Neste trabalho, alguns novos complexos imínicos de cobre(II) com ligantes inspirados em biomoléculas como oxindóis, contendo grupos indólicos, imidazólicos ou pirrólicos com diferentes características estruturais, foram sintetizados e caracterizados por análise elementar, espectrometria ESI-MS e espectroscopias IV, UVNis e EPR. As possíveis interações desses complexos de cobre com a albumina humana (HSA) e com o plasma sanguíneo foram estudadas através das técnicas EPR, CD e SDS-PAGE, indicando que estas ocorrem principalmente no sítio N-terminal da proteína. Suas reatividades frente a compostos biológicos relevantes, tais como glutationa, ascorbato e peróxido de hidrogênio, também foram verificadas. Alguns dos complexos estudados podem ser ativados por glutationa, ascorbato ou peróxido de hidrogênio, sendo capazes de gerar espécies reativas de oxigênio em concentrações significativas, na presença desses redutores ou oxidantes biológicos. Adicionalmente, as propriedades pró-oxidantes de tais complexos foram investigadas, visando elucidar estudos prévios de suas atividades pró-apoptótica e antitumoral. Alguns destes complexos foram mais eficientes em causar danos oxidativos à 2-deoxi-D-ribose, enquanto outros foram mais eficientes em causar oxidantes na proteína HSA, com formação de grupos carbonílicos, principalmente em presença de H202. Experimentos de CD complementaram estes resultados, indicando que somente alguns complexos causaram modificações na α-hélice da proteína. Experimentos de EPR com captador de spin, na presença de HSA e H202, mostraram a formação de quantidades apreciáveis de radicais hidroxil e radicais de carbono, em presença de peróxido de hidrogênio. Além disso, os complexos apresentaram notável habilidade de ligação ao DNA e conseqüente atividade nuclease, promovendo clivagens nas duas fitas. Experimentos de fluorescência, EPR, gel de eletroforese marcado com α-32P-UTP e CD foram ainda realizados, visando elucidar o mecanismo de ação destes complexos no meio biológico. Estes experimentos indicaram que eles podem se associar ao DNA, através de suas bases ou pela interação com a deoxi-ribose, já que promoveram danos oxidativos nestes substratos. Entretanto, não catalisam a hidrólise dos grupos fosfato, atuando, portanto, predominantemente por um mecanismo oxidativo. Através de CD, poucas perturbações na elipsicidade do DNA foram observadas, o que indica que estes complexos provavelmente estão localizadas nas cavidades ou alças do ácido nucléico. / Some novel imine-copper(II) complexes with ligands inspired in biomolecules such as oxindoles, containing indole, pirrole or imidazole moieties with different structural features were synthesized, and characterized by elemental analysis, IV, UV/Vis and EPR spectroscopies, and ESI-MS spectrommetry. Interactions of these complexes with human serum albumin (HSA) and human plasma were verified by EPR, CD and SDS-PAGE techniques, showing that they occur mainly at the N-terminal site of the protein. Their reactivity towards biological relevant compounds, such as glutathione, ascorbate and hydrogen peroxide were also verified; some of them are capable of generating ROS in significant concentrations, in the presence of these reducing or oxidant agents. Additionally, the activity of such copper(II) complexes in promoting oxidative damage to different substrates was investigated, in order to elucidate previous studies on their pro-apoptotic and antitumoral activity. Some of these complexes were much more efficient to cause oxidative damage to 2-deoxy-D-ribose, especially in the presence of hydrogen peroxide. On the contrary, others were more active in causing damage to HSA protein, with the formation of carbonyl groups. Experiments by CD corroborated these results, since only some of the complexes caused modifications in the protein -helix. EPR spin trapping experiments, in the presence of HSA and H2O2, showed significant generation of hydroxyl as well as carbon centered radicals. Moreover, all the complexes showed remarkable ability to bind to DNA, promoting double-strand cleavage, upon H2O2 activation. In order to investigate their mechanism of action, fluorescence, EPR, gel-electrophoresis with labeled α-32P-UTP and CD experiments were carried out. The results indicated that these complexes can bind to DNA through its bases or can interact with the deoxi-ribose rings, promoting oxidative damage to those substrates. On the contrary, they do not catalyze the hydrolysis of phosphate groups. By CD spectroscopy, little perturbations on the helicity conformation of the DNA were observed, indicating that these complexes are probably located in the grooves.

