EPEC atípicas (EPECa) são isoladas de surtos diarréicos em crianças, adultos e animais em países industrializados e em desenvolvimento. Hemolisinas são toxinas que atuam sobre a membrana de eritrócitos e de diversos tipos celulares. Tal grupo de toxinas é reconhecido como importante fator de virulência envolvido na patogênese bacteriana, por isso o objetivo foi avaliar a expressão de enterohemolisina em isolados de EPECa e analisar características fenotípicas como interferência do meio de cultivo e adesão a componentes de matriz extracelular. Observou-se prevalência de 5,4% de isolados enterohemolíticos, e variações na expressão da toxina foram associadas à concentrações de lactose e caseína nos meios de cultivo. Além disso, verificou-se forte associação entre produção de enterohemolisina e ligação à fibronectina celular. / Atypical EPEC (aEPEC) are isolated from diarrheal outbreaks in children, adults and animals in industrialized and developing countries. Hemolysins are toxins that act on the red cell membrane and various cell types. This group of toxins is recognized as an important virulence factor involved in the bacterial pathogenesis. The aim of this study was the evaluation of the enterohemolysin expression in aEPEC isolates as interference of the culture media and adhesion to components of extracellular matrix. The prevalence of enterohemolytic isolates was 5.4%, and variations in toxin expression were associated with lactose and casein concentrations in culture media. Moreover, it was found association between production of enterohemolysin and adhesion to cellular fibronectin.

Glioblastoma multiforme (G BM), ou astrocitoma grau IV, é o tumor mais comum e letal do sistema nervoso central. Uma de suas características mais marcantes é seu alto potencial invasivo do tecido normal adjacente. Neste processo, o remodelamento da matriz extracelular, modulado por enzimas que degradam seus componentes e por inibidores destas enzimas, é crucial. Foi descrito que a expressão de MMP-2 e MMP-9, membros da família das metaloproteinases de matriz, aumentam conforme a progressão de astrocitomas. A variante canônica de RECK suprime a invasão tumoral e metástase através da inibição da atividade de, pelo menos, três MMPs: MMP-2, MMP-9 e MMP-14. Uma correlação positiva tem sido observada entre a abundância da expressão de RECK em amostras tumorais e um prognóstico mais favorável para pacientes com diversos tipos de tumores. Neste estudo, variantes de splicing do gene supressor de tumor RECK foram identificadas através da análise de Expressed sequenced Tags (ESTs), isoladas por RT-PCR, sequenciadas e clonadas. Três novas variantes de splicing do gene RECK foram identificadas e caracterizadas. O perfil de expressão dos transcritos de RECK foi determinado através de ensaios de RT-PCR quantitativo em um painel de tecidos normais e, também, durante a progressão de astrocitomas. Foram utilizadas, para esta análise, amostras macro dissecadas de tumores de pacientes com astrocitomas grau I (n=15), II (n=15), III (n=15) e GBMs (n=30). Os resultados mostram que maior expressão de RECK canônico, acompanhada de maior razão de expressão da variante canônica em relação às variantes de splicing alternativo, correlaciona positivamente com maior sobrevida global de pacientes com GBM, sugerindo seu papel como potenciais biomarcadores para o prognóstico destes pacientes. Análise funcional das isoform as de RECK em células U87 MG revelou que as células superexpressando as isoformas não apresentam inibição do processo de invasão celular, como observado para superexpressão da proteína canônica. Dentre as isoformas analisadas, destaca-se RECK-B, isoforma potencialmente ancorada à membrana plasmática por GPI, como a proteína canônica RECK, sugerindo uma possível colocalização destas variantes. Observa-se que células superexpressando RECK-B apresentam maior capacidade tumorigênica. Os resultados indicam que as variantes de RECK e o balanço entre a expressão destas variantes, apresentam um papel importante no comportamento e na agressividade de GBMs, tendo potencial valor na clínica. Além disso, para abrir perspectivas para o estudo das variantes de RECK, o balanço de expressão dos transcritos canônico e alternativos deste gene foi explorado durante os processos de diferenciação osteogênica e adipogênica. Os resultados indicam que a expressão da variante canônica é mais abundante em relação à expressão de suas isoformas em estágios tardios da adipogênese, sendo que o perfil inverso é observado em relação à isoforma B durante a osteogênese, sugerindo que o balanço entre os níveis de expressão das isformas de RECK possui um potencial papel biológico que deve ser explorado durante esses processos. Em conjunto, os resultados demonstram a existência de, pelo menos, três variantes de splicing do gene supressor de tumor RECK com envolvimento na tumorigênese e na diferenciação celular, abrindo novas perspectivas para o estudo e a aplicação do gene RECK na clínica. / Glioblastoma multiforme (GBM) or grade IV astrocytoma is the most common and lethal tumor of the central nervous system. One