comprobado que los factores difieren para ambas técnicas, sugiriendo que el mecanismo de acción es distinto entre ellas. Otra opción de tratamiento en pacientes con QC, son la implantación de los anillos corneales intraestromales (ACI), que reducen las aberraciones de alto orden, y secundariamente mejoran la calidad visual. Sin embargo, los estudios disponibles presentan una gran variabilidad, que podría ser explicada por diferentes nomogramas disponibles o los distintos criterios de implantación de los ACI. En la actual tesis se ha desarrollado un nomograma de implantación de ACI optimizado, para lograr mejores resultados y más predecibles. En los últimos años, el uso de las lentes de contacto esclerales (LCE) han adquirido gran importancia en el manejo del QC, para una adecuada rehabilitación visual. Sin embargo, existe una gran variabilidad entre pacientes por varios factores, como puede ser el vault de la LCE. En la actual tesis, se ha demostrado una buena eficacia con la LCE ICD 16.50, en lo que respecta a la rehabilitación visual y lo más importante es que ésta mejora en la AV, se ha podido predecir a partir de varios factores. En definitiva, la actual tesis ha sido clave para lograr una optimización del manejo del QC. Las técnicas de CXL epi-on y epi-off, presentan una capacidad similar para detener la progresión del QC; se han obtenido los factores predictivos del efecto del tratamiento del CXL y uso de LCE en el QC; y se ha desarrollado un nomograma optimizado para la implantación de los ACI.

Orientadores: Ana Maria Marcondes, Newton Kara Jose / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T16:35:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Poterio_MarisaBraga_D.pdf: 773656 bytes, checksum: 72542a4d45c8aefe15115e27725a70ba (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar a influência da mitomicina C (MMC) a 0,02%, aplicada em dose única por 3 minutos, na proliferação e diferenciação das células do epitélio da córnea de coelhas. Durante o procedimento cirúrgico aplicou-se MMC ou soro fisiológico (SF) sendo a droga a ser utilizada em cada animal (nos 2 olhos) definida por sorteio. A solução sorteada foi aplicada topicamente na episclera da região limbar temporal, com o tecido epitelial da córnea íntegro (em um olho) e após a desepitelização parcial (no olho contra-lateral). Os animais foram distribuídos em lotes A (20 olhos), B (16 olhos) e C (14 olhos) e sacrificados respectivamente no 4º, 15º e 45º dia de experimento. Para estimular a proliferação celular, os animais do lote C foram submetidos à desepitelização da córnea central 3 dias antes do dia do sacrifício. Para o estudo da diferenciação do epitélio da córnea empregou-se anticorpos monoclonais (AE-1, AE-3 e AE-5). Para a análise da proliferação celular utilizou-se solução de 5-bromo-2-deoxiuridina (BrdU), aplicada via endovenosa em todos os animais, 24 horas antes do sacrifício. Nas lâminas preparadas para o estudo com BrdU, sob microscopia óptica foram definidas as porções temporal, nasal e central da córnea. Em cada porção contou-se, o número de células com expressão positiva deste marcador, em 3 campos aleatórios, definidos com objetiva milimetrada. A média aritmética dos 3 campos foi utilizada para análise estatística. Os resultados das médias e desvios-padrão do número de células marcadas pela BrdU nos lotes A, B e C utilizando-se a técnica de desepitelização parcial prévia da córnea e solução fisiológica, nas regiões temporal, central e nasal foram respectivamente de 15,07 ± 12,18; 5,53 ± 5,11; 1,80 ± 2,37 no lote A, 11,17 ± 11,15; 8,50 ± 7,18; 9,67 ± 9,09 no lote B e 12,34 ± 9,02; 15,67 ± 5,84; 3,78 ± 2,80 no lote C. Com a mesma técnica cirúrgica usando-se a MMC, foram respectivamente: 6,60 ± 5,33; 3,80 ± 6,36 e 1,93 ± 2,14 no lote A, 3,09 ± 2,40; 4,34 ± 2,97 e 2,59 ± 0,63 no lote B e 5,83 ± 8,55; 6,17 ± 1,55; 4,42 ± 2,63 no lote C. Para a técnica de desepitelização parcial da córnea após a aplicação de solução fisiológica as médias foram respectivamente: 13,80 ± 8,51; 7,47 ± 3,79; 3,07 ± 1,55 no lote A, 5,67 ± 4,49; 4,75 ± 2,13; 3,84 ± 3,45 no lote B e 6,78 ± 3,35; 11,67 ± 2,97; 3,78 ± 1,39 no lote C. Quando foi aplicado MMC e utilizada a técnica de desepitelização parcial da córnea após a aplicação de solução, 8,73 ± 7,35; 7,60 ± 6,88; 3,27 ± 1,85 no lote A, 1,75 ± 0,78; 3,92 ± 3,06; 2,67 ± 1,98 no lote B e 2,83 ± 3,54; 2,50 ± 2,08; 8,75 ± 9,62 no lote C. As diferenças entre MMC e SF foram significativas nos animais dos lotes A, B e C, nas áreas central e temporal das córneas estudadas quando a técnica de desepitelização parcial prévia foi aplicada. Não houve diferença entre as drogas quando se utilizou a técnica de desepitelização parcial da córnea após a aplicação de solução. Nas lâminas coradas com o AE1/AE3 e AE5 não houve interferência na diferenciação celular independentemente da droga ou da técnica. Esses resultados sugerem que a MMC a 0,02% em aplicação única episcleral por 3 minutos atua restritamente no local onde as células foram expostas e tem um efeito prolongado sobre a proliferação celular, na técnica de desepitelização parcial prévia / Abstract: This study was performed to evaluate the influence of 0,02% mitomycin C (MMC), applied on a single dose for 3 minutes, in proliferation and differentiation of the cornea rabbits epithelium cells. During the surgery procedure, MMC or 0,9% physiologic saline solution (SF) was applied and the solution for each animal (both eyes) was performed by raffle. A topic solution was applied at episclera of the temporal limbic area, with intact epithelial tissue (one