A redução univalente de oxigênio molecular nas células produz intermediários altamente reativos tais como o íon radical Superóxido (O-•2), o radical hidroxil (HO•) e o peróxido de hidrogênio (H2O2). Níveis muito altos ou baixos de tais espécies representam séria ameaça ao metabolismo celular. Diferentes estados patológicos têm sido relacionados com níveis anormais destas espécies em eritrócitos e plaquetas. A proteção biológica contra efeitos tóxicos associados com níveis excessivos de espécies ativadas de oxigênio, tem sido atribuída a três enzimas principais presentes em eritrócitos e outras células: superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase. Neste trabalho, foram feitas dosagens dessas enzimas protetoras em eritrócitos de indivíduos portadores de porfiria aguda intermitente. Esta doença caracteriza-se por um defeito na biossíntese de heme e clinicamente manifesta-se por dor abdominal intensa, paralisia e distúrbios neuropsíquicos. Foram encontrados nos pacientes em crise aguda atividades elevadas de superóxido dismutase e de glutationa peroxidase enquanto que a atividade de catalase permaneceu normal. Tais resultados apontam a possibilidade de que as manifestações clínicas de IAP relacionadas com toxicidade por oxigênio. Estejam Comparou-se também a atividade destas três enzimas em eritrócitos de residentes na cidade de são Paulo com o de moradores de Vila Parisi, conhecida pelo seu altíssimo nível de poluiçao atmosférica. Os níveis de superóxido dismutase e de glutationa peroxidase são bem mais elevados (cerca de 1,5 vezes) nos indivíduos residentes em Vila Parisi. A elevação da concentração intracelular destas enzimas pode ser sua resposta ao aumento da taxa de oxidação da oxihemoglobina, a qual é conhecida fonte de íons superóxido. Estes dados demonstram profundas diferenças no metabolismo de 02 entre esses dois grupos e talvez uma possível adaptação metabólica dos moradores de Vila Parisi aos altos níveis de poluição a que estão expostos. / The univalent reduction of molecular oxygen in cells produces very reactive species such as the superoxide anion (O-•2), the hydroxyl radical (HO•) and hydrogen peroxide (H2O2). Abnormally high or low concentrations of such species may represent a serious threat to the cellular metabolism. Indeed, several disorders have been associated with abnormal levels of these species in erythrocytes and platelets.The biological protection against toxic effects due to excessive levels of activated species of molecular oxygen has been attributed mainly to three enzymes occurring in erythrocytes and other cells: superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px) and catalase. In the present work, we report the activities of SOD, GSH-Px and catalase in the erythrocytes of patients with intermittent acute porphyria (IAP), an inborn error in the heme biosynthetic pathway. The clinical manifestations of IAP include abdominal pain and neuropsychiatric symptons. In patients undergoing acute attack, we found increased levels of SOD and GSH-Px, while that of catalase remains unchanged. These results point to the possibility that the clinical manifestations of IAP are related to oxygen toxicity. We have also compared the activities of these enzymes in residents of the city of são Paulo (Brazil) and in subjects living in Vila Parisi (Cubatão, SP, Brazil), a village submitted to high levels of atmospheric pollution. The erythrocyte SOD and GSH-Px levels were found to be ca. 1.5 fold higher in residents of Vila Parisi. These high intracellular enzyme concentrations may reflect a biological defense against an increase in the rate of oxyhemoglobin oxidation, known to be a source of superoxide species. Our results point to important differences between the two populations with respect to the metabolism of oxygen and, perhaps, a metabolic adaptation in the residents of Vila Parisi to the dramatically high levels of atmospheric pollution.

A diabetes é um distúrbio endócrino do metabolismo dos carboidratos, clinicamente caracterizada por hiperglicemia, resultante da incapacidade do organismo em secretar insulina, defeitos na sua ação ou ambos. Na última década, houve um crescente aumento no número de trabalhos sobre a múltipla hereditariedade de um tipo de diabetes rara e não imunológica diagnosticada antes dos 6 meses de vida, a diabetes neonatal (DN). A maioria dos estudos, existentes na literatura referentes à DN, foi realizada em pacientes e aborda principalmente aspectos clínicos, etiológicos e terapêuticos. No entanto, existe uma deficiência de estudos realizados em modelos animais, a fim de avaliar danos moleculares em tecidos submetidos à hiperglicemia neonatal. Recentemente, as consequências da diabetes no sistema nervoso central (SNC) têm recebido maior atenção, uma vez que os recentes estudos mostram que a hiperglicemia é capaz de promover a ruptura da homeostase redox no cérebro de ratos. Neste sentido, o estresse oxidativo (EO) parece representar um dos mecanismos pelos quais a hiperglicemia danifica o tecido cerebral em um período crucial de desenvolvimento. Diante disso, o presente trabalho objetivou estudar não só a relação do EO com a hiperglicemia neonatal em cérebro de ratos, mas também avaliar se os danos oxidativos promovidos pelas espécies reativas de oxigênio (ERO) na condição hiperglicêmica podem estar envolvidos no processo de morte celular neuronal. Para isso, foram utilizados ratos Wistar de 5 dias de vida, divididos em dois grupos: controle e diabético. O modelo de diabetes foi induzido pela administração intraperitoneal de estreptozotocina (STZ) em uma única dose de 100 mg/Kg peso corporal, sendo que foram considerados diabéticos os ratos com glicemia >200mg/dL. Os animais foram sacrificados com 10 dias de vida, ou seja, 5 dias após a administração de STZ. O cérebro total dos animais foi homogeneizado, centrifugado e o homogeneizado utilizado para as medidas de parâmetros de EO e expressão proteica. Além disso, o cérebro total foi utilizado em cortes histológicos para análise do parâmetro de morte celular neuronal, avaliada pela técnica FluoroJade C. Os parâmetros de EO analisados foram o metabolismo da glutationa, que engloba a atividade das enzimas glutationa S-transferase (GST), glutationa redutase (GR), glutamato-cisteína ligase (GCL) e a 8 determinação da concentração de glutationa total e reduzida (GSH/GSSG). A medida do peróxido de hidrogênio (H2O2) também foi avaliada, juntamente com a quantificação proteica por “Western Blot” do fator nuclear eritroide relacionado ao fator 2 (Nrf2), da superóxido dismutase (SOD), da catalase (CAT), da glutationa peroxidase (GPx), da heme oxigenase 1 (HO-1) e da tiorredoxina (TRX). Os parâmetros relativos à sobrevivência e morte celular avaliados foram a quantificação proteica por “Western Blot” da proteína cinase B (AKT), da proteína cinase B fosforilada (p-AKT), da glicogênio sintase cinase 3 β (GSK3β), da p38 proteína cinase ativada por mitógenos (p38), proteína cinase