of the most striking features of GBMs is their invasive potential of the normal surrounding brain tissue. It has been described that MMP-2 and MMP-9 expression levels increase during astrocytoma progression. Canonical RECK suppresses tumor invasion and metastasis by negatively regulating at least three matrix metalloproteinases, namely: MMP-9, MMP-2 and MT1-MMP. A positive correlation has been observed between the abundance of RECK express ion in tumor samples and a more favorable prognosis for patients with several types of tumors. In this study, splice variants of the RECK tumor suppressor gene were identified by Expressed Sequence Tag (EST) analysis, isolated by RT-PCR, sequenced and cloned. Three novel alternatively spliced variants of the RECK tumor suppressor gene were identified and characterized. The RECK transcripts expression profiles were investigated using quantitative RT-PCR assays in a normal tissue RNA panel and, also, during astrocytoma progression in macrodissected tumor samples of patients with astrocytoma grades I (n=15), II (n=15), III (n=15) and IV/GBM (n=30). The results show that higher canonical RECK expression, accompanied by a higher ratio of canonical to alternative transcript expression, positively correlated with higher overall survival rate after chemotherapeutic treatment of GBM patients. Our findings suggest that these RECK transcript variants may potentially be used as biomarkers for prognosis of GBM patients. U87 MG cells overexpressing each RECK alternative variant were generated and found to lack the supressive role of cellular invasion processes found upon overexpressing the canonical protein. Among the characterized isoforms, RECK-B stands out, since this isoform is potentially anchored to the cell membrane by a GPI anchor, exactly as the canonical RECK and, also, since cells overexpressing RECK-B display greater tumorigenic capacity. The results indicate that RECK variants and the balance between the expressions of these variants, play an important role in the behavior and aggressiviness of GBMs, therefore have a potential translational application. In addition, in order to investigate new perspectives for the analysis of these isoforms, the expression balance of RECK transcripts was assessed during osteogenesis and adipogenesis, by qRT - PCR. The results show that the expression of the canonical RECK variant is more abundant that that of its alternative isoforms in later stages of adipogenic differentiation. The opposite profile is found regarding RECK-B during osteogenesis, suggesting that the balance between the expressions of these transcripts may have a potential role during these processes. Taken together, the results show the existence of, at least, three alternatively spliced variants of the RECK tumor suppressor gene, which are involved in tumogigenesis and cellular differentiation, o pening new perspectives for studies and clinical application of the RECK gene.

Glioblastoma multiforme (G BM), ou astrocitoma grau IV, é o tumor mais comum e letal do sistema nervoso central. Uma de suas características mais marcantes é seu alto potencial invasivo do tecido normal adjacente. Neste processo, o remodelamento da matriz extracelular, modulado por enzimas que degradam seus componentes e por inibidores destas enzimas, é crucial. Foi descrito que a expressão de MMP-2 e MMP-9, membros da família das metaloproteinases de matriz, aumentam conforme a progressão de astrocitomas. A variante canônica de RECK suprime a invasão tumoral e metástase através da inibição da atividade de, pelo menos, três MMPs: MMP-2, MMP-9 e MMP-14. Uma correlação positiva tem sido observada entre a abundância da expressão de RECK em amostras tumorais e um prognóstico mais favorável para pacientes com diversos tipos de tumores. Neste estudo, variantes de splicing do gene supressor de tumor RECK foram identificadas através da análise de Expressed sequenced Tags (ESTs), isoladas por RT-PCR, sequenciadas e clonadas. Três novas variantes de splicing do gene RECK foram identificadas e caracterizadas. O perfil de expressão dos transcritos de RECK foi determinado através de ensaios de RT-PCR quantitativo em um painel de tecidos normais e, também, durante a progressão de astrocitomas. Foram utilizadas, para esta análise, amostras macro dissecadas de tumores de pacientes com astrocitomas grau I (n=15), II (n=15), III (n=15) e GBMs (n=30). Os resultados mostram que maior expressão de RECK canônico, acompanhada de maior razão de expressão da variante canônica em relação às variantes de splicing alternativo, correlaciona positivamente com maior sobrevida global de pacientes com GBM, sugerindo seu papel como potenciais biomarcadores para o prognóstico destes pacientes. Análise funcional das isoform as de RECK em células U87 MG revelou que as células superexpressando as isoformas não apresentam inibição do processo de invasão celular, como observado para superexpressão da proteína canônica. Dentre as isoformas analisadas, destaca-se RECK-B, isoforma potencialmente ancorada à membrana plasmática por GPI, como a proteína canônica RECK, sugerindo