eye) and after partial corneal desepithelization (other eye). The animals were arranged in a group A (20 eyes), group B (16 eyes) and group C (14 eyes). They were sacrificed respectively at 4th , 15th and 45th days of the post-operative. To stimulate cell proliferation, the animals of group C were submitted to central corneal desepithelization 3 days before the sacrifice day. Cellular differentiation markers (AE1, AE3 and AE5) were used for differentiation study of the corneal epithelium. A cellular proliferation marker 5-Bromo-2-Deoxyuridine (BrdU) was applied by intravenous injection in all of the animals, 24hs before the sacrifice. In the slides labeled with BrdU technique, the nasal, temporal and central areas were determined under optic microscopy. The number of labeled cells was counted in 3 different fields of each area using millimeter lenses. The arithmetic means of the 3 different fields was used for statistical analysis. The mean and standard deviation of the number of labeled cells with BrdU marker in A, B and C groups using previous partial corneal desepithelization technique and SF at temporal, central and nasal area were respectively 15.07 ± 12.18; 5.53 ± 5.11; 1.80 ± 2.37 in group A, 11.17 ± 11.15; 8.50 ± 7.18; 9.67 ± 9.09 in group B e 12.34 ± 9.02; 15.67 ± 5.84; 3.78 ± 2.80 in group C. Using the same technique and MMC the results were: 6.60 ± 5.33; 3.80 ± 6.36 e 1.93 ± 2.14 in group A, 3.09 ± 2.40; 4.34 ± 2.97 e 2.59 ± 0.63 in group B e 5.83 ± 8.55; 6.17 ± 1.55; 4.42 ± 2.63 in group C. For the corneal desepithelization surgical technique after SF application, the results were: 13.80 ± 8.51; 7.47 ± 3.79; 3.07 ± 1.55 in group A, 5.67 ± 4.49; 4.75 ± 2.13; 3.84 ± 3.45 in group B e 6.78 ± 3.35; 11.67 ± 2.97; 3.78 ± 1.39 in group C. When MMC was applied in the same surgical technique, the results were: 8.73 ± 7.35; 7.60 ± 6.88; 3.27 ± 1.85 in group A, 1.75 ± 0.78; 3.92 ± 3.06; 2.67 ± 1.98 in group B e 2.83 ± 3.54; 2.50 ± 2.08; 8.75 ± 9.62 in group C. The difference between MMC and SF were statistically significant at central and temporal areas when previous partial corneal desepithelization was performed in all groups. There was no difference between drugs when corneal desepithelization technique was used after solution application. There was no difference between differentiation cells in the slides labeled with AE1, AE3 and AE5 when drugs or surgical technique were analysed. These results suggests that 0,02% MMC applied for 3 minutes at the episclera, acts only at the exposed cells and have late effect under the cell proliferation, when the previous partial desepithelization surgery was applied. / Doutorado / Oftalmologia / Doutor em Ciências Médicas

[ES] Las células de los mamíferos secretan una gran variedad de vesículas extracelulares (EV) que participan activamente en la comunicación celular. Entre ellas, los exosomas son un tipo de EV cuyo tamaño está comprendido entre los 20 y 150 nanómetros que juegan un papel importante en la comunicación celular. De este modo, se ha descrito el papel de los exosomas en distintos procesos como la regeneración de tejidos, la respuesta inmunitaria o en la progresión de diferentes tipos de cánceres. Por otro lado, se ha observado que la actividad de la vía de señalización de Notch juega un papel importante en procesos de diferenciación celular, la angiogénesis o la proliferación, entre otros. Además, se ha relacionado con la aparición y progresión de un gran número de patologías, como el cáncer. Trabajos recientes han advertido que la actividad de la vía de Notch puede regularse mediante un nuevo mecanismo de señalización mediado por exosomas. En este trabajo se profundizó en este nuevo mecanismo de señalización de la vía de Notch en dos contextos diferentes como son las terapias regenerativas y el cáncer. Un trabajo previo de nuestro laboratorio demostró que las células madre mesenquimales (MSC) que mantenían una expresión aumentada del factor inducible por hipoxia 1α (HIF-1α; HIF-MSC) aumentaban el potencial terapéutico de las MSC nativas en un modelo de infarto agudo de miocardio (IAM) en rata a través de un aumento de la angiogénesis y una reducción de la fibrosis. Varios trabajos han estudiado la relación entre la vía de señalización de Notch y HIF-1α; así como la influencia de ambos en el proceso angiogénico. Por estos motivos, en este trabajo nos interesamos por evaluar la relación de ambas vías y su efecto sobre la angiogénesis a través de los exosomas liberados por las HIF-MSC y las MSC. Los resultados permitieron observar que la expresión de HIF-1α indujo un aumento en la secreción y la transferencia de exosomas de MSC a cultivos primarios de células endoteliales. Además, se observó que los exosomas derivados de HIF-MSC tenían un mayor potencial angiogénico tanto in vitro como in vivo en parte debido a una mayor incorporación del ligando de la vía de Notch Jagged1. Se ha observado que los exosomas derivados de células tumorales contribuyen a la progresión tumoral a través de mecanismos como la activación de la transición epitelio mesénquima (EMT), el establecimiento de nichos pre-metastáticos o la inmunomodulación. Así, se sabe que la vía de señalización de Notch es capaz de activar la EMT durante la progresión de distintos tipos de cánceres. Así mismo, los cánceres de mama de peor prognosis han sido relacionados con una desregulación de la vía de señalización de Notch. Por estas razones, nos inquietó la posibilidad de que la señalización de la vía de Notch a través de exosomas estuviera influyendo en la progresión del cáncer de mama. De este modo, estudiamos