Eventos isquêmicos seguidos por reperfusão levam ao dano celular e mitocondrial devido à abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (TPM). Todavia, o pré-condicionamento evita o dano celular por isquemia e reperfusão. Esse efeito protetor é semelhante ao obtido pela abertura do canal mitocondrial de potássio sensível a ATP (mitoKATP). Aqui, nós mostramos os mecanismos de sinalização que ativam o mitoKATP durante o pré-condicionamento, o papel redox destes canais e seu conseqüente mecanismo protetor. Usando células cardíacas HL-1, nós demonstramos que aumentos em espécies reativas de oxigênio (EROs) observadas durante o pré-condicionamento não foram revertidos por antagonistas do mitoKATP, que significativamente evitaram a proteção pelo pré-condicionamento. Isso sugere que essas espécies são formadas anteriormente à abertura do canal. Consistente com essa hipótese, a adição de catalase a corações perfundidos de rato e a células HL-1 promove reversão dos efeitos benéficos do pré-condicionamento, mas não do diazóxido (um agonista do mitoKATP). Por outro lado, 2-mercaptopropionil glicina preveniu a cardioproteção em ambos os casos, sugerindo que este composto deve apresentar outros efeitos além de antioxidante. De fato, verificamos que agentes redutores tiólicos interferem na ativação do mitoKATP mediada pelo diazóxido em mitocôndrias isoladas de coração de rato. Examinando como o mitoKATP pode ser ativado durante o pré-condicionamento, constatamos que EROs endógenas e exógenas fortemente ativaram o mitoKATP, sugerindo que o moderado aumento nas EROs durante o pré-condicionamento pode ativar esse canal. Uma vez ativado, o canal preveniu as condições (captação de Ca2+ e formação de EROs) que favorecem a ocorrência de TPM em situação de isquemia. A atividade deste canal também leva à diminuição de EROs gerados fisiologicamente ou durante períodos de isquemia e reperfusão, evitando o dano celular conseqüente. Este fato não envolveu nenhum aumento nos sistemas de remoção de oxidantes. Por outro lado, a inibição da TPM, usando ciclosporina A, preveniu o estresse oxidativo somente durante a reperfusão, mas protegeu as células de maneira indistinguível da abertura do mitoKATP. Juntos, nossos resultados sugerem que o mitoKATP age como um sensor para as EROs que diminui a sua geração em resposta a níveis aumentados de oxidantes. Em conseqüência, estes canais regulam o balanço redox em condições fisiológicas e previnem o estresse oxidativo em condições patológicas, inibindo com isso a ocorrência de TPM e morte celular isquêmica. / Ischemia followed by reperfusion results in impairment of cellular and mitochondrial functionality due to opening of mitochondrial permeability transition (MPT) pores. Nevertheless, preconditioning rescues cells from ischemic damage. Mitochondrial ATP-sensitive K+ channel (mitoKATP) opening also prevents cardiac ischemic cell death. Here we show the signaling mechanisms that activate mitoKATP during preconditioning, the redox role of these channels and consequent protective mechanisms. Using cardiac HL-1 cells, we found that increases in reactive oxygen species (ROS) observed during preconditioning were not inhibited by mitoKATP antagonists, although these drugs significantly avoided the protection afforded by preconditioning, suggesting their activation occurrs upstream of channel activity. Consistent with this, catalase addition to perfused rat hearts and HL-1 cells reversed the beneficial effects of preconditioning, but not of diazoxide (a mitoKATP agonist). On the other hand, 2-mercaptopropionylglycine prevented cardioprotection in both cases, suggesting this compound may present effects other than scavenging ROS. Indeed, thiol reducing agents impaired diazoxide-mediated activation of mitoKATP in isolated rat heart mitochondria. We found that endogenous or exogenous ROS strongly enhanced mitoKATP activity, suggesting that moderate increments in ROS release during preconditioning may activate mitoKATP. Furthermore, mitoKATP prevented conditions (Ca2+ uptake and ROS formation) that favor the opening of MPT pores under ischemic conditions. MitoKATP opening decreased ROS generation physiologically and during both ischemia and reperfusion, consequently avoiding cellular damage. This prevention does not involve an increase in oxidant removal systems. On the other hand, the inhibition of MPT, using cyclosporin A, prevented oxidative stress only during simulated reperfusion, but protected cells in a manner indistinguishable from mitoKATP opening. Collectively, our results suggest that mitoKATP acts as a ROS sensor that decreases mitochondrial ROS generation in response to enhanced local levels of oxidants. As a result, these channels regulate mitochondrial redox state under physiological conditions and prevent oxidative stress under pathological conditions, inhibiting MPT opening and ischemic cardiac damage.

