Foram estudadas as proteínas da membrana eritrocitária de quarenta e seis espécies diferentes pertencentes à treze ordens da classe Mammalia, através de eletroforese em gel de poliacrilamida. Observamos que: 1. não parece haver correlação entre as concentrações relativas de espectrinas e o volume corpuscular médio. 2. não parece haver correlação entre as concentrações relativas de banda 3 e o volume corpuscular médio. 3. parece haver uma correlação inversa entre as concentrações relativas das anquirinas e o volume corpuscular médio. Assim, a maior parte dos animais pertencentes à ordem dos Artiodacty/a estudados (girafa, cervo nobre, veado campeiro, veado catingueiro, carneiro, cabra), que apresentam volume corpuscular baixo, exibe aumento significativo da concentração das anquirinas. 4. observou-se, o aparecimento de uma banda difusa na região 4.5 no Didelphis marsupialis (gambá), Arctocephalus tropicalis e Arctocephalus australis (lobo marinho subantártico e lobo marinho das ilhas do sul) e Panthera leo (leão) quando os estromas são submetidos à ação do NEM na concentração de 200 µM, e o não encontro desta banda nas demais espécies estudadas. Este fato poderia advir da hipótese de haver, nas três espécies, sequências de aminoácidos comuns que possibilitariam a ação química direta do NEM. 5. observou-se que, nos mamíferos estudados, embora houvesse variações qualitativas e quantitativas das proteínas da membrana nas espécies estudadas, práticamente todas elas apresentaram as proteínas descritas no Homo sapiens, mostrando serem todas elas importantes na manutenção do citoesqueleto e da membrana como um todo. 6. Com exceção da cutia, que exibe provavelmente quatro formas de espectrinas, todas as demais espécies exibiram duas formas, embora com variações qualitativas e quantitativas. 7. A banda 3 foi a proteína que mais exibiu variação, seja no peso molecular, com variação desde 95 kDa (Capra hircus, cabra) até 169 kDa (Alouatta sp, bugio), seja no aspecto difuso ou bem definido. 8. Houve na região 4.1/4.2 uma variabilidade grande, seja qualitativa, seja quantitativa com aparentes ausências dê\' uma ou de outra. Alguns roedores, a cobaia, cutia, hamster exibiram somente uma banda protéica na região 4.1/4.2. 9. Entre os primatas, todas as proteínas apresentaram o mesmo padrão entre os Hominoidea (macacos antropóides, Gorilla gorilla e Pongo pygmaeus e homem, Homo sapiens) e os do Velho Mundo (Cercopithecoidea, Papio cynocephalus e Erythrocebus pata). Mas, os primatas do Novo Mundo (Ceboidea, Cebus apella, Alouatta sp e AteIes paniscus chamek) apresentaram variação do peso molecular da banda 3, apresentando no entanto o mesmo aspecto difuso dos outros primatas descritos anteriormente. 10. Com exceção do Didelphis marsupialis (gambá) e Giraffa came/opardalis (girafa), que apresentaram evidência da ação de serina-proteases sobre uma anquirina, as demais espécies não exibiram proteases intra-eritrocitárias ativas nas condições estudadas. / Forty six different mammal species from thirteen regarding their erythrocyte membrane proteins, following data were observed: 1. No correlation was observed between mean corpuscular volume and spectrins concentration. 2. No correlation was observed between mean corpuscular volume and band 3 concentration. 3. It seems that there is inverse correlation between mean corpuscular volume and ankyrins concentration. Most of the studied animmals belonging to Artiodactyla, which exhibit low mean corpuscular volume, present higher ankyrin concentration. 4. A diffuse band in 4.5 region was observed among the Didelphis marsupialis, Arctocephalus tropicalis, Arctocephalus australis and Panthera leo when the ghosts were treated with 200 µM NEM, what was not found in the others species. This fact could be ascribed to hypothetical sequence of the Iysine, hystidine and cysteine which may be prone to NEM direct chemical action. 5. Although some qualitative and quantitative changes were observed among ali the studied species, ali of them seem to occur in the humans, disclosing that they are \"house-keeping\" proteins which participate as important pieces in the cytoskeleton structure and the membrane as well. 6. Ali the species presented two spectrins, with exception of Dasyprocta sp., which exhibited fours bands in the spectrins region. 7. The band 3 was the protein which showed the greatest variation, since 95 kDa in the Capra hircus up to 169 kDa in the Alouatta sp., as well as in the aspect, diffuse or well defined. 8. A great variability was observed in the 4.1/4.2 region, with apparent absence of one or another. Some Rodentia exhibited only one protein in the 4.1/4.2 region. 9. Among the Primates, the Hominoidea and the Cercopithecoidea presented an uniform pattern, but the New World monkeys (Cebus apella, Alouatta sp. and Ateies paniscus chamek) exhibited a striking molecular weight band 3 variation, although keeping the common diffuse pattern. 11. Ali the studied species did not present the evidence of protease action upon the membrane proteins, except the Didelphis marsupialis and Giraffa camelopardalis, which disclosed a proteolytic action upon the ankyrin.

