C’est au XIXe siècle, avec la diffusion de la méthode expérimentale de Claude BERNARD et le passage d’une conception hiérarchisée du monde à une conception plus égalitariste, qu’apparait le conflit de valeurs qui sous-tend la problématique de l’expérimentation sur les animaux. Au XXe siècle, confortée par la thématisation philosophique de la souffrance animale, l’action des mouvements de protection et de libération des animaux contribue à l’émergence de législations ou de mesures d’autorégulation de la part de la communauté scientifique. Derrière cette préoccupation nouvelle pour le sort des animaux de laboratoire subsistent cependant des difficultés théoriques et pratiques qui constituent autant d’enjeux éthiques nécessitant la poursuite d’une réflexion pluridisciplinaire.

La cornée est le hublot transparent de l’oeil. Bien que de nombreux modèles alternatifs utilisant des cornées animales ex vivo aient vu le jour durant ces 30 dernières années, les recherches préclinique (étude de nouvelles stratégies diagnostiques et thérapeutiques) et fondamentale sur la cornée ont toujours besoin de l’expérimentation animale in vivo. Elle fait aujourd’hui l’objet d’une réglementation stricte afin d’éviter tout abus et maltraitance. Les animaux les plus fréquemment utilisés en recherche cornéenne sont des mammifères (souris, rat, lapin, chat, chien, cochon, boeuf et primate non humain). Malgré leur proximité phylogénétique de l’Homme, ces animaux peuvent présenter des différences notables avec la cornée humaines qui doivent être connues pour ne pas induire de biais dans l’expérimentation. Les objectifs de cette thèse sont de mettre au point les modèles animaux et les méthodes alternatives nécessaires aux travaux du laboratoire BiiGC (EA 2521, Université de Saint-Étienne, France). Ils sont illustrés par 3 projets innovants : 1/une étude préclinique utilisant un modèle de kératoplastie transfixiante chez le lapin pour évaluer la prévention du rejet d’allogreffe de cornée par implant sous conjonctival de déxamethasone ; 2/Le développement d’un bioréacteur cornéen porcin pour l’analyse de la cicatrisation épithéliale ; 3/ l’utilisation d’un modèle lapin de lésion endothéliale pour l’étude de la régénération endothéliale. Ces 3 travaux innovant démontrent la diversité des modèles animaux nécessaires en recherche fondamentale et translationnelle. / The cornea is the clear window of the eye. Although many alternative models using ex vivo animal corneas have emerged during the last 30 years, preclinical research (study of new diagnostic and therapeutic strategies) and fundamental corneal research still need animal experiments in vivo. The most commonly used animals in corneal research are mammals (mouse, rat, rabbit, cat, dog, pig, beef and non-human primate). Despite their phylogenetic proximity to humans, these animals may exhibit notable differences with the human cornea, which must be known so as not to induce bias into the experiment. The aims of this thesis are to develop the animal models and the alternative models necessary for the work of the BiiGC laboratory (EA2521, University of Saint-Etienne, France). They illustrated by 3 innovative projects: 1/ a preclinical study using penetrating keratoplasty model in rabbits to evaluate the prevention of corneal allografts rejection by a conjunctival implant of dexamethasone; 2/ The development of a porcine corneal bioreactor for the analysis of epithelial wound healing; 3/ The use of rabbit endothelial lesion model for the study of endothelial regeneration. These 3 innovative works demonstrate the diversity of animal models needed in fundamental and translational research

Controverse qui traverse les années, l’expérimentation animale, en dépit de fortes remises en question par des opposants de plus en plus véhéments, s’inscrit dans un certain immobilisme. A quoi tient cette « stagnation » ? Le substantif est-il d’ailleurs à propos ? La controverse en question ne s’inscrit-elle pas plutôt dans une « dynamique immobile » ? Afin d’étudier cette problématique, la thèse favorise une approche communicationnelle. L’étude se fait en trois temps, tout d’abord par l’analyse du dilemme moral sur lequel repose l’expérimentation animale, ce qui suppose un retour vers un certain nombre de textes philosophiques et éthiques fondamentaux. Puis, l’étude analyse les discours des opposants et des partisans et les raisons d’un difficile, voire impossible dialogue entre les deux camps. Dans cette situation de non-communication, le législateur devient, comme nous le voyons en dernier lieu, un recours dont chaque camp attend une solution… Une solution permettant de sortir de l’immobilisme ? / Throughout the years, despite strong questioning from more and more vehement opponents, the animal testing controversy has come to a standstill. What can explain this « immobility » ? Besides, is the noun accurate ? Is this controversy rather not in line with a « dynamic inertia » ? So as to investigate this issue, communicational approach is put forward.The study is divided into three parts. A first one analyzes the underlying moral dilemma of animal testing, which involves going back to some philosophical sources and ethical principles. Then, the study examines the opponents and supporters speeches as well as the reasons for a difficult and even an impossible dialogue between the two sides. In this situation of non-communication, the legislature is, as we see in the third part, a resort from which each side is expecting a solution... A solution to overcome the inertia ?

