Na literatura existe um consenso que os herbicidas glifosato (Gli) e 2,4-D interagem antagonicamente quando aplicados em combinação. No entanto, as bases bioquímicas e fisiológicas destes antagonismos são desconhecidas. Utilizou-se espectrometria de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) para a caracterização de moléculas de Gli e 2,4-D em várias formulações analíticas, preparadas de maneira que os herbicidas fossem obtidos sem os ingredientes inertes das formulações comerciais. Não foram encontradas alterações significativas na conformação atômica do herbicida nos espectros de RMN entre as formulações analíticas de Gli isopropilamina, dimetilamina, potássio ou amônio; 2,4-D Dimetilamina ou colina, quando analisadas separadamente ou em mistura. Avaliando também formulações comerciais dos herbicidas, não foram encontradas diferenças significativas entre os espectros de RMN para a mistura entre Gli e 2,4-D. A formulação comercial de Gli amoníaco apresentou alterações na conformação molecular do Gli, principalmente na região P da molécula que mostrou maior deslocamento químico, mas isso foi atribuído aos maiores teores de Na encontrados nessa formulação. Aplicando-se as diferentes formulações comerciais na espécie modelo de tomate Micro-Tom (MT), foram estudados os padrões de absorção dos herbicidas. A absorção de Gli radiomarcado pelas plantas de MT foi reduzida somente para a formulação Gli sal de amônio, independentemente da presença de 2,4-D. Neste trabalho, não se observou efeito antagônico na absorção entre Gli e 2,4-D. Por meio de um ensaio fatorial para determinar o efeito antagônico dos herbicidas em plantas de MT, observou-se que a dose de maior antagonismo para 2,4-D foi: 35 g i.a. ha-1 - 0,65 mM e para Gli, 70 g g i.a. ha-1 - 1,7 mM. A translocação do Gli radiomarcado foi significativamente reduzida em MT, quando aplicado com 2,4-D. Experimentos utilizando o marcador molecular GUS no gene DR5 do MT, mostraram que o Gli reduz a resposta de expressão gênica pelas vias de sinalização do 2,4-D. Os ensaios de quantificação de espécies reativas de oxigênio (EROs) induzidas pela atuação do 2,4-D, apresentaram menor produção na presença do Gli. O acúmulo de ácido chiquímico causado pelo Gli no MT foi maior quando aplicado sem mistura com 2,4-D. A interferência do 2,4-D na atuação do Gli foi confirmada nos mutantes insensíveis à auxina diageotropica (dgt) e Never ripe (Nr), em que a produção de EROs foi menor e a translocação do Gli foi mantida independente da aplicação com o 2,4-D. O acúmulo de ácido chiquímico na aplicação de Gli e a mistura dos herbicidas, foram semelhantes. O mutante yellow-green2 (yg2), menos sensível ao Gli, apresentou menor translocação do herbicida. O acúmulo de ácido chiquímico para este mutante foi menor quando aplicado com Gli, mas na mistura de Gli + 2,4-D, a quantidade do ácido aumentou. A insensibilidade ao Gli proporcionou o reestabelecimento da produção de EROs pelo 2,4-D na aplicação da mistura dos herbicidas. Neste trabalho, em contraposição ao conhecimento atual, não se observou qualquer efeito antagônico entre Gli e 2,4-D a nível químico, mas o antagonismo ocorreu por fatores da inter-relação dos mecanismos que cada herbicida induz nos níveis fisiológicos, bioquímicos e genéticos na biologia do organismo vegetal. / A consensus exists in literature that the herbicides glyphosate and 2,4-D interact antagonistically when applied in combination. However, the biochemical and physiological basis of this antagonism are unknown. It was used Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectrometry to characterize the molecules of glyphosate and 2,4-D prepared with high purity analytical compounds without the commercial formulations inert ingredients. No changes in atomic herbicide conformation ware found in NMR spectra of glyphosate formulations isopropylamine, dimethylamine, potassium or ammonium and 2,4-D dimethylamine or choline, when evaluated separately or in mixture. Analysing also the commercial herbicides formulations, no differences in NMR spectra for the mixture between glyphosate and 2,4-D ware found in chemical shift. The ammonium salt glyphosate formulations, presented changes in molecular conformation in P region of glyphosate showing higher chemical shift, which was attributed to higher levels of Na found in its composition. It was applied different commercial formulations in tomato cultivar Micro-Tom (MT) to study the pattern of herbicide absorption. The absorption of radiolabeled glyphosate by MT was reduced in the ammonium salt formulation, regardless of the 2,4-D\'s presence. In this work, no antagonistic effect in plant absorption was observed between glyphosate and 2,4-D. Factor assay was conducted using different concentrations of 2,4-D and glyphosate to determine the antagonistic effect on tomato plants. It was observed that the dose of greater antagonism to 2,4-D form 35 g a.i. ha-1 - 0.65 mM and for glyphosate, 70 g a.i. ha-1 - 1.7 mM. Assays using molecular reporter GUS in MT`s DR5 gene, showed that the glyphosate reduces gene expression responses through signalling pathways of the 2,4-D. The absorption of radiolabeled glyphosate was significantly reduced in MT, when it was applied with 2,4-D. In trials that it was quantified production of reactive oxygen species (ROS) on MT induced by 2,4-D performance, lower production were found when 2,4-D ware applied with glyphosate. The shikimic acid accumulation affected by glyphosate action in MT was higher when applied without 2,4-D mixture. The interference of 2,4-D in glyphosate`s actions was confirmed in auxin insensitive mutants diageotropica (dgt) and Never ripe (Nr), which ROS production was lower. In those mutants, glyphosate translocation was maintained regardless 2,4-D application and shikimic acid accumulation between glyphosate treatment and herbicide mixture were similar. The yellow-green2 (yg2) mutant was less sensitive to glyphosate, presenting low translocation to the herbicide. The shikimic acid accumulation for yg2 mutant was lower when applied with glyphosate, but when it was treated with glyphosate + 2,4-D, the amount of acid was increased. The insensitivity of glyphosate provided reestablishment of ROS production by 2,4-D, when the mixture of herbicides were applied. In this paper it was show that, in contrast to current knowledge, there was no antagonistic effect between glyphosate and 2,4-D in chemical level, but the antagonism occurred by factors of the interrelationship of the mechanisms that each herbicide induces in the physiological, biochemical and genetic levels in the biology of the plant organism.