Orientadores: Sonia Valeria P. Malheiros Marques Fernandes, Eneida de Paula / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T00:19:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Domingues_CleytonCrepaldi_M.pdf: 4439591 bytes, checksum: 806cbfd68fabc115f2daee1adf79c396 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: No processo de solubilização de lipídios e proteínas de membrana a escolha do surfatante é um passo fundamental. Um conhecimento detalhado das propriedades do surfatante se faz necessário na sua utilização em membranas biológicas. Neste trabalho determinamos algumas propriedades físico-químicas de dois novos surfatantes zwiteriônicos do tipo amidosulfobetaína, ASB-14 e ASB-16, e avaliamos seus efeitos sobre a solubilização de membranas eritrocitárias e suas proteínas. O ASB-16 por apresentar maior cauda hidrofóbica apresentou valor de CMC (concentração micelar crítica) cerca de 10 vezes menor que seu análogo ASB-14 nas condições estudadas (em água e em tampão PBS 5 mM, pH 7,4 a 25°C). Aplicando-se o tratamento clássico de Lichtenberg aos testes hemolíticos encontramos que o ASB-16 possui maior afinidade pelo ambiente membranar e seu efeito de solubulização sobre membranas eritrocitárias ocorre, portanto, em baixas razões surfatante/lipídio. O maior valor de partição e menor valor de CMC obtidos para o ASB-16 justificam seu efeito hemolítico superior. Além disso, ASB-14 e ASB-16 apresentaram efeitos hemolíticos superiores ao clássico Triton X-100. Dessa forma, esses resultados demonstraram que o comportamento agregativo e a interação hidrofóbica estão fortemente relacionados ao processo de solubilização. A solubilização das proteínas da membrana eritrocitária promovida pelo uso dos surfatantes ASB-14, ASB-16, CHAPS e Triton X-100 foi avaliada através da técnica de eletroforese bidimensional. Apesar do CHAPS solubilizar o maior número de proteínas que os demais surfatantes utilizados, o ASB-14 e ASB-16 mostraram-se capazes de solubilizar proteínas diferentes além de promoverem um aumento da solubilização de algumas proteínas. Portanto, nas condições experimentais utilizadas, a diferença entre o perfil de solubilização das proteínas e o efeito hemolítico induzido pelos surfatantes sugere que o fenômeno de hemólise não ocorre proporcionalmente à saída de proteínas da membrana. Os resultados obtidos nesse estudo sugerem que o uso de ASB-14 e ASB-16 em processos de solubilização de membranas e suas proteínas pode ser promissor e mais estudos sobre eles devem ser realizados / Abstract: The choice of a surfactant is one of the most important steps for lipid and membrane proteins solubilization. A detailed knowledge of the surfactant properties is very useful for its application into membrane studies. In this work, we determined physicochemical properties of two novel zwitterionic amidosulfobetaine surfactants, ASB14 and ASB-16, and their solubilization properties on erythrocyte membrane's lipids and proteins. For ASB-16, with a longer hydrophobic tail, the value of CMC (critica I micelle concentration) was about ten times smaller than that of ASB-14, both in water and in 5 mM PBS, pH 7.4, at 25°C. By applying a classical treatment for the interpretation of the hemolytic tests, we found that ASB-16 presents higher affinity for the membrane environment, 50 that, its effect on the erythrocyte membrane solubilization occurs at a small surfactant/lipid molar ratio. The higher partition coefficient value and lower CMC value obtained for ASB-16 explain its higher hemolytic effect, in comparison to ASB-14. Furthermore, ASB-14 and ASB-16 showed higher hemolytic activity than Triton X-100, a classic surfactant. These results showed that the aggregative phenomenon and hydrophobic interaction are strongly involved in the membrane solubilization process. The solubilization of erythrocyte membrane associated proteins, using ASB-14, ASB-16, CHAPS and Triton X-100, was evaluated through two-dimensional electrophoresis. Although CHAPS have solubilized more proteins than the others surfactants, ASB-14 and ASB-16 increased the solubilization of some proteins and different spots were observed. In the experimental conditions studied, the difference between the protein solubilization and the Iytic effect induced by surfactants suggest that the hemolytic phenomenon does not occur proportionally with the proteins release from the membrane. The results obtained in this study suggest that the use of ASB-14 and ASB-16 on biomembranes and their protein solubilization can be promising and further studies about them should be carried out / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Eneida de Paula, Cleyton Crepaldi Domingues / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T17:11:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Casadei_BrunaRenata_M.pdf: 5692711 bytes, checksum: 9dcfea152b622eb3bd7d81b793794e3e (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A visão atual sobre membranas biológicas abarca descrições cada vez mais complexas devido, principalmente, à descoberta de novos papéis atribuídos aos lipídios e sua heterogeneidade. Em particular a associação de esfingolipídios e colesterol, acrescida de proteínas específicas, constitui a base da formação de domínios membranares conhecidos como lipid rafts. Rafts são microdomínios funcionais de biomembranas e estão envolvidos em diversos processos biológicos como reconhecimento celular, endocitose, transdução de sinal, entre outros processos. Uma estratégia experimental para estudar esses domínios é a preparação de frações de membrana parcialmente resistentes ao tratamento com detergentes, a baixa temperatura (4°C). Neste trabalho