O amendoim (Arachis hypogaea L.) é um grão muito apreciado em todo o mundo, sendo cultivado em vários países desenvolvidos e em desenvolvimento. A planta é uma oleaginosa com alto valor nutricional e rica em compostos bioativos, cultivada largamente em zonas de clima semiárido, onde prevalece a seca, que pode afetar a produção e a composição dos grãos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a composição química, atividade antioxidante, compostos fenólicos, tocoferóis e ácidos graxos de genótipos de amendoim contrastantes quanto à adaptação a ambientes com limitação hídrica, bem como definir quais atributos são capazes de caracterizar esses genótipos. Os genótipos utilizados foram oriundos do programa de melhoramento genético de amendoim da Embrapa Algodão (Campina Grande - PB), os quais são adaptados ao estresse hídrico. Foram analisados grãos com e sem película, uma vez que seu consumo pode ocorrer de ambas as formas. Para os grãos sem a película a caracterização da fração oleosa foi realizada por meio da identificação e quantificação dos ácidos graxos e tocoferóis, enquanto que a avaliação química da fração fenólica foi feita por espectrometria de massas de alta resolução (LC-ESI-LTQ-Orbitrap-MS). A atividade antioxidante foi determinada por meio da desativação de espécies reativas de oxigênio (superóxido, ácido hipocloroso e peroxila) e do método on-line (HPLC-ABTS). Os resultados da caracterização da fração oleosa e fenólica dos grãos despeliculados foram ainda avaliados por análise multivariada para se definir quais atributos eram capazes de caracterizar os diferentes genótipos de amendoim. Para os grãos com a película foi realizada a caracterização química dos polifenóis por LC-ESI-LTQ-Orbitrap-MS, e a avaliação da atividade antioxidante pelo sequestro dos radicais livres DPPH e ABTS, além da análise multivariada dos resultados. De maneira geral, os genótipos tolerantes à seca foram os que apresentaram maior capacidade antioxidante. Os genótipos de amendoim avaliados apresentaram de 36 a 58% de ácidos graxos monoinsaturados em sua constituição, e relação oleico/linoleico mais elavada para os genótipos rasteiros. Foram também encontradas quantidades significativas de tocoferóis nos materiais analisados. O ácido p-cumárico, ácido cafeíco e a rutina foram identificados e quantificados por cromatografia líquida de alta resolução. Foram identificados, por meio da técnica de espectrometria de massas de alta resolução, 26 compostos fenólicos nos genótipos de amendoim despeliculados. Os grãos com película apresentaram perfil fenólico mais complexo, sendo identificados 58 compostos pertencentes a cinco classes distintas. Os isômeros do ácido coutárico foram os principais polifenóis, seguidos pela isorhamnetina-3-O-rutinosideo e os isômeros de ácido cumárico. De acordo com os resultados obtidos e a literatura, foram identificados 9 compostos nunca relatados em amendoim. As variáveis analisadas neste estudo mostraram ser possível o agrupamento dos genótipos de amendoim contrastantes quanto à adaptação aos ambientes com restrição hídrica. / Peanuts (Arachis hypogaea L.) are a widely appreciated grains throughout the world and it has been grown both in developed and developing countries. The plant is an oleaginous with high nutritional value and rich in bioactive compounds that has been cultivated in semi-arid zones - where drought prevails and it affects grain yield and composition. Thus, the aim of this work was in evaluating the chemical composition, antioxidant activity, phenolic compounds, tocopherols and fatty acids of contrasting peanut genotypes in relation to the adaptation to water limitation environments, as well as defining which attributes are able to characterize these genotypes. The adapted peanuts to water stress used here came from the breeding program of Embrapa Algodão (Campina Grande - PB). Grains with and without skin were analyzed, since their consumption can occur in both forms. In relation to the grains without the skin, the characterization of the oily fraction was made through the identification and quantification of the fatty acids and tocoferols, whereas the chemical evaluation of the phenolic fraction was performed by high-resolution mass spectrometry (LC-ESI-LTQ-Orbitrap-MS). The antioxidant activity was determined by reactive oxygen species deactivation (superoxide, hypochlorous acid and peroxyl) and on-line method (HPLC-ABTS). The results obtained through characterization of the oily and phenolic fraction of the grains without skin were further evaluated by multivariate analysis to determine which attributes were able to characterize the different peanut genotypes. In relation to the grains with skin, it was made the chemical characterization of the polyphenols by LC-ESI-LTQ-Orbitrap-MS and the evaluation of the antioxidant activity by the sequestration of the radicals DPPH and ABTS; besides, it was made the multivariate analysis of the results. In general, the samples tolerant to drought were the ones that presented greater antioxidant capacity than the others. The evaluated peanut genotypes presented 36 to 58% of monounsaturated fatty acids in relation to the total lipids in its constitution and showed oleic/linoleic ratio classified in normal and mid-oleic, which is a higher ratio for non-drought tolerant genotypes. Significant amounts of tocopherols were also found in the analyzed materials. p-coumaric acid, caffeic acid and rutin were identified and quantified by high-performance liquid chromatography. Twenty-six phenolic compounds were also identified in peanuts without skin using the high-resolution mass spectrometry technique. The peanuts with skin showed a more complex phenolic characteristc by being identified 58 compounds belonging to five different classes. The isomers of coutaric acid were the major polyphenols, followed by isorhamnetin-3-O-rutinoside and the isomers of coumaric acid. According to the results obtained and the literature, it is been identified 9 new compounds which were never found in peanuts. The variables analyzed in this study showed that it is possible to group contrasting genotypes peanuts as to drought tolerance.