Orientador: Adriana Zerlotti Mercadante / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-18T21:40:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Chiste_RenanCampos_D.pdf: 8233764 bytes, checksum: 20989b604d256eba3bcdcfda79445208 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Os compostos bioativos presentes no reino vegetal possuem importantes funções e ações biológicas, podendo ser considerados promotores da saúde humana. Já é reconhecida a associação entre a ingestão de frutas e vegetais e a diminuição do risco de desenvolvimento de diversas desordens crônico-degenerativas, tais como câncer, inflamações, doenças cardiovasculares, catarata, degeneração macular e outras, sendo os carotenóides e compostos fenólicos alguns dos grupos de compostos bioativos aos quais são atribuídas tais ações. As sementes e os extratos de urucum (Bixa orellana L.) são utilizados como corantes nas indústrias alimentícias, farmacêutica e de cosméticos, devido à presença majoritária do carotenóide bixina. Até então, não havia sido relatada na literatura a composição de compostos fenólicos das sementes de urucum. Dessa forma, foi desenvolvido e validado um método por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada aos detectores de arranjo de diodos e espectrômetro de massas (HPLC-DAD-MS/MS) para separar, identificar e quantificar bixina e os compostos fenólicos em semente de urucum. Adicionalmente, foi otimizado um procedimento de extração simultânea desses compostos através da metodologia de superfície de resposta. Além de bixina, conhecida por ser o principal carotenóide em sementes de urucum, a hipolaetina e um derivado de ácido caféico foram identificados, pela primeira vez, como os principais compostos fenólicos. O procedimento otimizado envolveu 15 extrações com acetona:metanol:água (50:40:10, v/v/v) como solvente, razão sólido-líquido de 1:9 (m/v) e 5 min para cada extração em ultrassom. O método cromatográfico proposto foi validado com sucesso para a análise simultânea de compostos fenólicos e bixina em sementes de urucum. Extratos líquidos de urucum com elevada capacidade antioxidante e potencial de cor foram obtidos a partir da extração de bixina e de compostos fenólicos de sementes de urucum utilizando solventes com diferentes polaridades (água, etanol:água, etanol, etanol:acetato de etila e acetato de etila). Os valores mais elevados de compostos fenólicos totais foram encontrados nos extratos obtidos com água, etanol:água e etanol (0,5 mg equivalentes de ácido gálico/mL), e o valor mais elevado de bixina foi encontrado no extrato obtido com etanol:acetato de etila (5,2 mg/mL), que foi caracterizado como o mais vermelho e o mais vívido (a* = 40,5, h°=46,1, C* = 58,4). O extrato obtido com etanol:acetato de etila também apresentou a maior atividade anti-radical livre (4,7 umol equivalente Trolox/mL) e a maior porcentagem de proteção ao triptofano contra o oxigênio singlete (63,6 %). Por outro lado, acetato de etila e a mistura etanol:água foram os solventes menos eficazes para a extração de compostos fenólicos e bixina, respectivamente. De acordo com a análise estatística multivariada, etanol:acetato de etila e acetato de etila foram os solventes mais promissores para obtenção de extratos de urucum com ambas as propriedades antioxidantes e de cor. A partir da extração com diferentes solventes (água, etanol:água, etanol, etanol:acetato de etila e acetato de etila), foram também obtidos extratos liofilizados de urucum, e a capacidade antioxidante na desativação de diferentes espécies reativas de oxigênio (ROS) e de nitrogênio (RNS) foi avaliada. Além disso, os teores de compostos fenólicos e de bixina dos extratos de urucum foram determinados por HPLC-DAD. Todos os extratos de urucum foram capazes de desativar todas as espécies reativas testadas (peróxido de hidrogênio, ácido hipocloroso, oxigênio singlete, radical óxido nítrico, ânion peroxinitrito e radical peroxila), em baixas concentrações na faixa de ?g/mL, com exceção do radical superóxido. O extratos de sementes de urucum obtidos com etanol:acetato de etila e acetato de etila, que apresentaram os maiores níveis de hipolaetina e bixina, respectivamente, foram os extratos com a maior capacidade antioxidante. Adicionalmente, o padrão de bixina apresentou os menores valores de IC50 na desativação de todas as ROS e RNS testadas. O piquiá (Caryocar villosum (Aubl.) Pers), fruta nativa da região Amazônica, pode ser considerado uma fonte inexplorada de compostos bioativos, uma vez que poucos estudos sobre seus constituintes químicos e fitoquímicos estão disponíveis. Dessa forma, a composição química e fitoquímica da polpa de piquiá foi determinada, incluindo a composição de carotenóides e de compostos fenólicos por HPLC-DAD-MS/MS. De acordo com a composição nutricional, água (52 %) e lipídios (25 %) foram os principais componentes encontrados na polpa e o valor energético total foi 291 kcal/100 g. Sobre os compostos bioativos, a polpa apresentou (base seca) maior teor de compostos fenólicos (236 mg equivalentes de ácido gálico/100 g), flavonóides totais (67 mg equivalentes de catequina/100 g) e taninos totais (60 mg equivalentes de ácido tânico/100 g) em relação ao teor de carotenóides totais (7 mg/100 g) e alfa-tocoferol (1 mg/100 g). Os principais compostos fenólicos identificados por HPLC-DAD-MS/MS, foram ácido gálico (182 ug/g polpa), seguido por ácido elágico ramnosídeo (107 ug/g polpa) e ácido elágico (104 ug/g polpa). Os principais carotenóides identificados foram all-trans-anteraxantina (3 ug/g), all-trans-zeaxantina (3 ug/g), all-trans-neoxantina (2 ug/g), all-trans-violaxantina (1 ug/g) e all-trans-?-caroteno (0,7 ug/g). A capacidade anti-radical livre da polpa (3,7 mmol equivalente Trolox/100 g) indica que a polpa pode ser considerada um eficiente sequestrador do radical peroxila. Foram obtidos também extratos liofilizados de polpa de piquiá a partir da extração com diferentes solventes (água, etanol:água, etanol, etanol:acetato de etila e acetato de etila). Todos os extratos naturais foram caracterizados em relação ao teor de compostos bioativos (compostos fenólicos totais, flavonóides, taninos, carotenóides e tocoferóis). Além disso, a capacidade de desativação do radical peroxila, assim como a porcentagem de proteção contra o oxigênio singlete foi determinada para todos os extratos. Os extratos obtidos com água e a mistura etanol:água apresentaram os maiores teores (base seca) de compostos fenólicos totais (9,2 e 6,3 mg de equivalentes de ácido gálico/g, respectivamente), flavonóides totais (3,8 e 2,5 mg equivalente de catequina/g, respectivamente) e taninos totais (7,6 e 2,4 mg de ácido tânico/g, respectivamente). O extrato obtido com etanol:água também apresentou a maior capacidade de desativação do radical peroxila (ORAC) (0,3 mmol equivalente Trolox/g extrato). Por outro lado, o extrato obtido com etanol, que foi classificado como o de cor mais vívida e amarelo (C*ab = 13,7 e b* = 13,3), apresentou o maior teor de carotenóides totais (0,1 mg/g) e maior percentual de proteção contra o oxigênio singlete (10,6 %). Com base nos resultados deste estudo, etanol:água, água e etanol são os solventes mais promissores para obtenção de extratos de piquiá com alto teor de compostos bioativos, proteção contra o oxigênio singlete e capacidade sequestradora do radical peroxila. Portanto, tais informações são importantes para as indústrias alimentícia, cosmética e farmacêutica, sabendo que o piquiá e o urucum são fontes naturais acessíveis de compostos bioativos para serem usados como potencial matéria-prima para obtenção de extratos contra os danos oxidativos em alimentos ou sistemas biológicos / Abstract: The bioactive compounds found in the plant kingdom have important biological functions and actions and may be considered human health promoters. The association between the intake of fruits and vegetables and the decreased risk of developing several chronic-degenerative disorders is already recognized, being the carotenoids and phenolic compounds, groups of the bioactive compounds responsible for such actions. The annatto (Bixa orellana L.) seeds and extracts are