la presencia de componentes de la vía de señalización de Notch en los exosomas procedentes de dos líneas tumorales de cáncer de mama, una más agresiva (MDA-MB-231) y otra menos agresiva (MCF-7). Así, se observó que varios componentes de Notch se sobreexpresaron en los exosomas procedentes de MDA-MB-231 en comparación con los procedentes de MCF-7. Fue de particular interés la detección del dominio intracelular con actividad transcripcional de Notch1 (N1ICD) sobreexpresado en los exosomas procedentes de MDA-MB-231. Debido a que previamente había sido demostrado que una sobreexpresión de N1ICD en MCF-7 aumentaba su tumorigenicidad a través de una inducción de la EMT, se evaluó el efecto de los componentes de Notch incorporados en los exosomas procedentes de ambas líneas tumorales sobre cultivos de MCF-7. Nuestros resultados sugieren que los componentes de Notch incorporados en los exosomas procedentes de MDA-MB-231 son funcionales y contribuyen a la induc / [CAT] Les cèl·lules dels mamífers secreten una gran varietat de vesícules extracel·lulars (EV) que participen activament en la comunicació celular. Entre elles, els exosomes són un tipus de EV amb una grandària compresa entre els 20 i 150 nanòmetres que juguen un paper important en la comunicació celular. D'aquesta manera, s'ha descrit el paper dels exosomes en diferents processos com la regeneració de teixits, la resposta immunitària o en la progressió de diferents tipus de càncers. D'altra banda, s'ha observat que l'activitat de la via de senyalització de Notch juga un paper molt important en processos de diferenciació cel·lular, la angiogénesis o la proliferació, entre altres. A més, s'ha relacionat amb l'aparició i progressió d'un gran nombre de patologies, com el càncer. Treballs recents han advertit que l'activitat de la via de Notch pot regular-se mitjançant un nou mecanisme de senyalització mediat per exosomes. En aquest treball es va aprofundir en aquest nou de mecanisme de senyalització de la via de Notch en dos contextos diferents com són les teràpies regeneratives i el càncer. Un treball publicat pel nostre equip de treball va demostrar que les cèl·lules mare mesenquimals (MSC) que mantenien una expressió augmentada del factor inducible per hipòxia 1α (HIF-1α; HIF-MSC) augmentaven el potencial terapèutic de les MSC natives en un model d'infart agut de miocardi (IAM) en rata a través d'un augment de la angiogénesis i una reducció de la fibrosi. Diversos treballs han estudiat la relació entre la via de senyalització de Notch i HIF-1α; així com la influència de tots dos en el procés angiogénic. Per aquests motius, en aquest treball ens vam interessar en estudiar la relació de totes dues vies i el seu efecte sobre la angiogénesis a través dels exosomes alliberats per les HIF-MSC i les MSC. Els resultats van permetre observar que l'expressió de HIF-1α va induir un augment en la secreció i la transferència d'exosomes de MSC a cultius primaris de cèl·lules endotelials. A més, es va observar que els exosomes derivats de HIF-MSC tenien un major potencial angiogénic tant in vitro com in vivo en part a causa d'una major incorporació del lligant de la via de Notch Jagged1. S'ha observat que els exosomes procedents de cèl·lules tumorals contribueixen a la progressió tumoral a través de mecanismes com l'activació de la transició epiteli mesènquima (EMT), l'establiment de nínxols pre-metastàtics o la inmunomodulació. En aquest sentit, se sap que la via de senyalització de Notch és capaç d'activar l'EMT durant la progressió de diferents tipus de càncers. Així mateix, els càncers de mama de pitjor prognosi han sigut reiteradament relacionats amb una desregulació de la via de senyalització de Notch. Per açò, ens va inquietar la possibilitat que la senyalització de la via de Notch a través d'exosomes estiguera influint en la progressió del càncer de mama. D'aquesta manera, estudiem la presència de components de la via de senyalització de Notch en els exosomes procedents de dues línies tumorals de càncer de mama, una més agressiva (MDA-MB-231) i una altra menys agressiva (MCF-7). Així, es va observar que diversos components de Notch es sobreexpresaben en els exosomes procedents de MDA-MB-231 en comparació amb els procedents de MCF-7. Va ser de particular interés la detecció del domini intracel·lular amb activitat transcripcional de Notch1 (N1ICD) sobreexpresat en els exosomes procedents de MDA-MB-231. Debut a que havia sigut demostrat que una sobreexpressió de N1ICD en MCF-7 augmentava la seua tumorigenicidad a través d'una inducció de l'EMT, es va evaluar l'efecte dels components de Notch incorporats en els exosomes procedents de les dues línies tumorals sobre cultius de MCF-7. Els nostres resultats suggereixen que els components de Notch incorporats en els exosomes procedents de MDA-MB-231 eren funcionals i contribuïen a la / [EN] Mammal cells secrete a great variety of extracellular vesicles (EV) that actively participate in intercellular communication. Among them, exosomes are a type of EV whose size is between 20 and 150 nanometers and play an important role in intercellular communication. In this way, the role of exosomes in different processes such as tissue regeneration, the immune response or in the progression of different types of cancers has been described. On the other hand, it has been observed that the Notch signaling pathway plays a very important role in processes such as cell differentiation, angiogenesis or proliferation, among others. In addition, it has been related to the appearance and progression of a large number of pathologies, such as