El presente trabajo de tesis se encuentra enmarcado dentro del proyecto multidisciplinario “Redes de intercambio marítimas y terrestres a larga distancia de vasijas de cerámica de prestigio en los Andes centrales durante el primer milenio antes de nuestra era: Un enfoque interdisciplinario”. El objetivo principal de esta tesis es determinar el alcance de la fluorescencia de rayos X portátil (pXRF) como técnica de análisis que permita discriminar entre grupos y su posible procedencia, de cerámicas encontradas en el sitio arqueológico de Puerto Nuevo. Para lograr lo anterior, se han estudiado 119 fragmentos de cerámica recogidos de la zona de excavación de Puerto Nuevo, además de 30 azulejos de control preparados a partir de material arcilloso recabado de diferentes zonas aledañas a la excavación. El análisis químico de estos grupos de piezas se realizó mediante pXRF con el fin de obtener la información composicional expresada como las áreas netas bajos los picos (NPA). A partir de esta información, mediante análisis de componentes principales y análisis de clúster, se construyeron los grupos composicionales. Se han encontrado 4 grupos composicionales y 2 casos extraños, los que, al ser comparados con el material arcilloso de control por medio de análisis discriminante, muestran que los fragmentos de cerámica podrían ser en su mayoría de origen local. Además, los grupos construidos mediante pXRF fueron contrastados con los grupos encontrados por medio de análisis petrográfico, y se observó una buena correlación entre los resultados de ambos enfoques. Finalmente, se ha determinado que la pXRF, empleada junto a un análisis estadístico adecuado, ha demostrado resultados lo suficientemente buenos como para constituir a la pXRF en una alternativa para estudios de este tipo. / Tesis

No description available.

En la present Tesi s’han abordat dos camps de gran actualitat en la Química Orgànica actual, l’organocatàlisi i la catàlisi promoguda per complexos d’Au(III). En ambdós blocs s’han orientat els esforços en la recerca de nous mètodes sintètics o en aprofundir en els ja existents a fi de millorar−los; sense perdre de vista en cap cas la seva aplicabilitat a casos sintètics reals. En el primer Bloc s’ha tractat de solucionar el problema de la lentitud de moltes de les transformacions organocatalíques. S’ha trobat com la oxazolidinona derivada de la condensació de la L−prolina amb el pivalaldehid (oxazolidinona de Seebach, d’ara endavant SolPro) permet dur a terme reaccions aldòliques entre cetones i aldehids en tan sols dues hores, millorant significativament molts dels temps de reacció descrits en la literatura. Els estudis per RMN de 1H van permetre de determinar que el procés clau era el bescanvi del pivalaldehid amb la cetona corresponent. També es van realitzar una sèrie de càlculs teòrics a fi d’esbrinar quin o quins podien ser els mecanismes implicats en aquests bescanvis. En el darrer capítol del Bloc 1 s’ha avaluat l’activitat catalítica de la SolPro en la reacció de Michael entre nitroalcans i cetones alfa,beta−insaturades, trobant−se que també l’accelera però no de manera tan espectacular com en el cas de l’aldòlica. En el segon Bloc s’han estudiat diverses transformacions que involucren, directa o indirectament, el grup nitro. En el capítol 2.2 s’han preparat diverses N−sulfenilimines quirals amb un procediment desenvolupat recentment en el nostre grup de recerca. En el capítol 2.3 s’ha posat a punt un mètode d’hidròlisi d’N−sulfenilimines realment suau i que evita la racemització dels estereocentres en alfa. Després d’haver provat diversos àcids de Lewis s’ha trobat que l’ús de quantitats catalítiques d’AuBr3 més l’addició de nitrit d’isoamil, permet d’obtenir cetones quirals a partir de la corresponent N−sulfenilimina. A més, és possible acoblar el mètode de formació d’N−sulfenilimines amb el d’hidròlisi d’aquestes, de manera que s’ha desenvolupat una reacció de Nef formal que transcorre en condicions molt suaus (pH pràcticament neutre) i sense racemització dels estereocentres en alfa. En el capítol 2.4 s’ha estudiat la transformació d’oximes a carbonils. De nou, l’AuBr3 s’ha mostrat com l’únic àcid de Lewis que permet la formació de cetones (o aldehids) a partir d’oximes. S’ha aconseguit que el procés sigui catalític si s’empra biacetil o isovaleraldehid com additius. Les condicions en les que té lloc la reacció són suaus (si bé el pH baixa lleugera o moderadament durant el decurs de la reacció). S’ha fet un estudi pioner per Espectrometria de Masses en Electroesprai en mode negatiu a fi de conèixer els detalls mecanístics, trobant−se que les espècies de tipus AuBrx(OH)y─ són les predominants i com la oxima s’hi coordina desplaçant Br─. El mètode s’ha aplicat a més d’una vintena de cetoximes i aldoximes obtenint−se resultats excel•lents. / This Thesis deals about Organocatalysis and gold−mediated catalysis, two fields that have experienced a rapid growth in recent years. In both sections, the efforts have been focused in the development of new synthetic methodologies or in gaining insight into existing procedures in order to improve them. In the first section, we attempted to solve the problem of the slow rate of some organocatalytic transformations. Several oxazolidinones were prepared and then were tested in aldol reactions between ketones and aldehydes. The most efficient was Seebach’s oxazolidinone (SolPro). With this catalyst aldol reaction take less than 2 