used as colourant in the food, pharmaceutical and cosmetic industries, due to the presence of bixin. As far as we are concerned, no information about the composition of phenolic compounds present in the annatto seeds and extracts was reported. Thus, a method by high performance liquid chromatography coupled to diode array detector and mass spectrometer (HPLC-DAD-MS/MS) was developed and validated for separation, identification and quantification of phenolic compounds and bixin in annatto seeds. Furthermore, using response surface methodology, an optimized procedure for simultaneous extraction of both compound classes was established. In addition to bixin, known to be the main carotenoid in annatto seeds, hypolaetin and a caffeoyl acid derivative were identified as the main phenolic compounds. The optimized procedure involved 15 extractions using acetone:methanol:water (50:40:10, v/v/v) as solvent, a solid¿liquid ratio of 1:9 (w/v) and an extraction time of 5 min per extraction in a sonicator. Validation data indicated that the developed HPLC method is suitable for the simultaneous analysis of phenolic compounds and bixin in annatto seeds. Liquid annatto extracts with high antioxidant capacity and colour potential were obtained from annatto seeds by extraction of phenolic compounds and bixin using solvents with different polarities (water, ethanol:water, ethanol, ethanol:ethyl acetate and ethyl acetate). The highest levels of total phenolic compounds were found in the water, ethanol:water and ethanol extracts (0.5 mg gallic acid equivalent/mL), and the highest level of bixin was found in the ethanol:ethyl acetate extract (5.2 mg/mL), which was characterised as the reddest and the most vivid one (a* = 40.5, h° = 46.1, C* = 58.4). The ethanol:ethyl acetate extract also showed the highest antioxidant activity (4.7 umol Trolox equivalent/mL) and the highest percentage of tryptophan protection against singlet oxygen (63.6 %). On the other hand, ethyl acetate and ethanol:water were the least effective solvents for the extraction of phenolic compounds and bixin, respectively. According to the multivariate statistical analysis, ethanol:ethyl acetate and ethyl acetate were the most promising solvents to obtain annatto extracts with both antioxidant and colour properties. From the extraction with different solvents (water, ethanol:water, ethanol, ethanol:ethyl acetate and ethyl acetate), freeze-dried annatto extracts were also obtained, and the capacities to scavenge reactive oxygen (ROS) and reactive nitrogen (RNS) species were evaluated. In addition, the levels of phenolic compounds and bixin in the annatto extracts were determined by HPLC-DAD. All annatto extracts were able to scavenge all the tested reactive species (hydrogen peroxide, hypochlorous acid, singlet oxygen, nitric oxide radical, peroxynitrite anion and peroxyl radical) at low concentration in the ug/mL range, with the exception of superoxide radical. The ethanol:ethyl acetate and ethyl acetate extracts of annatto seeds, which presented the highest levels of hypolaetin and bixin, respectively, were the extracts with the highest antioxidant capacity, and the bixin standard presented the lowest IC50 values. Piquia (Caryocar villosum (Aubl.) Pers), a native fruit from Amazon region, can be considered an unexploited source of bioactive compounds, since few studies about chemical and phytochemical constituents are available. Thus, the chemical and phytochemical composition of piquia pulp was determinaed, including the composition of carotenoids and phenolic compounds by HPLC-DAD-MS/MS. According to the nutritional composition, water (52 %) and lipids (25 %) were the major components found in the pulp and the total energetic value was 291 Kcal/100 g. Regarding the bioactive compounds, the pulp presented (dry basis) higher content of phenolic compounds (236 mg gallic acid equivalent/100 g), total flavonoids (67 mg catechin equivalent/100 g) and total tannins (60 mg tannic acid equivalent/100 g) than total carotenoids (7 mg/100 g) and alfa-tochopherol (1 mg/100 g). The major phenolic compounds identified by HPLC-DAD-MS/MS were gallic acid (182 ug/g pulp), followed by ellagic acid rhamnoside (107 ug/g pulp) and ellagic acid (104 ug/g pulp). The main carotenoids identified were all-trans-antheraxanthin (3 ug/g), all-trans-zeaxanthin (3 ug/g), all-trans-neoxanthin (2 ug/g), all-trans-violaxanthin (1 ug/g) and all-trans-beta-carotene (0.7 ug/g). The antioxidant capacity of the pulp (3.7 mmol Trolox/100 g) indicates that the pulp can be considered a good peroxyl radical scavenger. Freeze-dried extracts of piquia using five solvents with different polarities (water, ethanol:water, ethanol, ethanol:ethyl acetate and ethyl acetate) were also obtained. All natural extracts were characterised in relation to the contents of bioactive compounds (total phenolic compounds, flavonoids, tannins, carotenoids and tocopherols). In addition, the scavenging capacity of all piquia extracts against peroxyl radical, as well as the quenching capacity against singlet oxygen were determined. All the data were used for classification of the piquia extracts applying multivariate statistical analysis. The water and ethanol:water extracts presented the highest levels of total phenolic compounds (9.2 and 6.3 mg gallic acid equivalent/g, respectively), total flavonoids (3.8 and 2.5 mg catechin equivalent/g, respectively) and total tannins (7.6 and 2.4 mg tannic acid/g, respectively). The ethanol:water extract also showed the highest scavenging capacity against peroxyl radical (ORAC) (0.3 mmol Trolox equivalent/g extract). On the other hand, the ethanol extract, which was classified as the most vivid and yellow one (C*ab = 13.7 and b* = 13.3), presented the highest level of total carotenoids (0.1 mg/g) and highest percentage of protection against singlet oxygen (10.6 %). Based on the results of this study, ethanol:water mixture, water and ethanol are the most promising solvents to obtain piquia extracts with high contents of bioactive compounds, protection against singlet oxygen and peroxyl radical scavenging capacity. Therefore, such informations are important for the food, cosmetic and pharmaceutical industries, since piquia and annatto are natural sources of bioactive compounds available for use as a potential raw material to obtain extracts against oxidative damage in foods or biological systems / Doutorado / Ciência de Alimentos / Doutor em Ciência de Alimentos

Macrófagos recuperados de peritôneo de camundongos 48 horas após administração de concanavalina A (Con A) são ativados e possuem um conteúdo maior de mieloperoxidase (MPO) do que macrófagos residentes. Este aumento pode ser observado por immunobloting e pelo aumento da atividade peroxidásica. Esta atividade foi avaliada pela quimiluminescência desencadeada por homogenato de macrófagos e peróxido de hidrogênio, durante a oxidação de luminol e melatonina. Os macrófagos contendo MPO são capazes de gerar ácido hipocloroso quando estimulados com acetato de forbol miristato (PMA). O aumento do conteúdo de MPO em macrófagos é um processo que independe de interferon-γ (IFN-γ), uma vez que camundongos IFN-γ-\"knockout\" têm uma atividade ainda maior que camundongos \"wild type\". O contato entre macrófagos e neutrófilos in vivo, não é necessário para o incremento observado, visto que macrófagos de camundongos tratados com anticorpo anti-granulócitos preservam a atividade peroxidásica. Este achado é uma evidência de que em algumas condições a ativação de macrófagos é acompanhada por um aumento da atividade peroxidásica. Dentre o amplo espectro de ação da MPO, este processo pode ter um papel especial na inflamação. Também é de especial interesse o fato de macrófagos serem capazes de oxidar melatonina, um hormônio com vários efeitos imunomodulatórios. / Macrophages recovered from mice peritoneum 48 after concanavalin-A (Con A) administration are primed and have a higher content of myeloperoxidase (MPO) than resident cells. The increase of MPO is accompanied by an increment in peroxidase activity, evaluated by the chemiluminescence during the oxidation of luminol and melatonin triggered by macrophages homogenates plus hydrogen peroxide. MPO present in macrophages are able to generate hypochlorous acid when macrophages are stimulated with phorbol myristate acetate. Interferon-γ (IFN-γ) does not participate in the process that lead macrophages to become enriched in MPO, since IFN-γ knockout mice have an even higher peroxidase activity compared to the wild type. The contact of macrophages with neutrophil in vivo seems to be not necessary for the observed increment in peroxidase since macrophages recovered from mice treated with antigranulocyte antibody preserves the peroxidase activity. These finding provides evidences that, at least in some conditions, macrophage activation is accompanied by an increment in peroxidase activity. Given the broad spectrum of action of MPO, this process might play a special role in inflammation. Also of special interest is the finding that macrophages are able to oxidize melatonin, a hormone with several immunomodulatory effects.