cancer. Recent works have shown that the activity of the Notch pathway can be regulated by a new signaling mechanism mediated by exosomes. In this work, we deepened this new signaling mechanism of the Notch signaling pathway in two different contexts: the regenerative therapies and cancer. A work previously published by our laboratory showed that mesenchymal stem cells (MSC) that maintained an increased expression of hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α; HIF-MSC) increased the therapeutic potential of native MSC in a model of acute myocardial infarction (AMI) in rats through an increase in angiogenesis and a reduction in fibrosis. Several studies have studied the relationship between the Notch signaling pathway and HIF-1α as well as the influence of both in the angiogenic process. For these reasons, in this work we were interested in evaluating the relationship of both pathways and their effect on angiogenesis through exosomes released by HIF-MSCs and MSCs. The results showed that the expression of HIF-1α induced an increase in the secretion and the transfer of exosomes of MSC to primary cultures of endothelial cells. In addition, it was observed that exosomes derived from HIF-MSC had a greater angiogenic potential both in vitro and in vivo in part due to a greater incorporation of the Notch ligand Jagged1. In the last decade, it has been observed that exosomes from tumor cells contribute to tumor progression through mechanisms such as the activation of epithelial to mesenchymal transition (EMT), the establishment of pre-metastatic niches orimmunomodulation. In this sense, it is known that the Notch signaling pathway is capable of activating EMT during the progression of different types of cancers. Likewise, breast cancers of bad prognosis have been repeatedly related to a deregulation of the Notch signaling pathway. For these reasons, we were concerned about the possibility that the signaling of the Notch pathway through exosomes was influencing the progression of breast cancers. In this way, we studied the presence of Notch signaling pathway components in exosomes from the metastatic and more aggressive MDA-MB-231 and the non-metastatic and less aggressive MCF-7 cell lines. It was observed that several Notch components were overexpressed in exosomes from MDA-MB-231 compared to those from MCF-7. Of particular interest was the detection of the intracellular domain with transcriptional activity of Notch1 (N1ICD) overexpressed in MDA-MB-231 exosomes. It has been previously demonstrated that an overexpression of N1ICD in MCF-7 increases its tumorigenicity through an induction of EMT. Because of this, we evaluated the effect of Notch components incorporated in exosomes from both tumoral cell lines on MCF-7 cultures. Our results suggested that Notch components incorporated into MDA-MB-231 exosomes were functional and contributed to the induction of EMT when added to MCF-7 cultures in part due to N1ICD activity. / González-King Garibotti, H. (2019). Estudio de las Implicaciones de la Via de Señalización de Notch en Cardioregeneración y Cáncer [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/124343 / TESIS

La inflamación es un factor clave en la patogénesis de diversas enfermedades de la retina que eventualmente terminan en la pérdida de la visión y ceguera, tales como la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), la retinopatía diabética (RD), endolftalmitis bacteriana y la uveítis. En este contexto, las células del epitelio pigmentario de la retina (EPR) son esenciales para mantener la integridad estructural y funcional de la retina y se ha demostrado que, en estas condiciones patológicas, el EPR puede mediar importantes funciones inmunológicas y participar activamente de la respuesta inflamatoria. El objetivo principal de la presente tesis doctoral fue dilucidar los mecanismos moleculares involucrados en la respuesta inflamatoria del EPR. En particular nos propusimos estudiar el rol de la vía de la fosfolipasa D (PLD), generadora de mensajeros lipídicos, en dos modelos de injuria inflamatoria: i) inducida por lipopolisacárido (LPS) y ii) por altas concentraciones de glucosa (HG), a modo de simular las hiperglucemias características de la diabetes. En el desarrollo de esta tesis utilizamos dos líneas celulares de EPR de origen humano, las líneas ARPE-19 y D407. Las PLD clásicas hidrolizan fosfatidilcolina (PC) para generar un segundo mensajero lipídico, el ácido fosfatídico (PA) y colina. El PA puede desfosforilarse por las lípido fosfato fosfohidrolasas (LPP) para generar diacilglicerol (DAG), otro lípido bioactivo. Por lo tanto, la vía de PLD/LPP puede modular la actividad de las proteínas que responden al DAG, como las proteínas quinasas C (PKC) y también de proteínas que son moduladas por el PA, como mTOR (del inglés, mammalian target of rapamycin), entre otras. Resultados previos de nuestro laboratorio habían demostrado la activación de la vía PLD y la participación de las isoformas clásicas (PLD1 y PLD2) en la respuesta inflamatoria de las células del EPR expuestas a LPS. En el capítulo I estudiamos el rol de la vía PLD en la activación de la señalización por PKC en las células del EPR expuestas a LPS. Demostramos que ambas PLD clásicas son necesarias para la activación de isoformas convencionales de PKC (α y βII), mientras que la activación de la isoforma novel PKCε solo es dependiente de la PLD1. Evidenciamos además que la PKCε media la supervivencia de las células del EPR expuestas al LPS promoviendo una menor activación de la caspasa-3 y aumentando la expresión de Bcl-2 