Le tube digestif héberge une communauté microbienne complexe, le microbiote intestinal, dont les capacités métaboliques sont plus riches et diversifiées que celles codées par le génome de l'hôte. L'implication du microbiote intestinal dans divers aspects de la physiologie de l'hôte, comme le métabolisme nutritionnel et l'immunité, est depuis longtemps étudiée. En revanche, l'action potentielle du microbiote sur le développement et le fonctionnement du cerveau constitue une nouvelle piste de recherche, encore peu explorée. Dans ce contexte, nous avons réalisé une première étude générale de l'action du microbiote intestinal sur le cerveau en comparant les fonctions sensori-motrices, le comportement de type anxieux, l'état d'activation de l'axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien et le profil cérébral des monoamines de rats F344 axéniques et conventionnels. Les résultats révèlent que, chez cette lignée particulièrement sensible au stress, l'absence de microbiote intestinal exacerbe le comportement de type anxieux et la réponse hormonale au stress, et atténue le métabolisme dopaminergique cérébral. Afin d'étudier par quel moyen le microbiote peut agir sur le cerveau, une seconde étude a été menée, ciblant un métabolite bactérien spécifique, l’indole, dont certains dérivés oxydés par le foie sont connus pour avoir des propriétés neuroactives. L'indole est un métabolite naturel du microbiote intestinal, dont la surproduction pourrait survenir lors d'une dysbiose du microbiote. Deux cas de surproduction ont été modélisés : chronique et aiguë. Dans les deux cas, des modifications importantes du comportement de l'hôte ont été observées. En situation de surproduction chronique, l'indole favorise des comportements de type anxieux et dépressif, tandis qu'une surproduction aiguë a un effet sédatif marqué. D'un point de vue mécanistique, nous confirmons que l’indole peut agir sur le système nerveux central par la voie sanguine impliquant les dérivés oxydés et montrons pour la première fois qu'il peut aussi agir en activant les noyaux cérébraux du nerf vague. / The gastro-intestinal tract hosts a complex microbial community, the gut microbiota, whose collective genome coding capacity vastly exceeds that of the host genome. The involvement of the gut microbiota in various aspects of the host physiology, such as the nutritional metabolism and the immunity, has long been studied. In contrast, the possible action of the gut microbiota on brain development and functioning is a new line of research, still poorly explored. In this context, we performed a first general study of the effect of gut microbiota on the brain by comparing the sensory-motor functions, the anxiety-like behaviour, the activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis and the brain monoamine profile in germ-free and conventional F344 rats. The results show that, in this particularly stress-sensitive strain, absence of gut microbiota exacerbates the anxiety-like behaviour and neuroendocrine response to stress, and reduces brain dopamine metabolism. To investigate the means by which the microbiota can affect the brain, a second study was conducted, targeting a specific bacterial metabolite, indole, whose oxidative derivatives, produced by the liver, are known to have neuroactive properties. Indole is a natural metabolite of the gut microbiota, whoseoverproduction could occur during a microbiota dysbiosis. Two conditions of overproduction, namely chronic and acute, were modelled. In both cases, significant changes in the behaviour of the host were observed. In chronic overproduction, indole promotes anxiety- and depressive-like behaviours, while acute overproduction has a marked sedative effect. From a mechanistic point of view, we confirm that indole can act on the central nervous system through its oxidized derivatives and show for the first time that it can also act by activating the brain nuclei of the vagus nerve.