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_caroline_gomes_lucas.pdf: 894020 bytes, checksum: 8d27baa8c8ae08744efe112062ff8b86 (MD5) Previous issue date: 2014-02-19 / The possibility of increasing the genetic pattern and animal production make the in vitro production of embryos an extremely valuable technique for the technological development of livestock. However, due to the need for mimicking the in vivo process, that consists in several interdependent steps there are difficulties in setting the optimal conditions for each situation performed. The improvement of in vitro maturation (IVM) protocols through supplementation with different molecules can increase the efficiency of the culture medium and improve the competence of oocytes for fertilization and embryogenesis. A promising approach is the realization of mediated delivery of nanocarriers molecules. Tretinoin (TTN, all- trans retinoic acid - ATRA ) is a natural retinoid and active metabolite of vitamin A with important action in cell proliferation and differentiation and embryonic development under both in vivo and in vitro conditions. TTN acts on the cytoplasmic maturation process, in the initial embryonic development and oocyte competence, improving the quality of embryos generated. The combinations of tretinoin with polymeric nanoparticles are alternatives to enhance the solubility and chemical stability of this molecule, allowing controlled release and decreased degradation. The objective of this study was to evaluate the effects of IVM medium supplementation with tretinoin-loaded lipid-core nanocapsules (TTN-LNC) at concentrations of 0.25, 0.5 and 1 μM, by analysis of embryonic development until the blastocyst stage, production of reactive oxygen species (ROS), and expression of genes related to apoptosis and pluripotency. As main results, TTN-LNC 0.25 μM increased the rate of blastocyst production and reduced ROS production. In addition, TTN and TTN-LNC induced a lower gene expression of Bax and SHC1, suggesting beneficial effects on the development of embryos. The results indicate that nanoencapsulation allows the use of a lower dose of TTN-LNC with consequent obtention of higher percentages of blastocyst production and decreased production of ROS, making nanoembriology a potential tool for improving bovine embryos IVP. / A possibilidade de aumento do padrão genético e da produção animal torna a produção in vitro (PIV) de embriões uma técnica extremamente valiosa para o desenvolvimento tecnológico da pecuária. No entanto, devido a necessidade de uma mimetização do processo in vivo, que consiste em várias etapas interdependentes, há dificuldades em ajustar as condições ótimas requeridas para cada situação reproduzida. O melhoramento dos protocolos de maturação in vitro (MIV) através da suplementação com diferentes moléculas permite aumentar a eficiência dos meios de cultivo e melhorar a competência de oócitos para a fertilização e embriogênese. Uma abordagem altamente promissora é a realização da entrega de moléculas mediada por nanocarreadores. A tretinoína (TTN, ácido retinóico all-trans - ATRA) é um retinóide natural e metabólito ativo da vitamina A, com ação importante na proliferação e diferenciação celular, e no desenvolvimento embrionário tanto em condições in vivo como in vitro. A TTN age no processo de maturação citoplasmática, no desenvolvimento inicial embrionário e competência oocitária melhorando a qualidade dos embriões gerados. A associação da tretinoína à nanopartículas poliméricas surge como alternativa para melhorar a solubilidade e estabilidade química desta molécula, possibilitando uma liberação controlada e redução da degradação. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da suplementação com nanocápsulas de núcleo lipídico associadas à tretinoína (TTN-LNC) no meio de MIV, nas concentrações de 0,25, 0,5 e 1 μM, através da análise do desenvolvimento embrionário até o estágio de blastocisto, produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e expressão de genes relacionados a apoptose e pluripotência. Como principais resultados, a TTN-LNC a 0,25 μM aumentou a taxa de produção de blastocistos e reduziu a produção de EROs. Além disso, TTN e TTN-LNC induziram uma menor expressão dos genes Bax e SHC1 sugerindo efeitos benéficos sobre o desenvolvimento embrionário. Os resultados indicam que a nanoencapsulação permite a utilização de uma menor dose de TTN-LNC com consequente obtenção de maiores porcentagens de produção de blastocistos e diminuição da produção de EROs, tornando a nanoembriologia uma ferramenta potencial para a melhora da técnica de PIV de embriões bovinos.

This study aimed to analyze the association between the genetic polymorphism of the manganese-dependent superoxide dismutase (Ala16Val MnSOD) and the oxidative and inflammatory markers in hypercholesterolemic and control individuals. Cholesterol levels in the control group were 104 to 178 mg/dL (2.69 4.61 mmol/L), while the hypercholesterolemic group presented levels 250 to 529 mg/dL (6.47 13.70 mmol/L).. The following biomarkers were also investigated: cholesterol-LDL oxidized (ox-LDL), antibodies anti-LDL oxidized (Anti-ox-LDL), ultra-sensitive C reactive protein (us-CRP), thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), carbonyl protein, thiol groups, glutathione (GSH), Vitamins C and E, as well as the superoxide dismutase antioxidant enzymes (SOD) and catalasis (CAT). Additionally, we evaluated the levels of ischemia-modified albumin (IMA), as well as the lipid profile. IMA levels were higher in the hypercholesterolemic group and a significant association between hypercholesterolemia and ox-LDL, Anti-ox-LDL, IMA and us-CRP was observed. A negative correlation between HDL and us-CRP was observed as well. Ala16Val polymorphism influenced the oxidative and inflammatory markers and HDL cholesterol levels were lower in the hypercholesterolemic individuals with the allele V (VV + AV). The present study demonstrated a positive correlation between the total cholesterol levels, TBARS, carbonyl protein and thiol groups. In the hypercholesterolemic individuals there was a reduction in the GSH levels and in the SOD activity, probably due to the enzyme inactivation caused by the protein oxidation. The CAT activity significantly increased probably to partially compensate the oxidative stress. An increase in the Vitamin E serum levels was also observed in the hypercholesterolemic individuals. The group with hypercholesterolemia presented an increase of the oxidative stress, especially for the individuals with a VV genotype to Ala16Val MnSOD polymorphism. TBARS levels, carbonyl protein, thiols groups, Vitamin E and the catalasis activity were significantly higher in the hypercholesterolemic individuals with a VV genotype while GSH and SOD were lower in these individuals. Functionally, the Val MnSOD variant reduces the MnSOD efficiency thus increasing the probability of development of endothelial dysfunction and contributing to the increase in the risk of cardiovascular events, especially when associated to hypercholesterolemia states. / Este estudo analisou a associação