Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Sporotricosis is an acute or subacute mycotic infection caused by the Sporothrix complex species. The disease was already described in humans and in several animal species, mostly in cats, horses and dogs. Based on several outbreak reports in the literature, the species more predominant in cats of the Southeast and South regions of Brazil is S. brasiliensis. The transmission to humans include the occupational and the zoonotic forms. The presentation form more often seen in cats is multiple skin and mucosal lesions. The diagnostic methods include the isolation and identification of the agente in culture, the histopathology, the cytology, the intradermal sporotrichin test, the immunohistochemistry technique, and the polymerase chain reaction (PCR). The histopathological diagnosis is based on the morphological characteristics of the fungus and the respective inflammatory reaction. The main objectives of this retrospective study were to characterize the histomorphological and histochemical aspects of sporotrichosis in 10 cats, and also to evaluate epidemiological and clinical aspects, and gross findings obtained from the biopsy and necropsy protocols of the archives of the Laboratório de Patologia Veterinária of the Universidade Federal de Santa Maria. The disease affected mostly male mongrel cats, and was mostly observed in the cutaneous disseminated form. Gross lesions were characterized by cutaneous nodules (ulcerated or not) and by ulcerated masses or plaques. By histopathology, there were a relationship between the fungal load and two patterns of inflammatory response. The first pattern was characterized by high fungal load, and most yeasts were inside of numerous macrophages with abundant, many times vacuolated cytoplasm. The amount of neutrophils ranged from mild to moderate in this pattern. The second pattern was characterized by numerous epiteliod cells and many neutrophils. The fungal load was low and most yeasts were observed in the extracellular space. The yeasts were round, oval or cigar-shaped. Several histochemical techniques, such as Grocott s silver stain, periodic Schiff acid, and Alcian blue were utilized and they made it easier to visualize, to characterize the morphology, and to quantify the organisms. The Giemsa stain allowed visualizing the agent, but it not allowed to sharply highlight them from other intralesional components. Organisms were negative for melanin granules through the Fontana-Masson stain in all cases. The histomorphological and histochemical study allowed demonstrating determinant fungal characteristics to the establishment of the diagnosis by means of this diagnostic tool. / Esporotricose é uma infecção fúngica subaguda ou crônica, causada por espécies do complexo Sporothrix. A doença já foi descrita em humanos e em diversas espécies animais, mas ocorre com maior frequência em gatos, cavalos e cães. Baseado em vários relatos de surtos na literatura, a espécie mais predominante em gatos das regiões Sul e Sudeste do Brasil é S. brasiliensis. As formas de transmissão para humanos incluem a ocupacional e a zoonótica. A forma de apresentação mais frequente em gatos é de múltiplas lesões de pele e mucosas. Os métodos de diagnóstico compreendem o isolamento e identificação do agente em cultura, a histopatologia, a citologia, o teste intradérmico da esporotriquina, a técnica de imuno-histoquímica (IHQ) e a reação em cadeia de polimerase (PCR). O diagnóstico histopatológico é realizado observando-se as características morfológicas do fungo e a respectiva reação inflamatória. Os principais objetivos deste estudo retrospectivo foram caracterizar os aspectos histomorfológicos e histoquímicos da esporotricose em 10 gatos, além de avaliar os aspectos epidemiológicos, clínicos e os achados macroscópicos obtidos dos protocolos de biópsias e necropsias dos arquivos do Laboratório de Patologia Veterinária da Universidade Federal de Santa Maria. A doença afetou predominantemente gatos machos, sem raça definida e na forma cutânea disseminada. As lesões macroscópicas caracterizaram-se como nódulos cutâneos (ulcerados ou não) e como massas e placas ulceradas. Na histopatologia observou-se uma relação entre a quantidade de leveduras observada e dois padrões de resposta inflamatória. O primeiro padrão caracterizou-se por numerosas leveduras encontradas, na sua maioria, no interior de numerosos macrófagos com citoplasma abundante e muitas vezes vacuolizado. A quantidade de neutrófilos variava de leve a moderada e havia infiltrado geralmente leve de linfócitos e plasmócitos. O segundo padrão caracterizava-se por leve quantidade de leveduras observadas geralmente livres no espaço extracelular, numerosas células epitelioides e infiltrado predominantemente acentuado de neutrófilos. As leveduras eram redondas, ovais ou alongadas (em forma de charuto). Foram utilizadas várias técnicas histoquímicas como a impregnação pela prata de Grocott, ácido periódico de Schiff e azul Alciano que facilitaram a visualização, caracterização da morfologia e quantificação dos organismos. A coloração de Giemsa permitiu a visualização do agente, porém não permitiu destacá-los dos debris celulares. Os organismos foram negativos para grânulos de melanina pela coloração de Fontana-Masson em todos os casos. O estudo histomorfológico e histoquímico permitiu demonstrar características fúngicas determinantes para o estabelecimento do diagnóstico de esporotricose através dessa ferramenta diagnóstica.