demonstramos pela primeira vez o preparo e caracterização de frações resistentes a detergente (DRMs) extraídas de membranas de eritrócito humano, a partir do tratamento com os detergentes não iônicos polioxietileno 20-oleil éter (Brij 98) e polioxietileno 20-cetil éter (Brij 58), seguida de separação por ultracentrifugação em gradiente de sacarose. Essas DRMs foram obtidas a 4°C e 37°C, a partir de membranas intactas e com conteúdo reduzido de colesterol (após tratamento com metil-beta-ciclodextrina) e foram comparadas com DRMs de Triton X-100 (TX-100) em relação ao tamanho, conteúdo proteico e lipídico e grau de organização da bicamada. As frações de DRM de Brij mostraram-se enriquecidas em colesterol e fosfolipídios com ácidos graxos de cadeia saturada (em especial ácido lignocérico das esfingomielinas), características consistentes com lipid rafts. No entanto, DRMs de TX-100 apresentaram maior proporção de esfingomielinas/glicerofosfolipídios que as frações obtidas com Brij, além de menor proporção de fosfatidiletanolamina, um lipídio preferencial da monocamada interna da membrana de eritrócitos. Em relação à solubilização proteica, a membrana do eritrócito foi mais resistente ao tratamento com Brij 98 do que aos outros dois detergentes. Flotilina-2 e estomatina foram encontradas nas frações de DRMs de Brij 98 e Brij 58, porém a redução do conteúdo de colesterol da membrana eritrocitária resultou numa menor associação da flotilina-2 àquelas DRMs. Resultados de Ressonância Paramagnética Eletrônica, com uso de marcadores de spin do tipo doxil-estearato não acusaram variação significativa no grau de empacotamento dos lipídios nas bicamadas de DRMs de Brij 98 e Brij 58 em relação à membrana eritrocitária, diferentemente do observado em DRMs de TX-100 e do que seria esperado para domínios lipídicos na fase líquido-ordenada. Em conclusão, DRMs de eritrócitos humanos, com características compatíveis aos domínios funcionais de biomembranas (rafts), foram obtidas tanto a 4ºC quanto a 37ºC; essas frações resistentes aos Brij apresentaram tamanho, composição proteica e lipídica e grau de empacotamento da bicamada diferente das DRMs de TX-100, indicando um processo de extração diferencial dos componentes da membrana eritrocitária induzida por esses detergentes / Abstract: Depiction of biological membranes has been turning more and more complex lately due to the new roles assigned to their lipid components and their heterogeneity. The association between sphingolipids and cholesterol is the basis of lipid rafts formation. Rafts are functional microdomains of biological membranes which have been associated to different biological processes such as cellular recognition, endocytosis and signal transduction, among others. An useful experimental approach to study lipid rafts is the preparation of membrane fractions partially resistant to detergents under low temperature (4ºC). In this work we report the isolation of detergent resistant membranes (DRMs) from human erythrocytes treated with the non-ionic detergents polioxyethylene 20-oleoyl ether (Brij 98) and polioxyethylene 20-cetyl ether (Brij 58) followed by sucrose gradient ultracentrifugation. Such DRMs were obtained at 4°C and 37°C, from cholesterol-depleted (treated with methyl-beta-cyclodextrin) and intact erythrocyte membranes and they compared to DRMs obtained with Triton X-100 (TX-100) regarding the size, protein and lipid content and membrane fluidity. Brij DRMs were found to be enriched in cholesterol and phospholipids containing saturated fatty acids (especially those from sphingomyelin), features commonly associated to lipid rafts. Nevertheless, TX-100 DRMs presented higher sphingomyelin/phospholipid ratios and lower phosphatidylethanolamine content (a glycerophospholipid mainly present in the inner leaflet) than the Brij's. As for protein solubilization, erythrocyte membranes were more resistant to Brij 98 than to the other two detergents. Flotillin-2 and stomatin were found in both Brij 98 and Brij 8 DRMs. However, flotillin-2 was partially solubilized when DRMs were prepared from cholesterol-depleted erythrocyte membrane. Electron paramagnetic resonance experiments, with doxyl stearic acid spin labels incorporated in the DRMs showed no significant changes in the bilayer compactness of Brij 98 and 58 DRMs in comparison to intact membrane, a unexpected result for lipid domains existing in a liquid-ordered phase, and in contrast to results previously observed with TX-100 DRMs. Altogether, these results show the isolation of DRMs from human erythrocytes treated with Brij 98 and Brij 58 at low (4°C) and physiological temperature (37°C). These detergent-resistant membrane fractions, obtained with Brij 98 and 58 presented some lipid rafts features, although with differences in protein and lipid contents, size and membrane fluidity in comparison to TX-100 DRMs. Besides, these results suggest that TX-100, Brij 98 and Brij 58 induced a different solubilization process on the erythrocyte membrane / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Chapter II - [Introduction] The stability of a biological membrane is resultant from its composition and from the composition of the internal medium of the living organism, which depends on genetic influences, feeding and life style. [Objective] This work aimed to study transversally in a human female population the dependence of the erythrocytes stability with age, nutritional status, erythrocytes counting and medium corpuscular volume (MCV). [Subjects] The sample was constituted of human females (N = 67), with 20 to 94 years, proceeding from a defined region with similar dietary habits and life styles. [Methods] The