entre o polimorfismo genético da superóxido dismutase dependente de manganês (Ala16Val MnSOD) e biomarcadores oxidativos e inflamatórios em sujeitos hipercolesterolêmicos e controles. Os níveis de colesterol no grupo controle foram de 104 a 178 mg/dL (2.69 4.61 mmol/L) e hipercolesterolêmicos foram de 250 a 529 mg/dL (6.47 13.70 mmol/L). Os biomarcadores estudados foram: colesterol-LDL oxidado (ox-LDL), anticorpos anti- LDL oxidado (Anti-ox-LDL), proteína C reativa ultra-sensível (PCR-us), TBARS, proteína carbonil, grupos tióis, glutationa (GSH), vitamina C e E, bem como enzimas antioxidantes [superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT)]. Adicionalmente foram avaliados os níveis da albumina modificada na isquemia (IMA), bem como o perfil lipídico. Os resultados mostraram uma associação significante entre hipercolesterolemia e altos níveis de ox-LDL, Anti-ox-LDL, IMA e PCR-us. Esses resultados mostraram uma correlação positiva entre IMA e Anti-ox-LDL, e uma correlação negativa entre HDL e PCR-us associado a hpercolesterolemia. A influência do polimorfismo Ala16Val nos biomarcadores oxidativos e inflamatórios mostrou que os níveis de HDL foram mais baixos em hipercolesterolêmicos com o alelo V (VV + AV). A presente investigação destacou uma correlação positiva entre níveis de colesterol total, TBARS, proteína carbonil e grupos tióis. Nos sujeitos hipercolesterolêmicos ocorreu uma redução dos níveis de GSH e da atividade da SOD, provavelmente devido à inativação da enzima causada pela oxidação da proteína. A atividade da CAT foi aumentada provavelmente para compensar parcialmente o estresse oxidativo. Um aumento nos níveis sorológicos da Vitamina E também foi observado em sujeitos hipercolesterolêmicos. Baseado nos resultados encontrados, sugere-se uma correlação significante entre hipercolesterolemia e biomarcadores inflamatórios e de estresse oxidativo. Estudos prévios tem demonstrado a interação entre o genótipo VV e biomarcadores oxidativos como oxi-LDL. Contudo, a redução nos níveis de HDL é relevante em hipercolesterolêmicos VV quando comparados com outros grupos. Funcionalmente, a variante Val MnSOD reduz a eficiência MnSOD aumentando a probabilidade de disfunção endotelial e quando associado a hipercolesterolemia pode contribuir para aumentar o risco de eventos cardiovasculares.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Glutaric acidemia type I (GA-I) is an inborn error of metabolism (EIM) biochemically characterized by the main accumulation of glutaric acid (GA) and 3- hydroxyglutaric acid (3-OH-GA), and pathologically by a characteristic striatal degeneration. Due the absence of effective therapeutic strategies for this acidemia, several studies have investigated new therapies, since that one in three children subject to current treatments show striatal degeneration. In this context, the present work aimed in the first part, to investigate the effects of acute treatment with creatine (Cr), an endogenous compound guanidine which has shown neuroprotective effects in a variety of experimental models of neurodegenerative diseases and also in organic acidemias, on the GA-induced behavioral and neurochemical changes in vivo. Our results demonstrated that acute administration of Cr prevented the GA-induced behavioral and electrographic seizures, the carbonyl protein content increased and the Na+,K+-ATPase enzyme activity reduction in rats. Moreover, the Cr also protected the GA-induced sinaptossomal L-[3H]glutamate uptake reduction in vitro. As was observed in this first part, that the GA in a low concentration (10 nM) was able to reduce the L-[3H]glutamate uptake in striatal sinaptossomas of rats, and since that responsible mechanisms for striatal degeneration observed in patients are still poorly understood, we decided to evaluate in a second step, a primary action mechanism for the neurotoxic effects this low concentration of GA, which possibly may be present at the beginning of GA-I. We find that the GA reduced the L-[3H]glutamate uptake and increased the reactive species (ER) formation in sinaptossomas the striatum of rats in all times tested. Furthermore, we observed for the first time that the GA reduced the efficacy (VMax), but not the affinity (KD) of L-[3H]glutamate uptake in striatal sinaptossomas, suggesting a non-competitive inhibition. The addition of both the L-trans-pyrrolidine-2,4-dicarboxylate (PDC), a glutamate transporters inhibitor, with the GA did not alter the inhibitory effect on the of L-[3H]glutamate uptake induced by organic acid, indicating the involvement of glutamate transporters in the GA-induced uptake reduction. Since the glutamate transporters activity can be inhibited by oxidation, we show that although the antioxidant trolox protects against GA-induced ER formation increase, it did not protect against GA-induced glutamate uptake reduction in the synaptosomes of cerebral structure studied, suggesting that ER formation may be a late event in the neurotoxicity observed in GA-I. Moreover, we can not exclude the possibility that the GA may also directly stimulate the glutamate receptors, since the GA-induced ER formation was reduced by the non-NMDA glutamate receptor antagonist, the CNQX, but not by MK-801, suggesting that these receptors contributed, at least partly, to the GA-induced oxidative stress. Also determined GA, in this low concentration, did not show oxidant activity per se. Therefore, from results in this study it was observed the protective effect of Cr administration in the deleterious actions caused by the GA. Furthermore, we show for the first time that a GA low concentration cause primary excitotoxicity, and oxidative stress in brain structure predominantly affected in this disease. Therefore, we believe that this work may help explain the genesis of GA-I, as well as the development of effective adjuvant therapeutic strategies in the treatment this acidemia. / A acidemia glutárica tipo I (GA-I) é um erro inato do metabolismo (EIM) caracterizada bioquimicamente pelo acúmulo principal de ácido glutárico (GA) e ácido 3-hidroxiglutárico (3-OH-GA), e patologicamente por uma característica degeneração estriatal. Devido à escassez de medidas terapêuticas efetivas para essa acidemia, vários estudos têm investigado novas terapias, já que uma em cada três crianças submetidas aos atuais tratamentos sofre degeneração estriatal. Nesse contexto, o presente trabalho teve por objetivo em sua primeira parte, investigar os efeitos do tratamento agudo com creatina (Cr), um composto guanidínico endógeno que tem mostrado efeitos neuroprotetores em uma variedade de modelos experimentais de doenças neurodegenerativas e também em acidemias orgânicas, sobre as alterações comportamentais e neuroquímicas induzidas pelo GA in vivo. Nossos resultados demonstraram que a administração aguda de Cr preveniu as convulsões comportamentais e eletrográficas, o aumento do conteúdo de proteína carbonil e a redução da atividade da enzima Na+,K+-ATPase induzidos pelo GA em ratos. Além disso, a Cr também protegeu da redução da captação de L-[3H]glutamato sinaptossomal induzida pelo GA in vitro. Como foi observado nesta primeira parte, que o GA em uma baixa concentração (10 nM) foi capaz de reduzir a captação de L-[3H]glutamato em sinaptossomas estriatais de ratos, e desde que os mecanismos responsáveis pela degeneração estriatal observada nos pacientes glutaricoacidêmicos ainda não estão bem esclarecidos, decidimos avaliar em uma segunda etapa, um provável mecanismo de ação primário para os efeitos neurotóxicos desta baixa concentração de GA, que possivelmente pode estar presente no início da GA-I. Verificamos que o GA reduziu a captação de L-[3H]glutamato e aumentou a formação de espécies reativas (ER) em sinaptossomas de estriado de ratos em todos os tempos testados. Além disso, observamos pela primeira vez que o GA reduziu a eficácia (VMax), mas não a afinidade (KD) da captação de L-[3H]glutamato em sinaptossomas estriatais, sugerindo uma inibição do tipo não competitiva. A adição simultânea do L-trans-pirrolidina-2,4-dicarboxilato (PDC), um inibidor dos transportadores de glutamato, com o GA