c-Jun N-terminal (JNK), da célula-B de linfoma 2 (Bcl2) e da proteína X associada a Bcl2 (Bax). Os ratos submetidos ao modelo de hiperglicemia neonatal não apresentaram diferenças significativas nos parâmetros relacionados ao metabolismo da glutationa (GST, GR, GCL e GSH/GSSG), tampouco nas concentrações de H2O2 quando comparados ao grupo controle. A expressão proteica do Nrf2 foi diminuída no grupo diabético, enquanto que a expressão da CAT, HO-1 e TRX se apresentaram aumentadas no grupo diabético quando comparado ao grupo controle. Não foram encontradas diferenças significativas nas expressões proteicas da SOD e GPx. As expressões proteicas das proteínas p38 e Bcl2 foram aumentadas, enquanto a expressão da p-AKT se mostrou reduzida no grupo diabético. Já com relação à expressão das proteínas JNK, GSK3β e Bax não houve diferença significativa nos grupos analisados. Finalmente, com relação à técnica que avaliou morte celular neuronal, o grupo diabético apresentou três vezes mais marcações de neurônios fluorescentes, ou seja, com morte celular quando comparado com o grupo controle. Portanto, esses resultados sugerem que o EO pode representar um mecanismo envolvido nos efeitos da hiperglicemia no SNC de ratos neonatos. Além disso, as alterações na expressão de proteínas envolvidas em vias de sobrevivência/morte celular colaboram para o resultado de morte celular verificado no cérebro de animais com hiperglicemia neonatal e mostram os efeitos nocivos da DN em um período crucial de desenvolvimento cerebral. / Diabetes is an endocrine disorder of the carbohydrates metabolism clinically characterized by hyperglycemia, resulting from the inability of the body to secrete insulin, defeats in its action and both. In the last decade, there has been an increasing number of studies about neonatal diabetes (DN), a type of diabetes non-immunological diagnosed before 6 months of life. The most studies related to DN was developed in patients and mainly deal with clinical, etiological and therapeutic aspects. However, there is a few of studies in animal models in order to assess molecular damage in tissues submitted to neonatal hyperglycemia. Recently, the consequences of diabetes in the central nervous system (CNS) have received increased attention, as recent studies show that hyperglycemia is capable of promoting the rupture of redox homeostasis in the rat brain. Wherefore, the present work aimed to study not only the relationship between EO and neonatal hyperglycemia in rat brain, but also evaluate if the oxidative damage promoted by reactive oxygen species (ROS) in the hyperglycemic condition may be involved in the neuronal cell death process. For this, 5-day-old Wistar rats were used to promote the induction of diabetes, which was done with a single intraperitoneal streptozotocin (STZ) administration (100 mg/kg body weight). Rats with glycemia> 200 mg/dL were considered diabetic. The rats were sacrificed in 10 days of life, wherefore five days after STZ adiminstration. The whole brain of the rats was homogenized, centrifuged and homogenized used for EO techniques and protein expression measurements. In addition, total brain was used in histological sections for analysis of the neuronal cell death. The EO parameters evaluated were the activity of the glutathione S-transferase (GST), glutathione reductase (GR), glutamate-cystein ligase (GCL) and the determination of total and reduced glutathione concentration (GSH/GSSG). Hydrogen peroxide (H2O2) was evaluated along with Western Blot protein quantification of catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), heme oxygenase (HO-1) and thioredoxin (TRX). Relative to cell survival and death were evaluated protein kinase B (Akt), phosphorylated protein kinase B (p-Akt), glycogen synthase kinase 3β (GSK3β), p38 mitogen-activated protein kinase (p38), c-Jun amino-terminal kinases (JNK), phosphorylated c-Jun amino-terminal kinases (p-JNK), B-cell 10 lymphoma 2 (Bcl2) and Bcl2-associated protein X (Bax) by western blot. The neonatal hyperglycemia was not able to promote significant differences in the glutathione metabolism (GST, GR, GCL and GSH / GSSG) nor in the H2O2 measurement when compared to the control group. Nrf2 protein expression was decreased whereas CAT, HO-1 and TRX protein expression were increased in the diabetic group when compared to the control group. No significant differences were found in the protein expression of SOD and GPx. Also, p38 and Bcl2 protein expression was increased, whereas p-Akt was decreased in the diabetic group, already regarding the expression of JNK, p-JNK, Jsk3β and Bax proteins there were no significant difference in the analyzed groups. Finally, relative to neuronal cell death technique, the diabetic group presented three fold more neuronal cell death with fluorescent marking characteristic, when compared to the control group. Therefore, these results suggest that OE may represent a mechanism involved in the effects of hyperglycemia in the central nervous system of neonatal rats. In addition, changes in the expression of proteins involved in survival/death cell pathways contribute to the outcome of cell death, result found in the brain of animals with neonatal hyperglycemia and finally show the harmful effects of neonatal diabetes in a crucial period of brain development.

A acidez do solo é um dos principais fatores limitantes à produção vegetal. A toxicidade por alumínio, que ocorre apenas a pH baixo, tem sido extensamente investigada, enquanto o estresse causado pelo pH baixo tem recebido pouca atenção. Os estudos nesta área quase sempre presumem efeitos aditivos, e portanto independentes, da toxicidade por Al3+ e H+. Este provavelmente não é o caso, sendo que o pH baixo pode ser um fator de predisposição das células ao Al3+. As evidências indicam que o pH baixo causa desarranjos na parede de células em crescimento, gerando estresse que pode comprometer a sua funcionalidade e integridade. É provável que a susceptibilidade a este estresse deve ser dependente da pressão de turgor. Por sua vez, o metabolismo oxidativo e a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) na parede celular podem modular a sua extensibilidade por romper ou criar ligações dentro ou entre cadeias de polissacarídeo. Há grande interesse em se conhecer se, à semelhança do que ocorre em leveduras, as células vegetais possuem um sistema de percepção e resposta a estresse da parede. Os pêlos radiculares em crescimento são sensíveis a pH baixo e estresse hipo-osmótico e constituem um bom modelo experimental para estes estudos. Os objetivos deste trabalho foram: a) Otimizar um sistema experimental para o estudo de pêlos radiculares de tomateiro (Solanum lycopersicum L. cv Micro-Tom); b) Avaliar as respostas dos pêlos radiculares ao estresse por pH baixo e hipo-osmolaridade; c) Examinar o papel da modulação oxidativa da parede celular nestas respostas; e d) Avaliar a resposta de diferentes mutantes hormonais de Micro-Tom a estes fatores