erythrocytes stability against hypotonic lysis and ethanol action was given by the concentration of NaCl (H50) or ethanol (D50) capable to promote 50% of hemolysis. The H50 values were determined at 26, 32, 37, 42 and 47 °C; the D50 values were determined only at 37 °C. The nutritional status of the volunteers was evaluated with the Mini-Nutritional Assessment (MNA). [Results] H50 was inversely dependent (P<0.05) with age and MCV, but not with MNA score neither the erythrocyte counting of the volunteer, at 26, 32, 37 and 42 °C, but not at 47 °C. D50 presented a linear and positive dependency with the volunteer age. H50 present a linear and negative dependence with the temperature increase. The H50 values in the thermal dependence line of H50 for the females with 20 to 39 years were significantly higher than those for the females above 60 years. [Conclusions] The stability of the erythrocytes against hypotonic stress and denaturation by ethanol increased with the age of the volunteers. This stability increase was not determined by differences in the nutritional status neither in medium corpuscular volume. The stability of the erythrocytes decreased significantly with the temperature increase between 26 and 47 °C. The females above 60 years presented erythrocytes with higher stability than the females with 20 to 39 years within this thermal interval. / Capítulo II - [Introdução] A estabilidade de uma membrana biológica é resultante de sua composição e da composição do meio interno do organismo vivo, que dependem de influências genéticas, alimentação e estilo de vida. [Objetivo] Este trabalho teve por objetivo estudar transversalmente em uma amostra da população feminina a dependência da estabilidade de eritrócitos humanos com a idade, o estado nutricional, a quantidade de eritrócitos e o volume corpuscular médio (VCM). [Amostra] A amostra foi constituída de mulheres com 20 a 94 anos, provenientes de uma região definida com hábitos alimentares e estilos de vida semelhantes. [Métodos] A estabilidade de eritrócitos, contra lise por choque hipotônico e a ação de etanol, foi dada pela concentração de NaCl (H50) ou de etanol (D50) capaz de promover 50% de hemólise. Os valores de H50 foram determinados a 26, 32, 37, 42 e 47 °C, e os de D50, apenas a 37 °C. O estado nutricional das voluntárias foi avaliado pela Mini-Avaliação Nutricional (MNA). [Resultados] H50 foi inversamente dependente (P<0.05) da idade, mas não com o escore do MNA, o VCM e a contagem de eritrócitos das voluntárias, a 26, 32, 37 e 42 °C, mas não a 47 °C. D50 apresentou uma dependência linear positiva com a idade. H50 apresentou uma dependência linear negativa com o aumento da temperatura. Os valores de H50 na reta de dependência térmica de H50 das mulheres com 20 a 39 anos foram significantemente maiores daqueles da reta das mulheres acima de 60 anos. [Conclusões] A estabilidade dos eritrócitos contra estresse hipotônico e desnaturação por etanol aumentou com a idade de suas doadoras. Este aumento na estabilidade de eritrócitos não foi determinado por diferenças no estado nutricional e nem por diferenças no volume corpuscular médio. A estabilidade dos eritrócitos das voluntárias diminuiu significantemente com o aumento na temperatura entre 26 e 47 °C. As mulheres com mais de 60 anos apresentaram eritrócitos com maior estabilidade do que aquelas com 20 a 39 anos nesse intervalo térmico. / Doutor em Genética e Bioquímica

Objetivo: Comparar a evolução clínica de pacientes críticos idosos (>= 60 anos) com pacientes mais jovens (< 60 anos) após a implementação de uma estratégia liberal ou restritiva de transfusão de hemácias. Métodos: Trata-se de uma análise dos seguintes ensaios clínicos randomizados: Transfusion Requirements After Cardiac Surgery (TRACS), Transfusion Requirements in Surgical Oncologic Patients (TRISOP) e Transfusion Requirements In Critically ill Oncologic Patients (TRICOP). Nós estratificamos os pacientes em idade abaixo de 60 anos ou maior ou igual a 60 anos que foram randomizados para uma estratégia liberal ou restritiva de transfusão de hemácias. O desfecho composto foi um combinado de mortalidade em 30 dias e complicações graves. Resultados: Dos 1000 pacientes incluídos, 567 (57%) apresentavam 60 anos ou mais e 433 (43%) apresentavam menos de 60 anos e foram incluídos no estudo. O desfecho primário nos pacientes mais jovens (< 60 anos) ocorreu em 57% dos pacientes do grupo liberal e em 48% dos pacientes do grupo restritivo (p=0,060). O desfecho primário nos pacientes idosos foi alcançado em 63,3% dos pacientes no grupo liberal e em 69,4% dos pacientes no grupo restritivo (p=0,123). Entretanto, nos pacientes mais idosos, o choque cardiogênico foi mais frequente nos pacientes no grupo submetido a estratégia restritiva (14,8% vs 6%, p=0,001). Conclusões: Embora não tenha sido demonstrada nenhuma diferença no desfecho primário entre os grupos, a estratégia restritiva de transfusão foi associada a aumento da ocorrência de choque cardiogênico nos pacientes idosos críticos quando comparada a estratégia liberal. O risco cardiovascular da anemia pode ser mais deletério do que o risco da transfusão de sangue em pacientes idosos / Objective: The aim of this study was to compare outcomes in critically ill patients who are aged 60 years or more or less than 60 years after implementation of a restrictive or a liberal transfusion strategy. Methods: This is an analysis of the Transfusion Requirements After Cardiac Surgery (TRACS) randomized clinical trial of the Transfusion Requirements in Surgical Oncologic Patients (TRISOP) randomized clinical trial and of the Transfusion Requirements In Critically ill Oncologic Patients (TRICOP) randomized clinical trial. In this analysis, we separated patients into those aged 60 years or more (elderly) and those aged less than 60 years randomized to a restrictive or a liberal strategy of red blood cell transfusion. The primary outcome was a composite defined as a combination of 30-day all-cause mortality and severe morbidity. Results: Of the 1000 patients included in the studies, 567 (57%) were aged 60 years or more and 433 (43%) were aged less than 60 years and were included in this study. The primary outcome in younger patients ( < 60 years-old) occurred in 56.9% of patients in the liberal strategy group and in 47.9% of patients in the restrictive strategy group (p=0.060). The primary outcome in elderly patients (>= 60 years-old) occurred in 63.3% of patients in the liberal strategy group and in 69.4% of patients in the restrictive strategy group (p=0.123). However, in the older patients, cardiogenic shock was more frequent in patients in the restrictive transfusion group (14.8% vs 6%, p=0.001). Conclusions: Although there was no difference between groups regarding the primary outcome, a restrictive transfusion strategy was associated with an increased rate of cardiogenic shock in elderly critical patients compared with a more liberal strategy. Cardiovascular risk of anemia may be more harmful than the risk of blood transfusion in older patients

The photobiomodulation therapy (PBMT) has many demonstrated applications in the health area including anti-inflammatory and wound healing effects. The main objective of this work is to verify if the PBMT causes measurable changes in the mechanical properties of cells, specifically in red blood cells, epithelial cells and fibroblasts. In addition, to contribute to the knowledge of the action mechanisms of the PBMT, this study intends to support applications of the PBMT during invasive procedures, such as the direct photo-treatment of the blood in surgical procedures with cardiopulmonary bypass, regarding security of the cellular integrity. For this analysis, three experimental techniques were used: optical magnetic twisting cytometry (OMTC), defocusing microscopy and confocal laser-scanning microscopy. Human bronchial epithelial cells were evaluated with OMTC. The epithelial cell culture was either photo-treated or not, with red laser (lambda=660 nm), and fixed power and time (power density of 153 mW/cm2, time 300 s). It was not possible to observe significant differences between photo-treated and control epithelial cells, for the hysteresivity (ratio between the cell loss and elastic shear moduli). The defocusing microscopy, similar to a phase contrast microscopy, was used to study human red blood cells from fresh blood. The red blood cells were either photo-treated or not, with red laser (lambda=660 nm), and different powers and times (power densities from 0 to 510 mW/cm2, times from 0 to 180 s). Some morphological and mechanical characteristics of individual red blood cells were evaluated, such as volume, radial profile of cell thickness, lateral and vertical membrane fluctuations, for the photo-treated and control red blood cells. It was not possible to detect differences between the two groups, for any of the parameters analyzed. For both techniques, the absence of detectable differences might be due to several factors, such as the non-action of the PBMT, with the parameters used, in the epithelial cells and red blood cells or to the small sensitivity of each technique. Confocal laser-scanning microscopy was used to evaluate the actin filaments of mouse fibroblasts. The fibroblast cell culture was either photo-treated or not, with red (lambda=625 nm) or infrared (lambda=808 nm) light and fixed power and time (power density from 113 to 158 mW/cm2, time 300 s). The nucleus and cell areas increased slightly when comparing photo-treated and control cells. On the other hand, the total actin, total actin density and the number of filaments decreased. These changes were detected for a short time after treatment, however, after 24 h they are not anymore detectable. The total branch length does not seem to suffer any modifications. In summary, with the data acquired with the three techniques, it was found that the PBMT, in the red range, with the parameters used, could not cause noticeable changes in red blood cells and epithelial cells, in vitro. On the other hand, the PBMT in the red and near-infrared range, with the power and times used, cause changes in actin filaments of fibroblasts, in vitro, in particular the decrease of the total actin density. / A terapia por fotobiomodulação tem muitas aplicações na área de Saúde devido a sua ação anti-inflamatória e de reparação tecidual. O objetivo geral desse trabalho é verificar se a terapia por fotobiomodulação provoca mudanças nas propriedades mecânicas de células, em particular em hemácias, células epiteliais e fibroblastos. Além de contribuir com o conhecimento dos mecanismos de ação da terapia por fotobiomodulação, este estudo pretende subsidiar aplicações da terapia por fotobiomodulação durante procedimentos mais invasivos, como a iluminação direta do sangue em procedimentos cirúrgicos com circulação extracorpórea, sob o ponto de vista da segurança quanto à integridade celular. Para essa análise foram utilizadas três técnicas experimentais: citometria óptica magnética de oscilação (OMTC), microscopia de desfocalização e microscopia confocal. Com a técnica de OMTC foram avaliadas células epiteliais brônquicas humanas em cultura, foto-tratadas com laser vermelho (lambda=660 nm), com potência e tempo fixos (densidade de potência de 153 mW/cm2, tempo 300 s). Não foi possível constatar diferenças significativas