Orientador: Iracilda Zeppone Carlos / Banca: Iracilda Zeppone Carlos / Banca: Maria Terezinha Serrão Peraçoli / Banca: Cleni Maria Marzocchi Machado / Banca: Luciana Simon Pereira Crott / Banca: Beatriz Maria Machado de Medeiros / Resumo: Os receptores "toll-like" (TLR) são importantes no reconhecimento de patógenos por um hospedeiro e conseqüentemente para a ativação da resposta imune inata. Evidências clínicas e experimentais mostram que defeitos nesses receptores ou em suas vias de sinalização deixam o hospedeiro suscetível a vários tipos de infecção. Já foi demonstrado que o TLR2 e o TLR4 estão envolvidos no reconhecimento de vários fungos, como Candida albicans, Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus e Saccharomyces cerevisiae, entretanto não há informações disponíveis sobre a participação dos TLRs no reconhecimento do Sporothrix schenckii. O S. schenckii é um fungo termodimórfico causador da esporotricose, uma infecção micótica caracterizada pelo comprometimento da pele e tecidos subcutâneos; em algumas ocasiões, como em pacientes imunocomprometidos, pode induzir lesões em órgãos. Os mecanismos de defesa, principalmente a imunidade mediada por células, são importantes na resistência à infecção. O objetivo deste trabalho foi verificar o papel do TLR4 na resposta dos macrófagos ao S. schenckii, empregando camundongos defectivos na expressão de TLR4 (C3H/HeJ) e camundongos controle (C3H/HePas), através da avaliação de mediadores imunológicos produzidos pelas células peritoneais dos camundongos, da expressão de proteínas acessórias ao TLR4 e da avaliação da apoptose destas células durante dez semanas. A produção dos intermediários reativos do oxigênio, determinada através da técnica de redução do vermelho de fenol, revelou que os camundongos defectivos na expressão do TLR4 produziram menores concentrações de H2O2 que os camundongos TLR4 normais. Nestes, as maiores concentrações de H2O2 foram induzidas pela presença do extrato lipídico da fase miceliar do S. schenckii. No entanto, a produção de óxido nítrico (NO) e das citocinas ocorreu... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Toll-like receptors (TLR) are important to pathogen recognition by a host and to the subsequent triggering of an innate immune response. Experimental and clinical evidence show that defects in TLR or in signaling pathways downstream from these receptors render hosts susceptible to various types of infection. TLR2 and TLR4 are involved in recognition of several fungi, such as Candida albicans, Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus and Saccharomyces cerevisiae. However, no information is available about TLR recognition of Sporothrix schenckii. S. schenckii is a thermally dimorphic fungus, the causative agent of sporotrichosis, a mycotic infection characterized by frequent involvement of the skin and subcutaneous tissues; occasionally, it may also produce lesions of the internal organs mostly reported among immunocompromised hosts. Immune defense mechanisms, particularly cellmediated immunity have been reported to be important in infection resistance. The aim of this study was to assess the role of TLR4 in the response of macrophages to S. schenckii, using TLR4-deficient mice (C3H/HeJ) and control mice (C3H/HePas), evaluating immunological mediators produced by exudate peritoneal cells, TLR4 accessory protein expression, and apoptosis of these cells over a period of ten weeks. Reactive oxygen intermediates production was determined through phenol red oxidation method and has revealed that TLR4-defective mice produced lower levels of H2O2 than TLR4 normal mice. In these animals, higher H2O2 concentrations were seen when lipid extract obtained from S. schenckii mycelium was used. However, nitric oxide (NO) and cytokine production occurred in higher levels when cells were challenged with lipid extract from S. schenckii yeast cells, which is the morphotype found in the host during infection. NO and cytokines such as IL-1, TNF- and IL-10 production in culture supernatants were also lower... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Sporothrix shenckii é o agente etiológico da esporotricose, micose de carater crônico e de ampla distribuição mundial. No Brasil, vem crescendo o número de casos da doença, bem como a incidência de formas clínicas graves ou atípicas. Nosso grupo de pesquisa desenvolveu um anticorpo monoclonal contra o componente antigênico proteíco de 70 kDa, secretado pelas células leveduriformes de S. schenckii, denominado anticorpo monoclonal (AcMo) P6E7. Este AcMo apresentou atividade profilática e terapêutica na esporotricose experimental, no entanto, este anticorpo possui origem murina, o que pode gerar uma resposta imunogênica quando administrado em humanos, impossibilitando sua utilização por tempo prolongado. Visando sua possível utilização no tratamento da esporotricose humana, a nossa proposta foi a humanização do AcMo P6E7 na forma de FvFc (Fv-linker- Fc) através de engenharia genética. Inicialmente construimos duas versões uma humanizada e outra quimérica do AcMo contra a fração de 70 kDa do antigeno de S. schenckii. Os anticorpos foram expressos em vetores de expressão dicistrônicos e produzidos com eficiência e estabilidade estrutural em células de mamíferos da linhagem CHO. Posteriormente, esses anticorpos foram purificados por cromatografia de afinidade e analisados quanto a sua capacidade de ligação ao fungo e função efetora. Verificamos que os FvFcs construídos foram capazes de se ligar a porção de 70 kDa do antígeno de S. schenckii. Através de ensaios de fagocitose, constatamos que os fragmentos FvFc do P6E7 humanizado e quimérico foram capazes de opsonizar as leveduras de S. schenckii aumentando, assim, o índice fagocítico em macrófagos humanos. Esses dados em conjunto, sugerem a possível utilização do anticorpo construído no tratamento da esporotricose humana. / Sporothrix shenckii is the etiological agent of sporotrichosis, a chronical fungal infection that shows a worldwide distribution. In Brazil, there is a growing number of cases of sporotrichosis, as well as the incidence of severe or atypical clinical forms. Our research group developed a monoclonal antibody (mAb) against the fungal antigenic component a protein of 70 kDa, secreted by S. schenckii yeasts called P6E7. This mAb showed prophylactic and therapeutic activity in experimental sporotrichosis, however, this antibody has murine origin, which can generate an immune response when administered to humans, precluding their use for prolonged time. For its possible use in the treatment of human sporotrichosis, our proposal is the humanization of mAb P6E7 through genetic engineering. Initially, we built two versions of the original antibody: an humanized version and a chimeric antibody both against the 70 kDa fraction from S. schenckii antigen. The antibodies were expressed in dicistronic expression vectors and were efficiently produced in mammalian cells CHO strain, showing good structural stability. Subsequently, these antibodies were purified by affinity chromatography and assayed for their binding ability to the fungus and effector function. We found that the built os FvFcs (Fv-linker- Fc) fragments were capable of binding to the 70 kDa portion of S.schenckii antigen. Through phagocytosis assays, we found that the FvFc fragments from the humanized and chimeric P6E7 were able to opsonize S. schenckii yeasts, thus increasing the phagocytic index in human macrophages. Together, These data suggest the potential use of the antibodies constructed in the treatment of human sporotrichosis.