uma possível colocalização destas variantes. Observa-se que células superexpressando RECK-B apresentam maior capacidade tumorigênica. Os resultados indicam que as variantes de RECK e o balanço entre a expressão destas variantes, apresentam um papel importante no comportamento e na agressividade de GBMs, tendo potencial valor na clínica. Além disso, para abrir perspectivas para o estudo das variantes de RECK, o balanço de expressão dos transcritos canônico e alternativos deste gene foi explorado durante os processos de diferenciação osteogênica e adipogênica. Os resultados indicam que a expressão da variante canônica é mais abundante em relação à expressão de suas isoformas em estágios tardios da adipogênese, sendo que o perfil inverso é observado em relação à isoforma B durante a osteogênese, sugerindo que o balanço entre os níveis de expressão das isformas de RECK possui um potencial papel biológico que deve ser explorado durante esses processos. Em conjunto, os resultados demonstram a existência de, pelo menos, três variantes de splicing do gene supressor de tumor RECK com envolvimento na tumorigênese e na diferenciação celular, abrindo novas perspectivas para o estudo e a aplicação do gene RECK na clínica. / Glioblastoma multiforme (GBM) or grade IV astrocytoma is the most common and lethal tumor of the central nervous system. One of the most striking features of GBMs is their invasive potential of the normal surrounding brain tissue. It has been described that MMP-2 and MMP-9 expression levels increase during astrocytoma progression. Canonical RECK suppresses tumor invasion and metastasis by negatively regulating at least three matrix metalloproteinases, namely: MMP-9, MMP-2 and MT1-MMP. A positive correlation has been observed between the abundance of RECK express ion in tumor samples and a more favorable prognosis for patients with several types of tumors. In this study, splice variants of the RECK tumor suppressor gene were identified by Expressed Sequence Tag (EST) analysis, isolated by RT-PCR, sequenced and cloned. Three novel alternatively spliced variants of the RECK tumor suppressor gene were identified and characterized. The RECK transcripts expression profiles were investigated using quantitative RT-PCR assays in a normal tissue RNA panel and, also, during astrocytoma progression in macrodissected tumor samples of patients with astrocytoma grades I (n=15), II (n=15), III (n=15) and IV/GBM (n=30). The results show that higher canonical RECK expression, accompanied by a higher ratio of canonical to alternative transcript expression, positively correlated with higher overall survival rate after chemotherapeutic treatment of GBM patients. Our findings suggest that these RECK transcript variants may potentially be used as biomarkers for prognosis of GBM patients. U87 MG cells overexpressing each RECK alternative variant were generated and found to lack the supressive role of cellular invasion processes found upon overexpressing the canonical protein. Among the characterized isoforms, RECK-B stands out, since this isoform is potentially anchored to the cell membrane by a GPI anchor, exactly as the canonical RECK and, also, since cells overexpressing RECK-B display greater tumorigenic capacity. The results indicate that RECK variants and the balance between the expressions of these variants, play an important role in the behavior and aggressiviness of GBMs, therefore have a potential translational application. In addition, in order to investigate new perspectives for the analysis of these isoforms, the expression balance of RECK transcripts was assessed during osteogenesis and adipogenesis, by qRT - PCR. The results show that the expression of the canonical RECK variant is more abundant that that of its alternative isoforms in later stages of adipogenic differentiation. The opposite profile is found regarding RECK-B during osteogenesis, suggesting that the balance between the expressions of these transcripts may have a potential role during these processes. Taken together, the results show the existence of, at least, three alternatively spliced variants of the RECK tumor suppressor gene, which are involved in tumogigenesis and cellular differentiation, o pening new perspectives for studies and clinical application of the RECK gene.

Orientador: Edson Rosa Pimentel / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T20:40:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Almeida_MarcosdosSantosde_M.pdf: 1553509 bytes, checksum: 83b5ab6bad050eff3b5f36b0524643b3 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A eletroacupuntura (EA) tem sido utilizada amplamente para o tratamento de uma variedade de doenças inflamatórias e para o alivio da dor. No entanto, não há relatos na literatura sobre o efeito da EA na composição e organização da matriz extracelular (MEC) de tendões em processo de cicatrização. Objetivo: Investigar através de análises bioquímicas e morfológicas, o efeito da EA durante o pico de síntese dos componentes da MEC, 15 dias após transecção parcial do tendão calcâneo de ratos. Materiais e Métodos: Ratos