hours. Exchanges between pìvalaldehyde and different ketones were proved by 1H-NMR studies which suggested that these exchanges are essential in the mechanism. Finally, in chapter 1.5, the scope of the catalytic activity of SolPro was evaluated in a Michael reaction between nitroalkanes and alpha, beta-unsaturated ketones. Transformations in which the nitro group is involved were studied in the second section. In chapter 2.2 several chiral N-sulphenylimines were prepared according a novel procedure developed in our group. In chapter 2.3 a novel method to hydrolyze N-sulphenylimines was developed, which works in very mild conditions (room temperature, almost neutral pH) and avoids the racemization of alpha stereocenters. After an exhaustive screening of several Lewis acids, only AuBr3 catalyzed the reaction at neutral pH and afforded the corresponding ketone without racemization of alpha-stereocenters. Finally, in chapter 2.4, the transformation of oximes into carbonyl compounds was studied. Again, only AuBr3 was able to perform the hydrolysis of oximes into ketones (or aldehydes) in mild conditions (although the pH decreased slightly or moderately during the reaction). A pioneering study by Mass Spectroscopy (Electrospray in negative mode) showed that oximes coordinate to species like AuBrx(OH)y─ and this coordination is crucial in order to obtain the carbonyl compound.

L’interès creixent de la població general per la “medicina natural”, juntament amb els efectes beneficiosos que s’han demostrat per al resveratrol, ha incrementat la presència en els mercats d’aliments funcionals o nutracèutics basats en la seva composició. Per a poder fer al•legacions nutricionals i de propietats saludables en aquests tipus de productes és necessari un suport científic que recolzi, amb la màxima evidència, els efectes que es pretenen declarar, tenint en compte els paràmetres relacionats amb la biodisponibilitat i l’efecte de la matriu de l’aliment. La biodisponibilitat del resveratrol és baixa, donat el seu elevat metabolisme, de manera que els seus efectes beneficiosos es troben, actualment, en una certa controvèrsia. Les futures investigacions s’estan enfocant cap a la possible activitat dels metabòlits del resveratrol. Abans, però, es requereix informació més concreta sobre la biodisponibilitat del resveratrol i, sobretot, del seu metabolisme després del consum de quantitats moderades d'aliments que el continguin, per tal de conèixer les concentracions dels diferents metabòlits que es poden assolir en l’organisme. Per a dur a terme aquest tipus d’estudis es requereixen tècniques analítiques d’elevada sensibilitat i selectivitat que permetin una clara identificació del perfil metabòlic del resveratrol en mostres biològiques. L’objectiu principal d’aquesta Tesi Doctoral és conèixer el perfil metabòlic del resveratrol quan és administrat en dosis dietètiques en humans i la influència de la matriu de l’aliment en la seva biodisponibilitat, així com desenvolupar la metodologia adient per cromatografia líquida acoblada a espectrometria de masses (UPLC-MS/MS). Per a assolir aquest objectiu i gràcies a la disponibilitat d’estàndards purs dels metabòlits pròpiament, ja sigui per la seva recent disponibilitat comercial o expressament sintetitzats, s’ha desenvolupat una metodologia òptima per a l’anàlisi del perfil metabòlic del resveratrol, que ha estat validada segons els criteris establerts per la FDA. Amb aquesta metodologia, s’ha definit el perfil metabòlic del resveratrol més complet de tota la literatura actual, constituït per 21 compostos que engloben als metabòlits de fase II del resveratrol i el piceid i els derivats de l’acció microbiana, proposant les estructures químiques d’aquells dels quals no es disposa estàndard. La quantificació d’aquest perfil, excretat 4 hores després de la ingesta d’una beguda funcional a base d’extracte de raïm, ha demostrat diferències interindividuals significatives. El coneixement de la biodisponibilitat i el metabolisme del resveratrol al llarg del temps s’ha dut a terme amb un estudi farmacocinètic, en el qual s’ha demostrat que, després d’un consum moderat de vi negre i d’un nutracèutic a base d’extracte de raïm, el piceid pot ser absorbit ràpidament en la seva forma intacte, però assolint baixes concentracions; mentre que la formació de metabòlits de resveratrol requereix un temps major, que encara s’allarga més per als d’origen microbià. L’excreció més lenta dels sulfats de resveratrol ha aportat més evidència a la possible saturació de les vies de glucuronidació del resveratrol. Pel que fa a l’efecte de la matriu alimentària, s’ha demostrat que l’alcohol no afecta al metabolisme del resveratrol, estudiant-ne el perfil metabòlic excretat. A més a més, l’excreció urinària global del perfil metabòlic del resveratrol no s’ha vist afectada per la matriu que constitueixen uns comprimits a base d’extracte de raïm, com a producte nutracèutic, en comparació amb la del vi negre; tot i que la dissolució del comprimit implica una absorció retardada dels compostos d’aquest, que fa augmentar la quantitat de metabòlits microbians excretats. / The beneficial effects reported for resveratrol have aroused interest in its consumption, and thus a lot of functional foods or nutraceuticals based on their composition have been developed. Before making nutritional and health claims about these products, more information is required on the resveratrol bioavailability and metabolism