Esporotricose é uma micose subcutânea, causada principalmente pelo fungo Sporothrix schenckii e a nova espécie Sporothrix brasiliensis. Foi relatado na literatura que os camundongos infectados com a cepa de S. schenckii M-64 produziu uma resposta imune mista, em que o soro dos camundongos infectados reagiram apenas com uma glicoproteína de 70 kDa (gp70), identificada como importante fator de virulência. Assim o presente trabalho visa avaliar a importância à virulência e eficácia do anticorpo monoclonal P6E7 em outras cepas do complexo Sporothrix. Camundongos foram infectados com as cepas de S. schenckii (1099-18 e 15383) e S. brasiliensis (5110 e 17943). Cada 7 dias, o baço e fígado foram retirados para a análise do UFC e citocinas. Foi realizado western blot com o soro dos camundongos infectados e com anticorpo monoclonal P6E7 utilizando o exoantígenos das diferentes cepas. Foi realizado protocolo de tratamento com o anticorpo P6E7 nos camundongos infectados, para a avaliação da carga fúngica no baço e no fígado. Análise de citocinas mostrou que as cepas de S. schenckii induziram uma resposta mista Th1/Th2, entretanto nos camundongos infectados com as cepas de S. brasiliensis, não foi observada produção significativa de citocinas. No western blot realizado com exoantígenos das cepas de Sporothrix sp. foi observado diferentes componentes antigênicos, quando o soro de camundongos infectados foi utilizado, porém a reação com anticorpo monoclonal contra a gp70 demonstrou que a gp70 estava presente apenas no exoantígeno da cepa mais virulenta 5110. Infecção realizada com todas as cepas demonstrou cronicidade pela análise UFC. O tratamento com o AcMo P6E7 foi eficaz no tratamento da esporotricose experimental, sendo capaz de diminuir a carga fúngica, principalmente no baço dos camundongos infectados. / Sporotrichosis is a subcutaneous mycosis, caused mainly by fungi Sporothrix schenckii and the new specie Sporothrix brasiliensis. Was reported in previous studies that mice infected with low virulent S. schenckii M-64 strain, produced a mixed immune response, where the infected mice serum reacted only with a 70 kDa glycoprotein (gp70), identified as important virulence factor. Thus, the present study aims to evaluate the virulence importance and effectiveness of monoclonal antibody P6E7 in other Sporothrix complex strains. Mice were infected with Sporothrix yeast strain of S. schenckii (1099-18 and 15383) and S. brasiliensis (5110 and 17943). Each 7 days, the spleen and liver were taken for CFU and cytokines analysis. The western blot was performed with the serum obtained from infected mice and a monoclonal antibody P6E7 using exoantigens from different strains. Was performed treatment protocol with the monoclonal antibody P6E7 on infected mice, for spleen and liver fungal burden evaluation. Cytokine analysis showed that S. schenckii strains induce a mixed Th1/Th2 response, however in the S. brasiliensis strains wasn\'t observed significant cytokine production. In western blot accomplished with the strains exoantigens was observed different antigenic components when the infected mice serum was used, however with monoclonal antibody against gp70 demonstrated that gp70 was present only in most virulent strain 5110. Infection performed with all strains demonstrated chronicity for CFU analysis. Treatment with Mab P6E7 was effective in experimental sporotrichosis, with reducing capable of fungal load, mainly in the spleen of infected mice.

A esporotricose caracteriza-se como uma micose subcutânea causada por fungos dimórficos do gênero Sporothrix, capazes de acometer o homem e uma grande variedade de animais, dentre eles os felinos. A princípio, Sporothrix schenckii era a única espécie conhecida como responsável pela esporotricose. Após estudos genotípicos e fenotípicos de isolados ambientais, clínicos humanos e animais, verificou-se alta variabilidade entre os isolados e estabeleceu-se a existência de um Complexo Sporothrix. Dentro deste, a maior causadora de surtos epidêmicos, justificada por uma maior virulência e capacidade de evasão da resposta imune, é a espécie Sporothrix brasiliensis. Nesse sentido, dada a ausência de estudos direcionados a está espécie, objetivou-se avaliar a importância de receptores Toll like-2 (TLR-2) e Toll like-4 (TLR-4) na infecção por S. brasiliensis. Além disso, utilizando técnicas de proteômica, procurou-se elucidar proteínas diferencialmente expressas em S. brasiliensis quando comparado à espécie S. schenckii. Para avaliação da resposta imune utilizaram-se modelos in vitro e in vivo de infecção, e para a investigação das proteínas diferencialmente expressas, utilizou-se a técnica de proteômica Bottom-up. A investigação da resposta imune in vitro mostrou a dependência dos receptores TLR-2 e TLR-4 no desencadeamento da resposta imune. Os ensaios in vivo mostraram a importância desses receptores no controle da infecção e dependência dos mesmos na produção de citocinas, principalmente nos primeiros 14 dias de infecção. Na ausência do receptor TLR-2, houve a polarização de resposta Th17 na tentativa de controle da infecção. Quando avaliadas as diferenças entre as espécies S. brasiliensis e S. schenckii, em termos de proteínas expressas, verificou-se que S. brasiliensis expressa diferencialmente 60 proteínas. Dentre essas, 9 são relatadas na literatura, como importantes na virulência e escape imunológico dos principais fungos de importância médica. Os resultados encontrados no presente trabalho permitem concluir que reconhecimento de S. brasiliensis é dependente dos receptores TLR-2 e TLR-4. Estudos que investiguem a utilização de outras vias de sinalização como mecanismos compensatórios, bem como, o sinergismo desses receptores no contexto da infecção por S. brasiliensis são fundamentais na compreensão da fisiopatologia dessa doença. No que tange a caracterização proteica, estudos com mutantes para cada uma das proteínas descritas nesse trabalho devem ser avaliados. / Sporotrichosis is a subcutaneous mycosis caused by dimorphic fungi of the genus Sporothrix that affects humans and animals, predominantelly felines. Inicially, Sporothrix schenckii was the only specie associated to sporotrichosis. However, after genotypic and phenotypic