Le tube digestif héberge une communauté microbienne complexe, le microbiote intestinal, dont les capacités métaboliques sont plus riches et diversifiées que celles codées par le génome de l'hôte. L'implication du microbiote intestinal dans divers aspects de la physiologie de l'hôte, comme le métabolisme nutritionnel et l'immunité, est depuis longtemps étudiée. En revanche, l'action potentielle du microbiote sur le développement et le fonctionnement du cerveau constitue une nouvelle piste de recherche, encore peu explorée. Dans ce contexte, nous avons réalisé une première étude générale de l'action du microbiote intestinal sur le cerveau en comparant les fonctions sensori-motrices, le comportement de type anxieux, l'état d'activation de l'axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien et le profil cérébral des monoamines de rats F344 axéniques et conventionnels. Les résultats révèlent que, chez cette lignée particulièrement sensible au stress, l'absence de microbiote intestinal exacerbe le comportement de type anxieux et la réponse hormonale au stress, et atténue le métabolisme dopaminergique cérébral. Afin d'étudier par quel moyen le microbiote peut agir sur le cerveau, une seconde étude a été menée, ciblant un métabolite bactérien spécifique, l'indole, dont certains dérivés oxydés par le foie sont connus pour avoir des propriétés neuroactives. L'indole est un métabolite naturel du microbiote intestinal, dont la surproduction pourrait survenir lors d'une dysbiose du microbiote. Deux cas de surproduction ont été modélisés : chronique et aiguë. Dans les deux cas, des modifications importantes du comportement de l'hôte ont été observées. En situation de surproduction chronique, l'indole favorise des comportements de type anxieux et dépressif, tandis qu'une surproduction aiguë a un effet sédatif marqué. D'un point de vue mécanistique, nous confirmons que l'indole peut agir sur le système nerveux central par la voie sanguine impliquant les dérivés oxydés et montrons pour la première fois qu'il peut aussi agir en activant les noyaux cérébraux du nerf vague.

Le "gold-standard" du traitement chirurgical des scolioses est l'arthrodèse, qui consiste, à l'aide d'une instrumentation adaptée, à corriger et redresser les déformations scoliotiques, puis fusionner les vertèbres du segment pathologique afin de consolider la correction réalisée. Cette fusion entraine la destruction de la biomécanique physiologique du rachis, en supprimant sa mobilité et sa croissance. Les travaux réalisés dans le cadre de cette thèse portent sur le développement et la validation d'un nouveau concept d'instrumentation rachidienne ayant pour objectifs de réduire voire d'arrêter l'évolution des déformations rachidiennes, en conservant croissance et mobilité. Ce nouveau dispositif a nécessité une étude biomécanique large, partant du concept nouveau de cet implant, passant par la mise au point d'une méthodologie expérimentale, la conception et la réalisation de prototypes, puis leur validation à travers des études numériques, mécaniques, tribologiques et in vivo sur gros animal. La caractérisation in vitro du dispositif porte sur des essais mécaniques de caractérisation de matériau et des essais tribologiques de caractérisation du frottement. La caractérisation in vivo consiste en deux études menées sur gros animal, le modèle de porc Landrace, une première sur l'étude de l'arrachement de vis pédiculaires, puis une seconde, de validation de concept, avec 2 mois d'implantation du montage. Les premières conclusions tirées de ces travaux sont positives quant au bon fonctionnement du système. Des études en cours et à venir permettront de compléter ces résultats, et de valider le système dans son ensemble, afin de permettre sa future mise sur le marché. / The "gold standard" of surgical treatment of scoliosis is arthrodesis, which, with an appropriate instrumentation, corrects and straightens the deformities and fuses the vertebra of the pathologic segment to consolidate the correction. This fusion leads to the destruction of the physiological biomechanics of the spine, destroying growth and mobility. The work done in this thesis focuses on the development and validation of a new concept of spinal instrumentation which objectives are to reduce or even stop the development of spinal deformities, maintaining growth and