El virus de la laringotraqueitis infecciosa (VLTI) es responsable de una importante enfermedad respiratoria en aves. La glicoproteína G (gpG) es un factor de virulencia en el VLTI, identificada como una proteína viral de unión a quimioquinas (CKBP) capaz de unirse a quimioquinas de aves y de otras especies modulando su actividad. Esto hace de la gpG una proteína de interés científico y comercial, requiriéndose, por lo tanto, tener suficiente cantidad de proteína disponible para futuros estudios funcionales y estructurales. Se describe un método para la producción de gpG recombinante del VLTI en un biorreactor de tanque agitado, infectando la línea celular de Spodoptera frugiperda Sf-9 con el baculovirus BV-gpG. Para este fin, fue necesario una caracterización previa del crecimiento de las células Sf-9; a su vez, optimizar la producción de gpG a pequeña escala y finalmente, definir parámetros operacionales en el biorreactor Biostat B plus que aseguren un ambiente hidrodinámico adecuado para el crecimiento e infección de las células. Las células Sf-9 mostraron una velocidad específica máxima de crecimiento (µmax) de 0,026/h, un tiempo de doblaje poblacional (TDP) de 27 horas y una densidad celular máxima de 8,7x106 cel/mL. A pequeña escala, la producción de gpG fue mayor al cosechar las células a las 72 horas post infección (hpi) independientemente de la multiplicidad de infección (MOI) empleada en el rango de 1,2 a 20. Una mayor producción de gpG fue obtenida al infectar las células durante la fase de crecimiento exponencial temprana comparada a la fase de crecimiento exponencial tardía. La densidad óptima de infección varió en dependencia del empleo de medio condicionado (2x106 cel/mL) o de medio fresco (7x106 cel/mL). En el manejo del biorreactor, se observó que el empleo de una velocidad de agitación de 170 rpm, una tasa de aireación de 0.04 vvm y un valor de pO2 de 40%, mostraron que las células Sf-9 no fueron sensibles a un estrés de corte de 0.38 N/m2 a un valor de número de Reynolds alto (20x104) en condiciones de aireación por sparger. Una eficiente producción de gpG en 3,5 L de biorreactor fue lograda infectando el cultivo en fase de crecimiento exponencial, a una densidad de 2x106 cel/mL, un MOI de 2 y cosechado a las 72 hpi. Mediante un ELISA sandwich se logró cuantificar el rendimiento volumétrico de gpG his, el cual fue de 3.66 mg/L, lo que representa un aumento de 2 fold comparado a la producción en el matraz. Los resultados demuestran la factibilidad de producir glicoproteína G en células de insecto infectadas con un baculovirus a escala de biorreactor. / Tesis

Submitted by Ana Lúcia Torres (bfmhuap@gmail.com) on 2017-09-20T15:54:57Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) JORGE HENRIQUETESE COM CORREÇÕES DA BANCA JAN 2017.pdf: 4201838 bytes, checksum: f47ae0fb55a2d648c74ac2facf85217d (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Lúcia Torres (bfmhuap@gmail.com) on 2017-09-20T15:55:06Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) JORGE HENRIQUETESE COM CORREÇÕES DA BANCA JAN 2017.pdf: 4201838 bytes, checksum: f47ae0fb55a2d648c74ac2facf85217d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-20T15:55:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) JORGE HENRIQUETESE COM CORREÇÕES DA BANCA JAN 2017.pdf: 4201838 bytes, checksum: f47ae0fb55a2d648c74ac2facf85217d (MD5) Previous issue date: 2016 / Universidade Federal Fluminense. Centro de Ciências Médicas. Instituto Biomédico. Departamento de Morfologia. Anatomia Humana / A uretra masculina humana possui uma macro estrutura uniforme. Apesar disso apresenta evidências clínicas, morfológicas e moleculares ao longo de seus segmentos, que indicam haver diferenças estruturais e patológicas entre os mesmos. A maioria das alterações da uretra prostática (UP), em homens acima dos 50 anos, são consideradas como sendo secundárias à compressão devido ao crescimento de nódulos fibromatosos