studies of human and animal clinical isolates, a high variability among the isolates was found and was concluded the existence of a complex: the Sporothrix Complex. Inside the Sporothrix complex, the major cause of epidemic outbreaks, justified by a greater virulence and ability to evade the immune system, is Sporothrix brasiliensis. Concerning this, the absence of studies directed to this specific specie, the aim was to evaluate the importance of Toll like receptor-2 (TLR-2) and Toll like receptor-4 (TLR-4) during S. brasiliensis infection. In addition, was look using proteomics techniques, the proteins differentially expressed in S. brasiliensis when compared to S. schenckii. To evaluate the immune response, in vitro and in vivo tecniques were used, and for the investigation of differentially expressed proteins, the Bottom-up proteomics technique was used. The investigation of the in vitro immune response showed the dependence of TLR-2 and TLR-4 receptors on phagocytosis and the production of inflammatory mediators, such as cytokines and NO. In vivo assays showed the importance of these receptors to control the infection and their dependence on cytokine production during the first 14 days of infection. In the absence of the TLR-2 receptor, the Th17 response was polarized in an attempt to control the infection. Evaluating the differences between S. brasiliensis and S. schenckii, in terms of expressed proteins, it was verified that S. brasiliensis differentially expressed 60 proteins. Among these, 9 are reported in the literature, as important in the virulence and immune evasion among the most important medical fungi. The results found in the present study allow to conclude that S. brasiliensis recognition is dependent on TLR-2 and TLR-4 receptors. Studies investigating the use of other signaling pathways as compensatory mechanisms, as well as the synergism of these receptors in the context of S. brasiliensis infection, are fundamental to understand the pathophysiology of this disease. Regarding the protein characterization, studies with mutants for each of the proteins described in this work should be evaluated.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_caroline_bohnen_de_matos.pdf: 562109 bytes, checksum: 6339bc1f54f1654dae0b8adf8c276724 (MD5) Previous issue date: 2014-02-12 / Sporotrichosis is the main domestic feline ringworm, highly relevant because it is a zoonosis involving six fungal species belonging to the Sporothrix complex. The fungal isolation of home and veterinary environments has been proven, proving to be an important source of infection for animals and humans. The search for alternative to disinfectants commonly used products is increasing, mainly by continuing reports of resistance by microorganisms. The Origanum vulgare and Rosmarinus officinalis stand out because they have proven antimicrobial activity. Given the above, the objective of the study was to evaluate the efficacy of disinfectants and plant extracts in eliminating the fungus Sporothrix complex, and report a case of multifactorial dermatitis in a dog. For this, in vitro tests were performed using the technique of direct exposure to evaluate the action of the tincture, aqueous extract and alcoholic extract of O. vulgare and R. officinalis against clinical isolates of dogs and cats with sporotrichosis. Subsequently, the plant extracts that showed better results in the direct exposure test were evaluated for the elimination of Sporothrix spp different contaminated surfaces, also using different disinfectants. As an experimental model surfaces of stainless steel, formica and ceramic tile floors, tested in quadruplicate using the technique of spray-wipe-spray were used. According to the study, the hydroalcoholic extract and tincture of O. vulgare and R. officinalis were effective in eliminating the fungus Sporothrix complex, with no difference from the area used, including showing better results when compared to commercial products used. / A esporotricose é a principal micose dos felinos domésticos, apresentando grande importância por tratar-se de uma zoonose envolvendo seis espécies fúngicas pertencem ao complexo Sporothrix. O isolamento fúngico de ambientes domiciliares e veterinários já foi comprovado, revelando-se uma importante fonte de infecção para animais e humanos. A busca de produtos alternativos aos desinfetantes utilizados normalmente é crescente, principalmente pelos constantes relatos de resistência por parte dos microrganismos. O Origanum vulgare e o Rosmarinus officinalis destacam-se por apresentarem atividade antimicrobiana comprovada. Diante do exposto, o objetivo do estudo foi avaliar a eficácia de desinfetantes e de extratos vegetais na eliminação de fungos do complexo Sporothrix, e relatar um caso clínico de dermatite multifatorial em um canino. Para isso, testes in vitro foram realizados através da técnica de exposição direta para avaliar a ação da tintura, do extrato aquoso e do extrato hidroalcoólico de O. vulgare e R. officinalis frente a isolados clínicos de cães e gatos com esporotricose. Posteriormente, os extratos vegetais que demonstraram melhores resultados no teste de exposição direta foram avaliados em relação a eliminação do Sporothrix spp de diferentes superfícies contaminadas, utilizando também diferentes desinfetantes. Como modelo experimental foram utilizadas superfícies de aço inoxidável, fórmica e piso cerâmico, testadas em quadruplicata através da técnica de spray-wipe-spray. De acordo com o estudo, o extrato hidroalcoolico e a tintura de O. vulgare e R. officinalis foram eficazes na eliminação de fungos do complexo Sporothrix, não havendo diferença em relação a superfície utilizada, inclusive apresentando melhores resultados quando comparado aos produtos comerciais utilizados.