after moderate doses consumed and with a special regard on the effect of the food matrix. In such studies, high sensitivity analytical techniques are necessary to allow clear identification of the metabolic profile of resveratrol in biological samples. The aim of this thesis is to determine the metabolic profile of resveratrol when administered at dietary doses in humans and the influence of the food matrix on its bioavailability, as well as to develop a suitable methodology by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (UPLC-MS/MS). With the pure metabolite standards now available, an optimized methodology was developed and validated for analysis of the resveratrol metabolic profile. This method defined the widest profile until now available, consisting of 21 compounds which include resveratrol and piceid phase II metabolites and those derived from microbiota, for whose chemical structures were suggested. The quantification of this profile, excreted 4 hours after ingestion of a grape extract functional beverage, demonstrated significant interindividual differences. The behaviour of resveratrol metabolism after the post-ingestion of natural products was studied in a pharmacokinetic study, which showed that, after a moderate consumption of red wine and a grape extract nutraceutical, piceid can be quickly absorbed in its intact form, but achieving low concentrations. Metabolites’ formation required more time and even though for the microbial ones. The slow excretion of resveratrol sulfates provided more evidence to the possible saturation of the glucuronidation pathway. Regarding the food matrix effect, it was demonstrated that alcohol does not affect resveratrol metabolism. In addition, overall urinary excretion of the resveratrol metabolic profile was not affected by the tablet matrix of the grape extract nutraceutical, compared to red wine. However, dissolution of the tablet delayed absorption of their compounds, which increases the amount of microbial metabolites excreted.

En diferentes partes del país existe una gran cantidad de objetos de nuestro patrimonio cultural, pertenecientes a la época colonial. Especialmente las iglesias cuentan con una amplia diversidad de ellos, entre los que destacan las pinturas, pero que por causas naturales y humanas se van deteriorando. Para recuperar su estado inicial se necesita realizar labores de restauración y conservación. El conocimiento de los materiales utilizados en las pinturas a restaurar (y posteriormente a conservar) puede ser de gran ayuda para el trabajo de los profesionales que realizan estas tareas. Además, la información obtenida es de importancia para complementar la documentación histórica de estas obras y para su puesta en valor. Ante ello surge como propuesta la aplicación del análisis químico como una herramienta para obtener la información mencionada. El presente estudio aborda el análisis de las obras “Asedio en Pamplona” y “San Ignacio recibe al Duque de Gandía”, pertenecientes a la Compañía de Jesús, Comunidad de San Pedro de Lima. El objetivo principal es conocer la conformación pictórica de las obras, los materiales y las técnicas utilizadas por el artista, todo ello mediante el uso de técnicas no invasivas y microdestructivas. El proceso de investigación consta de tres etapas, que comprenden la examinación visual de las obras, la toma y preparación de muestras y el análisis mediante el uso de diversas técnicas: fluorescencia de rayos X, microscopía óptica, microespectroscopía Raman, microscopía electrónica de barrido, cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas y reflectografía infrarroja. En base a los resultados se determina que las dos pinturas contienen materiales que fueron utilizados típicamente en pintura colonial. Además, cuentan con muchas similitudes en cuanto a los materiales utilizados (pigmentos, aglutinantes, barnices), como también en la técnica (esbozos, forma de mezclar los pigmentos, presencia de capas múltiples, el formato de las obras, por ejemplo) y por ello existe la posibilidad de que ambas pertenezcan al mismo autor. / Tesis

La degradación de los aceites lubricantes en MCIA ha sido durante los últimos años un tema de gran interés desde diferentes perspectivas, tanto desde el punto de vista del desarrollo de motores, formulaciones de los propios aceites, procedimientos de medida estandarizados, etc. y más aún cuando se han evidenciado diferencias significativas en los procesos degradativos atendiendo a las diferentes configuraciones: motores diesel frente a GNC, lo que ha suscitado el interés en desarrollar este trabajo de investigación. Dentro del campo del análisis de aceites, una de las herramientas mas antiguas y fundamentales para la aplicación del llamado Mantenimiento Predictivo en motores de combustión interna alternativos (MCIA), la técnica de espectrometría infrarroja por transformada rápida de Fourier (FT-IR), es la principal y más comúnmente utilizada técnica, para cuantificar de manera directa la degradación del aceite, a través de la medida de los niveles de oxidación y nitración. A pesar de que esta técnica analítica ha sido utilizada durante muchos años para el análisis de la oxidación en los rangos del infrarrojo medio, no existe una metodología estandarizada para este tipo concreto de aplicaciones (MCIA) y sólo desde hace unos años se dispone de un estándar internacionalmente reconocido (ASTM D 7214-07) para la cuantificación de los niveles de