mobility. This device is composed of materials used in new ways, leading to friction issues that do not exist in the current spinal systems. Thus, the system required a large biomechanical study, starting from the new concept of this implant, carrying on the development of an experimental methodology, designing and prototyping and then validation through numerical, mechanical, tribological and large animal in vivo studies. In vitro characterization of the device involves characterization of material through mechanical tests, and characterization of the tribological behavior of the system. In vivo characterization consists of two studies on large animal, the Landrace pig model : a first one on pedicle screws pullout, and a second one with 2 months of implantation, to validate the concept. The initial findings from this work are positive about the correct behavior of this system. Ongoing and future studies will complement those results, and validate the system as a whole, to allow future marketing.

La Spectroscopie de Résonance Magnétique (SRM) constitue un outil non-invasifunique pour l’exploration biochimique du métabolisme des organismes vivants. Cependant,en raison des champs magnétiques couramment utilisés chez l’homme etle petit animal, la SRM in vivo du proton ne permet pas de quantifier précisémentla concentration de tous les métabolites présents dans le cerveau. La SRM à deuxdimensions spectrales (SRM 2D), technique utilisée en routine en chimie, permetde séparer efficacement les signatures spectrales des métabolites facilitant ainsi leuridentification et leur quantification en termes de concentrations. Les travaux réalisésdans le cadre de cette thèse concernent le développement de méthodes d’acquisitionet de quantification de spectres RMN 2D J-résolus in vivo et sont présentéssuivant deux axes majeurs. Le premier axe concerne les travaux relatifs à la SRM2D J-résolue conventionnelle qui ont fait l’objet du développement d’une séquenceJ-PRESS sur un imageur 7 T pour l’acquisition de spectres 2D sur le cerveau de rat.Les données acquises sont traitées avec une méthode d’analyse spectrale développéeet optimisée spécifiquement pour la quantification de données SRM 2D J-résolues,reposant sur une connaissance a priori et un ajustement numérique dans le domainetemporel. Le second axe concerne les travaux relatifs à la réduction de la duréed’acquisition en SRM 2D avec le développement de techniques basées sur le conceptrécent de RMN ultrarapide. Une nouvelle séquence de SRM 2D J-résolue ultrarapidea été développée et validée sur un imageur 7 T et a permis l’acquisition de spectres2D complets avec une durée d’acquisition de l’ordre de la seconde. / In vivo proton Magnetic Resonance Spectroscopy (MRS) is a powerful tool for metabolicprofiling because this technique is non-invasive and quantitative. However,conventional localized spectroscopy presents important in vivo metabolic informationthrough overlapped spectral signatures greatly affecting the quantification accuracy.Two-dimensional (2D) MRS, originally developed for analytical chemistry,has great potential to unambiguously distinguish metabolites. Therefore, metabolitequantification is improved allowing accurate estimation of their concentrations. Inthis thesis, the research findings are presented under two main headings. The firstline of research focuses on conventional 2D MRS J-resolved. A J-PRESS sequencewas developed allowing the acquisition of in vivo 2D MRS spectra, which were processedby a dedicated quantification method. Experiments were performed on therat brain using a 7 T imaging system and different sampling strategies were evaluated.The quantification method, specifically developed to handle 2D J-resolved MRSdata quantification in time domain, is based on a strong prior-knowledge. However,2D MRS suffers from long acquisition times due to the collection of numerous incrementsin the indirect dimension. Therefore, the second line of research focuseson the reduction of acquisition time using recently developed methods based on theultrafast NMR concept. A new pulse sequence was designed, allowing 3D localizedultrafast 2D J-resolved spectroscopic acquisition on a 7T small animal imaging system. This breakthrough allows the acquisition of a complete 2D spectrum in a singlescan, resulting in acquisition times of a few seconds.