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_tatiana_antunes.pdf: 3388546 bytes, checksum: 6c26eaf4ab24c11f046c7e7b2f9f2566 (MD5) Previous issue date: 2010-03-10 / Sporotrichosis is a subcutaneous mycosis of zoonotic character, cosmopolitan development subacute or chronic whose agent the dimorphic fungus Sporothrix schenckii affecting man and various species of animals, especially the domestic cat, being considered of interest to Public Healt. Considering the difficulties in the therapeutic treatment of ringworm in this animal species, including toxicity and the development of resistance to antifungal agents traditionally used to treat disease the study aimed evaluate the immunogenic capacity of yeast cells of S. schenckii inactivated both in immunoprophylaxis and immunotherapy of sporotrichosis. We used 160 Wistar albin rats (Rattus norvegicus) at 70 days (80 in immunoprophylaxis and 80 in immunotheraphy) were divided into four groups that were immunized three times every 15 days. The groups were divided as follows: G1 (control, mineral oil), G2 (Ag + incomplete freund adjuvant), G3 (Ag + Freund's complete adjuvant) and G4 (Ag + incomplete freund adjuvant + propolis). Preparation of the vaccine used was an isolate of S. schenckii from yeast in the form of a case of cutaneous sporotrichosis of domestic cat. The fungus was grown in medium liquid (Brain-Heart broth), incubated for 10 days at 370C and kept under constant agitation to obtain the yeast form. The culture was filtered through a double layer of sterile gauze, centrifuged, washed twice with buffered saline (PBS), homogenized and standardized in 108 cells of S. schenckii / ml. The cells were inactivated with 0.02% thimerosal and then emulsified with mineral oil, and vaccines packaged in sterilized sealed and kept at a temperature of 40C throughout the experimental period. Was used a dose of 0.1 ml/animal intramuscularly. Rats that received the vaccine as immunoprophylaxis after the three doses were challenged, and inoculated subcutaneously with 2X103 cells / ml of S. schenckii in the right footpad and evaluated for 10 days. Animals treated with immunotherapy were inoculated with the agent after 14 days and received three doses of immunogen. After the experimental period all were euthanized and necropsy to mycological examination, histopathology and counting colony forming units. The results were: immunoprophylaxis in the pathological changes showed statistically significant differences (P <0.05) in the vaccinated groups (G2, G3 and G4) compared to the control group (G1) to the point of inoculation, with no statistical difference the evaluation of internal organs. Immunotherapy clinical evaluation at the injection showed that there was no statistical difference among the four experimental groups, but at the end of the experiment the groups G1, G2, G3 and G4 had respectively 8.3%, 58.3%, 41.7 % and 50% of injuries in the process of regression and healing. In relation to injuries in other body areas only in the last week of the experiment, the G2 and G3 differ statistically (P <0.05) in the control group (G1). Pathological changes were found in the internal organs of the four experimental groups, but with a greater number of lesions in group CONT. Both in immunoprophylaxis and immunotherapy the retroisolation of the agent and count of colony forming units showed that there was growth of S. schenckii in the four experimental groups, but with less frequency and quantification of CFU at the point of inoculation and internal organs of the groups G2, G3 and G4. In histopathologic evaluation to determine the presence of granulomas and pyogranulomas focal and multifocal in the point of inoculation and internal organs of the four groups, but the animals that received immunoprophylactic changes were more restricted to the point of inoculation. The results indicate that the three vaccine formulations (AIF ACF and AIFP) used as immunoprophylactic and immunotherapy have not been effective for the remission of the lesions of experimental cutaneous sporotrichosis. / Esporotricose é uma micose subcutânea de caráter zoonótico, cosmopolita de evolução subaguda ou crônica que tem como agente etiológico o fungo dimórfico Sporothrix schenckii afetando o homem e várias espécies de animais, principalmente o felino doméstico, sendo considerada de interesse para a Saúde Pública. Considerando as dificuldades terapêuticas no tratamento da micose nessa espécie animal, incluindo toxicidade e o desenvolvimento de resistência aos antifúngicos tradicionalmente utilizados na terapia da enfermidade o estudo objetivou avaliar a capacidade imunogênica de células leveduriformes de S. schenckii inativadas tanto na imunoprofilaxia como na imunoterapia da esporotricose. Foram utilizados 160 ratos albinos wistar (Rattus norvergicus) com 70 dias (80 na imunoprofilaxia e 80 na imunoterapia) sendo divididos em quatro grupos que receberam três doses do imunógeno a cada 14 dias. Os grupos foram divididos em: G1 (controle- óleo mineral), G2 (Ag+ adjuvante incompleto de freund), G3 (Ag + adjuvante completo de freund) e G4 (Ag + adjuvante incompleto de freund + própolis). Para preparação da vacina foi utilizado um isolado de S. schenckii na forma leveduriforme proveniente de um caso de esporotricose cutânea de felino doméstico. O fungo foi cultivado em meio líquido (Brain-Heart broth), incubado durante 10 dias a 37oC e mantido sob agitação constante para obtenção da forma leveduriforme. A cultura foi filtrada em dupla camada de gaze estéril, centrifugada, lavada duas vezes com solução salina tamponada (PBS), homogeneizada e padronizada em 108 células de S. schenckii/ ml. As células foram inativadas com thimerosal a 0,02% e posteriormente emulsificadas com óleo mineral, sendo as vacinas acondicionadas em frascos estéreis fechados e mantidas a temperatura de 40C durante todo o período experimental. Foi utilizada uma dose de 0,1 ml/animal por via intramuscular. Os ratos que receberem a vacina como imunoprofilaxia após as três doses foram desafiados, sendo inoculados por via subcutânea com 2X103 células/ml de S. schenckii e avaliados durante 10 dias. Os animais tratados com imunoterápico foram inoculados com o agente e após 14 dias receberam três doses do imunógeno. Após o período experimental todos foram eutanasiados e feita necropsia para realização de análise micológica, histopatológica e contagem das Unidades Formadoras de Colônias. Os resultados obtidos foram: na imunoprofilaxia as alterações anatomopatológicas demonstraram diferença estatísticamente significativa (P<0,05) dos grupos vacinados (G2, G3 e G4) quando comparados ao grupo controle (G1) em relação ao ponto de inoculação, não