não alterou o efeito inibitório sobre a captação de L-[3H]glutamato induzido pelo ácido orgânico, indicando a participação dos transportadores de glutamato na redução da captação desse neurotransmissor induzida pelo GA. Desde que a atividade dos transportadores de glutamato pode ser inibida por oxidação, evidenciamos que embora o antioxidante trolox proteja do aumento da formação de ER induzidas pelo GA, ele não protege da redução da captação de L-[3H]glutamato induzida por este ácido orgânico em sinaptossomas de estriado. Estes achados sugerem que a formação de ER pode ser um evento tardio na neurotoxicidade observada na GA-I. Além disso, não podemos excluir a possibilidade de que o GA também possa estimular diretamente os receptores de glutamato, desde que a formação de ER induzidas pelo GA foi atenuada pelo antagonista de receptor de glutamato não-NMDA, o CNQX, mas não pelo MK-801 e o GA, nessa baixa concentração, não apresentou atividade oxidante per se. Portanto, os resultados apresentados no presente estudo demonstram que a administração previa de creatina protege das ações deletérias ocasionadas pelo GA. Além disso, evidenciamos, pela primeira vez, que uma baixa concentração de GA causa ações excitotóxicas primárias, bem como, estresse oxidativo na estrutura cerebral predominantemente afetada nesta doença. Assim, acreditamos que este trabalho possa auxiliar na elucidação da gênese da GA-I, bem como no desenvolvimento de estratégias terapêuticas adjuvantes eficazes no tratamento desta acidemia.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The objective of this work was to evaluate the antioxidant activity of (E)-1-(1-(methylthio)-1-selenopheny) hept-1-en-2-yl) pyrrolidin-2-one: an organoselenium compound with low toxicity (compound 1). A number of parameters were examined in brain, liver and plasma of rats and mice as indicators of toxicity, including reactive species to the thiobarbituric acid levels, ascorbic acid content, δ-aminolevulinate dehydratase and catalase activity, AST, ALT, urea and creatinine levels. Ours experiments demonstrated that in vitro, compound 1 showed a concentration-dependent reduction in TBARS production and in the generation of reactive species (RS) caused by Fe2+/malonate when was tested by DCFH-DA oxidation. The LD50 for compound 1 was calculated administering by oral route and the results demonstrated higher than 500 mg/kg. We also examined the toxicity of the compound 1 in ex vivo experiments and the results demonstrated that it did not change hepatic δ-aminolevulinate dehydratase activity at 100 and 250 mg/kg only showed an inhibition at the highest dose (500mg/kg) of compound 1 but in this same dosage no significant differences were detected in brain of mice. Hepatic lipid peroxidation in treated mice did not differ from control values otherwise, in brain tissue, all doses showed a significant reduction in TBARS levels. One of the biochemicals parameters measured were urea and creatinine levels in plasma of treated mice treated. The urea levels showed a decrease at highest dose and creatinine to increase at middle and high doses. Ascorbic acid content, that is an endogenous antioxidant, was increased only at the highest dose of compound 1. Catalase activity in brain of exposed mice had a tendency to decrease and showed a significant result only at 100mg/kg. In contrast with this, in hepatic tissue, the catalase activity showed a significant increased in all doses. We concluded that this is a promising compound with greater antioxidant activity and low toxicity but are necessary many detailed pharmacological studies involving this type of organoselenium compounds. / O objetivo desse trabalho foi avaliar a atividade antioxidante do E-1,1-metiltioselenofenil-2-pirrolidinona-hepteno (composto 1); um composto orgânico de selênio que apresenta baixa toxicidade. Um grande número de parâmetros foram avaliados em cérebro, fígado e plasma de ratos e camundongos e foram usados como indicadores de toxicidade: níveis de TBARS e ácido ascórbico, atividade da δ-ALA-D e da catalase, e níveis de ALT, AST, uréia e creatinina. Nossos experimentos demonstraram que, in vitro, o composto 1 apresentou uma redução dependente da concentração na produção de TBARS e na geração de espécies reativas (RS) induzidos por Fe2+/malonato quando o teste utilizado foi o da oxidação da DCFH-DA. A dose letal (LD50) para o composto 1 foi calculada quando administrada pela via oral e os resultados demonstraram ser esta maior do que 500 mg/kg. Utilizando experimentos ex vivo medimos a toxicidade do composto 1 e os resultados demonstraram que esse composto não mudou a atividade da δ-ALA-D (delta-aminolevulinato desidratase) em 100 e 250 mg/kg e que somente apresentou uma inibição da atividade na maior dose (500mg/kg) entretanto, nessa mesma dose não houve nenhuma diferença significante na atividade da δ-ALA-D em cérebros de camundongos. A peroxidação lipídica em tecidos hepáticos de camundongos não foi alterada comparando-a com o grupo controle contudo, em tecido cerebral todas as doses testadas apresentaram uma redução significante nos níveis de TBARS. Os níveis de uréia diminuíram somente na maior dose, já os de creatinina aumentaram em doses média e alta. Também foram avaliados os níveis de ácido ascórbico e apresentaram aumentados somente na maior dose. No cérebro de camundongos, a atividade da catalase diminuiu significantemente em 100mg/kg. Em oposição a isso, no tecido hepático a atividade da catalase apresentou um aumento significante em todas as doses. Com esses resultados, nós concluímos que trata-se de um composto promissor que apresenta uma grande atividade antioxidante e uma baixa toxicidade, entretanto são necessários mais estudos farmacológicos detalhados.

The production of reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS) is a metabolic situation, observed in different physiological conditions. When their production is exacerbated, there is an efficient antioxidant system able to control and re-install the homeostasis. Oxidative stress results from an acute and chronic imbalance between the production of ROS and antioxidant capacities of living cells and organisms. In the present case, the release of bursts of ROS and RNS by individual macrophages RAW 264.7 was investigated, in real time, in absence and presence of quinones (alpha- and beta-lapachones) and ascorbic acid. A selective electrochemical detection of each ROS or RNS was conducted at platinized carbon fiber microelectrodes positioned at micrometric distances from single cells, always compared to controls. The results show that the presence of beta-lapachone with 0.1 to 100 µM, within one hour of incubation, leads to a decrease of RONS release by macrophages. Conversely, when the incubation time increases (4 hours and more), for concentrations of 1 µM of ortho-quinone, the quantity of the released species increases. Finally, the increasing of the concentration up to 10 µM with four hours of incubation and more is associated to cell death. The exact nature of the released electroactive species was characterized and the original flux could be reconstructed in terms of O2• and NO•. In the first hour, with 10 µM, the decrease of the oxidative burst concerns mainly the RNS species. The amount of ROS, quantified in terms of H2O2 was shown to be higher than in control. At concentration of 1 µM and after longer time incubation, i. e., 4 hours, the amount of ROS, quantified in terms of H2O2 and O2• and NO2- was shown to be higher than in control. It was observed which ONOO- was decreased in both situations. On the other hand, alpha-lapachone was unable to significantly increase ROS and RNS production in macrophage cells, even after 24 hours of incubation. The cytotoxic concentration observed for alpha-lapachone was ten times higher when compared with beta-lapachone. To overcome solubility and bioavailability problems with beta-lapachone, beta-cyclodextrin was used. UV/vis spectroscopy has been used to monitor the inclusion phenomena of beta-lapachone within the cavity of beta-cyclodextrin, together with studies concerning the competitive effects of