Wistar machos com 60 dias de idade foram divididos em 3 grupos: Não tenotomizados (G1), tenotomizados (G2) e tenotomizados e submetidos a EA (G3). Agulhas de acupuntura (AC) foram inseridas nos pontos E-36 e B-57 e uma corrente elétrica com onda farádica bipolar assimétrica na freqüência de 2 Hz e intensidade de 2-4 Volts foi aplicada nas agulhas por 20 minutos, 3 vezes por semana em dias alternados, em um total de 6 sessões. Análises bioquímicas foram feitas através da SDS-PAGE, dosagem de proteínas não colagênicas (PNCs), glicosaminoglicanos (GAGs) e hidroxiprolina. Análise da metaloproteinase-2 (MMP-2) foi realizada por zimografia. Para análise morfológica em microscopia de luz comum, os cortes foram corados com hematoxilina-eosina (HE) e azul de toluidina (AT). Para análise em microscopia de polarização os cortes foram corados com Ponceau SS e a birrefringência foi avaliada em termos de valor de média de cinza em pixels utilizando um analisador de imagem. Resultados: EA nos pontos utilizados não alterou a concentração de PNCs, GAGs ou a atividade enzimática da MMP-2 nos tendões transeccionados. Já a concentração de hidroxiprolina foi significativamente aumentada nestes tendões quando tratados com EA. Na análise morfológica nos cortes corados com HE e AT, aparentemente não houve alterações na composição nem na organização da MEC. No entanto, na análise da birrefringência houve uma maior reorganização das fibras de colágeno no grupo tratado com EA. Conclusão: Nossos resultados indicam que a EA pode oferecer benefícios terapêuticos para o tratamento de lesões tendíneas através do aumento do conteúdo do colágeno e da reorganização molecular de suas fibras / Abstract: Electroacupuncture (EA) has been used to treat a variety of inflammatory diseases and pain relief. Therefore, there are no reports in the literature about the effect of EA on the composition and organization of the extracellular matrix (ECM) of tendons in the healing process. Objective: To investigate by morphological and biochemical analysis, the effect of EA during the peak of synthesis of ECM components, 15 days after partial transection of the Achilles tendon of rats. Methods: Male Wistar rats with 60 days old were divided into three groups: no tenotomized (G1), tenotomized (G2) and tenotomized and submitted to EA (G3). Acupuncture (AC) needles were inserted in the E-36 and B-57 points and an electrical current with asymmetrical bipolar faradic wave at frequency of 2 Hz and intensity of 2-4 Volts was applied to the needles for 20 minutes, 3 times per week on alternate days, for a total of 6 sessions. Biochemical analyses were done by SDS-PAGE, dosage of non collagenous proteins (NCPs), glycosaminoglycans (GAGs) and hydroxyproline. Analysis of metalloproteinase-2 (MMP-2) was carried out by zymography. For morphological analyses, the sections were stained with hematoxilin-eosin (HE) and toluidine blue. For polarization microscopy analysis the sections were stained with Ponceau SS and birefringence was evaluated in terms of gray average values in pixels using an image analyzer. Results: EA at points used did not alter the concentration of NCPs, GAGs or the enzymatic activity of MMP-2 in transected tendons. However, the concentration of hydroxyproline was significantly increased when these tendons were treated with EA. In the morphological analysis, apparently there were no changes in the composition and organization of the ECM. However, analysis of the birefringence showed higher reorganization of collagen fibers in the group treated with EA. Conclusion: Our results indicate that EA may offer therapeutic benefits for treatment of tendon injuries by increasing the content of collagen and the molecular reorganization of its fibers / Mestrado / Anatomia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

EPEC atípicas (EPECa) são isoladas de surtos diarréicos em crianças, adultos e animais em países industrializados e em desenvolvimento. Hemolisinas são toxinas que atuam sobre a membrana de eritrócitos e de diversos tipos celulares. Tal grupo de toxinas é reconhecido como importante fator de virulência envolvido na patogênese bacteriana, por isso o objetivo foi avaliar a expressão de enterohemolisina em isolados de EPECa e analisar características fenotípicas como interferência do meio de cultivo e adesão a componentes de matriz extracelular. Observou-se prevalência de 5,4% de isolados enterohemolíticos, e variações na expressão da toxina foram associadas à concentrações de lactose e caseína nos meios de cultivo. Além disso, verificou-se forte associação entre produção de enterohemolisina e ligação à fibronectina celular. / Atypical EPEC (aEPEC) are isolated from diarrheal outbreaks in children, adults and animals in industrialized and developing countries. Hemolysins are toxins that act on the red cell membrane and various cell types. This group of toxins is recognized as an important virulence factor involved in the bacterial pathogenesis. The aim of this study was the evaluation of the enterohemolysin expression in aEPEC isolates as interference of the culture media and adhesion to components of extracellular matrix. The prevalence of enterohemolytic isolates was 5.4%, and variations in toxin expression were associated with lactose and casein concentrations in culture media. Moreover, it was found association between production of enterohemolysin and adhesion to cellular fibronectin.