de estresse. Os principais parâmetros avaliados foram a taxa de alongamento (µm.min-1) e a freqüência de rompimento dos pêlos. Tanto o estresse por pH baixo quanto choques hipo-osmóticos resultaram em taxas de alongamento significativamente diminuídos e o rompimento de pêlos radiculares, mas os efeitos dos tratamentos hipo-osmóticos foram mais marcantes. Uma curva de resposta frente à osmolaridade da solução externa revelou que a taxa de alongamento aumentou com a diminuição da osmolaridade até alcançar um limiar em que houve redução drástica da taxa de alongamento e começou-se a observar o rompimento de pêlos. Também se observou uma interação entre hipo-osmolaridade e pH baixo. O emprego do inibidor difenileno iodônio não forneceu evidências do envolvimento de NADPH oxidases da membrana plasmática na resposta de pêlos radiculares a choque hipo-osmótico ou pH baixo. Já no caso do inibidor ácido salicilhidroxâmico, encontrou-se evidências do envolvimento de peroxidases da parede. Nos mutantes hormonais dgt (pouco sensível a auxina) e epi (super produtor de etileno), mas não em not (deficiente em ácido abscísico), os pêlos radiculares apresentaram uma melhor resposta de ajustamento a choque hipo-osmótico do que Micro-Tom, reduzindo o alongamento e o rompimento dos pêlos. Este trabalho fornece fortes evidências de que os pêlos radiculares possuem um mecanismo de percepção e resposta a estresse da parede visando à manutenção de sua integridade e que apresentam bom potencial como sistema modelo nesta linha de pesquisa / Soil acidity is a major factor limiting plant growth worldwide. Aluminum toxicity, which occurs only at low pH, has been extensively studied, whereas low pH stress has received much less attention. Studies on Al3+ and H+ toxicity make the underlying assumption that the effects of these stress factors are additive, and, therefore independent of each other. However, this is most likely not the case and low pH may be a factor which increases susceptibility to further injury by Al3+. There is evidence that low pH causes disruption in cell wall structure of growing cells, which might jeopardize cell wall functionality and integrity. It is likely that turgor pressure plays an important role in cell wall stress caused by low pH. The apoplastic metabolism of reactive oxygen species (ROS) can modulate cell wall extensibility by making or breaking bonds within and between cell wall polysaccharides. A major question is whether, similarly to yeast, plant cells have a cell wall integrity signaling and response system. Growing root hairs are sensitive to low pH and hypo-osmotic stress and are potentially good experimental systems for such investigations. The objectives of this study were: a) Optimize an experimental system to examine tomato (Solanum lycopersicum L. cv Micro-Tom) root hairs; b) Examine the response of root hairs to low pH and hypo-osmotic stress; c) Examine the role of oxidative modulation of the cell wall in these responses; and d) Evaluate the response of different hormonal mutants of Micro-Tom to these stress factors. Root hair elongation rates (µm.min-1) and the frequency of cell bursting were the major experimental parameters which were evaluated. Both low pH and, more markedly, hypo-osmotic stress caused significant reductions in elongation rates and the bursting of root hair tips. In a response curve to varying osmolarities of the external medium, root hair elongation rates increased with decreasing osmolarities until a threshold was reached and elongation rates decreased drastically and the bursting of root hairs began to be observed. Interactions between low pH and hypo-osmolarity were observed. The use of the inhibitor diphenylene iodonium (DPI) did not provide evidence for the involvement of plasma membrane NADPH in the response of root hairs to low pH and hypo-osmotic shock. However, a role for cell wall peroxidases was provided by use of the inhibitor salicylhydroxamic acid (SHAM). Root hairs of the hormonal mutants dgt (low sensitivity to auxin) and epi (ethylene super producer), but not not (deficient in abscisic acid), displayed a more effective response to hypo-osmotic shock than Micro-Tom, by decreasing elongation rates and cell bursting to a greater degree. This study provides strong evidence to suggest that root hairs have a cell wall integrity response system and that root hairs are potentially good cell model systems for such research

Moléculas de L-cisteína (CSH) e L-glutationa (GSH) foram ancoradas na superfície de eletrodos de ouro, previamente modificados com uma camada autoarranjada de ácido 3-mercaptopropiônico (MPA). Esta arquitetura molecular foi importante para preservar a atividade redox dos grupos tiólicos da CSH e GSH na interface eletrodo/solução. A identificação do par redox R-S-S-R/R-SH, bem como a determinação do pKa dos grupos -SH superficiais, foram efetuadas usando voltametria cíclica em soluções de eletrólito em diferentes pH contedo ferricianeto de potássio. A presença dos grupos -SH e -S-S- na superfície dos eletrodos modificados foi ainda confirmada por Espectroscopia Raman de Superfície. Determinaram-se as constantes de velocidade de transferência de carga do processo quase reversível R-S-S-R / R-SH. Estes eletrodos modificados apresentaram resposta eletrocatalítica para a redução de espécies reativas de oxigênio (ROS), como peróxido de hidrogênio e para a oxidação de compostos com atividade antioxidante como a quercetina. Demonstrou-se que a presença de íons Cu2+ na superfície destes eletrodos é capaz de deslocar o equilíbrio do par R-SS-R/R-SH, no sentido oxidativo. Métodos de quantificação para estes compostos foram desenvolvidos por amperometria hidrodinâmica e voltametria cíclica. / L-cysteine molecules (CSH) and L-glutathione (GSH) were anchored on the surface of gold electrodes, previously modified with a self assembled monolayer of 3-mercaptopropionic acid (MPA). This molecular architecture was important to preserve the redox properties of the thiol groups of CSH and GSH in the interface electrode / solution. The identification of the redox couple RSSR / R-SH and the determination of the pKa of -SH groups surface were made using cyclic voltammetry in electrolyte solutions at different pH contents potassium ferricyanide. The presence of the -SH and -SS- modified electrode surface was further confirmed by Raman spectroscopy of surface. It was determined the rate constants of direct electron transfer of quasi-reversible coupled R-SS-R/R-SH. The modified electrodes showed electrocatalytic response to the reduction of reactive oxygen species (ROS) such as hydrogen peroxide and the oxidation of compounds with antioxidant activity such as quercetin. It was demonstrated that presence of Cu2+ ions on the electrode surface can shift the equilibrium of the RSSR/R-SH redox coupled into oxidative direction. Hydrogen peroxide and Quercetin were detected at these modified electrodes using amperometry and hydrodynamic cyclic voltammetry.