Le déoxynivalénol (DON) est une mycotoxine qui contamine la plupart des cultures de céréales dans toutes les régions du monde. Capable de résister aux procédés de transformation subies par les céréales, le DON peut se retrouver alors, à l'état de contaminants dans les matières premières (céréales) ainsi que dans les denrées alimentaires transformées destinées à l'Homme (pâtes, pain, bières) et à l'animal (granulés) à des concentrations supérieures aux limites règlementaires. Malgré les efforts de recherche pour caractériser les multiples aspects de l'impact d'une contamination par le DON, les effets bactériologiques de cette mycotoxine n'étaient pas encore documentés chez l'Homme. L'Agence Nationale de Sécurité Sanitaire (Anses), dans le cadre de sa mission de protection du consommateur, a donc souhaité évaluer l'impact d'une contamination au DON sur le microbiote intestinal humain (MIH). Dans cette étude, nous avons d'abord évalué la cinétique du DON chez le porc et chez le rat, puis nous avons utilisé un modèle de rats à flore humanisée pour évaluer l'impact d'une exposition sub-chronique de la mycotoxine sur la composition du MIH. Le DON est un contaminant rapidement distribué et éliminé. Au sein du tractus digestif, il entraine des changements bactériologiques significatifs chez certains principaux groupes bactériens composant le MIH. Cette étude apporte des données complémentaires à l'analyse du risque lié à l'exposition du DON chez l'Homme et montre l'intérêt des modèles animaux étudiés dans des scénarii particuliers d'exposition au DON.

Le déoxynivalénol (DON) est une mycotoxine qui contamine la plupart des cultures de céréales dans toutes les régions du monde. Capable de résister aux procédés de transformation subies par les céréales, le DON peut se retrouver alors, à l'état de contaminants dans les matières premières (céréales) ainsi que dans les denrées alimentaires transformées destinées à l'Homme (pâtes, pain, bières) et à l'animal (granulés) à des concentrations supérieures aux limites règlementaires. Malgré les efforts de recherche pour caractériser les multiples aspects de l'impact d'une contamination par le DON, les effets bactériologiques de cette mycotoxine n'étaient pas encore documentés chez l'Homme. L'Agence Nationale de Sécurité Sanitaire (Anses), dans le cadre de sa mission de protection du consommateur, a donc souhaité évaluer l'impact d'une contamination au DON sur le microbiote intestinal humain (MIH). Dans cette étude, nous avons d'abord évalué la cinétique du DON chez le porc et chez le rat, puis nous avons utilisé un modèle de rats à flore humanisée pour évaluer l'impact d'une exposition sub-chronique de la mycotoxine sur la composition du MIH. Le DON est un contaminant rapidement distribué et éliminé. Au sein du tractus digestif, il entraine des changements bactériologiques significatifs chez certains principaux groupes bactériens composant le MIH. Cette étude apporte des données complémentaires à l'analyse du risque lié à l'exposition du DON chez l'Homme et montre l'intérêt des modèles animaux étudiés dans des scénarii particuliers d'exposition au DON.