oxidación en aceites usados de transmisiones. Esta tesis consta de cuatro partes, a saber: Durante la primera parte de la tesis se hace un estudio de los aspectos fundamentales de la degradación en aceites lubricantes de MCIA como son sus causas, efectos y mecanismos de reacción entre otros aspectos. La segunda parte se centrará en las características y fundamentos de las principales técnicas analíticas dentro del campo de análisis de aceite para el estudio de la degradación en lubricantes de MCIA, como son la FT-IR, la voltamperometría lineal de barrido y la potenciometría, utilizadas para la medida aspectos intrínsecos de la / Gómez Estrada, YA. (2013). Contribución al desarrollo y mejora para la cuantificación de la degradación en aceites lubricantes usados de MCIA a través de la técnica de espectrometría infrarroja por transformada de Fourier (FT-IR) [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/19244

Tesis por compendio / [EN] A series of biochemical reactions responsible for aroma, color, texture and flavour of the final product occur during the dry-cured ham processing. Among these reactions, proteolysis of muscle proteins is one of the most important, resulting in the generation of a large amount of peptides which could be used as quality markers of dry-cured ham. In this sense, proteomic techniques based on mass spectrometry have become a fundamental tool for the identification of peptides naturally generated throughout the dry-cured ham processing. So, the present Thesis has been focused on the study of the intense degradation of three proteins present in dry-cured ham: LIM domain-binding protein 3, ubiquitin-60S ribosomal protein and titin protein, identifying the peptide sequences generated at different times along the process and evaluating their potential as markers of dry-cured ham processing time. Moreover, peptide oxidation that occurs during dry-curing process has been studied due to its importance on final quality of dry-cured ham as well as its influence on the nutrititional and sensory characteristics, showing oxidation of methionine residues in numerous peptides generated from the degradation of the major myofibrillar proteins. Besides the identification of peptidic sequences, recent advances in mass spectrometry techniques have allowed the precise quantitation of proteins in complex mixtures. So, a label-free methodology has been optimized for the relative quantitation of major sarcoplasmic proteins from the quantitation of the generated peptides and the study of the proteolytic degradation along the dry-cured ham processing. This methodology represents an advance regarding quantitative methods used to date as it allows a simple, accurate and reliable evaluation of changes in the abundance of proteins throughout the dry-cured ham processing. Several recent studies have been focused on the study of the potential of dry-cured ham as a source of bioactive peptides, mainly those showing angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory activity. However, it is not clear whether these peptides are able to cross the intestinal barrier and reach the blood stream in an active form. Thus, in the present Thesis the transepithelial transport of dry-cured ham peptides having ACE inhibitory activity has been simulated through a Caco-2 cell monolayer, showing the absorption of intact peptides or fragments generated by the action of intestinal peptidases, which could exert an in vivo antihypertensive effect. / [ES] Durante el proceso de elaboración del jamón curado tienen lugar una serie de reacciones bioquímicas responsables del aroma, color, textura y sabor del producto final. Entre estas reacciones destaca la intensa proteolisis de las proteínas musculares, cuyo resultado es la generación de una gran cantidad de péptidos algunos de los cuales podrían ser utilizados como marcadores de calidad del jamón. En este sentido, las técnicas proteómicas basadas en espectrometría de masas son una herramienta fundamental para la identificación de los péptidos generados de manera natural a lo largo de proceso de elaboración del jamón curado. Así, la presente Tesis Doctoral se ha centrado en estudiar la intensa degradación de tres proteínas presentes en el jamón: la proteína 3 de unión al dominio LIM, la proteína ribosomal ubiquitina-60S y la proteína titina, identificando las secuencias de los péptidos generados a distintos tiempos durante el proceso y evaluando su potencial como marcadores del tiempo de curado del jamón. Además, se han estudiado los cambios oxidativos a nivel peptídico que tienen lugar durante el proceso de curado del jamón, cuya importancia radica en su efecto sobre la calidad y las características tanto nutricionales como sensoriales del producto final, evidenciando la oxidación del aminoácido metionina en numerosos péptidos generados a partir de las principales proteínas miofibrilares. Además de la identificación de las secuencias peptídicas, los recientes avances en técnicas de espectrometría de masas han permitido la cuantificación precisa de proteínas en muestras complejas. Así, se ha optimizado un método sin marcaje ("label-free") para la cuantificación relativa de las principales proteínas sarcoplásmicas a partir de la cuantificación de los péptidos generados y de esta forma estudiar la degradación proteolítica durante el proceso de elaboración del jamón curado. Esta metodología supone un avance respecto a los métodos cuantitativos