Compostos α-aminocarbonilícos como ácido 5-aminolevulínico (ALA) e aminoacetona (AA) apresentam um grande potencial pró-oxidante, pois sofrem reações de enolização e subseqüente oxidação aeróbica, com a formação de espécies radicalares de oxigênio, íons NH4+ e α-oxoaldeídos potencialmente citotóxicos. A α-aminocetona 1,4-diamino-2-butanona (DAB), um análogo da putrescina, é um agente microbicida de vários parasitas incluindo Trypanosoma cruzi. Acredita-se que o mecanismo de morte desencadeado por DAB nos parasitas seja por meio da inibição competitiva da ornitina descarboxilase (ODC), importante enzima do metabolismo de poliaminas, muito embora tenha sido observado de igual forma danos oxidativos nestes parasitas quando tratados com DAB. O objetivo deste trabalho é esclarecer o mecanismo de oxidação química de DAB e sua ação pró-oxidante à cultura de células de mamíferos (LLC-MK2 e RKO), assim como sua atividade microbicida contra tripomastigotas de Trypanosoma cruzi. Demonstramos aqui que DAB, quimicamente similar ao ALA e AA, sofre reação de oxidação catalisada por íons fosfato, e por íons de metais de transição como Fe(II) e Cu(II), resultando na formação de radicais de oxigênio, H2O2, NH4+, 2-oxo-4-aminobutanal como produto principal da oxidação de DAB e de compostos ciclicos de caracter pirrólico. Danos oxidativos observados em ferritina, apotransferrina e liposomos de cardiolipina e fosfatidilcolina (20:80) contribuem para a nossa hipótese de ação pró-oxidante de DAB. O tratamento de células de mamíferos das linhagens LLC-MK2 (IC50 1,5 mM, tratamento de 24 h) e RKO (IC50 0,3 mM, tratamento de 24 h) com DAB levou à alteração do balanço redox celular, à ativação de resposta antioxidante e ao desencadeamento de morte celular via apoptose e parada de ciclo celular. Em culturas de tripomastigotas de T. cruzi o tratamento com DAB culminou na redução da motilitidade e viabilidade destes parasitas (IC50 0,2 mM, tratamento de 4 h), assim como depleção do conteúdo tiólico acompanhado pelo aumento da atividade de TcSOD. Além do mais, DAB mostrou-se eficiente em limitar a invasão de tripomastigotas às células hospedeiras (LLC-MK2) e reduzir a proliferação de amastigotas intracelulares, contudo fortemente relacionada à necrose das células hospedeiras infectadas, uma vez que são alvos mais susceptíveis de ação oxidativa. Estes resultados suportam nossa hipótese que DAB exerce ação pró-oxidante e contribui deste modo com o mecanismo já descrito de morte celular associada à inibição da biossíntese de poliaminas em vários microorganismos. / α-Aminocarbonyl componds such as 5-aminolevunilic acid (ALA) and aminoacetone (AA) have been shown to exhibit pro-oxidant properties. These compounds undergo phosphate-catalyzed enolization in physiological pH and subsequent aerobic oxidation, yielding reactive oxygen species, NH4+ ions and an α-oxoaldehyde highly cytotoxic. The &#945-aminoketone 1,4-diamino-2-butanone (DAB) is a putrescine analogue and a microbicidal agent to various parasites including Trypanosoma cruzi. The mechanism of DAB toxicity to these parasites is attributed to DAB competitive inhibition of ornithine decarboxylase (ODC), a key enzyme on polyamine biosynthesis, although it has also been shown DAB isto implicated in oxidative damage to these parasites. Our aim is to clarify the mechanism of DAB aerobic oxidation and of its putative pro-oxidant activity to mammalian cell cultures (LLC-MK2 and RKO cell linages) and to Trypanosoma cruzi trypomastigotes. Here we show that, similar to ALA and AA, DAB undergoes aerobic oxidation in presence of phosphate ions and of transition metal ions such as Fe(II) and Cu(II), yielding oxygen radicals, H2O2, NH4+ and 2-oxo-4-aminobutanal accompanied by its condensation cyclic products displaying pyrrolic characteristics. Oxidative alterations to ferritin, apotransferrin and liposomes of cardiolipin and phosphatidylcholine (20:80) were observed under DAB treatment strongly supporting our hypothesis of DAB pro-oxidative activity. DAB treatment of mammalian cultured cells LLC-MK2 (IC50 1.5 mM, 24 h incubation) and RKO (IC50 0.3 mM, 24 h incubation) resulted in redox imbalance, induction of antioxidant response, activation of apoptosis pathway and cell cycle arrest. DAB is shown here to trigger Trypanosoma cruzi trypomastigotes decreased parasite motility and viability (IC50 0.2 mM, 4 h incubation), as well as redox thiol imbalance parallel to increase TcSOD activity. In addition, DAB efficiently hampered host cell (LLC-MK2) invasion by trypomastigotes. In addition, intracellular amastigotes showed to be susceptible to DAB toxicity, although strongly related to necrosis of infected host cells, which are more vulnerable to oxidative stress. Altogether, these data support our hypothesis that oxidative stress contributes to DAB cytotoxicity.