Notre équipe vient de découvrir une méthode originale d’obtention d’extraits de Bacteroides thetaiotaomicron (E) qui préserve sa viabilité. Après culture anaérobie de ce commensal intestinal en milieu gélosé pauvre en facteurs de croissance, puis exposition à l’air, la bactérie semble posséder et générer dans E tout l’équipement de détoxication des espèces réactives de l’oxygène in vitro. Il laisse alors augurer d’un pouvoir thérapeutique à visée anti-inflammatoire.Objectifs et méthodes : Le but est d’abord de caractériser E, aux plans glucidique, lipidique et protéique. Dans ce dernier cas, il s’agit de séparer les protéines produites par la bactérie vivante et contenues dans E par électrophorèse bidimensionnelle et de les identifier par la technique des cartes peptidiques massiques. Les gels (n≥6) sont traités statistiquement (PDQuest®, Bio-Rad). Pour mieux localiser ces protéines dans la bactérie, elles sont comparées avec celles obtenues par destruction de B. thetaiotaomicron et identifiées dans la fraction cellulaire relative à la membrane bactérienne externe. Un travail de microscopie électronique est aussi entrepris pour visualiser les éventuels évènements intervenant pendant l’extraction.Le but est alors de vérifier, in vitro, l’effet antioxydant de l’extrait bactérien standardisé et d’en contrôler l’innocuité en modèles cellulaires utilisant le granulocyte neutrophile. L’effet thérapeutique anti-inflammatoire est ensuite recherché chez l’animal. L’action de E est d’abord évaluée en modèle murin d’inflammation cutanée auriculaire induite par dépôt de chlorure de benzalkonium, sous anesthésie générale. Des témoins positifs et négatifs de traitement et d’autres ne subissant pas d’irritation sont testés en parallèle. L’épaisseur des oreilles est mesurée toutes les heures pendant 5 h et des coupes histologiques d’oreilles, effectuées au bout de 2 h chez certains animaux. Deux colorations différentes permettent alors d’évaluer la quantité de mastocytes dégranulant localement.L’action de E, administré par voie intra-rectale (IR), est ensuite testée chez des souris subissant les premières phases d’un processus inflammatoire, en modèle de colite aiguë. Celle-ci est induite per os par du dextran sulfate sodium (DSS) ; elle évolue sur 8 jours. Sont considérés en parallèle des témoins positifs et négatifs de traitement et d’autres ne subissant pas de colite. Des scores cliniques et des scores histologiques de sévérité sont établis tous les jours de l’expérience. Des marqueurs de l’inflammation sont suivis dans les tissus murins après autopsie des animaux. [...] / Our team had discovered a new method to obtain extracts of Bacteroides thetaiotaomicron (E) which preserved its viability. This intestinal symbiont was anaerobically grown on an agar medium poorly supplemented in growth factors. After exposure to air, the bacterium seemed to possess and generate in E all the equipment able in vitro to detoxify reactive oxygen species. It let us expect a therapeutic power referred to anti-inflammatory properties.Objectives and methods: The aim was first to characterize E, in terms of carbohydrates, lipids and proteins. To achieve this last-mentioned goal, proteins contained in E coming from living bacteria were separated by two-dimensional electrophoresis and identified by the peptide mass fingerprinting technique. The gels (n ≥ 6) were statistically analyzed (PDQuest®, Bio-Rad). To find the origin of these proteins in bacteria, they were compared with those obtained by destruction of B. thetaiotaomicron (BT) and identified in the cell fraction containing the bacterial outer membrane proteins. Electron microscopy work was also undertaken to visualize any event occurring during extraction.The antioxidative effect of standardized E extracts was checked in vitro. E safety was also controlled in cell models using polymorphonuclear neutrophils. An E anti-inflammatory effect was then searched in animal models. E was first evaluated using a skin irritation mouse model. Inflammation was induced by benzalkonium chloride on ears of anesthetized mice. Positive and negative controls were treated in parallel. The ear thickness was measured every hour for 5 h and histological ear sections were performed after 2h for some animals. Two different staining methods enabled the enumeration of degranulating mast cells in ear sections.The effect of the bacterial extract was next tested locally by intrarectal (IR) instillations in mice undergoing the early stages of inflammation in a dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis. This acute model evolved over 8 days. In parallel, positive and negative animal controls underwent or not the colitis and were treated or not. Clinical and colonic histological severity scores were daily determined. Inflammation markers were measured in mouse colonic tissues after animal autopsy. [...]