β2-glicoproteína I (β2GPI) é encontrada (200µg/mL) no plasma, 60% livre e 40% em lipoproteínas. Esta proteína de fase aguda, com afinidade por superfícies negativas pode ser clivada pela plasmina. Fragmentos são purificados como dímeros ou multímeros de β2GPI. Formas monomérica e dimérica de β2GPI foram purificadas de soro humano e identificadas por SDS-PAGE, imunoblot e ELISA Somente a forma monomérica foi detectada no teste ELISA Os efeitos de ambas as formas sobre o burst respiratório de polimorfonucleares humanos (PMN), estimulados in vitro com zymosan opsonizado, foram estudados por quimioluminescência amplificada por luminol ou lucigenina e citometria de fluxo, pela oxidação do OCFH. A forma monomérica inibiu a quimioluminescência amplificada por luminol (-43.6 x -7.33 AEU/s), mas não por lucigenina, e aumentou a oxidação de DCFH e a produção de Óxido Nítrico (•NO). É provável que o •No, via peroxinitrito, medeie os efeitos de β2GPI sobre o burst respiratório de PMN. / Circulating blood contains approximately 200µg/mL of β 2-glycoprotein I (β2GPI), either free (60%) or lipoprotein bound (40%). This acute phase protein, with affinity for negative surfaces, can be cleaved by plasmin. Fragments purify as dimeric or multimeric (β2GPI. Both (β2GPI forms were purified from human sera and identified by SDS-PAGE, immunoblotting and ELISA. ELISA reactivity was dependent on the monomeric status of (β2GPI. The effects of dimeric and monomeric (β2GPI upon respiratory burst of human polimorphonuclear neutrophils (PMN) stimulated in vitro with opsonized zymosan were studied. Respiratory burst was evaluated by luminol- or lucigenin-amplified chemiluminescence, or by DCFH oxidation (flow-cytometry assay). The monomeric, but not the dimeric form, inhibited the luminol chemiluminescence of zymosan-stimulated PMNs (-43.6 x -7.33 AEU/s). Lucigenin chemiluminescence was insensitive to (β2-GPI. Monomeric (β2GPI increases both DCFH oxidation and nitric oxide production. Nitric oxide, probably through peroxynitrite reactions, mediates (β2GPI effects upon PMNs respiratory burst.

Electrophoretic microsystems (EM) are powerful tools for the separation of species of microsystems analyzes which can easily be combined with electrochemical detection (ECD) and therefore making it ideal for a method of detection. However, the influence of high voltage at the working electrode used for the separation is a problem to be overcome due to the increased signal/noise ratio and possible damage of the electrode and/or the potentiostat. Thus, it was proposed in this thesis one EM hybrid PDMS / glass configuration with dual-channel potentiostat coupled to an electrically isolated in order to minimize the influence of high potential in the separation channel and improve the separation efficiency of the species and subsequently, improve detection limits. The EM contains two separate parallel channels 200 microns and a channel separation and another reference, and each containing a platinum electrode 15 or 50 μm placed about 1 to 4 μm in the channel. An electrode served as the working electrode, positioned in the separation channel, and another electrode as reference electrode, placed in the reference channel. This configuration associated with the electrically isolated potentiostat allowed the amperometric signals were measured without any change or potential interference arising from the high voltage applied separation. Aiming to evaluate the effectiveness of the methodology proposed in this thesis, samples nitrite, tyrosine and peroxynitrite (reactive nitrogen species – RNS), hydrogen peroxide (reactive oxygen species – ROS), ascorbic acid, glutathione and cysteine were injected into the channel containing the working electrode, while simultaneously boric acid buffer pH 11 containing TTAB was injected into the reference channel containing the reference electrode. From this configuration, we obtained a significant reduction in noise level (about 0.94 pA) and a relative improvement in the resolution ratified by electropherograms, compared with using single channel configuration. The limits of detection (LOD) for the chemical species mentioned above were 0.58 μM, 0.14 μM, 0.75 μM, 0.21 μM, 0.82 μM, was not obtained for cysteine and 1.63 μM, respectively. The efficiency can also be seen by analyzing nitrite performed on samples of perfusate blood of sheeps and rats, where have been detected a concentration of 68.05 μM and 22.04 μM, respectively, by the proposed method. It was also proposed in this thesis, microfabrication and evaluation of a PMMA electrophoretic microsystem with single channel configuration coupled to a base made of the same material to fix the microchip with electrochemical detection using a carbon paste electrode. The purpose of the construction of the base was to obtain, by fixing, reproducibility of events. And the microfabrication of PMMA EM aimed the viability of its use in analysis perspective as having the lowest cost per unit made due to the use of CO2 laser for microfabrication, which has a value considerably lower, compared with photolithographic processes. The evaluation of this system was performed through the analysis standards of serotonin and acetaminophen, which proved that the microfabrication of this system showed good reproducibility and repeatability of events, making it viable processing. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os microssistemas eletroforéticos (MSE) são ferramentas poderosas para a separação de espécies em microssistemas de análises, onde pode ser facilmente combinada com detecção eletroquímica (DEQ) e tornando-se, portanto, um método de detecção ideal. No entanto, a influência da alta tensão no eletrodo de trabalho utilizada para a separação é um problema a ser contornado devido o aumento da relação sinal/ruído e possíveis danificações do eletrodo e/ou do potenciostato. Assim, foi proposto nesta tese um MSE híbrido de PDMS/vidro com configuração de duplo-canal acoplado a um potenciostato eletricamente isolado com objetivo de minimizar a influência do elevado potencial no canal de separação e melhorar a eficiência de separação das espécies e, subsequentemente, melhorar os limites de detecção. O MSE contém dois canais paralelos separados 200 μm, sendo um canal de separação e outro de referência, e cada um deles contendo um eletrodo de platina de 15 ou 50 μm colocados cerca de 1 a 4 μm dentro do canal. Um eletrodo serviu como eletrodo de trabalho, posicionado no canal de separação, e o outro eletrodo como eletrodo de referência, posicionado no canal de referência. Essa configuração associado ao potenciostato eletricamente isolado permitiu que os sinais amperométricos fossem medidos sem qualquer mudança de potencial ou de interferência oriunda da alta tensão de separação aplicada. Objetivando avaliar a eficiência da metodologia proposta nessa tese, amostras de nitrito e peroxinitrito (espécies reativas de nitrogênio – ERN), tirosina, peróxido de hidrogênio (espécie reativa de oxigênio – ERO), ácido ascórbico, glutationa e cisteína foram injetadas no canal contendo o eletrodo de trabalho, enquanto que simultaneamente o tampão de ácido bórico contendo TTAB pH 11 foi injetado no canal de referência contendo o eletrodo de referência. A partir desta configuração, obteve-se uma significativa diminuição no nível de ruído (cerca de 0,94 pA) e uma relativa melhora na resolução ratificadas pelos eletroferogramas, se comparado com a configuração que utiliza canal único. Os limites de detecção (LOD) para as espécies químicas supracitados foram de 0,58 μM, 0,14 μM, 0,75 μM, 0,21 μM, 0,82 μM, não foi obtida para a cisteína, e 1,63 μM, respectivamente. A eficiência também pode ser vista através das análises de nitrito realizadas em amostras de perfusato de sangue de ovelhas e ratos, onde foram detectados uma concentração de 68,05 μM e 22,04 μM, respectivamente, através da metodologia proposta. Foi proposto também nessa tese, a microfabricação e avaliação de um microssistema eletroforético de PMMA com configuração de canal único acoplado a uma base feita do mesmo material para fixar o microchip, com detecção eletroquímica usando eletrodo de pasta de carbono. O objetivo da construção da base foi obter, através da fixação, reprodutibilidade de eventos. E a microfabricação do MSE de PMMA objetivou a viabilidade do seu uso em análises tendo como perspectiva o baixo custo por unidade confeccionada devido ao uso de laser de CO2 para a microfabricação, o qual possui um valor agregado consideravelmente menor, se comparado com os processos fotolitográficos. A avaliação desse sistema foi feita através das análises de padrões de serotonina e acetaminofeno, onde comprovou-se que a microfabricação desse sistema apresentou boa reprodutibilidade e repetitividade de eventos, tornando-se viável o seu processamento.

β2-glicoproteína I (β2GPI) é encontrada (200µg/mL) no plasma, 60% livre e 40% em lipoproteínas. Esta proteína de fase aguda, com afinidade por superfícies negativas pode ser clivada pela plasmina. Fragmentos são purificados como dímeros ou multímeros de β2GPI. Formas monomérica e dimérica de β2GPI foram purificadas de soro humano e identificadas por SDS-PAGE, imunoblot e ELISA Somente a forma monomérica foi detectada no teste ELISA Os efeitos de ambas as formas sobre o burst respiratório de polimorfonucleares humanos (PMN), estimulados in vitro com zymosan opsonizado, foram estudados por quimioluminescência amplificada por luminol ou lucigenina e citometria de fluxo, pela oxidação do OCFH. A forma monomérica inibiu a quimioluminescência amplificada por luminol (-43.6 x -7.33 AEU/s), mas não por lucigenina, e aumentou a oxidação de DCFH e a produção de Óxido Nítrico (•NO). É provável que o •No, via peroxinitrito, medeie os efeitos de β2GPI sobre o burst respiratório de PMN. / Circulating blood contains approximately 200µg/mL of β 2-glycoprotein I (β2GPI), either free (60%) or lipoprotein bound (40%). This acute phase protein, with affinity for negative surfaces, can be cleaved by plasmin. Fragments purify as dimeric or multimeric (β2GPI. Both (β2GPI forms were purified from human sera and identified by SDS-PAGE, immunoblotting and ELISA. ELISA reactivity was dependent on the monomeric status of (β2GPI. The effects of dimeric and monomeric (β2GPI upon respiratory burst of human polimorphonuclear neutrophils (PMN) stimulated in vitro with opsonized zymosan were studied. Respiratory burst was evaluated by luminol- or lucigenin-amplified chemiluminescence, or by DCFH oxidation (flow-cytometry assay). The monomeric, but not the dimeric form, inhibited the luminol chemiluminescence of zymosan-stimulated PMNs (-43.6 x -7.33 AEU/s). Lucigenin chemiluminescence was insensitive to (β2-GPI. Monomeric (β2GPI increases both DCFH oxidation and nitric oxide production. Nitric oxide, probably through peroxynitrite reactions, mediates (β2GPI effects upon PMNs respiratory burst.