ethanol concentration on this behavior. A value of 15 ± 5 M-1 was found for the association constant between beta-lapachone and beta-cyclodextrin in phosphate buffer. This clearly indicates that the equilibrium between the free and the complexed substrate is decreased in the presence of EtOH. Amperometry at platinized carbon fiber ultramicroelectrodes allowed quantitative and kinetic investigations of the overall effect of ascorbic acid on oxidative stress responses produced by single cells pertaining to two different cell lines derived from immune cells: macrophages RAW 264.7 and phagocytes PLB-985. These fine and minute amperometric measurements performed on single cells confirmed that in contradiction with its alleged universal anti-oxidant properties, ascorbic acid may affect positively or negatively the RNS content of oxidative bursts produced by each cell type, through affecting the primary production of NO• by the cells. So, vitamin C acts exclusively as an anti-oxidant (viz., reduced the primary NO• flux) onto PMA-treated PLB 985 cells, thus decreasing the quantity of RNS released by these granulocyte-type cells. Conversely, it gives rise to a prooxidant activity (viz., increased the primary NO• flux) onto RAW267.4 macrophage cells, increasing their production of RNS species. These studies demonstrate the advantage of electrochemical methods for analyzing in real-time and quantitatively the effect of pharmacologically active compounds in cells, in case of oxidative burst. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), de nitrogênio (ERN), entre outras espécies reativas, é parte integrante do metabolismo e é observada em diversas condições fisiológicas. Quando sua produção é exacerbada, o organismo dispõe de um eficiente sistema antioxidante que consegue controlar e restabelecer o equilíbrio. O estresse oxidativo resulta do desequilíbrio entre o sistema pró e antioxidante, com predomínio dos oxidantes. A liberação de ERO e ERN em macrófagos individuais da linhagem RAW 264.7 foi estudada em tempo real, em ausência e presença de quinonas (alfa- e beta-lapachonas) e de ácido ascórbico. A detecção eletroquímica seletiva de ERO e ERN, em conjunto e individualmente foi conduzida, utilizando-se microeletrodos de fibra de carbono platinizada, posicionados a distâncias micrométricas de uma célula, sempre em relação a controles. Os resultados do tratamento com beta-lapachona (0,1 a 100 µM), com 1 hora de incubação, mostram que ocorre a diminuição de ERON liberados pelos macrófagos. Contrariamente, quando o tempo de tratamento aumenta (4 e 6 horas) para a concentração de 1 µM, ocorre o aumento da quantidade de espécies reativas liberadas. Em concentração de 10 µM e com tempo de tratamento acima de 4 horas ocorre morte celular. A natureza exata das espécies eletroativas liberadas foi caracterizada e o fluxo original foi determinado em termo de O2• e NO•. No tratamento de 1 hora com 10 µM de beta-lapachona, houve diminuição do surto oxidativo relacionado principalmente às ERNs. A quantidade de ERO, em termos de H2O2 foi muito maior do que o controle. Em diferentes condições, com 1 µM com 4 horas de tratamento, a quantidade de ERO, em termos de H2O2, O2• e NO2-, foi maior que o controle. Nas duas condições, obteve-se a diminuição acentuada de ONOO-. Por outro lado, a incubação com alfa-lapachona não foi capaz de alterar significantemente a liberação de ERON pelos macrófagos, mesmo após 24 horas de tratamento. A concentração citotóxica observada para a alfa-lapachona foi dez vezes maior quando comparada com a beta-lapachona. Para contornar problemas relacionados à solubilidade e biodisponibilidade da beta-lapachona, fez-se uso da ciclodextrina. A espectroscopia no UV/Vis foi utilizada para monitorar o fenômeno de inclusão de beta-lapachona na cavidade da beta-ciclodextrina, com análise do efeito competitivo do etanol. O valor da constante de associação entre a beta-lapachona e a beta-ciclodextrina, em tampão fosfato, foi de 15 ± 5 M-1, mostrando que a presença de etanol afeta a formação do complexo. A amperometria utilizando ultramicroeletrodos de fibra de carbono platinizada permitiu investigar quantitativa e cineticamente o efeito total do ácido ascórbico no surto oxidativo produzido por células individuais pertencentes a duas diferentes linhagens derivadas de células imunes: macrófagos (RAW 264.7) e fagócitos PLB-985. Medidas amperométricas finas realizadas em células individuais confirmaram que o ácido ascórbico pode estimular ou atenuar o surto oxidativo produzido por cada linhagem celular, afetando a produção primária de NO• das células. Assim, a vitamina C reduz o fluxo primário de NO• nas células PLB-985 pré-tratadas com PMA, enquanto aumenta o fluxo primário de NO• em macrófagos RAW 264.7. Esses estudos demonstram a vantagem dos métodos eletroquímicos para analisar em tempo real e quantitativamente o efeito farmacológico de compostos ativos em células, no caso de surto oxidativo.

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A utilização de tomate cv. ‘Micro-Tom’ modificado quanto a expressão do gene que condifica a proteína MT-sHSP23.6 é uma excelente ferramenta de pesquisa para entender o seu papel como chaperona nos processos celulares em condições potencialmente estressantes. Isto posto, o presente estudo teve por objetivo investigar a resposta do sistema antioxidante enzimático e não enzimático em genótipos de tomate cv. ‘Micro-Tom’ com diferentes níveis de expressão de MT-sHSP23.6 submetidos ao déficit hídrico pré-colheita e hipóxia pós-colheita. Foram utilizados frutos de genótipos de tomate c.v ‘Micro-Tom’ tipo selvagem (WT) e com maior expressão do gene que codifica a proteína MT-sHSP23.6 (Sense). Para o experimento do primeiro capítulo, foram colhidos frutos no estádio breaker que foram submetidos às condições de normoxia (23 ºC, escuro) e hipóxia (fluxo de nitrogênio diário de 0,0098 MPa/10 minutos, 23 ºC, escuro) por 5 e 8 dias, respectivamente. Para o experimento do segundo capítulo, foram utilizados frutos no estádio breaker, oriundos plantas que foram submetidas a tratamentos sob irrigação normal e sob déficit hidrico (8 dias de suspensão). Após a colheita, os frutos foram submetidos a condição de hipóxia similar a do primeiro experimento. Em ambos os estudos foi avaliada a tonalidade de cor dos frutos (Hueº), bem como as enzimas do sistema antioxidante enzimático, espécies reativas de oxigênio, sistema antioxidante não-enzimático e a atividade antioxidante. No primeiro experimento, constatou-se que as enzimas antioxidantes apresentaram maior atividade no período de hipóxia para os frutos do genótipo Sense em comparação aos WT. Também apresentaram menor concentração de ânion superóxido, tanto sob condições de normoxia quanto hipóxia. Quanto aos antioxidantes não enzimáticos analisados, destaque para o maior acúmulo de compostos fenólicos no período pós-hipóxia e ácido L-ascórbico no período de hipóxia para o genótipo Sense. Durante o período de hipóxia, o genótipo Sense apresentou a maior atividade antioxidante. Já no segundo experimento, observou-se que o déficit hídrico promoveu um maior acúmulo de compostos do sistema antioxidante não enzimático, como os compostos fenólicos totais e ácido ascórbico. Também se observou que algumas vezes, em especial no período de hipóxia, a influência de uma maior expressão de MT-sHSP23.6 superou a do déficit hídrico. Os resultados obtidos nos dois experimentos demonstraram que uma maior expressão do gene que codifica a proteína MT-sHSP23.6 influencia positivamente o sistema antioxidante de frutos de tomate submetidos ao déficit hídrico pré-colheita e hipóxia pós-colheita, através do aumento da atividade de enzimas antioxidantes e 8 acúmulo de compostos antioxidantes, evidenciando que estas proteínas podem estar relacionadas aos mecanismos de tolêrancia das plantas à diferentes fatores abióticos de estresse. / Tomato (Solanum lycopersicum L.) is a horticultural crop of pivotal importance for human nutrition and research. Tomato fruits are extremely versatile, nutritious and rich in bioactive compounds. It is also an excellent plant model for studies involving ripening, especially cv. 