Neste trabalho, alguns novos complexos imínicos de cobre(II) com ligantes inspirados em biomoléculas como oxindóis, contendo grupos indólicos, imidazólicos ou pirrólicos com diferentes características estruturais, foram sintetizados e caracterizados por análise elementar, espectrometria ESI-MS e espectroscopias IV, UVNis e EPR. As possíveis interações desses complexos de cobre com a albumina humana (HSA) e com o plasma sanguíneo foram estudadas através das técnicas EPR, CD e SDS-PAGE, indicando que estas ocorrem principalmente no sítio N-terminal da proteína. Suas reatividades frente a compostos biológicos relevantes, tais como glutationa, ascorbato e peróxido de hidrogênio, também foram verificadas. Alguns dos complexos estudados podem ser ativados por glutationa, ascorbato ou peróxido de hidrogênio, sendo capazes de gerar espécies reativas de oxigênio em concentrações significativas, na presença desses redutores ou oxidantes biológicos. Adicionalmente, as propriedades pró-oxidantes de tais complexos foram investigadas, visando elucidar estudos prévios de suas atividades pró-apoptótica e antitumoral. Alguns destes complexos foram mais eficientes em causar danos oxidativos à 2-deoxi-D-ribose, enquanto outros foram mais eficientes em causar oxidantes na proteína HSA, com formação de grupos carbonílicos, principalmente em presença de H202. Experimentos de CD complementaram estes resultados, indicando que somente alguns complexos causaram modificações na α-hélice da proteína. Experimentos de EPR com captador de spin, na presença de HSA e H202, mostraram a formação de quantidades apreciáveis de radicais hidroxil e radicais de carbono, em presença de peróxido de hidrogênio. Além disso, os complexos apresentaram notável habilidade de ligação ao DNA e conseqüente atividade nuclease, promovendo clivagens nas duas fitas. Experimentos de fluorescência, EPR, gel de eletroforese marcado com α-32P-UTP e CD foram ainda realizados, visando elucidar o mecanismo de ação destes complexos no meio biológico. Estes experimentos indicaram que eles podem se associar ao DNA, através de suas bases ou pela interação com a deoxi-ribose, já que promoveram danos oxidativos nestes substratos. Entretanto, não catalisam a hidrólise dos grupos fosfato, atuando, portanto, predominantemente por um mecanismo oxidativo. Através de CD, poucas perturbações na elipsicidade do DNA foram observadas, o que indica que estes complexos provavelmente estão localizadas nas cavidades ou alças do ácido nucléico. / Some novel imine-copper(II) complexes with ligands inspired in biomolecules such as oxindoles, containing indole, pirrole or imidazole moieties with different structural features were synthesized, and characterized by elemental analysis, IV, UV/Vis and EPR spectroscopies, and ESI-MS spectrommetry. Interactions of these complexes with human serum albumin (HSA) and human plasma were verified by EPR, CD and SDS-PAGE techniques, showing that they occur mainly at the N-terminal site of the protein. Their reactivity towards biological relevant compounds, such as glutathione, ascorbate and hydrogen peroxide were also verified; some of them are capable of generating ROS in significant concentrations, in the presence of these reducing or oxidant agents. Additionally, the activity of such copper(II) complexes in promoting oxidative damage to different substrates was investigated, in order to elucidate previous studies on their pro-apoptotic and antitumoral activity. Some of these complexes were much more efficient to cause oxidative damage to 2-deoxy-D-ribose, especially in the presence of hydrogen peroxide. On the contrary, others were more active in causing damage to HSA protein, with the formation of carbonyl groups. Experiments by CD corroborated these results, since only some of the complexes caused modifications in the protein -helix. EPR spin trapping experiments, in the presence of HSA and H2O2, showed significant generation of hydroxyl as well as carbon centered radicals. Moreover, all the complexes showed remarkable ability to bind to DNA, promoting double-strand cleavage, upon H2O2 activation. In order to investigate their mechanism of action, fluorescence, EPR, gel-electrophoresis with labeled α-32P-UTP and CD experiments were carried out. The results indicated that these complexes can bind to DNA through its bases or can interact with the deoxi-ribose rings, promoting oxidative damage to those substrates. On the contrary, they do not catalyze the hydrolysis of phosphate groups. By CD spectroscopy, little perturbations on the helicity conformation of the DNA were observed, indicating that these complexes are probably located in the grooves.

Sepse, a resposta do organismo a uma infecção, está associada a altas taxas de mortalidade. A razão pela qual um mecanismo protetor resulta num quadro clínico fatal permanece inexplicada. Em trabalho prévio nosso grupo demonstrou que exossomos de origem plaquetária são os mais freqüentes em plasma de pacientes com choque séptico e que estes podem induzir apoptose em células musculares lisas vasculares e células endoteliais em cultura. Demonstramos ainda que tais exossomos possuíam uma fonte enzimática de ROS, uma NADPH oxidase cuja atividade poderia estar associada à indução da apoptose (Janiszewski et al., 2004). No presente trabalho, nós buscamos criar um modelo de geração ex vivo de exossomos similares aos encontrados em pacientes sépticos e identificar possíveis vias responsáveis pela liberação destes e seus efeitos. Choque séptico é uma condição relacionada com exposição a lipopolissacarídeo (LPS) e geração de alta quantidade de trombina, TNF e espécies reativas de nitrogênio. Através de citometria de fluxo revelamos que plaquetas humanas expostas ao doador de NO dietilamina-NONOato e ao LPS geraram exossomos similares àqueles encontrados em pacientes com choque séptico, expondo alta quantidade de tetraspaninas CD9, CD63 e CD81 mas pouca fosfatidilserina. Por outro lado, plaquetas expostas à trombina ou TNF liberaram partículas com características claramente distintas, com alta exposição de fosfatidilserina e baixa de tetraspaninas. Assim como os exossomos sépticos, os exossomos obtidos pela exposição de NO e LPS geraram radical superóxido e NO, como demonstrado pela quimioluminescência da lucigenina (5M) e celenterazinina (5M) e pela fluorescência da 4,5-diaminofluoresceína (10mM) e 2,7-diclorofluoresceína (10mM). A análise por Western Blot nos permitiu identificar as subunidades Nox1, Nox2 e p22phox da NADPH oxidase e a isoforma induzível da enzima NO sintase (NOS) nesses exossomos. Como esperado, inibidores da NOS e da NADPH oxidase reduziram significamente os sinais fluorescentes e quimioluminescentes. Em adição, as células endoteliais em cultura expostas aos exossomos gerados por dietilamina-NONOato e LPS sofreram significativo aumento da taxa de apoptose quando comparadas àquelas expostas a exossomos controle. A inibição da NADPH oxidase assim como da NOS reduziu expressivamente tal efeito. Adição de urato (1mM), mostrou efeito aditivo sobre a inibição do sinal fluorescente, assim como redução adicional da taxa apoptótica, sugerindo papel importante do radical peroxinitrito. Nós propomos, assim, que exossomos derivados de plaquetas podem representar papel adicional no já complexo cenário da sinalização vascular redox. Nesse sentido, uma abordagem baseada em exossomos pode fornecer novas ferramentas para o entendimento e até tratamento da disfunção vascular na sepse / Sepsis, the bodys response to infection, is associated with high mortality rates. Why a protective mechanism turns into a deadly clinical picture is a matter of debate, and goes largely unexplained. In previous work we demonstrated that plateled derived exosomes are found in the plasma of septic patients with septic shock and can induce endothelial and vascular smooth muscle cell apoptosis in culture through an enzymatic superoxide source (Janiszewski et al., 2004). In this work we sought to create a model for ex vivo generation of exosomes, and to identify the pathways responsible for ROS release by exosomes and their effects. Septic shock is a condition related to exposure of lipopolysaccharide (LPS), generation of high amounts of thrombin, TNF and nitrogen reactive species. Through flow cytometry we demonstrated that human platelets exposed to the NO-donor diethylamine-NONOate, and to LPS, generated exosomes similar to those found in the blood of septic shock patients, with high exposure of the tetraspanin CD9, CD63, and CD81, but little phosphatidylserine. On the other hand, platelets exposed to thrombin or TNF released particles with clearly distinct characteristics, such as high phosphatidylserine and low tetraspanin. Like the septic exosomes, the exosomes obtained by NO and LPS exposure generated superoxide radical and NO, as disclosed by lucigenin and coelenterazine chemiluminescence and by 4,5-diaminofluorescein and 2,7-dichlorofluorescein fluorescence. Western Blot analysis revealed the presence of Nox1, Nox2 and p22phox NADPH oxidase subunits and the inducible isoform of NO synthase (NOS) in these exosomes. As expected, NOS inhibitors or NADPH oxidase inhibitors significantly reduced the fluorescence and chemiluminescente signals. In addition, endothelial cells exposed to NO or LPS generated exosomes underwent apoptotic death, while control exosomes had no effects on apoptosis. NADPH oxidase as well as NOS inhibition significantly reduced apoptosis rates. Concomitant generation of NO and superoxide suggests biological effects of the highly reactive radical peroxynitrite. In fact, the peroxynitrite scavenger urate (1 mM) showed an additive effect on fluorescent signal inhibition, as well as on endothelial apoptosis rate reduction. We thus propose that platelet-derived exosomes may be another class of actors in the complex play known as vascular redox signaling. In this sense, an exosome-based approach can provide novel tools for further understanding and even treating vascular dysfunction related to sepsis

Introdução: Wistar Audiogenic Rats (WAR) é modelo experimental desenvolvido na Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, para estudo da epilepsia, entretanto, a seleção genética em resposta aos comportamentos de crises audiogênicas também trouxe à tona alterações no metabolismo energético nesses animais. Dois estudos são relevantes deste ponto de vista, no primeiro Botion e Doretto observaram que WAR após serem estimulados apresentam: (a) valores de glicemia maior em relação ao Wistar; (b) aumento no lactato circulante - o que pode indicar deficiência na fosforilação oxidativa (OXPHOS); (c) aumento da atividade adrenérgica, induzindo dessensibilização da via lipolítica ?-adrenérgica no tecido adiposo epididimal. Pereira e colaboradores investigando o metabolismo de carboidratos relataram: (a) aumento na via glicólica; (b) translocação de GLUT4 aumentada no músculo gastrocnêmico e (c) redução nos níveis de glicogênio muscular. Objetivo: Diante desses achados o presente estudo tem como objetivo elucidar o metabolismo energético mitocondrial e sua relação com as crises epiléticas induzidas por estímulos sonoros. Resultados: Através de analises comportamentais e calorimetria indireta, relatamos que WAR possui perfil ansiogênico e tem preferência em oxidar aminoácidos; utilizando biopsias de tecido hepático, musculo esquelético e cardíaco, observamos maior densidade mitocondrial, acompanhada de maior geração de H2O2 e como consequência maior estresse oxidativo; na busca para elucidar com maior destreza, realizamos isolamento da fração mitocondrial do tecido hepático, e concluímos que não há maior geração de H2O2 por mitocôndria, porém há um enriquecimento proteico (algumas proteínas funcionais - como as envolvidas na OXPHOS- e outras não-funcionais - como as UCPs), além de relatarmos maiores níveis de proteínas envolvidas na dinâmica mitocondrial, desse modo podemos concluir que WAR possuem maior densidade mitocondrial e mitocôndrias com maior eficiência; o mesmo perfil mitocondrial foi observado no tecido cerebral. Após tratamento com DNP e NAC, observamos redução do estresse oxidativo no tecido cerebral, porém apenas NAC reduziu a severidade da crise, assim concluímos que o suave desacoplamento induzido por DNP não é capaz de reduzir de forma significativa a severidade da crise, porém a inibição da glicólise pelo NAC, alterou a bioenergética cerebral é capaz a reduzir a severidade da crise, deixando evidenciado que o metabolismo energético tem papel essencial/relevante na crise epilética induzida por estímulos sonoros em WAR, enquanto o estresse oxidativo tem papel secundário. / Introduction: Wistar Audiogenic Rats (WAR) is an experimental model