utilizados hasta el momento ya que permite evaluar de manera sencilla, precisa y fiable los cambios en la abundancia de proteínas a lo largo del proceso de elaboración del jamón curado. Varios estudios recientes se han centrado en estudiar el potencial del jamón curado como fuente de péptidos bioactivos, principalmente aquellos que son inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina I (ECA). Sin embargo, no se conoce si estos péptidos son capaces de atravesar la barrera intestinal y alcanzar la corriente sanguínea en forma activa. Por ello, en la presente Tesis Doctoral se ha simulado el transporte intestinal mediante la utilización de células Caco-2 de péptidos del jamón inhibidores de la ECA, evidenciado la absorción de péptidos enteros, o fragmentos de los mismos generados por acción de las peptidasas intestinales, que podrían ejercer un efecto antihipertensivo in vivo. / [CA] Al llarg del procés d'elaboració del pernil curat tenen lloc una sèrie de reaccions bioquímiques responsables de l'aroma, color, textura i sabor del producte final. Entre aquestes reaccions destaca la intensa proteolisis de les proteïnes musculars, el resultat de la qual és la generació d'una gran quantitat de pèptids alguns dels quals podrien ser utilitzats com a marcadors de qualitat del pernil. En aquest sentit, les tècniques proteòmiques basades en espectrometria de masses són una ferramenta fonamental per a la identificació dels pèptids generats de manera natural al llarg de procés d'elaboració del pernil curat. Així, la present Tesi Doctoral s'ha centrat a estudiar la intensa degradació de tres proteïnes presents en el pernil: la proteïna 3 d'unió al domini LIM, la proteïna ribosomal ubiquitina-60S i la proteïna titina, identificant les seqüències dels pèptids generats a distints temps al llarg del procés i avaluant el seu potencial com a marcadors del temps de curat del pernil. A més, s'han estudiat els canvis oxidatius a nivell peptídic que tenen lloc durant el procés de curat del pernil, la importància dels quals radica en el seu efecte sobre la qualitat i les característiques tant nutricionals com sensorials del producte final, evidenciant l'oxidació de l'aminoàcid metionina en nombrosos pèptids generats a partir de les principals proteïnes miofibrilars. A més de la identificació de les seqüències peptídiques, els recents avanços en tècniques d'espectrometria de masses han permés la quantificació precisa de proteïnes en mostres complexes. Així, s'ha optimitzat un mètode sense marcatge ("label-free") per a la quantificació relativa de les principals proteïnes sarcoplàsmiques a partir de la quantificació dels pèptids generats i d'esta manera estudiar la degradació proteolítica durant el procés d'elaboració del pernil curat. Esta metodologia suposa un avanç respecte als mètodes quantitatius utilitzats fins al moment ja que permet avaluar de manera senzilla, precisa i fiable els canvis en l'abundància de proteïnes al llarg del procés d'elaboració del pernil curat. Diversos estudis recents s'han centrat en estudiar el potencial del pernil curat com a font de pèptids bioactius, principalment aquells que són inhibidors de l'enzim convertidor d'angiotensina I (ECA). No obstant això, no es coneix si aquests pèptids són capaços de travessar la barrera intestinal i arrivar al corrent sanguini en forma activa. Per això, en la present Tesi Doctoral s'ha simulat el transport intestinal mitjançant l'utilització de cèl·lules Caco-2 amb pèptids del pernil inhibidors de l'ECA, evidenciant l'absorció de pèptids sencers, o fragments generats per acció de les peptidases intestinals, que podrien exercir un efecte antihipertensiu in vivo. / Gallego Ibáñez, M. (2015). PÉPTIDOS GENERADOS EN JAMÓN CURADO COMO MARCADORES DE CALIDAD [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/55506 / Premios Extraordinarios de tesis doctorales / Compendio

[ES] Debido a la naturaleza (poli)iónica de los conjugados polipéptido-fármaco (PDC), su traslado a clínica puede ser una tarea complicada y costosa, que requiere técnicas de polimerización reproducibles y escalables, la implementación de herramientas analíticas sofisticadas, pasos de caracterización exhaustivos y la recopilación de datos detallados de seguridad y eficacia. Algunas técnicas clásicas implementadas en el control de calidad de los PDC no se pueden utilizar para el análisis cualitativo y cuantitativo de productos de degradación y metabolitos. Como alternativa, la espectrometría de masas (MS) y el análisis de fraccionamiento de flujo de campo de flujo asimétrico (AF4) se han posicionado de forma relevante en dicha caracterización de polipéptidos y PDC. Mediante el uso de métodos de LC-MS, se puede realizar el análisis tanto de fármacos como de productos o metabolitos de degradación. Además, dado que la separación en AF4 no se basa en la interacción del analito con la columna, como ocurre en SEC, sino aplicando el flujo cruzado en un canal vacío; en AF4 es posible una separación de moléculas "a medida" según su tamaño y peso molecular dando lugar a la mejora selectiva de la separación. Teniendo en cuenta lo descrito anteriormente con respecto al diseño de PDC y su caracterización, la investigación incluida en esta tesis se centra en el desarrollo de nuevos procedimientos analíticos que ayuden a la selección de candidatos PDC con las características adecuadas que les permitirán avanzar a su evaluación preclínica. Implementaremos una herramienta de inteligencia