Sepse, a resposta do organismo a uma infecção, está associada a altas taxas de mortalidade. A razão pela qual um mecanismo protetor resulta num quadro clínico fatal permanece inexplicada. Em trabalho prévio nosso grupo demonstrou que exossomos de origem plaquetária são os mais freqüentes em plasma de pacientes com choque séptico e que estes podem induzir apoptose em células musculares lisas vasculares e células endoteliais em cultura. Demonstramos ainda que tais exossomos possuíam uma fonte enzimática de ROS, uma NADPH oxidase cuja atividade poderia estar associada à indução da apoptose (Janiszewski et al., 2004). No presente trabalho, nós buscamos criar um modelo de geração ex vivo de exossomos similares aos encontrados em pacientes sépticos e identificar possíveis vias responsáveis pela liberação destes e seus efeitos. Choque séptico é uma condição relacionada com exposição a lipopolissacarídeo (LPS) e geração de alta quantidade de trombina, TNF e espécies reativas de nitrogênio. Através de citometria de fluxo revelamos que plaquetas humanas expostas ao doador de NO dietilamina-NONOato e ao LPS geraram exossomos similares àqueles encontrados em pacientes com choque séptico, expondo alta quantidade de tetraspaninas CD9, CD63 e CD81 mas pouca fosfatidilserina. Por outro lado, plaquetas expostas à trombina ou TNF liberaram partículas com características claramente distintas, com alta exposição de fosfatidilserina e baixa de tetraspaninas. Assim como os exossomos sépticos, os exossomos obtidos pela exposição de NO e LPS geraram radical superóxido e NO, como demonstrado pela quimioluminescência da lucigenina (5M) e celenterazinina (5M) e pela fluorescência da 4,5-diaminofluoresceína (10mM) e 2,7-diclorofluoresceína (10mM). A análise por Western Blot nos permitiu identificar as subunidades Nox1, Nox2 e p22phox da NADPH oxidase e a isoforma induzível da enzima NO sintase (NOS) nesses exossomos. Como esperado, inibidores da NOS e da NADPH oxidase reduziram significamente os sinais fluorescentes e quimioluminescentes. Em adição, as células endoteliais em cultura expostas aos exossomos gerados por dietilamina-NONOato e LPS sofreram significativo aumento da taxa de apoptose quando comparadas àquelas expostas a exossomos controle. A inibição da NADPH oxidase assim como da NOS reduziu expressivamente tal efeito. Adição de urato (1mM), mostrou efeito aditivo sobre a inibição do sinal fluorescente, assim como redução adicional da taxa apoptótica, sugerindo papel importante do radical peroxinitrito. Nós propomos, assim, que exossomos derivados de plaquetas podem representar papel adicional no já complexo cenário da sinalização vascular redox. Nesse sentido, uma abordagem baseada em exossomos pode fornecer novas ferramentas para o entendimento e até tratamento da disfunção vascular na sepse / Sepsis, the bodys response to infection, is associated with high mortality rates. Why a protective mechanism turns into a deadly clinical picture is a matter of debate, and goes largely unexplained. In previous work we demonstrated that plateled derived exosomes are found in the plasma of septic patients with septic shock and can induce endothelial and vascular smooth muscle cell apoptosis in culture through an enzymatic superoxide source (Janiszewski et al., 2004). In this work we sought to create a model for ex vivo generation of exosomes, and to identify the pathways responsible for ROS release by exosomes and their effects. Septic shock is a condition related to exposure of lipopolysaccharide (LPS), generation of high amounts of thrombin, TNF and nitrogen reactive species. Through flow cytometry we demonstrated that human platelets exposed to the NO-donor diethylamine-NONOate, and to LPS, generated exosomes similar to those found in the blood of septic shock patients, with high exposure of the tetraspanin CD9, CD63, and CD81, but little phosphatidylserine. On the other hand, platelets exposed to thrombin or TNF released particles with clearly distinct characteristics, such as high phosphatidylserine and low tetraspanin. Like the septic exosomes, the exosomes obtained by NO and LPS exposure generated superoxide radical and NO, as disclosed by lucigenin and coelenterazine chemiluminescence and by 4,5-diaminofluorescein and 2,7-dichlorofluorescein fluorescence. Western Blot analysis revealed the presence of Nox1, Nox2 and p22phox NADPH oxidase subunits and the inducible isoform of NO synthase (NOS) in these exosomes. As expected, NOS inhibitors or NADPH oxidase inhibitors significantly reduced the fluorescence and chemiluminescente signals. In addition, endothelial cells exposed to NO or LPS generated exosomes underwent apoptotic death, while control exosomes had no effects on apoptosis. NADPH oxidase as well as NOS inhibition significantly reduced apoptosis rates. Concomitant generation of NO and superoxide suggests biological effects of the highly reactive radical peroxynitrite. In fact, the peroxynitrite scavenger urate (1 mM) showed an additive effect on fluorescent signal inhibition, as well as on endothelial apoptosis rate reduction. We thus propose that platelet-derived exosomes may be another class of actors in the complex play known as vascular redox signaling. In this sense, an exosome-based approach can provide novel tools for further understanding and even treating vascular dysfunction related to sepsis