havendo diferença estatística na avaliação dos órgãos internos. Na imunoterapia a avaliação clínica no ponto de inoculação evidenciou que não houve diferença estatística entre os quatro grupos experimentais, porém ao final do experimento os grupos G1, G2, G3 e G4 apresentavam respectivamente 8,3%, 58,3%, 41,7% e 50% das lesões em processo de regressão e cicatrização. Em relação a lesões em outras áreas corpóreas somente na última semana do experimento os grupos G2 e G3 diferiram estatisticamente (P<0,05) do grupo controle (G1). Alterações anatomopatológicas foram encontradas nos órgãos internos dos quatro grupos experimentais, porém com um maior numero de lesões nos animais do grupo CONT. Tanto na imunoprofilaxia quanto na imunoterapia o retroisolamento do agente e Contagem das Unidades Formadoras de colônias demonstraram que houve crescimento do S. schenckii nos quatro grupos experimentais, porém com menor freqüência e quantificação de UFCs no ponto de inoculação e órgãos internos dos grupos G2, G3 e G4. Na avaliação histopatológica foi verificada a presença de granulomas e piogranulomas focais e multifocais no ponto de inoculação e órgãos internos dos quatro grupos, porém os animais que receberam imunoprofilático as alterações ficaram mais restritas ao ponto de inoculação. Os resultados permitem concluir que as três formulações de vacinas (AIF, ACF e AIFP) utilizadas como imunoprofilático e imunoterápico não foram eficazes para a remissão completa das lesões de esporotricose cutânea experimental.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-01-15T16:50:22Z No. of bitstreams: 1 jordanadeabreulazzarini.pdf: 11340904 bytes, checksum: 748a672389e8977fcf91c77687db2f7b (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-01-25T17:41:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 jordanadeabreulazzarini.pdf: 11340904 bytes, checksum: 748a672389e8977fcf91c77687db2f7b (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-25T17:41:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 jordanadeabreulazzarini.pdf: 11340904 bytes, checksum: 748a672389e8977fcf91c77687db2f7b (MD5) Previous issue date: 2015-07-30 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O presente trabalho buscou caracterizar fitoquimicamente, avaliar o potencial antifúngico frente às principais linhagens causadoras de esporotricose no Brasil; a atividade antioxidante e a citotoxicidade preliminar dos óleos essenciais adquirido comercialmente (OCM) e obtido por extração no laboratório de Farmacognosia da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Juiz de Fora (OEX) e do extrato hidroetanólico 95% (v/v), obtidos a partir das folhas de Pimenta pseudocaryophyllus (Gomes) Landrum (Myrtaceae). O screening fitoquímico realizado com o extrato hidroetanólico resultou na identificação de flavonoides, taninos e proantocianidinas. A quantificação destes metabólitos secundários na droga vegetal, por espectrofotometria UV-VIS, resultou em 18,77% de constituintes fenólicos totais, 10,69% de taninos e 0,52% de flavonoides. O perfil cromatográfico obtido por CGEM do OEX indicou elevados teores de monoterpenos (48,83%) e fenilpropanoides (39,08%), tendo como constituinte majoritário o eugenol (34,38%). O OCM apresentou elevados teores de sesquiterpenos (25,64%) e fenilpropanoides (70,05%), e também apresentou o eugenol como constituinte majoritário (66,93%). Extrato e frações apresentaram notável atividade antioxidante pelo método de redução do DPPH, sugere-se que a mesma seja atribuída aos altos teores de compostos fenólicos, flavonoides e taninos encontrados. Promissores resultados de atividade antioxidante foram encontrados para os OEX e OCM, os quais possuem como constituinte majoritário o eugenol. Para a avaliação da atividade antifúngica foram utilizadas as seguintes linhagens fúngicas: Sporothrix schenckii ATCC 1099- 18, Sporothrix schenckii IPEC 15383, Sporothrix brasiliensis ATCC 5110 e Sporothrix brasiliensis IPEC 17943 e duas linhagens clínicas de Sporothrix schenckii, denominadas genericamente como A e B. O OEX apresentou atividade antifúngica frente a todas as linhagens em concentrações que variaram de 260,46 a 520,90 μg/mL. Foi observada atividade fungicida frente a todas as linhagens em concentrações acima de 520,90 μg/mL. O OCM foi capaz de inibir todas as linhagens em concentrações que variaram de 65,52 a 260,10 μg/mL. Foi observada atividade fungicida frente a todas as linhagens em concentrações acima de 262,10 μg/mL. O eugenol apresentou atividade antifúngica frente a todas as linhagens em concentrações que variaram de 34,36 a 137,48 μg/mL. Foi observada atividade fungicida frente a todas as linhagens em concentrações acima de 137,48 μg/mL. Ao ajustar os resultados de atividade antifúngica a 100% do constituinte majoritário eugenol, verificou-se a existência de sinergismo entre os constituintes do OEX, que apresentou maior atividade antifúngica (CIM=89,54 μg/mL) do que o eugenol (CIM=136,11 μg/mL) para quatro das seis linhagens estudadas. Foi observado que somente duas das linhagens estudadas apresentaram susceptibilidade à anfotericina b e três linhagens foram consideradas resistentes ao cetononazol com valores de CIM de 4,0 μg/mL. Em relação ao itraconazol, todas as linhagens estudadas foram consideradas resistentes, com valores de CIM>128 μg/mL. Estes resultados sugerem indícios de resistência fúngica das linhagens estudadas em relação aos fármacos de referência empregados no tratamento da esporotricose. As eletromicrografias das linhagens fúngicas revelaram que, tanto nos fungos expostos aos tratamentos experimentais, quanto naqueles expostos aos fármacos de referência, pode-se observar deformidades na estrutura fúngica quando comparadas ao grupo não tratado. Em relação aos ensaios de citotoxicidade realizados com fibroblasto murino (L929) pelo método de redução do MTT, o extrato não apresentou citotoxicidade nas concentrações avaliadas (10 a 100 μg/mL), o eugenol não apresentou citotoxicidade em concentrações menores ou igual a 125 μg/mL, o OCM não foi tóxico em concentrações menores ou igual a 250 μg/mL. Já em relação ao OEX concentrações inferiores ou igual a 62,5 μg/mL não apresentaram citotoxicidade. / The purpose of this work is to carry out