artificial, diseño de experimentos, para desarrollar métodos analíticos adecuados y determinar las condiciones óptimas en la síntesis de nanoconjugados polipeptídicos. Además, exploraremos técnicas relativamente nuevas, como AF4 para desarrollar nuevos nanoconjugados polipeptídicos simples y de combinación y además, generaremos imágenes de espectrometría de masas, para entender su comportamiento en modelos preclínicos relevantes, lo que nos permitirá identificar terapias eficaces para una gran variedad de patologías (tumores sólidos avanzados incluyendo cáncer de mama triple negativo, cáncer de próstata y cáncer de páncreas, así como, lesión medular). / [CAT] A causa de la naturalesa (poli)iònica i, de vegades, proteica dels conjugats polipèptid-fàrmac (PDC), el seu trasllat a clínica pot ser una tasca complicada i costosa, que requereix tècniques de polimerització reproduïbles i escalables, la implementació d'eines analítiques sofisticades, passos de caracterització exhaustius i la recopilació de dades detallades de seguretat i eficàcia. Algunes tècniques clàssiques implementades en el control de qualitat dels PDC no es poden utilitzar per l'anàlisi qualitativa i quantitativa de productes de degradació i metabòlits. Com a alternativa, l'espectrometria de masses (MS) i l'anàlisi del fraccionament de flux de camp de flux asimètric (AF4) han trobat el seu camí en la caracterització de PDC. Mitjançant l'ús de mètodes LC-MS, es pot realitzar l'anàlisi tant de fàrmacs com de productes/metabòlits de degradació. A més, atès que la separació en AF4 no es basa en la interacció de l'analit amb la columna com en SEC sinó aplicant el flux creuat en un canal buit, una separació de molècules "a mesura" segons la seua grandària i pes molecular i la millora selectiva de la separació és possible en l'instrument AF4. Tenint en compte tot el descrit anteriorment respecte al disseny de PDC i la seua caracterització, la investigació inclosa en aquest projecte es centra en el desenvolupament de nous procediments analítics que ajuden a la selecció de candidats PDC per als seu estudi preclínic posterior. Implementarem una eina d'intel·ligència artificial, disseny d'experiments, per a desenvolupar mètodes analítics i la síntesi de nanoconjugats basats en polipèptids de manera adequada. A més, explorarem tècniques relativament noves, com AF4, i generarem imatges d'espectrometria de masses, per a desenvolupar nous conjugats a la recerca de teràpies eficaces per a tractar una varietat de malalties (càncer de mama triple negatiu, càncer de pròstata, càncer de pàncrees, així com en la lesió de medul·la espinal). / [EN] Due to the (poly)ionic and proteinic nature of polypeptide-drug conjugates (PDCs), their translation "from bench to bedside" represents a complex and expensive undertaking, requiring reproducible and scalable polymerization techniques, the implementation of sophisticated analytical tools, exhaustive characterization steps, and the collection of detailed safety and efficacy data. Classical techniques, such as liquid chromatography (LC) - UV/Vis and size exclusion chromatography (SEC) implemented in the quality control of PDCs during and after synthesis, cannot always support a qualitative and quantitative analysis of degradation products and metabolites. As an alternative, mass spectrometry (MS) and asymmetric flow field flow fractionation (AF4) have grown in influence on polypeptide and PDC characterization. The analysis of drug and degradation products/metabolites can take advantage of LC when coupled to MS. Meanwhile, AF4-mediated separation does not suffer from problems related to the interaction of the analyte with the column like in SEC; instead, AF4 applies a cross flow in an empty channel, which supports the "tailor-made" separation of molecules according to size and molecular weight. The research included in this Ph.D. thesis focuses on developing new analytical procedures that will aid the selection of PDC candidates for further preclinical studies. We implemented an artificial intelligence tool (design of experiments) to develop analytical methods and optimize the synthesis of genipin-crosslinked PDCs. Moreover, we explored relatively new techniques, such as AF4 and mass spectrometry imaging, in developing novel single and combination PDCs and studying their biological fate in the search for efficient therapies for a range of diseases (advanced solid tumors, including triple negative breast, prostate, and pancreatic cancer, as well as spinal cord injury). / Dordevic, S. (2023). Development of Analytical Procedures for the Characterization of Polypeptide-Based Nanoconjugates [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/194554