developed in the Ribeirão Preto Medical School, for the study of epilepsy, however, the genetic selection in response to the behaviors of audiogenic crisis also brought up changes in energy metabolism in these animals. Two studies are relevant from this point of view, in the first Botion and Doretto observed that WAR after being stimulated present: (a) higher blood glucose values in relation to the Wistar; (b) Increase in circulating lactatewhich may indicate deficiency in oxidative phosphorylation (OXPHOS); (c) Increased adrenergic activity. Pereira and collaborators investigating the metabolism of carbohydrates reported: (a) increase in glycolysis; (b) Translocation of GLUT4 increased in gastrocnemius muscle and (c) reduction in muscle glycogen levels. Objective: In the face of these findings, the present study aims to elucidate the mitochondrial energy metabolism and its relation to the epileptic crises induced by sound stimuli. Results: Through behavioral analysis and indirect calorimetry, we report that WAR has reduced exploratory activity and has preference to oxidize amino acids; Using biopsies of liver tissue, skeletal and cardiac muscles, we observe greater mitochondrial density, accompanied by greater generation of H2O2 and as a result of greater oxidative stress; in the search to elucidate with greater dexterity, we perform isolation of the mitochondrial fraction of the hepatic tissue, and we conclude that there is no greater generation of H2O2 by mitochondria, but there is a protein enrichment (some functional proteins - such as those involved in OXPHOS - and other nonfunctional ones - such as UCPs), in addition to reporting higher levels of proteins involved in mitochondrial dynamics, so we can conclude that WAR has greater mitochondrial density and mitochondria more efficiently; the same mitochondrial profile was observed in the brain tissue. After treatment with DNP and NAC, we observed reduction of oxidative stress in the brain tissue, but only NAC reduced the severity of the crisis, so we conclude that the smooth decoupling induced by DNP is not able to significantly reduce the severity of the crisis, however the inhibition of glycolysis by the NAC, altered the brain bioenergetics is able to reduce the severity of the crisis, leaving evidence that the energy metabolism has essential/relevant role in the epileptic crisis induced by sound stimuli in WAR, while oxidative stress has secondary role.

O hipertireoidismo é uma patologia epidemiologicamente importante, que afeta o sistema cardiovascular de forma proeminente. O estado hipertireoideo pode afetar o metabolismo basal, consumo de O2 celular, sistema renina angiotensina, assim como, estimular a produção de espécies ativas de oxigênio. Estas alterações produzem consequências morfológicas, funcionais, bioquímicas e moleculares no tecido cardíaco. A hipertrofia cardíaca, decorrente do hipertireoidismo, instala-se devido a uma série de eventos que sinalizam à proliferação e sobrevivência celular, envolvendo as espécies ativas de oxigênio, a ativação do sistema renina angiotensina cardíaco e o sistema nervoso autonômico. Neste estudo, bloqueamos o receptor AT1 da angiotensina II para avaliarmos a influência do sistema renina angiotensina cardíaco sobre o desenvolvimento da hipertrofia cardíaca, a participação do balanço autonômico sobre o coração e o papel das espécies ativas de oxigênio neste processo, em modelo experimental de hipertireoidismo. Para isto, foram utilizados ratos Wistar machos, pesando cerca de 220g, divididos em 4 grupos experimentais: Controle (C), Losartan (L) (10 mg/Kg de peso corporal/dia, 28 dias, sonda intragástrica) , T4 (12mg/L água de beber, 28 dias), e T4+L. Foram avaliados a massa cardíaca, análise espectral do balanço simpato-vagal, a expressão protéica do receptor AT1 da Angiotensina II e da gp91phox, peróxido de hidrogênio (H2O2), Nrf-2 e Heme-oxigenase-1 (HO-1) no tecido cardíaco. A hipertrofia cardíaca e o desequilíbrio autonômico induzidos pelo hipertireoidismo foram atenuados no grupo T4+L. Os níveis de H2O2, Nrf-2, gp91phox e HO-1 foram elevados no grupo T4, e significativamente reduzidos no grupo T4+L, quando comparados ao grupo Controle. A expressão protéica do receptor AT1 esteve elevada nos dois grupos hipertireoideos. Os resultados obtidos sugerem que o bloqueio do receptor AT1 promove importante impacto sobre o balanço simpato-vagal e a hipertrofia cardíaca, no hipertireoidismo, sendo as espécies ativas de oxigênio e o sistema Nrf-2/HO-1 possíveis mediadores destas alterações. / Hyperthyroidism is an epidemiologic relevant pathology, which substantially affects the cardiovascular system. The hyperthyroid state may affect basal metabolism, O2 cell consumption, renin-angiotensin system, and increase reactive oxygen species production. Those alterations produce morphological, biochemical, functional and molecular consequences in cardiac tissue. Hyperthyroidism induced cardiac hypertrophy develops due to a set of events, which signals cell survival and proliferation, including reactive oxygen species, cardiac rennin-angiotensin system, and autonomic nervous system. In the present study, the role of cardiac renin-angiotensin system on development of hyperthyroidism induced cardiac hypertrophy, and the involvement of autonomic nervous system and reactive oxygen species, were assessed trough blockade of angiotensin II receptor AT1. For that, were used male Wistar rats, weighting about 220g, divided in 4 experimental groups,: Control (C), Losartan (L) (10mg/Kg body weight/day, 28 days, intragastric probe), T4 (12mg/L L-thyroxin in drinking water, 28 days), and T4+L. Cardiac mass, spectral analysis (autonomic balance), hydrogen peroxide (H2O2), and myocardial protein expression of angiotensin II receptor (AT1), NADPH oxidase, Nrf-2, and heme-oxygenase-1 (HO-1), were quantified. Cardiac hypertrophy and autonomic umbalance induced by thyroid hormones were attenuated in the T4+losartan group. The H2O2, as well as Nrf-2, gp91phox, AT1 and HO-1 immunocontent were elevated in T4 group. All these effects were attenuated by losartan, except AT1 levels. The overall results suggest that blockade of AT1 receptor lead to relevant impact on autonomic balance and cardiac hypertrophy, being ROS and Nrf-2/ HO-1 system possible mediators in this alterations in experimental hyperthyroidism.