entre as células epiteliais foto-tratadas e as células controle, para a histerisividade (razão entre os módulos viscoso e elástico das células). Com a técnica de microscopia de desfocalização, semelhante a uma microscopia de contraste de fase, foram estudadas hemácias humanas de sangue recém coletado. As hemácias foram tratadas com laser vermelho (lambda=660 nm), com potências e tempos variados (densidade de potência de 0 a 510 mW/cm2, tempo de 0 a 180 s). Foram avaliadas algumas características morfológicas e mecânicas das hemácias individualmente, como o volume, perfil radial de espessura, flutuações lateral e vertical da membrana, tanto para hemácias foto-tratadas quanto para hemácias controle. Não foi possível detectar diferenças entre as hemácias foto-tratadas e controle para nenhum dos parâmetros avaliados. Para ambas as técnicas, a falta de mudanças observáveis poderia ser devida a diversos fatores, como a não ação da terapia por fotobiomodulação nas células epiteliais e nas hemácias, com os parâmetros aqui empregados, ou à falta de sensibilidade de cada uma das técnicas usadas. A microscopia confocal foi utilizada para avaliar os filamentos de actina de fibroblastos de camundongo em cultura, os quais foram foto-tratados com luz vermelha (lambda=625 nm) ou infravermelha (lambda=808 nm) e potência e tempo fixos (densidade de potência de 113 a 158 mW/cm2, tempo 300 s). Foi possível constatar ligeiro aumento nas áreas nuclear e celular das células foto-tratadas em relação aos fibroblastos controle. Também foi possível verificar a diminuição da quantidade total de actina, densidade de actina e do número de filamentos de actina nos fibroblastos foto-tratados. Essas mudanças são detectadas para tempos curtos após o tratamento, sendo que depois de 24 h elas desaparecem. O tamanho total dos filamentos parece não sofrer alterações. A partir dos dados coletados com as três técnicas, foi possível constatar que a terapia por fotobiomodulação, com os parâmetros utilizados, não consegue provocar mudanças perceptíveis em hemácias e em células epiteliais, in vitro. Porém, causa mudanças nos filamentos de actina de fibroblastos, in vitro, em particular a diminuição da densidade de actina total.

Introdução: Desde a década de 1970, quando se observou que a transfusão pré-transplante renal diminuía a rejeição ao enxerto, o efeito transfusion-related immunomodulation (TRIM) vem sendo estudado, não havendo, ainda, um entendimento completo de seu mecanismo. Recentemente, a descrição das células T reguladoras (TREG) trouxe novas possibilidades de compreensão desse fenômeno, com grande implicação terapêutica. Objetivos: Avaliar a proporção de células TREG antes e após a transfusão de concentrado de hemácias em uma amostra de pacientes clínicos não imunossuprimidos e correlacionar os resultados com o volume transfundido e o tempo de estocagem do sangue. Métodos: Pacientes com diversas patologias clínicas e com indicação de transfusão de concentrado de hemácias foram recrutados consecutivamente. Após assinatura do consentimento informado, o número de células TREG pré e pós-transfusão foi avaliado, bem como sua correlação com o número de unidades transfundidas e o tempo de estocagem. Resultados: Observou-se um aumento estatisticamente significativo na proporção de células TREG (CD4+, CD25+, FOXP3+) 72 horas após a transfusão (p=0,003). Tal aumento mostrou correlação com o número de unidades transfundidas, mas não com o tempo de estocagem (p=0,017 e 0,49, respectivamente). Conclusão: O aumento do numero de células TREG parece estar presente após transfusão de hemácias não leucodepletadas mesmo em uma amostra heterogênea, o que reforça sua importância clínica. A influência do número de unidades mas não do tempo de estocagem corrobora estudos anteriores. O mecanismo molecular do efeito TRIM, bem como seu impacto clínico em um cenário real, ainda precisam ser melhor avaliados. / Background: Transfusion-related immunomodulation (TRIM) has been the subject of research since the 1970s, when transfusion before kidney transplantation was found to decrease the rates of allograft rejection, but the mechanisms underlying this effect have yet to be fully elucidated. The recent description of regulatory T cells (TREG) has paved the way for a new understanding of this phenomenon, with major therapeutic implications. Objectives: To assess the levels of TREG cells before and after transfusion of packed red blood cells in a clinical sample of non-immunosuppressed patients and to correlate findings with the volume of blood transfused and length of storage. Methods: Patients with a variety of clinical conditions and with an indication for transfusion of packed red blood cells were recruited consecutively. After providing informed consent, pre- and post-transfusion TREG levels were measured, and their correlation with number of units transfused and length of storage was assessed. Results: There was a significant increase in the levels of TREG cells (CD4+/CD25+/FOXP3+) within 72 hours of transfusion (p=0.003). This increase correlated with the number of units transfused, but not with length of storage (p=0.017 and 0.49, respectively). Conclusion: An increase in TREG cell levels appears to follow transfusion of non-leukoreduced packed red blood cells even in a heterogeneous sample, which highlights the clinical relevance of this phenomenon. The influence of number of transfused units, but not of length of storage, on the results corroborates the findings of previous non-clinical studies. Further research is warranted to better investigate the molecular mechanism of the TRIM effect, as well as its clinical impact in real-world settings.