'Micro-Tom', which features small size, short life cycle, and easy transformation. It is well known that sHSPs (small heat shock proteins) play an important role in tolerance to abiotic stresses which can lead to oxidative damage. Genetically transformed 'Micro-Tom' plants with different expression levels of MT-sHSP23.6 are an excellent research tool to understand its role as a chaperone in cellular processes under potentially stressful conditions. Therefore, the present study aimed to investigate the role of the MT-sHSP23.6 protein in the enzymatic and non-enzymatic antioxidant system of 'Micro-Tom' tomato fruits subjected to pre-harvest water deficit and post-harvest hypoxia. Fruits of 'Micro-Tom' tomato wild type (WT) and with higher expression of the gene coding for the protein MT-sHSP23.6 (Sense) genotypes were used. For the experiment of the first chapter, fruits were harvested at the breaker stage and subjected to normoxia (23 °C, dark) and hypoxia (daily nitrogen flow of 0.0098 Mpa/10 minutes, 23 °C, dark) storage for 5 and 8 days, respectively. For the experiment of the second chapter, fruits were used in the breaker stage, from plants that underwent treatments under normal irrigation and under water deficit (8 days of suspension). After harvest, the fruits were subjected to hypoxia conditions similar to those of the first experiment. In both studies the color tone of the fruits (Hue°) was evaluated, as well as the components of the enzymatic antioxidant system, reactive oxygen species, non-enzymatic antioxidant system and antioxidant activity. In the first experiment, it was found that the antioxidant enzymes presented higher activity in the period of hypoxia for the fruits of the Sense genotype in comparison to the WT. They also presented lower concentration of superoxide anion, both under normoxia and hypoxia storage. Regarding non-enzymatic antioxidants, the highest accumulation of phenolic compounds in the post-hypoxia period and L-ascorbic acid in the period of hypoxia for the Sense genotype was the most significant. During hypoxia period, the Sense genotype had the highest antioxidant activity. In the second experiment, it was observed that the water deficit promoted a greater accumulation of compounds of the non-enzymatic antioxidant system, such as total phenolic compounds and L-ascorbic acid. It has also been observed that sometimes, especially in the period of hypoxia, the influence of a higher expression of MT-sHSP23.6 surpassed that of the water deficit. The results obtained in the two experiments demonstrated that a higher expression of the gene coding for the MT-sHSP23.6 protein positively influences the antioxidant system of tomato fruits subjected to pre-harvest water deficit and post-harvest hypoxia, by increasing the activity of antioxidant enzymes and accumulation of antioxidant compounds, evidencing that these proteins may be related to the mechanisms of plant tolerance to different abiotic stress factors.

Espécies carbonílicas tripletes formadas quimicamente no escuro, por exemplo, durante a peroxidação de lipídios, têm reatividade química análoga à de radicais alcoxilas. Aventou-se que tais espécies possam estar implicadas na fisiopatologia de doenças degenerativas (\"estresse carbonílico\"). A pesquisa dos efeitos de espécies tripletes sobre algumas biomoléculas e consequentes respostas biológicas, propostas e pesquisadas no período 1970 - 1990 (hipótese de \"fotoquímica sem luz\" dos Profs. G. Cilento, IQUSP, e Emil H. White, Johns Hopkins University), encontrou empecilhos instrumentais e relativamente poucas propostas foram confirmadas. Com o uso de técnicas de alta resolução, tais como EPR, HPLC e MS, este trabalho teve como objetivo analisar intermediários e produtos de tais processos e estudar mecanismos de reação de acetona triplete, produzida quimicamente pela decomposição térmica de 3,3,4,4-tetrametildioxetano (TMD) ou, enzimaticamente, pela oxidação aeróbica de isobutanal (IBAL), catalisada por peroxidase de raiz forte (HRP), na presença de aminoácidos e proteínas. Este trabalho demonstra a formação de um radical acetila, presumidamente formado da clivagem α de acetona triplete, e um radical terciário centrado em carbono, formado pela abstração de hidrogênio do IBAL. Resultados de espectrometria de massas demonstraram a formação de três diferentes adutos entre o radical terciário de IBAL, com L-Trp. Aventou-se que um dos produtos era resultante de alteração no nitrogênio e os outros no carbono 3, ambos no anel indólico. Observou-se também a formação de produto correspondente ao radical hidroxipropionil com L-Trp. Também se observaram dois produtos de L-Trp típicos de sua oxidação por oxigênio singlete, a formilquinurenina, e um aduto de função álcool. A formação de base de Schiff entre o L-Trp estudado e o IBAL também é apresentada. A formação de oxigênio singlete foi evidenciada indiretamente via EPR utilizando o spin trap TEMP e através de um captador de adição-9,10 (tipo Diels-Alder) em derivado de antraceno. Foram realizados, também, experimentos com precursores de melanina e demonstrou-se a formação de espécies excitadas do ácido 5,6-dihidroxi-indol-2-carboxílico (DHICA) que poderiam explicar a formação de produtos de DNA tipicamente resultantes de reação fotoquímica, mas na ausência de luz. Tais resultados corroboram a reação de espécies tripletes com biomoléculas, possibilitando a compreensão de número significativo de eventos biológicos conhecidos, mas teoricamente \"proibidos\" de ocorrer no estado fundamental, em tecidos não expostos à luz / Electronically excited triplet carbonyl species formed as products of some biochemical reactions, such as lipid peroxidation, behave similarly as alcoxyl radicals. It has long been hypothesized that such excited species could have a role in some diseases (\"carbonyl stress\"). Research of chemical lesions of triplet carbonyls over biomolecules and their biological response took place principally from 1970 to 1990 (the \"photochemistry without light\" hypothesis proposed by Profs. G. Cilento, IQUSP, and Emil H. White, Johns Hopkins University), but it suffered from the lack of required instrumentation, and just few cases of photo(bio)chemistry without light were confirmed. The aim of this work, using high resolution techniques (EPR, HPLC, and MS), is to analyze the reaction products of excited triplet acetone with aminoacid and protein targets. Triplet acetone was produced from the thermal decomposition of 3,3,4,4-tetramethyldioxetane (TMD) or from the aerobic oxidation of isobutanal (IBAL) catalyzed by horseradish peroxidase (HRP). We revealed the generation of acetyl radical, putatively originated from α-cleavage of triplet acetone, and a carbon-centered tertiary radical, proposed as an IBAL radical formed by hydrogen abstraction from IBAL. Mass spectrometry showed production of three adducts from the reaction of IBAL radical with L-Trp, one of them at the nitrogen 1 and the other two at carbon 3 from the amino acid indole ring. Two adducts with m/z correspondent to the reaction between L-Trp (at carbon 3) and a hydroxypropionyl radical, and two products typically formed from singlet oxygen (formylkynurenine and an alcohol L-Trp adduct) were also observed. A Schiff base between L-Trp and IBAL was also observed. Singlet oxygen production from triplet-triplet energy transfer from excited acetone to ground state molecular oxygen was indirectly showed by EPR spin trapping with TEMP, and by MS using the anthracene derivative EAS to trap (9,10-cycloaddition) of 18O2 (1Δg). Other data reported here include the demonstration of excited species formed when DHICA, a melanin precursor, was oxidized. These results might explain the generation of DNA photochemical products (thymine dimers) in the absence of light. Altogether, we collect strong and significant evidence in this thesis that corroborate the reactivity of triplet excited species with a couple of biomolecules, providing insights over some reportedly known molecular events that are theoretically forbidden to occur in the ground state but happen in tissues non-exposed to light