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:30:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_Bianca_Palma_Santana.pdf: 5946140 bytes, checksum: fbcbf4959ad9ccac3ca669ef232ffb3b (MD5) Previous issue date: 2011-12-06 / The development of scaffolds for tissue engineering should be biocompatible, where the degradation products should not be cytotoxic, tumorigenic, nephrotoxic or cause any toxic effects to the body. Despite the widespread use in tissue engineering, there is an effort to improve the functionality of this material for future applications. Important parameters should be observed in connection with properties that could influence the behavior of cells: pore size, pore shape, and surface treatment, for example. Among the materials used for the production of scaffolds, natural polymers have been the most widely used, given its high design flexibility and degradability. Scaffolds using nano-materials allow a greater similarity to natural extracellular matrix and these systems could be combined with biological inducers (eglectins) to address specific biological responses. The aim of our research is to obtain an alginate hydrogel functionalized nano/micro fiber based hydroxyapatite and titanium dioxide as well as bioactive substances (lectins), to the application in vitro for later use in the pulp tissue regeneration / O desenvolvimento de scaffolds para aplicação na engenharia tecidual deve ser biocompatível, onde os produtos de degradação não devam ser citotóxicos, tumorigênicos, nefrotóxicos ou causar qualquer outro efeito tóxico ao organismo. Apesar do largo uso em engenharia tecidual, existe um esforço para melhorar a funcionalidade deste material para futuras aplicações. Parâmetros importantes deveriam ser observados em relação às propriedades que poderiam influenciar o comportamento celular: tamanho dos poros, formato dos poros, e tratamento da superfície, por exemplo. Dentre os materiais utilizados pela produção de scaffolds, os polímeros naturais têm sido os mais empregados, dada a sua grande flexibilidade de desenho e degradabilidade. Scaffolds utilizando nano-materiais permitem uma similaridade maior com a matriz extracelular natural e estes sistemas poderiam ser combinados com indutores biológicos (por exemplolectinas) para direcionar respostas biológicas específicas. O objetivo geral de nossa pesquisa é obter um hidrogel de alginato funcionalizado com nano/micro fibras a base de hidroxiapatita e dióxido de titânio, bem como substâncias bioativas (lectinas), visando à aplicação in vitro para futura utilização em regeneração do tecido pulpar

Aneurismas e dissecções da aorta ascendente são caracterizados por degradação das fibras elásticas e de colágeno e diminuição de células musculares lisas, predominantemente em áreas mucóides, as quais são relacionadas ao acúmulo de glicosaminoglicanos ou proteoglicanos. Tendo em vistas tais alterações, estudamos a topologia das metaloproteases nestas doenças. Cortes de 5?m de aortas, fixadas em fomol e embebidas em parafina, foram submetidos a reações imuno-histoquímicas para MMP-3 (estromelisina), MMP-7 (matrilisina) e plasminogênio/plasmina na camada média. Em paralelo, cortes de aortas foram submetidos a coloração pela hematoxilina e eosina e azul de Alcian (para material mucóide). Aortas de 8 pacientes com aneurisma de aorta torácica e 10 com dissecções agudas foram analisadas. Adicionalmente, 9 aortas normais foram estudadas como controle. Em todos os casos, MMP-3 e, mais expressivamente, MMP-7 apresentaram marcação dentro dos acúmulos mucóides. Em contrapartida, a marcação para plasmina/plasminogênio situou-se ao redor deles. Fora dessas áreas, a MMP-3 mostrou distribuição intra e extracelular, a MMP-7 apresentou marcação intra e extracelular predominante na segunda metade da túnica média, e plasmina/plasminogênio teve co-localização com células musculares lisas. Considerando que matrilisina e estromelisina atuam sobre os proteoglicanos e sobre outros componentes da matriz extracelular, estas enzimas poderiam estar envolvidas diretamente na gênese dos aneurismas e dissecções da aorta ascendente, com possível modulação por plasminogênio/plasmina / In dissections and non-inflammatory aneurysms of the ascending aorta there is an increase in mucoid (proteoglycan) deposition. We analyzed by immunoperoxidase the distribution of stromelysin (MMP-7), matrilysin (MMP-3) and plasminogen/plasmin, enzymes that act on proteoglycans, in sections of human aortas with these diseases and in controls. In cases with any of these diseases MMP-7 and MMP-3 were accumulated in the areas of mucoid degeneration, and plasmin around them. Such enzymes could thus be involved in these diseases. We also evaluated by morphometry the amount of collagen in the two halves of the aortic media.