Submitted by Sandro Camargo (sandro.camargo@unipampa.edu.br) on 2015-03-09T02:33:51Z No. of bitstreams: 1 116110002.pdf: 901358 bytes, checksum: edf3d6fae4ace04065873f00039b9507 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-09T02:33:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 116110002.pdf: 901358 bytes, checksum: edf3d6fae4ace04065873f00039b9507 (MD5) Previous issue date: 2012-11-16 / A hiperglicemia leva a uma série de fenômenos bioquímicos que estão envolvidos na gênese do estresse oxidativo. O vinho é considerado um alimento antioxidante por conter uma grande quantidade de compostos fenólicos. O objetivo desse estudo foi observar o efeito antioxidante do vinho Tannat (safra 2006), produzido em Itaqui (RS), sobre o estresse oxidativo induzido por glicose ou frutose em eritrócitos in vitro. Eritrócitos foram incubados durante 24 horas a 37°C com concentrações de 5, 10, 30 e 100 mmol/L de glicose ou frutose, na presença ou ausência de diferentes volumes de vinho (0,075, 0,15 e 0,225 mL de vinho/mL de eritrócitos). Foram determinadas espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico, consumo de glicose e fragilidade osmótica dos eritrócitos, além de polifenóis totais, antocianinas totais, ácido gálico, ácido caféico, epicatequina, resveratrol e a capacidade antioxidante (DPPH) do vinho. Os eritrócitos incubados com glicose e frutose apresentaram um aumento significativo da peroxidação lipídica quando comparados com eritrócitos incubados com 5 mmol/L de glicose ou frutose, o que foi prevenido com a adição de vinho. O vinho tinto apresentou altas concentrações de polifenóis totais, ácido gálico, ácido caféico, epicatequina e resveratrol, além de boa capacidade antioxidante. O consumo de glicose pelos eritrócitos nas concentrações de 5 e 10 mmol/L foi significativo, o que não ocorreu para os eritrócitos incubados com 30 e 100 mmol/L de glicose. O volume de 0,075 mL de vinho foi capaz de prevenir a inibição da captação de glicose pelos eritrócitos incubados com 30 e 100 mmol/L de glicose. No teste de fragilidade osmótica concentrações hipotônicas de NaCl induziram lise progressiva dos eritrócitos, que foi significativa apenas para os eritrócitos incubados com 30 e 100 mmol/L de frutose, sendo esta revertida através do tratamento dos eritrócitos com o vinho. Podemos concluir que o vinho tinto, a partir do volume mais baixo utilizado, pode diminuir a peroxidação lipídica, prevenir a inibição da captação de glicose pelos eritrócitos, além de diminuir a fragilidade osmótica de eritrócitos incubados com frutose. Este efeito antioxidante do vinho se deve, provavelmente, às altas concentrações de polifenóis encontrados e sua boa capacidade antioxidante. / Hyperglycemia leads a series of biochemical phenomena that are involved in the genesis of oxidative stress. The wine is considered an antioxidant food to contain a large amount of phenolic compounds. The aim of this study was to observe the antioxidant effect of Tannat wine (vintage 2006), produced in Itaqui (RS), on oxidative stress induced by glucose or fructose in erythrocytes in vitro. Erythrocytes were incubated for 24 hours at 37°C with concentrations of 5, 10, 30 and 100 mmol/L glucose or fructose in the presence or absence at different volumes of wine (0.075, 0.15 and 0.225 mL of red wine/mL of erythrocytes). Were determined Thiobarbituric acid reactive species, glucose consumption and osmotic fragility of erythrocytes; in addition total phenolic, anthocyanins, gallic acid, caffeic acid, epicatechin, resveratrol and the DPPH Scavenging Activity of wine. Erythrocytes incubated with glucose and fructose showed a significant increase in lipid peroxidation compared with erythrocytes incubated with 5 mmol/L glucose or fructose, which was prevented by addition of wine. The red wine presented high concentrations of total polyphenols, gallic acid, caffeic acid, epicatechin and resveratrol, further good antioxidant potential. The consumption of glucose by the erythrocytes at concentrations of 5 and 10 mmol/L was significant, this was not observed for the erythrocytes incubated with 30 and 100 mmol/L glucose. The volume of 0.075 ml of wine was able to prevent the inhibition of glucose uptake by erythrocytes incubated with 30 and 100 mmol/L glucose. In the test of osmotic fragility hypotonic concentrations of NaCl induced lysis of erythrocytes progressive, which was significant only for erythrocytes incubated with 30 and 100 mmol/L fructose, this being reversed by treating cells with wine. We conclude that red wine, from the lower volume used, can decrease lipid peroxidation, prevented the inhibition of glucose uptake and decreased osmotic fragility of erythrocytes incubated with fructose. This antioxidant effect of wine is probably due to high concentrations of polyphenols and its good antioxidant capacity.