In the present thesis we have explored different factors that impede accurate quantitative description of non-covalent protein-protein and protein-ligand interactions and design of new potent and specific binders from the scratch. Firstly, we addressed the role of solvent in the mechanism of non-covalent interactions. Secondly, we tackled the question about the intrinsic conformational flexibility of the protein molecules and the part it plays in weak interactions between proteins. In the first part of the thesis we studied the interactions of vascular endothelial growth factor (VEGF) protein with five cyclic peptides in solution and gas phase. The results showed that affinities of five ligands to VEGF in solution and gas phase are ranked in inversed order. That is, the that has the highest affinity in solution (as shown by chemical shift perturbation NMR and isothermal titration calorimetry) forms the weakest complex with VEGF in gas phase, and vice versa. We compared gas-phase and solution binding affinities of of five peptides and made qualitative conclusions about the role of the solvent in protein-ligand interactions. In order to obtain more quantitative information about the gas-phase behavior of non-covalent complexes we have developed a combined experimental/theoretical approach to study the energetics of collisional activation of the ion prior to dissociation. We applied developed strategy to model CID in traveling wave ion guide (TWIG) collision cell. We validated the model on the CID of leu-enkephalin peptide and then applied developed strategy to five non-covalent protein-peptide complexes and found activation energies of their dissociation reactions. Next we applied ESI native MS to study the allosteric interactions between the molecular chaperonin GroEL and ATP. The obtained data allowed to construct a scheme of conformational transition of GroEL upon binding of ATP and distinguish between two different cooperativity models, providing strong arguments in favor of Monod-Wyman-Changeux (MWC) model. Finally, be studied the backbone dynamics of VEGF with a combination of NMR relaxation and all-atom force-field based normal mode analysis (NMA). We showed that combination of experimental and computational approach allows to identify flexible zones with higher level of confidence. We also found out that residues, that are involved VEGF-receptor interactions, reside in or close to the flexible zones, suggesting the critical role conformational plasticity plays in the non-covalent protein-protein interactions. / Las biomoléculas de los organismos vivos realizan sus funciones principalmente a través de interacciones débiles reversibles entre ellas. La transducción de señal, la replicación de ADN/ARN, otros procesos enzimáticos y, virtualmente, cualquier otro proceso involucrado en las funciones vitales de cualquier organismo vivo (de las simples amebas, al complejo ser humano), requiere que las moléculas “hablen” entre ellas. Dicho lenguaje se basa en interacciones no covalentes. La flexibilidad conformacional es una propiedad esencial de las grandes biomoléculas, y muchas de las funciones desempeñadas por proteínas se basan en su capacidad para cambiar de conformación en respuesta a un factor externo. Geométricamente hablando, la presencia de flexibilidad en una proteína obstaculiza el diseño racional de medicamentos porque posibilita la existencia de un número muy elevado de conformaciones de dicha proteína. Por este motivo, cualquier información sobre la flexibilidad de una proteína es sumamente valiosa para la comprensión de PPI y PLI y para el diseño racional de medicamentos. Los capítulos 1-3 de la presente tesis versan sobre la solvatación, mientras que la flexibilidad se estudiara en el capitulo 4.

The great need to sterilize biologically sensitive or sterile material in operating theatres, has been given great importance for years. Among the various decontamination techniques being studied, there is a relatively new technique that involves using plasma for the process of decontaminating and sterilizing operating theatres. Plasma is known as the fourth State of matter, and holds the properties of free electrons, ions and cations, as well as other reactive species. This makes it a good candidate for the sterilization and/or decontamination of biological material. Nowadays, the use of plasma is being used with equipment that serves in the process of decontamination. Yet, this equipment at present, is working with low pressure and small volumes, based on the configuration of the electrodes. Generally, noble gases or peroxide are used to produce plasma, which makes it very difficult to use in the field. This thesis requires atmospheric pressure and non-thermal plasma generation equipment. In particular, a system called Atmospheric Pressure Plasma Chamber - No Thermal Plasma (APPC-NTP) and another system called Atmospheric-Pressure Plasma Jet - No Thermal Plasma (APPJ-NTP), which are based on two different systems. Both systems are characterized by the use of pure air as gas for the production of plasma. They work at atmospheric pressure and produce plasma at room temperature, which makes them perfect candidates to be used cost-effectively in many situations, even in the field, and can be used in the decontamination of sensitive material. The objective of this thesis is to investigate and establish a correlation if any, between independent variables entering the system, and dependent variables, or output of the system. This, in order to understand the behaviour of the plasma generated in the conditions, explained in the previous paragraph. While it is true that there are two different systems, the APPC-NTP and APPJ-NTP, the first has been divided into two, during the development of this thesis. Because two completely different voltage amplifiers have been used, the variables which have been studied, both input and output, have given different results. In conclusion, the work which has been done for this thesis, has established the correlation between the variables of entry and exit. Thus, leaving open the possibility of studying the behaviour of these, in relation to the efficiency of biological decontamination