O Brasil possui uma rica diversidade em espécies de plantas nativas cujo potencial bioativo, embora ainda pouco investigado, as coloca como alvos de pesquisa na área de produtos naturais. Dentre as espécies nativas estão o açaí-do-Pará (Euterpe oleraceae Mart.) e o inajá (Maximiliana maripa Aubl. Drude), frutos processados visando, principalmente, a obtenção de polpa e óleo. Contudo, a extração mecânica do óleo por prensagem gera grande quantidade de um material residual denominado \"torta\", geralmente descartado no meio ambiente como resíduo ou destinado à alimentação animal. Considerando-se a busca por ingredientes ativos naturais em substituição aos sintéticos para aplicação industrial, e a necessidade de exploração científica de resíduos agroindustriais, este trabalho teve como objetivo otimizar a extração de compostos antioxidantes de tortas de açaí e inajá, e avaliar a composição fenólica dos extratos otimizados pela técnica de espectrometria de massas de alta resolução (LC-ESI-QTOF-MS), bem como suas atividades biológicas antioxidante, citotóxica e anti-inflamatória (in vitro) e antimicrobiana. Para tanto, a melhor condição de extração dos compostos antioxidantes foi determinada empregando-se um planejamento experimental com delineamento do tipo DCCR juntamente com a metodologia de superfície de resposta. A atividade antioxidante (variável resposta) foi determinada pelos métodos de sequestro do radical ABTS, FRAP e redução do reagente Folin-Ciocalteau, sob diferentes temperaturas de extração e concentrações de etanol (variáveis exploratórias). Encontrada a condição de extração ideal (70°C e 50% de etanol, v/v) foi realizada a caracterização fenólica por espectrometria de massas de alta resolução, que possibilitou a identificação de 20 compostos bioativos no extrato de torta de açaí e de 6 no de inajá, dentre os quais estão apigeninas, catequinas e derivados do ácido caféico. As atividades biológicas avaliadas foram: antioxidante, determinada pelos métodos de sequestro dos radicais livres sintéticos ABTS e DPPH, FRAP, redução do reagente Folin-Ciocalteau, além da desativação de espécies reativas de oxigênio (radical peroxila, ânion superóxido e ácido hipocloroso); anti-inflamatória, pela inibição da ativação do fator de transcrição NF-κB; e antimicrobiana, pela determinação da CIM e CBM. Os resultados indicaram que ambos os extratos apresentaram elevada atividade antioxidante, todavia, o extrato de torta de açaí destacou-se em comparação ao da torta de inajá. O extrato da torta de açaí não promoveu redução da viabilidade celular para a cultura de macrófagos RAW 264.7 nas concentrações de 1, 10 e 100 μg/mL, enquanto que no extrato de torta de inajá não foi verificada redução da viabilidade nas concentrações de 1, 10, 100 e 1000 μg/mL (p>0,05). Os extratos ainda apresentaram atividade anti-inflamatória, sendo os extratos das tortas de inajá e de açaí capazes de inibir a ativação de NF- κB em 40 e 100%, repectivamente. O extrato de torta de inajá não apresentou atividade antimicrobiana, ao passo que o de torta de açaí inibiu o crescimento de bactérias patogênicas em concentrações de 1250 e 2500 μg/mL. Este trabalho mostra o potencial bioativo desses resíduos, corroborando com potenciais aplicações tecnológicas de seus extratos em escala industrial. / Brazil has a rich diversity of native plant species which bioactive potential, although still unexploited, places them as research targets in the natural products area. Among these native species are açaí-do-Pará (Euterpe oleraceae Mart.) and inajá (Maximiliana maripa Aubl. Drude), fruits processed mainly aiming the extraction of pulp and oil. However, the oil mechanical extraction by pressing results in great amounts of a residual material termed \"cake\", generally discarded in the environment or destined to animal feeding. Considering the search for natural active ingredients to substitute the synthetic ones for industrial application, and the need of scientific investigation of agroidustrial residues, this paper aimed to optimaze the extraction of antioxidant compounds from açaí and inajá cakes, and to evaluate the phenolic composition of the extracts by high resolution mass spectrometry (LC-ESI-QTOF-MS), as well as their antioxidant, cytotoxic and anti-inflammatory (in vitro), and antimicrobial, activities. For this purpose, the best condition for extraction of the antioxidante compounds was determined by using an experimental design with a RCCD design together the response surface methodology. The antioxidant activity (dependent variable) was determined by the methods ABTS radical scavenging, FRAP assay and Folin-Ciocalteau reagent reduction, under different temperatures (°C) of extraction and ethanol concentrations (%, v/v) (independent variables). Established the best extraction condition (70°C and etanol 50%, v/v), the phenolic profile of the cakes extracts was characterized by LC-ESI-QTOF-MS, which made possible the identification of 20 bioactive compounds in açaí cake extract and 6 in inajá cake extract, among which are apigenins, catechins and caffeic acid derivatives. The following biological activities were analyzed: antioxidant, by ABTS and DPPH synthetic radicals scavenging assay, FRAP, Folin-Ciocalteau reagent reduction, and oxygen reactive species deactivation (peroxil, superoxide and hipochlorous acid radicals); anti-inflammatory, by the inhibition of the transcription factor NF-κB activation; and antimicrobial, by determining MIC and MBC. The results indicated that both extracts show high antioxidante activity, however, the açaí cake extract stood out compared to inajá cake extract. The açaí cake extract didn\'t decrease cell viability for RAW 264.7 macrophages culture in the concentrations 1, 10 and 100 μg/mL, while the inajá cake extract didn\'t decrease the cell viability in the concentrations 1, 10, 100 and 1000 μg/mL (p>0,05). The extracts still exhibited anti-inflammatory activity, being the inajá and açaí cakes extracts capable to inhibit NF-κB activation in 40% and 100%, respectively. The inajá cake extract didn\'t show antimicrobial activity, while açaí cake extract inhibited the growing of pathogenic bacteria in concentrations of 1250 and 2500 μg/mL. This work confirms the bioactive potential of the residues, supporting possible technological applications of the extracts on an industrial scale.