Este trabalho propõe um sistema de baixo custo baseado em uma plataforma com um processador RISC para contagem de células vermelhas (hemácias) de animais silvestres aplicável a animais domésticos. Este sistema tem o objetivo de realizar a contagem semi-automática de células de diferentes espécies de animais silvestre, cujos tamanhos e volumes variam consideravelmente. Os resultados obtidos com a contagem de células de cães e cavalos mostram que o sistema proposto consegue contar de modo automático a maioria das células, apresentando um erro médio de 1,88% de falsos negativos e de 1,82% de falsos positivos. O sistema permite ao usuário corrigir manualmente esta contagem, no máximo, 3,70% da quantidade total das células. Também, o sistema permite o armazenamento das imagens das amostras como forma de documentação do exame. / A RISC-based platform is proposed for supporting the counting of red blood cells of wild animals. This platform is aimed for semi-automatic counting of the cells from different species of animals where size and volume of cells can greatly differ. The results show that this system can automatically count most of the cells correctly with an average error of only 1.88% of false negatives and 1.82% of false positives. It’s possible for the user to manually correct the results where a work at most 3.70%. It´s also possible to storage the images for future use.

Made available in DSpace on 2016-08-15T20:31:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MarcondesDT_DISSERT.pdf: 728916 bytes, checksum: 8c13a239f8df3b37ffebe85a27801c15 (MD5) Previous issue date: 2013-11-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The present study aimed to evaluate the hematological, biochemical and hemogasometric changes in caprine blood stored in CPDA-1 and CPD/SAG-M bags. Seven male, adult, neutered, mixed breed goats weighing an average of 45kg were used. From each animal, 25% of the estimated total blood volume was collected into two plastic bags, one containing CPDA-1 and another with CPD/SAG-M; next they were stored for 42 days. Hematological (number of erythrocytes, packed cell volume, total and plasmatic hemoglobin, degree of hemolysis, mean cell volume, leukocytes), biochemical (glucose, lactate, sodium, potassium, total plasma protein), hemogasometric (pH, bicarbonate, partial pressure of oxygen, partial pressure of carbon dioxide, oxygen saturation, base deficit, total carbon dioxide) and microbiological evaluations were performed in seven moments (T), T0 (immediately after sampling), T7 (seven days), T14 (fourteen days), T21 (twenty-one days) , T28 (twenty-eight days), T35 (thirty-five days) and T42 (forty-two days after sampling). In the two bags there was an increase of plasmatic hemoglobin, degree of hemolysis, lactate, pO2 and a decrease of total hemoglobin and pH. In the bags there was no alteration in the erythrocyte count, glucose, sodium, potassium or partial pressure of carbon dioxide. In the comparison with the CPDA-1, the CPD/SAG-M bag had lower erythrocytes, packed cell volume, total hemoglobin and sodium, as well as higher levels of hemolysis and plasmatic hemoglobin. The changes observed in the caprine blood stored for 42 days in CPDA-1 and CPD/SAG-M bags were not sufficient to invalidate their use as a therapeutic resource, however, it has been found that it is preferable to use CPDA-1 bags for the conservation of caprine blood / O presente trabalho objetivou fazer avaliação hematológica, bioquímica e hemogasométrica do sangue caprino armazenado em bolsas CPDA-1 e CPD/SAG-M. Foram utilizados 7 caprinos machos, adultos, castrados, sem raça definida, pesando em média 45kg. O sangue foi coletado em duas bolsas plásticas, uma contendo CPDA-1 e outra CPD/SAG-M, sendo armazenadas durante 42 dias. Realizou-se avaliações hematológicas (número de eritrócitos, volume globular, hemoglobina total e plasmática, grau de hemólise, volume corpuscular médio, leucócitos), variáveis bioquímicas (glicose, lactato, sódio, potássio, proteínas totais), variáveis hemogasométricas (pH, bicarbonato, pressão parcial de oxigênio e de dióxido de carbono, saturação de oxigênio, déficit de base, dióxido de carbono total) e microbiologia, em sete momentos (T), sendo T0 (imediatamente após a coleta), T7 (sete dias), T14 (quatorze dias), T21 (vinte e um dias), T28 (vinte e oito dias), T35 (trinta e cinco dias) e T42 (quarenta e dois dias após a coleta). Nas duas bolsas houve aumento da hemoglobina plasmática, grau de hemólise, lactato, pressão parcial de oxigênio, redução de hemoglobina total e pH. Nas bolsas não houve variação no número de eritrócitos, glicose, sódio, potássio e pressão parcial de dióxido de carbono. Na comparação com a CPDA-1, a bolsa CPD/SAG-M apresentou menores valores de eritrócitos, VG, hemoglobina total e sódio, e maiores valores de grau de hemólise e hemoglobina plasmática. As alterações observadas no sangue caprino armazenado durante 42 dias, em bolsas CPDA-1 e CPD/SAG-M, não foram suficientes para invalidar seu uso como recurso terapêutico