or sterilization. / La necesidad de descontaminar biológicamente material sensible o de esterilizar material en quirófanos, ha hecho durante años que se estudien diversas técnicas de descontaminación. Entre ellas surge una técnica relativamente nueva que es la posibilidad de descontaminar o esterilizar mediante plasma. El plasma es conocido por ser el cuarto estado de la materia, y debido a que es un estado en el que están presentes electrones libres, iones, cationes y otras muchas especies reactivas, parece que puede ser un buen candidato para conseguir la esterilización y/o descontaminación de material biológico. En la actualidad ya existen equipos que descontaminan mediante plasma pero estos equipos trabajan a bajas presiones y con pequeños volúmenes por la configuración de los electrodos y, en general, utilizan gases nobles o peróxido para producir el plasma por lo que hace que sea muy complicado su uso en campo. En esta tesis se utilizan equipos de generación de plasma no térmico a presión atmosférica, en concreto dos sistemas diferentes: un sistema denominado cámara de plasma a presión atmosférica - Plasma no térmico o APPC.NTP (Atmospheric Pressure Plasma Chamber - No Thermal Plasma) y otro sistema denominado Jet de plasma a presión atmosférica - Plasma no térmico o APPJ-NTP (Atmospheric-Pressure Plasma Jet - No Thermal Plasma). Ambos sistemas se caracterizan por usar aire puro como gas para la producción de plasma, trabajar a presión atmosférica y producir plasma a temperatura ambiente, lo que los convierte en candidatos perfectos para poder ser utilizados de forma económica en multitud de situaciones, incluso en campo, y de poder ser usados en la descontaminación de material sensible. El objetivo de esta tesis es única y exclusivamente tratar de establecer, en caso de existir, correlaciones entre variables independientes de entrada al sistema y variables dependientes o de salida del sistema a fin de entender el comportamiento del plasma generado en las condiciones explicadas en el párrafo anterior. Si bien es verdad que existen dos sistemas diferentes el APPC-NTP y el APPJ-NTP, el primero se ha dividido en dos durante el desarrollo de la tesis debido a que se han utilizado dos amplificadores de voltaje totalmente diferentes, por lo que las variables estudiadas tanto de entrada como de salida han sido distintas. El trabajo de esta tesis ha concluido con el establecimiento de las correlaciones obtenidas entre las variables de entrada y de salida dejando abierta la posibilidad de estudiar el comportamiento de estas en relación a la eficiencia de descontaminación biológica o la esterilización. / La necessitat de descontaminar biològicament material sensible o d'esterilitzar material als quiròfans, ha fet al llarg d'anys que s'estudien diverses tècniques de descontaminació. D'aquestes en surt una tècnica relativament nova que consiteix en descontaminar o esterilitzar mijançant plasma. El plasma és conegut per ser el quart estat de la matèria, y i degut a que és un estat en el que estan presents electrons lliures, ions, cations i altres espècies reactives sembla que pot ser un bon candidat per a aconseguir l'esterilització i/o descontaminació de material biològic.Eixida del sistema amb loblectiu d'entendre el comportament del plasma generat en les condicions. A l'actualitat ja existeixen equips que descontaminen mijançant plasma però aquestos equips treballen a baixes pressions i amb xicotets volums per la configuració dels electrodes i que, en general, utilitzen gasos nobles o peròxid per a produir el plasma, aquestes raons fan que siga molt complicat el seu ús en camp. A aquesta tesi s'utilitzaran equips de generació de plasma no tèrmic a pressió atmosfèrica, en concret dos sistemes diferents, un sistema anomenat càmera de plasma a pressió atmosfèrica-Plasma no tèrmic o APPC.NTP (Atmospheric Pressure Plasma Chamber - No Thermal Plasma) i altre sistema anomenat Jet de plasma a pressió atmosfèrica - Plasma no tèrmic o APPJ-NTP (Atmospheric-Pressure Plasma Jet - No Thermal Plasma). Tots dos sistemes es caracteritzen per l'ús d'aire pur com a gas per a la producció de plasma, treballar a pressió atmosfèrica i produir plasma a temperatura ambient, i per tant els converteix en cadidats perfectes per a poder ser utilitzats de forma econòmica en multitud de situacions, inclòs en camp i de poder ser usats en la descontaminació de material sensible. L'objectiu d'aquesta tesi és única i exclusivament tractar d'establir, en cas d'existir, correlacions entre variables independents d'entrada al sistema i variables dependents o d'eixida del sistema amb la finalitat d'entendre el comportament del plasma generat en les condicions exposades al paràgraf anterior. Malgrat que existeixen dos sistemes diferents, el APPC-NTP i el APPJ-NTP, el primer s'ha dividit en dos al llarg del desenvolupament de la tesi degut a que s'han utilitzat dos amplificadors de voltatge totalment diferents, pel que les variables estudiades, tant d'entrada con d'eixida, han estat diferents. El treball de la tesi ha conclòs amb l'establiment de les correlacions obtingudes entre les variables d'entrada i d'eixida deixant oberta la possibilitat d'estudiar el comportament d'aquestes en relació a l'eficiència de descontaminació biològica o l'esterilització. / Baeza Oliete, G. (2017). Contribución a la Generación de Plasma Frío Mediante Electrodos Tipo SMD y JET [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/86202