the phytochemical study, evaluate the potential antifungal against the major strains causing sporotrichosis in Brazil, the antioxidant activity and the preliminary cytotoxicity of essential oils obtained commercially (CMO) and obtained by extraction in Pharmacognosy Laboratory of Pharmacy Faculty of the Federal University of Juiz de Fora (OEX) and hydroethanolic extract 95% (v/v), obtained from the leaves of Pimenta pseudocaryophyllus (Gomes) Landrum (Myrtaceae). The phytochemical screening performed with the hydroethanolic extract resulted in the identification of flavonoids, tannins and proanthocyanidins. The quantification of these secondary metabolites in plant drug, by UV-VIS revealed the presence of phenolic constituents (18.77%), tannins (10.69%) and flavonoids (0.52%). The chromatographic profile obtained by GC-MS indicated the OEX high levels of monoterpenes (48.83%) and phenylpropanoids (39.08%) having as a major constituent eugenol (34.38%). The OCM had high levels of sesquiterpenes (25.64%) and phenylpropanoids (70.05%), with as major constituent eugenol (66.93%). Extract and fractions showed notable antioxidant activity by reduction of DPPH method, it is suggested that it be attributed to the high concentration of phenolic compounds, flavonoids and tannins found. Promising results of antioxidant activity were found for the OEX and OCM, which have as major constituent eugenol. For evaluating the antifungal activity the following fungal strains were used: Sporothrix schenckii ATCC 1099-18, Sporothrix schenckii IPEC 15383, Sporothrix brasiliensis ATCC 5110 and Sporothrix brasiliensis IPEC 17943 and two clinical strains, known generically as A and B. The OEX showed activity antifungal against all strains at concentrations ranging from 260.46 to 520.90 μg/mL. It was observed fungicidal activity against all strains at concentrations above 520.90 μg/mL. The OCM was able to inhibit all strains at concentrations ranging from 65.52 to 260.10 μg/mL. It was observed fungicidal activity against all strains at concentrations above 262.10 μg/mL. The eugenol showed antifungal activity against all strains at concentrations ranging from 34.36 to 137.48 μg/mL. It was observed fungicidal activity against all strains at concentrations above 137.48 μg/mL. By adjusting the results of antifungal activity to 100% of major constituent eugenol, it was found that there is synergy between the constituents of the OEX, with the highest antifungal activity (MIC = 89.54 μg/mL) than eugenol (MIC = 136.11 μg/mL) for four of the six strains studied. It was noted that only two of the studied strains were susceptible to amphotericin B and three strains were considered resistant cetononazol with MIC values of 4.0 μg/mL. Compared to itraconazole, all the strains studied were considered resistant with MIC values> 128 μg/mL. The micrographs revealed that the fungal strains in both fungi exposed to the experimental treatments, as those exposed to the reference drug, one can observe fungal deformities in structure when compared to the untreated group. In relation to the cytotoxicity assays performed with murine fibroblasts (L929) by the MTT reduction method, the extract showed no cytotoxicity at concentrations tested (10 to 100 μg/mL), eugenol showed no cytotoxicity at concentrations less than or equal to 125 μg/mL, OCM was not toxic at concentrations less than or equal to 250 μg/mL. In relation to the OEX concentrations below or equal to 62.5 μg/mL showed no toxicity.

Orientador: Iracilda Zeppone Carlos / Resumo: A esporotricose é uma micose subcutânea emergente que acomete animais e humanos, causada por espécies patogênicas do fungo Sporothrix schenckii senso lato. A doença, distribuída em todo o mundo, é mais freqüente na América Latina e países como Brasil, Uruguai, Peru e Colômbia constituem áreas endêmicas. No Brasil, a doença tornou-se um problema de saúde em razão do aumento de casos, manifestando-se com uma intrigante transmissão zoonótica por gatos. Os fatores ambientais extremos modificam a fisiologia dos microrganismos, permitindo sua sobrevivência e induzendo mudanças na virulência dos fungos patógenos com incidência direta no sistema imune. O tolueno encontra-se dentre os principais contaminantes dos solos como consequencia dos derramamentos de gasolinas, resíduos da indústria, dentre outras fontes de poluição, porém, o efeito deste contaminante sobre a virulência do fungo S. schenckii ainda não foi elucidado. Neste estudo foi avaliado o crescimento e a virulência de S. schenckii quando exposto ao tolueno. O fungo sobreviveu a 0,01 e 0,10% (vol/vol) de tolueno, sendo a população reduzida até 17,5 e 5,4%, respectivamente. O consumo de tolueno na concentração 0,01% mostrou uma redução de 26% após 48 horas. As enzimas superóxido dismutase e catalase nos fungos expostos ao tolueno foram altamente expressas, o qual permitiu uma maior remoção das espécies reativas de oxigênio intracelular nos fungos expostos, e uma menor sensibilidade à exposição de H2O2 sendo que resistiram at... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

As propriedades terapêuticas das plantas medicinais são cada vez mais estudadas, principalmente devido aos crescentes casos de resistência antimicrobiana, como observado em cepas do Complexo Sporothrix. As plantas da família Lamiaceae são conhecidas por suas propriedades antifúngicas, entretanto, são escassos seus estudos contra agentes causadores da esporotricose. Devido ao potencial promissor dessas plantas, objetivou-se (1) avaliar a atividade anti-Sporothrix spp. in vitro de Origanum vulgare L. (orégano), Origanum majorana L. (manjerona) e Rosmarinus officinalis L. (alecrim) nas formas de óleos essenciais, extratos aquosos de infusão e decocção e extratos hidroalcoólicos contra isolados clínicos de Sporothrix spp. obtidos de casos clínicos de esporotricose humana, canina e felina; (2) avaliar os principais constituintes químicos presentes nos óleos essenciais das plantas; e (3) avaliar a atividade citotóxica in vitro. Extratos aquosos e hidroalcoólicos foram preparados a partir de partes aéreas das plantas. Em óleos essenciais, produtos comerciais e produtos extraídos de partes aéreas por hidrodestilação em Clevenger foram testados. Ambos