A matriz extracelular do endométrio (ECM) é constituída por moléculas secretadas que compõem o microambiente celular e são ativadas ou suprimidas principalmente pelos hormônios esteróides ovarianos, estradiol (E2) e progesterona (P4) durante o ciclo estral. A identificação de genes envolvidos no remodelamento e receptividade pode levar à descoberta de importantes processos biológicos ligados ao sucesso gestacional. Os objetivos foram: 1. identificar a relação de diferentes tamanhos de folículos pré-ovulatórios (FPO) e corpo lúteo (CL) e de seus respectivos hormônios E2 e P4 com a expressão endometrial de genes associados com o remodelamento da ECM durante o período de pré-implantação; e 2. analisar a relação entre a expressão gênica de determinados componentes da ECM avaliada no dia 6 após inseminação artificial (IA) com sucesso gestacional. Para tal, dois experimentos foram realizados. No experimento 1, estudo 1 e estudo 2, 42 e 74 vacas Nelore (Bos indicus) adultas, respectivamente foram sincronizadas obtendo-se ao final dois grupos com distintos tamanhos FPO e CL consequentemente, distintas concentrações de E2 no proestro e P4 no diestro. Os grupos foram: Folículo Grande-CL Grande (FG-CLG; estudo 1, n=20; estudo 2, n=35) e Folículo Pequeno-CL Pequeno (FP-CLP; estudo 1, n=22; estudo 2, n=39). Amostras de tecido endometrial foram coletadas por biópsia no D0 (estro) e pós-mortem no D4 (estudo 1) e D7 (estudo 2). Concentrações de E2 e P4 foram mensuradas por radioimunoensaio (RIA) obtendo- se menores concentrações no grupo FP-CLP. No experimento 2, vacas adultas, Nelore (Bos indicus; n=33) foram sincronizadas utilizando um protocolo a base de prostaglandina F 2α (PGF2α) e observação de estro. As vacas foram inseminadas artificialmente (IA) e seis dias após, uma biópsia endometrial coletada. O diagnóstico de gestação foi realizado após 30 dias por meio de ultrasonografia (US) e então as vacas foram divididas em grupo Prenhe e Não- Prenhe (P e NP) para análise retrospectiva. Abundância de transcritos foi avaliada por sequenciamento (RNAseq) assim como qPCR em amostras de ambos experimentos. Realizaram-se também exames histológicos em amostras do D4 e D7 (estudo 2) para avaliação de colágeno total assim como espessura de fibras colágenas. Resultados determinaram uma maior abundância de transcritos relacionados ao remodelamento de MEC, em destaque TGFβ, MMPs, TIMPs e colágenos em vacas pertencentes aos grupos NP e FP-CLP. O mesmo foi observado para abundância de colágeno. No entanto, não observou-se diferença na relação entre fibras grossas e finas entre os tratamentos. Análises de correlação e regressão indicaram que folículos pré-ovulatórios de maior tamanho geram CL maiores e assim maiores concentrações de P4, a qual está negativamente associada à abundância de colágenos. Assim, de acordo com resultados aqui descritos, assume-se que a alteração da homeostase da MEC devido ao incremento na abundância de colágeno pode ser prejudicial à gestação em bovinos. / The endometrial extracellular matrix (ECM) é build up of secretory molecules that make up the cellular microenvironment and suffer activation or suppression mainly by the ovarian steroid hormones, estradiol (E2) and progesterone (P4) during the estrous cycle. The identification of genes involved in endometrial remodeling and receptivity may reveal important biological processes linked to gestational success. The objectives were: 1. identify the relationship among preovulatory follicle (POF) size and corpus luteum (CL) and its respective hormones, E2 and P4 on the endometrial expression of genes related to extracellular matrix remodeling during the pre-implantation period; and 2. analyze the relationship between endometrial ECM gene expression evaluated on day 6 post artificial insemination (AI) with pregnancy outcome. For such, two experiments were carried on. On experiment 1, study 1 and study 2, 42 and 74, respectively, adult Nelore (Bos indicus) cows were synchronized aiming to manipulate the peri-ovulatory endocrine environment, obtaining at the end of the protocol, two groups with distinct pre-ovulatory follicle (POF) and corpus luteum (CL) sizes, leading to groups with distinct E2 and P4 concentrations. The groups were: Large Follicle/CL (LF/CL; study 1, n=20, study 2, n=35) and Small Follicle/Cl (SF/CL; study 1, n=22; study 2, n=39). Endometrial samples were collected by biopsy on D0 (Estrus) and post-mortem on D4 and on study 2 post-mortem on D7. P4 and E2 concentrations were measured by RIA with a significative difference between the groups, being lower hormonal concentrations in the SF- SCL group and higher concentrations in the LF-LCL group . In experiment 2, adult Nelore (Bos indicus) cows (n=33) were synchronized using a prostaglandin 2α (PGF2α) and heat detection based protocol. The cows were AI and six days after an endometrial biopsy was collected. Pregnancy diagnosis was performed on day 30 by ultrasound (US) examination and cows were divided into pregnant and non-pregnant (P vs. NP) groups for a retrospective analysis. Histology was performed on D4 and D7 samples for total collagen abundance as well as fiber thickness. Correlation and regression analysis indicate that larger preovulatory follicles as well as higher P4 concentrations have a negative effect on collagen content. RNA- Seq analysis and confirmation by qPRC was performed on selected samples from experiment 1, study 2 and experiment 2. Comparison of mRNA levels of ECM components samples revealed higher levels of transcripts envolved in ECM remodeling, highlighting TGFβ MMPs, TIMPs and collagens in NP cows when compared with P cows as well as in the SF- SCL compared to the LF-LCL group. The same was observed for collagen abundance. However, there was no difference between thin and thick collagen fibers between treatments. Correlation and regression analysis indicate that larger POF lead to larger CL and hence, higher P4 concentrations, which has a negative effects on collagen abundance. Therefore, according to the results presented here, we can imply that an alteration in ECM homeostasis due to increased collagen abundance may be harmful to pregnancy in cows.