y la activación de Akt. Por otra parte, las PKCα y β no estarían involucradas en la pérdida de la viabilidad inducida por el LPS. En conclusión, la vía PLD1-PKCε media la supervivencia de las células del EPR previniendo las señales apoptóticas inducidas por el LPS. En el capítulo II caracterizamos el modelo de injuria celular inducido por HG. La exposición de las células del EPR a HG indujo la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), la activación de la caspasa-3 y la disminución de la funcionalidad mitocondrial (parámetro de viabilidad celular). Demostramos además que los niveles elevados de glucosa inducen en las células del EPR la activación temprana y concatenada de la vía PLD y de la quinasa regulada por factores extracelulares (ERK1/2), la fosforilación del inhibidor de κB (IκB) y la activación del factor de transcripción nuclear κB (NFκB). La activación del NFκB inducida por la HG se correlacionó con el incremento en la expresión de los ARNm de interleuquinas (IL) proinflamatorias (IL-6, IL-8) y de la ciclooxigenasa-2 (COX-2). Finalmente, demostramos que en las células del EPR expuestas a HG los inhibidores farmacológicos de PLD1 (VU0359595) y de PLD2 (VU0285655-1) previenen la expresión de los mediadores proinflamatorios, la activación de la caspasa-3 y la reducción en la viabilidad celular. Los resultados obtenidos en las células expuestas a LPS y al modelo de injuria inducida por HG demuestran que el rol de las PLD en las células del EPR difiere según cuál sea el origen de la injuria inflamatoria. Estos hallazgos indican la importancia de conocer los mecanismos moleculares involucrados en la respuesta inflamatoria del EPR desencadenada por distintos estímulos. Nuestros resultados postulan a las isoformas clásicas de PLD como posibles dianas terapéuticas para distintas enfermedades inflamatorias de la retina. / Inflammation is a key factor in the pathogenesis of several retinal diseases that eventually end in vision loss and blindness, such as age-related macular degeneration (AMD), diabetic retinopathy (DR), retinitis pigmentosa (RP) and uveitis. In this context, retinal pigment epithelial (RPE) cells are essential to maintain the integrity and function of the retina and it has been shown that, under these pathological conditions, RPE cells can mediate important immunological functions and actively participate in the inflammatory response. The main objective of this Ph. thesis was to elucidate the molecular mechanisms involved in the inflammatory response of the RPE. In particular, we wanted to study the role of the lipid messenger generating phospholipase D (PLD) pathway in two inflammatory injury models: i) induced by lipopolysaccharide (LPS) and ii) by high glucose (HG) concentrations, in order to simulate the typical hyperglycemia of diabetes. To this end, we used two human RPE cell lines: ARPE-19 and D407. Classical PLDs hydrolyze phosphatidylcholine (PC) to generate the lipid second messenger, phosphatidic acid (PA), and choline. PA can be further dephosphorylated by lipid phosphate phosphatases (LPP) in order to generate diacylglycerol (DAG), another lipid messenger. Thus, the PLD/LPP pathway can modulate the activity of DAG-responding proteins, such as protein kinases C (PKCs) and PA-responding proteins such as mTOR (mammalian target of rapamycin), among others. Previous results from our laboratory demonstrated the activation of the PLD pathway and the participation of classical PLD isoforms (PLD1 and PLD2) in the inflammatory response of RPE cells exposed to LPS. In the first chapter of this thesis, we studied the role of the PLD pathway in the activation of LPS-induced PKC signaling in RPE cells. We demonstrated that both PLDs are necessary for the activation of conventional PKC isoforms (PKCα/βII) while the activation of the novel PKCε is dependent only on PLD1. We also showed that PKCε mediates the survival of RPE cells exposed to LPS by promoting less activation of caspase-3 and increasing Bcl-2 expression and activation of Akt. In contrast, PKCα and β may not be involved in the cell viability loss induced by LPS. In conclusion, the PLD1-PKCε pathway mediates RPE cell survival by preventing apoptotic signals induced by LPS. In chapter II we characterized the model of cellular injury induced by HG. RPE cell exposure to HG induced reactive oxygen species (ROS) generation, caspase-3 activation and reduced mitochondrial functionality (cell viability parameter). We also demonstrated that in RPE cells high glucose levels induce the early and concatenated activation of the PLD pathway and of extracellular signal regulated kinase (ERK1/2), the phosphorylation of inhibitor of κB (IκB) and the activation of nuclear factor κB (NFκB). The activation NFκB induced by HG was found to correlate with the increased expression of proinflammatory interleukins (IL-6, IL-8) and cyclooxygenase-2 (COX-2) mRNA. Finally, we demonstrated that in RPE cells exposed to HG pharmacologycal inhibitors of PLD1 (VU0359595) and PLD2 (VU0285655-1) prevent the expression of proinflammation mediators, the activation of caspase-3 and the reduction in cell viability. The results obtained in RPE cells exposed to LPS and in the model of cellular injury induced by HG demonstrate that the role of PLD isoforms in RPE cells differs depending on the origin of the inflammatory injury. These findings indicate the importance of knowing the molecular mechanisms involved in the RPE inflammatory response elicited by different stimuli. Our results postulate classical PLD isoforms as possible therapeutic targets for several retinal inflammatory diseases. / TEXTO PARCIAL en período de teletrabajo