Introdução: Wistar Audiogenic Rats (WAR) é modelo experimental desenvolvido na Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, para estudo da epilepsia, entretanto, a seleção genética em resposta aos comportamentos de crises audiogênicas também trouxe à tona alterações no metabolismo energético nesses animais. Dois estudos são relevantes deste ponto de vista, no primeiro Botion e Doretto observaram que WAR após serem estimulados apresentam: (a) valores de glicemia maior em relação ao Wistar; (b) aumento no lactato circulante - o que pode indicar deficiência na fosforilação oxidativa (OXPHOS); (c) aumento da atividade adrenérgica, induzindo dessensibilização da via lipolítica ?-adrenérgica no tecido adiposo epididimal. Pereira e colaboradores investigando o metabolismo de carboidratos relataram: (a) aumento na via glicólica; (b) translocação de GLUT4 aumentada no músculo gastrocnêmico e (c) redução nos níveis de glicogênio muscular. Objetivo: Diante desses achados o presente estudo tem como objetivo elucidar o metabolismo energético mitocondrial e sua relação com as crises epiléticas induzidas por estímulos sonoros. Resultados: Através de analises comportamentais e calorimetria indireta, relatamos que WAR possui perfil ansiogênico e tem preferência em oxidar aminoácidos; utilizando biopsias de tecido hepático, musculo esquelético e cardíaco, observamos maior densidade mitocondrial, acompanhada de maior geração de H2O2 e como consequência maior estresse oxidativo; na busca para elucidar com maior destreza, realizamos isolamento da fração mitocondrial do tecido hepático, e concluímos que não há maior geração de H2O2 por mitocôndria, porém há um enriquecimento proteico (algumas proteínas funcionais - como as envolvidas na OXPHOS- e outras não-funcionais - como as UCPs), além de relatarmos maiores níveis de proteínas envolvidas na dinâmica mitocondrial, desse modo podemos concluir que WAR possuem maior densidade mitocondrial e mitocôndrias com maior eficiência; o mesmo perfil mitocondrial foi observado no tecido cerebral. Após tratamento com DNP e NAC, observamos redução do estresse oxidativo no tecido cerebral, porém apenas NAC reduziu a severidade da crise, assim concluímos que o suave desacoplamento induzido por DNP não é capaz de reduzir de forma significativa a severidade da crise, porém a inibição da glicólise pelo NAC, alterou a bioenergética cerebral é capaz a reduzir a severidade da crise, deixando evidenciado que o metabolismo energético tem papel essencial/relevante na crise epilética induzida por estímulos sonoros em WAR, enquanto o estresse oxidativo tem papel secundário. / Introduction: Wistar Audiogenic Rats (WAR) is an experimental model developed in the Ribeirão Preto Medical School, for the study of epilepsy, however, the genetic selection in response to the behaviors of audiogenic crisis also brought up changes in energy metabolism in these animals. Two studies are relevant from this point of view, in the first Botion and Doretto observed that WAR after being stimulated present: (a) higher blood glucose values in relation to the Wistar; (b) Increase in circulating lactatewhich may indicate deficiency in oxidative phosphorylation (OXPHOS); (c) Increased adrenergic activity. Pereira and collaborators investigating the metabolism of carbohydrates reported: (a) increase in glycolysis; (b) Translocation of GLUT4 increased in gastrocnemius muscle and (c) reduction in muscle glycogen levels. Objective: In the face of these findings, the present study aims to elucidate the mitochondrial energy metabolism and its relation to the epileptic crises induced by sound stimuli. Results: Through behavioral analysis and indirect calorimetry, we report that WAR has reduced exploratory activity and has preference to oxidize amino acids; Using biopsies of liver tissue, skeletal and cardiac muscles, we observe greater mitochondrial density, accompanied by greater generation of H2O2 and as a result of greater oxidative stress; in the search to elucidate with greater dexterity, we perform isolation of the mitochondrial fraction of the hepatic tissue, and we conclude that there is no greater generation of H2O2 by mitochondria, but there is a protein enrichment (some functional proteins - such as those involved in OXPHOS - and other nonfunctional ones - such as UCPs), in addition to reporting higher levels of proteins involved in mitochondrial dynamics, so we can conclude that WAR has greater mitochondrial density and mitochondria more efficiently; the same mitochondrial profile was observed in the brain tissue. After treatment with DNP and NAC, we observed reduction of oxidative stress in the brain tissue, but only NAC reduced the severity of the crisis, so we conclude that the smooth decoupling induced by DNP is not able to significantly reduce the severity of the crisis, however the inhibition of glycolysis by the NAC, altered the brain bioenergetics is able to reduce the severity of the crisis, leaving evidence that the energy metabolism has essential/relevant role in the epileptic crisis induced by sound stimuli in WAR, while oxidative stress has secondary role.