Orientador: Vera Luiza Capelozzi / Coorientador: Claudia Aparecida Rainho / Banca: João Lauro Viana de Camargo / Banca: Thais Helena A. Thomaz Queluz / Banca: Alexandra Muxfeldt Ab'Saber / Banca: Rimarcs Gomes Ferreira / Resumo: A fibrose pulmonar é a base patológica de uma variedade de doenças crônicas incuráveis. A IL-17A, uma glicoproteína secretada de células Th17, é uma citocina pró-fibrótica relacionada recentemente à síntese de colágeno V e fibrose pulmonar. O remodelamento parenquimatoso pulmonar da matriz extracelular pelo colágeno I e V, apoptose e resposta Th17 foi estudado em camundongos Balb/c, C57/B6J selvagens e com knockout para o receptor A da IL-17; para determinar as vias fisiopatológicas que prolongam a fase tardia do processo fibrótico induzido por bleomicina e paraquat. Microscopia eletrônica, imunofluorescência, imunohistoquímica, detecção in situ da apoptose, morfometria, reconstrução tridimensional e reação em cadeia da polimerase em tempo real foram usados para avaliar a quantidade, estrutura e cadeias moleculares dos tipos de colágenos, apoptose e células imunes. Verificamos um aumento da síntese e secreção do colágeno V que promove a perpetuação da fibrose pulmonar de maneira IL-17A dependente. Além disso, observou-se que marcadores críticos da resposta Th17 como IL17, STAT3, TGF-β, IL-6, IL- 21, IL-23 e células T CD4+ foram significantemente aumentados em cepas susceptíveis a fibrose pulmonar e intensificadas na ausência do receptor A da IL-17. O aumento de marcadores Th17 resulta em um aumento de células T CD4+ através de uma resposta imune que efetivamente bloqueia a degradação do colágeno V, o qual contribui para o bloqueio da apoptose. Nosso estudo indica que o colágeno V participa da perpetuação da fibrose pulmonar por mecanismos IL-17 dependente e independentes, indicando o potencial alvo terapêutico do colágeno V e das vias de sinalização da resposta IL-17 no tratamento das doenças fibroproliferativas pulmonares / Abstract: Pulmonary fibrosis is the pathologic basis for a variety of incurable human chronic lung diseases. IL-17A, a glycoprotein secreted from IL-17- producing cells, has recently been shown to be a profibrotic cytokine involved in type V collagen synthesis and pulmonary fibrosis. Remodeling of the extracellular matrix by collagen I and V, cell death and Th-17 immune response were evaluated in Balb/c, wild and IL-17 receptor A knockout C57/B6J mice, to determine the pathways that prolong the late phase of the fibrotic process induced by bleomycin and paraquat. Electron microscopy, immunofluorescence, immunohistochemistry, in situ detection of apoptosis, morphometry, tridimensional reconstruction and a real-time PCR were used to evaluate the amount, structure and molecular chains of collagen types, apoptosis and immune cells. We verified increased synthesis and secretion of type V collagen that promoted the maintenance of pulmonary fibrosis in a IL-17A dependent manner. However, we observed that the critical Th17 markers, IL-17, STAT3, TGF-β, IL-6, IL-21, IL-23 and CD4+ T cells, were significantly increased in the fibrosis-susceptible strain and intensified in the absence of IL-17 receptor A. Increased Th17 markers resulted in an increase in CD4+ T cells in fibrotic lung tissue toward an immune response that effectively blocked degradation of collagen V, which contributes to block apoptosis. Our studies indicate that collagen V participates in the maintenance of pulmonary fibrosis in both Th-17 - dependent and -independent manners and that collagen V and the components of the Th-17 signaling pathway are potential therapeutic targets for the treatment of fibroproliferative lung diseases / Doutor

A matriz extracelular do endométrio (ECM) é constituída por moléculas secretadas que compõem o microambiente celular e são ativadas ou suprimidas principalmente pelos hormônios esteróides ovarianos, estradiol (E2) e progesterona (P4) durante o ciclo estral. A identificação de genes envolvidos no remodelamento e receptividade pode levar à descoberta de importantes processos biológicos ligados ao sucesso gestacional. Os objetivos foram: 1. identificar a relação de diferentes tamanhos de folículos pré-ovulatórios (FPO) e corpo lúteo (CL) e de seus respectivos hormônios E2 e P4 com a expressão endometrial de genes associados com o remodelamento da ECM durante o período de pré-implantação; e 2. analisar a relação entre a expressão gênica de determinados componentes da ECM avaliada no dia 6 após inseminação artificial (IA) com sucesso gestacional. Para tal, dois experimentos foram realizados. No experimento 1, estudo 1 e estudo 2, 42 e 74 vacas Nelore (Bos indicus) adultas, respectivamente foram sincronizadas obtendo-se ao final dois grupos com distintos tamanhos FPO e CL consequentemente, distintas concentrações de E2 no proestro e P4 no diestro. Os grupos foram: Folículo Grande-CL Grande (FG-CLG; estudo 1, n=20; estudo 2, n=35) e