O carcinoma ex-adenoma pleomórifoco (CXAP) é a contraparte maligna do Adenoma pleomórfico (AP), sendo sua malignização descrita em 10% dos AP. Histológicamente o CXAP apresenta grande variação morfológica vista a capacidade do componente maligno se originar de diferentes estruturas do componente misto do AP. Nota-se que grande parte dos CXAP apresentam caráter infiltrativo, metástase linfonodal e metástase tardia. Para que as células neoplásicas adquiram um fenótipo com maior capacidade infiltrava é necessário que passem por um processo de transição de um fenótipo epitelial para mesenquimal. Este processo é conhecido como Transição epitélio-mesênquima (TEM). Tal processo é visto em situações fisiológicas, tais quais, migração de células ectodérmicas durante o período embriológico, reparação e cicatrização e também em processos neoplásicos. O objetivo deste trabalho é avaliar a presença de proteínas inerentes ao processo de transição epitélio mesênquima e comparar a expressão destas proteínas com achados histopatológicos sugestivos de invasão e mestástase. A análise das proteínas E-caderina e Beta-catenina em células neoplásicas de CXAP foi realizada de forma semi-quantitativa conforme sugerido pela literatura. Os casos foram subdividos de acordo com a positividade da reação de imunohistoquímica. Onde houve ausência de células positivas o caso recebeu escore 0, casos onde houve <10% de células positivas o escore foi 1, casos onde 10- 75% de células positivas escore 2 e consequentemente 3 para casos em que >75% das células eram positivas. Tais achados foram relacionados com presença de invasão angiolinfática, perineural, metástase tardia, recorrência e metástase linfonodal. De um total de 16 casos de CXAP, o sitio mais acometido foi a parótida e 53% da nossa amostra era composta por homens, a idade média foi de 52,9 anos e a parótida foi o sitio mais acometido. A análise histopatológica demonstrou que quando havia marcação para E-caderina a mesma se dava em membrana celular. 12,5% ausência de marcação, 50% dos casos com marcação fraca 31,25% dos casos com expressão moderada e 6,25% dos casos com marcação intensa. Já para Beta-catenina um caso apresentou marcação citoplasmática e os restantes em membrana celular.18,75% ausente de marcação, 25 % com marcação fraca, 50% dos casos com marcação moderada e 6,25 dos casos com marcação intensa. A imuno-marcação estava distribuída de forma difusa tanto no front de invasão quanto no parênquima do carcinoma. Casos com maior presença de E-caderina apresentaram mais metástases linfonodais, p=0,035. Para outros critérios de invasão nenhuma relação estatística significante foi observada. Sugere-se que E-caderina e Beta-catenina não fazem parte do processo de invasão e metástase de CXAP nem são fatores relacionados a invasão dos tecidos adjacentes. / Carcinoma ex-pleomorphic adenoma (CXAP) is the malignant counterpart of pleomorphic adenoma(PA), although malignant transformation of PA is unusual occurring in 10% of the PA cases. The CXAP histologically presents an intense morphologic variation due to the ability of the malignant tissue to originate from any structure of de mixed component. A significant number of CXAPs show an infiltrative behavior, lymph node metastasis and late metastasis. The cell component must undergo a morphologic alteration changing the epithelial phenotype to a mesenchymal one. That development process is known as epithelial-mesenchymal transiction (MET). This process is seen in physiologic situations, like cell migration on embryologic ectodermal evolution, tissue repair and int neoplastic processes. The main objective of this study was to evaluate immunohistochemical expression of epithelial-mesenchymal transiction proteins, e-caderin and beta-catenin in malignant areas of CXAP and correlate with pathologic parameters that indicates migration, like perineural and angiolymphatic invasion and metastasis as suggested by the literature. Immunohistochemical analysis was performed semiquantitatively according to the scores 0 (no positive cell), 1 (<10% positive cells), 2 (10-75% of cells positive, and 3 (>75% positive cells). These results were also correlated with pathological parameters of neoplastic aggressiveness using the Fisher\'s exact test. Of the16 cases, the parotid gland was the most involved site and men were affected in 53.8 % of our sample. The mean age was 52.9 year. The histopathological analysis showed that in all cases in which e-caderin was positive, the immunoreaction was of the cell membrane 12,5% of the cases showed absent of e-caderin expression, 50% showed weak expression, 31,25% showed moderate expression and 6,25 show strong one. In the other hand, b-catenin showed cytoplasmic expression in one case, all other cases showed protein in cell membrane. 18,75 showed absent expression, 25% showed weak expression, 50% showed moderate and 6,25% showed intense one. The immunohistochemical reaction was diffuse and presented itself in invasion front as well as in the carcinoma parenchyma. Cases presenting high expression of e-caderin developed more lymph node metastasis, p=0,035. For the others invasion parameters there was no statistic summary observed. This work suggest that e-caderin and b-catenin have no relation to CXAP carcinogenesis or invasion process