óleos foram analisados quimicamente por cromatografia gasosa. Testes in vitro foram realizados pela técnica de Microdiluição em Caldo contra isolados clínicos de Sporothrix spp. oriundos de humanos, caninos e felinos, bem como ambiental nas fases leveduriforme (CLSIM27A3) e filamentosa (CLSI-M38A2), sendo testados entre 72 a 0.07 mg/mL. Os efeitos citotóxicos foram avaliados através do ensaio MTT em células VERO (78 a 5000 μg/mL). Na fase leveduriforme, os óleos essenciais extraído e comercial de orégano apresentaram atividade anti-Sporothrix spp. nas concentrações inibitórias mínimas (CIM) e concentrações fungicidas mínimas (CFM) de 36 a ≤2.25 mg/mL e de alecrim entre 72 a≤2.25 mg/mL, não havendo diferença estatística entre os tipos de óleos. Por sua vez, óleo comercial de manjerona apresentou CIM/CFM de 18 a ≤2.25 mg/mL. Na fase micelial, 100% dos isolados felinos e caninos foram sensíveis aos óleos essenciais de orégano (0.14 a ≤0.07 mg/mL), alecrim (18 a ≤0,07 mg/mL) e manjerona (4.5 a ≤0.07 mg/mL). Extratos aquosos e hidroalcoólicos de orégano apresentaram atividade inibitória e fungicida, respectivamente, em 100% e entre 90% a 35% dos isolados animais (40 a ≤0.07 mg/mL). Nas mesmas concentrações, o extrato hidroalcoólico de manjerona inibiu de 90% a 100% dos isolados. Entretanto, os demais extratos de manjerona e de alecrim apresentaram fraca atividade anti-Sporothrix spp. sobre 40% a 5% dos isolados, não havendo atividade antifúngica sobre as infusões de alecrim preparadas em 10 e 60 minutos. Sobre itraconazol, Sporothrix spp. foi sensível na fase leveduriforme (16 a ≤0.03 μg/mL) e filamentosa (64 a ≤0.12 μg/mL), entretanto, 5 foi observada resistência antifúngica em 4% e 28% (CIM e CFM >16 μg/mL, respectivamente) dos isolados na fase leveduriforme, ao passo que, na fase filamentosa, a resistência ocorreu em 12,5% e 85% dos isolados (CIM e CFM >64 μg/mL, respectivamente). Os óleos essenciais de orégano e manjerona apresentaram maior atividade citotóxica com 80% de inviabilidade celular, ao passo que os extratos aquosos e hidroalcoólico de manjerona foram os menos citotóxicos. A análise química foi similar nos produtos das plantas Lamiaceae, diferindo a concentração dos compostos, os quais α-pineno e 1,8-cineol foram majoritários para o óleo extraído do alecrim e α- terpineno, terpineol-4 e timol para o óleo extraído de orégano, ao passo que 1,8-cineol foi majoritário para os produtos comerciais de alecrim e manjerona, e carvacrol para orégano. A boa atividade anti-Sporothrix spp. in vitro das plantas da família Lamiaceae, em especial ao Origanum vulgare L., é promissora para o tratamento da esporotricose, inclusive sobre isolados clínicos resistentes. / Therapeutics properties of medicinal plants are increasingly studied, mainly due to increasing cases of antimicrobial cases, as observed in strains of Sporothrix Complex. Plants of Lamiaceae family are known for their antifungal properties, but studies in causative agents of sporotrichosis are scarces. Due to the promising potential of these plants, aimed to (1) evaluate the in vitro anti-Sporothrix spp. activity of aqueous extracts of infusion and decoction, hydroalcoholic extract and essential oils os Origanum vulgare L. (oregano), Origanum majorana L. (marjoram) and Rosmarinus officinalis L. (rosemary); (2) evaluate the main chemical constituents present in essential oils; and (3) evaluate the in vitro cytotoxic activity. Aqueous and hydroalcoholic extracts were prepared from the aerial parts of the plants. In essential oils, commercial products and extracted products from aerial parts through hydrodistillation in Clevenger were tested. Both essential oils were chemically analyzed by gas chromatography. In vitro tests were performed by broth microdilution technique against clinical isolates of Sporothrix spp. from humans, dogs and cats with sporotrichosis, as well as environmental soil, in yeast (CLSI-M27A3) and mycelial (CLSI-M38A2) phases and tested from 72 to 0.07 mg/mL. Cytotoxic effects were assessed by MTT assay on VERO cells (78 to 5000 μg/mL). In yeast phase, the extracted and commercial essential oils of oregano showed anti-Sporothrix spp. activity in the minimum inhibitory concentrations (MIC) and minimum fungicidal concentration (MFC) of 36 to ≤2.25 mg/mL and rosemary between 72 to ≤2.25 mg/mL, with no statistical difference between the types of oils. In turn, commercial marjoram oil showed MIC/MFC of ≤2.25 to 18 mg/mL. In the mycelial phase, 100% of feline and canine isolates were sensibles to essential oils of oregano (0.14 to ≤0.07 mg/mL), rosemary (18 to ≤0,07 mg/mL) and marjoram (4.5 to ≤0.07 mg/ml). Aqueous and hydroalcoholic extracts of oregano showed inhibitory and fungicidal activity, respectively, 100% and between 90% and 35% of animal isolates (40 to ≤0.07 mg/mL). In the same concentrations, hydroalcoholic extract of marjoram inhibited 90% to 100% of the isolates. However, other extracts of marjoram and rosemary showed weak activity anti- Sporothrix spp. about 40% to 5% of the isolates, with no antifungal activity by INF10 and INF60 rosemary. About itraconazole, Sporothrix spp. was sensitive in the yeast phase (16 to ≤0.03 mg/mL) and filamentous (64 to ≤0.12 mg/mL), however, antifungal resistance was observed in 4% and 28% (MIC and MFC > 16 μg/mL, respectively) in fungal isolates in the yeast form, and in the mycelial form, the resistence occurred in 12.5% and 85% of isolates (MIC and MFC > 64 μg/mL, respectively). Essential oils of oregano and marjoram exhibited greater cytotoxic activity with 80% cell inviability, while hydroalcoholic and aqueous extracts of marjoram were less cytotoxic. The chemical analysis was similar for the products of Lamiaceae plants and differed in the concentration of the compounds, which α-pinene and 1,8-cineole were majoritary for extracted oil of rosemary and α-terpinene, terpineol-4 and thymol for extracted oil of 7 oregano, while 1,8-cineole was majoritary for commercial products of rosemaru and marjoram, and carvacrol for oregano. The good in vitro anti-Sporothrix spp. activity of the plants of Lamiaceae family, mainly to Origanum vulgare L., is promising for the treatment of sporotrichosis, including against clinical isolates resistant.