Folículo Pequeno-CL Pequeno (FP-CLP; estudo 1, n=22; estudo 2, n=39). Amostras de tecido endometrial foram coletadas por biópsia no D0 (estro) e pós-mortem no D4 (estudo 1) e D7 (estudo 2). Concentrações de E2 e P4 foram mensuradas por radioimunoensaio (RIA) obtendo- se menores concentrações no grupo FP-CLP. No experimento 2, vacas adultas, Nelore (Bos indicus; n=33) foram sincronizadas utilizando um protocolo a base de prostaglandina F 2α (PGF2α) e observação de estro. As vacas foram inseminadas artificialmente (IA) e seis dias após, uma biópsia endometrial coletada. O diagnóstico de gestação foi realizado após 30 dias por meio de ultrasonografia (US) e então as vacas foram divididas em grupo Prenhe e Não- Prenhe (P e NP) para análise retrospectiva. Abundância de transcritos foi avaliada por sequenciamento (RNAseq) assim como qPCR em amostras de ambos experimentos. Realizaram-se também exames histológicos em amostras do D4 e D7 (estudo 2) para avaliação de colágeno total assim como espessura de fibras colágenas. Resultados determinaram uma maior abundância de transcritos relacionados ao remodelamento de MEC, em destaque TGFβ, MMPs, TIMPs e colágenos em vacas pertencentes aos grupos NP e FP-CLP. O mesmo foi observado para abundância de colágeno. No entanto, não observou-se diferença na relação entre fibras grossas e finas entre os tratamentos. Análises de correlação e regressão indicaram que folículos pré-ovulatórios de maior tamanho geram CL maiores e assim maiores concentrações de P4, a qual está negativamente associada à abundância de colágenos. Assim, de acordo com resultados aqui descritos, assume-se que a alteração da homeostase da MEC devido ao incremento na abundância de colágeno pode ser prejudicial à gestação em bovinos. / The endometrial extracellular matrix (ECM) é build up of secretory molecules that make up the cellular microenvironment and suffer activation or suppression mainly by the ovarian steroid hormones, estradiol (E2) and progesterone (P4) during the estrous cycle. The identification of genes involved in endometrial remodeling and receptivity may reveal important biological processes linked to gestational success. The objectives were: 1. identify the relationship among preovulatory follicle (POF) size and corpus luteum (CL) and its respective hormones, E2 and P4 on the endometrial expression of genes related to extracellular matrix remodeling during the pre-implantation period; and 2. analyze the relationship between endometrial ECM gene expression evaluated on day 6 post artificial insemination (AI) with pregnancy outcome. For such, two experiments were carried on. On experiment 1, study 1 and study 2, 42 and 74, respectively, adult Nelore (Bos indicus) cows were synchronized aiming to manipulate the peri-ovulatory endocrine environment, obtaining at the end of the protocol, two groups with distinct pre-ovulatory follicle (POF) and corpus luteum (CL) sizes, leading to groups with distinct E2 and P4 concentrations. The groups were: Large Follicle/CL (LF/CL; study 1, n=20, study 2, n=35) and Small Follicle/Cl (SF/CL; study 1, n=22; study 2, n=39). Endometrial samples were collected by biopsy on D0 (Estrus) and post-mortem on D4 and on study 2 post-mortem on D7. P4 and E2 concentrations were measured by RIA with a significative difference between the groups, being lower hormonal concentrations in the SF- SCL group and higher concentrations in the LF-LCL group . In experiment 2, adult Nelore (Bos indicus) cows (n=33) were synchronized using a prostaglandin 2α (PGF2α) and heat detection based protocol. The cows were AI and six days after an endometrial biopsy was collected. Pregnancy diagnosis was performed on day 30 by ultrasound (US) examination and cows were divided into pregnant and non-pregnant (P vs. NP) groups for a retrospective analysis. Histology was performed on D4 and D7 samples for total collagen abundance as well as fiber thickness. Correlation and regression analysis indicate that larger preovulatory follicles as well as higher P4 concentrations have a negative effect on collagen content. RNA- Seq analysis and confirmation by qPRC was performed on selected samples from experiment 1, study 2 and experiment 2. Comparison of mRNA levels of ECM components samples revealed higher levels of transcripts envolved in ECM remodeling, highlighting TGFβ MMPs, TIMPs and collagens in NP cows when compared with P cows as well as in the SF- SCL compared to the LF-LCL group. The same was observed for collagen abundance. However, there was no difference between thin and thick collagen fibers between treatments. Correlation and regression analysis indicate that larger POF lead to larger CL and hence, higher P4 concentrations, which has a negative effects on collagen abundance. Therefore, according to the results presented here, we can imply that an alteration in ECM homeostasis due to increased collagen abundance may be harmful to pregnancy in cows.