O carcinoma ex-adenoma pleomórifoco (CXAP) é a contraparte maligna do Adenoma pleomórfico (AP), sendo sua malignização descrita em 10% dos AP. Histológicamente o CXAP apresenta grande variação morfológica vista a capacidade do componente maligno se originar de diferentes estruturas do componente misto do AP. Nota-se que grande parte dos CXAP apresentam caráter infiltrativo, metástase linfonodal e metástase tardia. Para que as células neoplásicas adquiram um fenótipo com maior capacidade infiltrava é necessário que passem por um processo de transição de um fenótipo epitelial para mesenquimal. Este processo é conhecido como Transição epitélio-mesênquima (TEM). Tal processo é visto em situações fisiológicas, tais quais, migração de células ectodérmicas durante o período embriológico, reparação e cicatrização e também em processos neoplásicos. O objetivo deste trabalho é avaliar a presença de proteínas inerentes ao processo de transição epitélio mesênquima e comparar a expressão destas proteínas com achados histopatológicos sugestivos de invasão e mestástase. A análise das proteínas E-caderina e Beta-catenina em células neoplásicas de CXAP foi realizada de forma semi-quantitativa conforme sugerido pela literatura. Os casos foram subdividos de acordo com a positividade da reação de imunohistoquímica. Onde houve ausência de células positivas o caso recebeu escore 0, casos onde houve <10% de células positivas o escore foi 1, casos onde 10- 75% de células positivas escore 2 e consequentemente 3 para casos em que >75% das células eram positivas. Tais achados foram relacionados com presença de invasão angiolinfática, perineural, metástase tardia, recorrência e metástase linfonodal. De um total de 16 casos de CXAP, o sitio mais acometido foi a parótida e 53% da nossa amostra era composta por homens, a idade média foi de 52,9 anos e a parótida foi o sitio mais acometido. A análise histopatológica demonstrou que quando havia marcação para E-caderina a mesma se dava em membrana celular. 12,5% ausência de marcação, 50% dos casos com marcação fraca 31,25% dos casos com expressão moderada e 6,25% dos casos com marcação intensa. Já para Beta-catenina um caso apresentou marcação citoplasmática e os restantes em membrana celular.18,75% ausente de marcação, 25 % com marcação fraca, 50% dos casos com marcação moderada e 6,25 dos casos com marcação intensa. A imuno-marcação estava distribuída de forma difusa tanto no front de invasão quanto no parênquima do carcinoma. Casos com maior presença de E-caderina apresentaram mais metástases linfonodais, p=0,035. Para outros critérios de invasão nenhuma relação estatística significante foi observada. Sugere-se que E-caderina e Beta-catenina não fazem parte do processo de invasão e metástase de CXAP nem são fatores relacionados a invasão dos tecidos adjacentes. / Carcinoma ex-pleomorphic adenoma (CXAP) is the malignant counterpart of pleomorphic adenoma(PA), although malignant transformation of PA is unusual occurring in 10% of the PA cases. The CXAP histologically presents an intense morphologic variation due to the ability of the malignant tissue to originate from any structure of de mixed component. A significant number of CXAPs show an infiltrative behavior, lymph node metastasis and late metastasis. The cell component must undergo a morphologic alteration changing the epithelial phenotype to a mesenchymal one. That development process is known as epithelial-mesenchymal transiction (MET). This process is seen in physiologic situations, like cell migration on embryologic ectodermal evolution, tissue repair and int neoplastic processes. The main objective of this study was to evaluate immunohistochemical expression of epithelial-mesenchymal transiction proteins, e-caderin and beta-catenin in malignant areas of CXAP and correlate with pathologic parameters that indicates migration, like perineural and angiolymphatic invasion and metastasis as suggested by the literature. Immunohistochemical analysis was performed semiquantitatively according to the scores 0 (no positive cell), 1 (<10% positive cells), 2 (10-75% of cells positive, and 3 (>75% positive cells). These results were also correlated with pathological parameters of neoplastic aggressiveness using the Fisher\'s exact test. Of the16 cases, the parotid gland was the most involved site and men were affected in 53.8 % of our sample. The mean age was 52.9 year. The histopathological analysis showed that in all cases in which e-caderin was positive, the immunoreaction was of the cell membrane 12,5% of the cases showed absent of e-caderin expression, 50% showed weak expression, 31,25% showed moderate expression and 6,25 show strong one. In the other hand, b-catenin showed cytoplasmic expression in one case, all other cases showed protein in cell membrane. 18,75 showed absent expression, 25% showed weak expression, 50% showed moderate and 6,25% showed intense one. The immunohistochemical reaction was diffuse and presented itself in invasion front as well as in the carcinoma parenchyma. Cases presenting high expression of e-caderin developed more lymph node metastasis, p=0,035. For the others invasion parameters there was no statistic summary observed. This work suggest that e-caderin and b-catenin have no relation to CXAP carcinogenesis or invasion process