É grande a preocupação quanto à presença de poluentes persistentes (POP) no ambiente aquático, devido ao potencial destes micropoluentes em afetar organismos aquáticos e a saúde humana. Dentre os POP estão os herbicidas atrazina (ATZ) e amicarbazona (AMZ), empregados no controle de ervas daninhas no cultivo de cana-de-açúcar, responsável por grande parte do consumo de herbicidas no país. O conhecimento do destino desses compostos no meio ambiente é essencial para avaliar seus potenciais impactos, embora não haja na literatura estudos detalhados relacionados a esse tema. No presente trabalho, através da combinação de resultados de experimentos realizados em simulador solar empregando matéria orgânica natural isolada, dados da literatura e simulações matemáticas, foi investigado o destino ambiental fotoquímico da AMZ, considerando as características de corpos d\'águas brasileiros. Analogamente e para fins de comparação, simulou-se o destino ambiental fotoquímico da ATZ com base em informações da literatura. Os resultados das simulações indicaram que a matéria orgânica dissolvida e a profundidade da coluna d\'água são as variáveis que mais influenciam na persistência dos dois herbicidas. O tempo de meiavida pode chegar a aproximadamente 2 meses e 1 ano, para AMZ e ATZ, respectivamente. Assim como é importante o entendimento do destino ambiental dos POP, também é essencial a investigação de processos avançados de oxidação desses poluentes, muitos dos quais são fotoirradiados. Procurando contribuir nesse sentido, neste trabalho estudou-se a fotólise da ATZ sob radiação UV em 254 nm, considerando os efeitos da taxa específica de emissão de fótons e da concentração inicial do herbicida. Procurou-se investigar detalhadamente o papel de espécies reativas de oxigênio (ROS) neste processo, resultados até então não discutidos na literatura. Além disso, os resultados obtidos para ATZ foram comparados aos disponíveis na literatura para AMZ. A degradação dos dois herbicidas diminui com o aumento da concentração inicial dos herbicidas, seguindo decaimento de pseudo primeira-ordem e aumentando com a taxa de emissão de fótons. Os resultados sugerem a formação de produtos persistentes e as ROS foram apontadas como atores importantes durante a degradação fotolítica dos herbicidas. / The presence of Persistent Organic Pollutants (POP) in aquatic environment is a subject of great concern, especially due to their capacity to affect not only aquatic organisms but also the human health. Herbicides as atrazine (ATZ) and amicarbazone (AMZ) are also classified as POP and are widely applied to control weeds on sugarcane cultivations, which are responsible for the increased consumption of herbicides in Brazil. The knowledge regarding the fate of these compounds once released into the environment represents an important issue and is also a type of information usually lacking in the available literature. Through the use of results obtained in experiments performed with a solar simulator, literature data, and mathematical simulations, the photochemical destination of AMZ in the environment was studied considering the characteristics of Brazilian surface water bodies. For purposes of comparison, the environmental destination of ATZ was also simulated. The results indicate that the dissolved organic matter and the depth of the water column are the most influential variables in the environmental persistence of these pesticides. Their half-life may extend up to 2 months to a year, for AMZ and ATZ, respectively. Besides the environmental fate, this investigation also aims to shine a light on the degradation of these contaminants in irradiated advanced oxidation processes. Accordingly, ATZ photolysis through the use of UV radiation (254 nm) was studied, whilst taking into consideration both the herbicide initial concentration and the specific photon emission rate. Another important contribution of this study is the investigation of the role of reactive oxygen species (ROS) in photolytic processes, a subject not usually discussed in the literature. In addition, a crossed-reference analysis between the results obtained for ATZ and those available in the literature for AMZ is presented. The degradation of both herbicides diminishes with the increase in their initial concentration and follows a pseudo first-order decay, increasing with the photon emission rate. Moreover, the results indicate that the formation of persistent degradation products does occur and that ROS play a crucial role in photolytic herbicide degradation.

Moléculas de L-cisteína (CSH) e L-glutationa (GSH) foram ancoradas na superfície de eletrodos de ouro, previamente modificados com uma camada autoarranjada de ácido 3-mercaptopropiônico (MPA). Esta arquitetura molecular foi importante para preservar a atividade redox dos grupos tiólicos da CSH e GSH na interface eletrodo/solução. A identificação do par redox R-S-S-R/R-SH, bem como a determinação do pKa dos grupos -SH superficiais, foram efetuadas usando voltametria cíclica em soluções de eletrólito em diferentes pH contedo ferricianeto de potássio. A presença dos grupos -SH e -S-S- na superfície dos eletrodos modificados foi ainda confirmada por Espectroscopia Raman de Superfície. Determinaram-se as constantes de velocidade de transferência de carga do processo quase reversível R-S-S-R / R-SH. Estes eletrodos modificados apresentaram resposta eletrocatalítica para a redução de espécies reativas de oxigênio (ROS), como peróxido de hidrogênio e para a oxidação de compostos com atividade antioxidante como a quercetina. Demonstrou-se que a presença de íons Cu2+ na superfície destes eletrodos é capaz de deslocar o equilíbrio do par R-SS-R/R-SH, no sentido oxidativo. Métodos de quantificação para estes compostos foram desenvolvidos por amperometria hidrodinâmica e voltametria cíclica. / L-cysteine molecules (CSH) and L-glutathione (GSH) were anchored on the surface of gold electrodes, previously modified with a self assembled monolayer of 3-mercaptopropionic acid (MPA). This molecular architecture was important to preserve the redox properties of the thiol groups of CSH and GSH in the interface electrode / solution. The identification of the redox couple RSSR / R-SH and the determination of the pKa of -SH groups surface were made using cyclic voltammetry in electrolyte solutions at different pH contents potassium ferricyanide. The presence of the -SH and -SS- modified electrode surface was further confirmed by Raman spectroscopy of surface. It was determined the rate constants of direct electron transfer of quasi-reversible coupled R-SS-R/R-SH. The modified electrodes showed electrocatalytic response to the reduction of reactive oxygen species (ROS) such as hydrogen peroxide and the oxidation of compounds with antioxidant activity such as quercetin. It was demonstrated that presence of Cu2+ ions on the electrode surface can shift the equilibrium of the RSSR/R-SH redox coupled into oxidative direction. Hydrogen peroxide and Quercetin were detected at these modified electrodes using amperometry and hydrodynamic cyclic voltammetry.