Tesi realitzada a l'Institut d'Investigacions Biomèdiques de Barcelona (IIBB-CSIC IDIBAPS) / Les patologies renals s’han convertit en una problemàtica a nivell mundial, en l’actualitat poden afectar a una de cada 9 persones al llarg de la seva vida i porten associats elevats costos econòmics. Malgrat els últims avenços científics i millores en el tractament d’aquestes patologies, el transplantament renal i la diàlisi continuen sent les dues úniques opcions terapèutiques efectives en el tractament de la insuficiencia renal. La regeneració de l’epiteli renal és determinant en la recuperació del pacient ja que determina que es pugui restablir la funcionalitat d’aquest òrgan. L’obtenció de precursors renals a partir de cèl•lules mare que puguin integrar-se i regenerar el ronyó lesionat s’ha convertit en una àrea de recerca biomèdica molt important. L’objecte d’estudi d’aquesta tesi va ser conèixer els mecanismes involucrats en la diferenciació de les cèl•lules mare embrionàries (ESCs) i les cèl•lules mare adiposes (ASCS) cap al llinatge epitelial renal ja que aquestes cèl•lules poden ser una potencial font d’aquests precursors renals amb capacitat regenerativa. Recentment s’ha descobert que els miRNAs, que tenen la funció de regular l’expressió gènica en l’etapa post-transcripcional, són essencials en la diferenciació de les cèl•lules mare i s’han trobat miRNAs específics que regulen la diferenciació a un llinatge cel•lular en concret. En aquest sentit, el nostre objectiu general en aquest treball va ser estudiar el paper dels miRNAs en la diferenciació de cèl•lules mare a progenitors epitelials renals. Per això, primer de tot es van realitzar experiments de diferenciació en que els cossos embrionaris (EBs) induïts a partir de les cèl•lules mare embrionàries (ESCs) es van cultivar amb un medi de cultiu suplementat amb all-trans-retinoic acid (ATRA) i activina A, i les cèl•lules mare adiposes (ASCs) amb un medi amb una concentració fisiológica de glucosa suplementat amb ATRA. Amb aquests protocols de diferenciació, es van obtenir cèl•lules amb característiques de progenitors renals. Els EBs cultivats amb el protocol de diferenciació expressaven els marcadors de l’organogènesi renal inicial (Pax2, WT1, Wnt4, Notch2 i Wnt9b). Les ASCs cultivades amb ATRA varen canviar la seva morfologia a una morfologia epitelial i van expressar marcadors tant de l’organogènesi renal inicial (Pax2, WT1, Wnt4, Six2 i Megalina) com els marcadors epitelials (Citoqueratina 18, E-caderina). Un anàlisis de miRNAs va demostrar que la família de miRNAs let-7 es sobreexpressava durant la diferenciació dels EBs i que el miRNA let-7e més concretament era essencial en l’expressió dels marcadors Pax2, Wt1i Wnt4 ja que la seva silenciació disminuïa l’expressió d’aquests gens. En les ASCs, en canvi, es va demostrar que el miRNA let-7e també augmentava en la diferenciació i que a més tenia característiques d’inductor de la diferenciació, essent essencial en l’expressió tant dels marcadors de l’organogènesi renal (Pax2, Wt1, Wnt4, Megalina) com del marcador epitelial CK18. Profunditzant en el paper del miRNA let-7e en la diferenciació, es va demostrar amb experiments de Western blot, que el miRNA let-7e modula els nivells de β-catenina a través d’un mecanisme que implica la inhibició de la PKCβ i la conseqüent disminució en la fosforilació de la GSK3β (Ser-9) i que això és imprescindible per la correcta diferenciació de les ESCs. Per altra banda, en les ASCs es va demostrar utilitzant l’assaig del gen reporter de la luciderasa, que el miRNA let-7e inhibeix directament l’expressió de la metal•loproteinasa 9 i que d’aquesta manera modula la diferenciació de les ASCs al llinatge epitelial renal. / Role of miRNA in stem cell differentiation Renal diseases have become a worldwide problem that can affect one in nine people throughout their life. Despite recent scientific advances, kidney transplantation and dialysis are still the only two effective therapeutic options in renal failure. The regeneration of the epithelium is critical for patient recovery as it determines the restoration of the kidney functionality. Cell precursors obtained from renal stem cells that can regenerate and integrate the injured kidney have become an important research area. The aim of our study was to determine the mechanisms involved in the differentiation of embryonic stem cells (ESCs) and adipose stem cells (ASCs) to renal epithelial lineage as these cells can be a source of these renal precursors with regenerative potential. It was recently discovered that miRNAs, which have the function of regulating gene expression in the post-transcriptional level, are essential in the differentiation of stem cells. In this sense, our main objective was to study the role of miRNAs in stem cells differentiation to renal epithelial progenitors. For this purpose, We have carried out experiments of stem cells differentiation. Embryoid bodies (EBs) from ESCs were cultured with activin A and ATRA and ASCs where cultured in a medium with physiological concentration of glucose supplemented with ATRA, obtaining progenitor cells with renal epithelial characteristics. EBs expressed the early kidney organogenesis markers (Pax2, WT1, Wnt4, Notch2 Wnt9b) and ASCs changed their morphology to a more epithelial one and expressed both markers of kidney organogenesis (Pax2, WT1, Wnt4, SIX2 i Megalin) and epithelial markers (cytokeratin-18 and E-cadherin). Furthermore, miRNA analysis and the subsequent overexpression and silencing of the miRNA let-7e in stem cells, demonstrates that this miRNA has characteristics of differentiation inductor and that is essential in the expression of both kidney organogenesis markers and epithelial markers. Furthermore, the ESCs, let-7e miRNA modulates β-catenin levels through a mechanism involving inhibition of PKCβ and the consequent decrease in the phosphorylation of GSK3 (Ser-9). Moreover, it was demonstrated using the luciferase assay, that the miRNA let-7e directly inhibits expression of gelatinase B (MMP9) in ASCs and thereby modulates its renal epithelial differentiation.