hiperplásicos do tecido prostático. Os sinais obstrutivos consequentes a Hiperplasia Prostática Benigna (HPB) incluem hesitação para iniciar a micção, redução da força e calibre do jato urinário, bem como, tardiamente, retenção urinária. Para tentar explicar as alterações que ocorreram na estrutura histológica da UP, no processo da HPB, estudamos as variações qualitativas e quantitativas que ocorreram na densidade volumétrica (Vv) do componente fibroso da matriz extracelular (MEC) e do músculo liso da UP de pacientes com HPB submetidos a tratamento cirúrgico. Foram estudadas amostras obtidas da UP de 10 pacientes com HPB sintomática, submetidos à prostatectomia aberta. Os pacientes não tinham história de tratamento prévio, para HPB. A idade dos pacientes selecionados para o presente estudo variou entre 63 a 79 anos. Para fins de comparação, foram usadas amostras controle obtidas durante a necropsia de 10 indivíduos adultos jovens com idades variando de 18 a 25 anos, vítimas de morte violenta sem comprometimento do sistema urogenital e/ou manipulação uretral. Todas as Próstatas do grupo controle apresentavam peso entre 20-25g, sendo consideradas adultas e dentro dos limites da normalidade. As amostras foram fixadas em solução de formol 10% e processadas para inclusão em parafina. Para análise da Vv, foram usadas as técnicas de coloração de tricrômico de Masson e, de Weigert. Também foram submetidas a análise imunohistoquímica. A Vv do componente fibroso da MEC e do músculo liso foi determinada pela análise de 25 campos aleatórios de cada fragmento de UP usando um sistema teste M-42. Os dados quantitativos foram analisados por meio do teste de Kolmogorov-Smirnov e Mann-Whitney. A Vv (%médio±SD) nos grupos controle e HPB foram respectivamente: 20,3±0,3 e 17,12±1,1 para as fibras do sistema elástico (p <0,007); 29,7 ± 1,9 e 25,1 ± 2,4 para colágeno (p <0,03). A Vv do músculo liso apresentou aumento, não significativo, no grupo HPB, 49,9 ± 0,4 e 52,3 ± 2,3. Por outro lado, 21,9±1,5 e 29,1±1,2 para a fibronectina (P < 0. 0001). / The human male urethra has a uniform structure. Despite this, presents morphological, molecular and clinical evidence throughout their segments that indicates pathological and structural differences between them. Most of changes in prostatic urethra (PU) in men over 50 years, are considered to be secondary to compression due to the growth of fibrous hyperplastic prostate tissue nodules. The signs of obstructive Benign Prostatic Hyperplasia (BPH) reflect the decreased distendibility of the prostatic urethra; that includes hesitation to begin urination, reduced force and caliber of the urinary stream, as well as (late) retention. To explain the histological, structural changes that occurred in the prostatic urethra, studies were made to analyse the changes in quality and quantity that occurred in the volumetric density of the fibrous component of the extracellular matrix (ECM) and smooth muscle of the urethra of patients with BPH submitted to surgical treatment. Samples were obtained from the urethra of 10 patients with symptomatic BPH who had undergone open prostatectomy. No patient had a history of previous treatment for BPH. The age ranged from 63-79 years. To compare we used control samples obtained during autopsy of 10 young adults subjects aged 18-25 that died from violent death without involvement of the urogenital system or uretral manipulation. The samples were fixed in formalin 10% and processed for paraffin embedding. For analysis of Vv, were used staining techniques tricomic Masson and Weigert. Were also submitted to immunohistochemical analysis. The Vv fibrous component of MEC and smooth muscle was determined by the analysis of 25 random fields of each fragment of a test system using M-42. Quantitative data were analyzed using the olmogorov-Smirnov and Mann-Whitney test. The Vv (mean ± SD) in the control and BPH groups respectively were: 20.3±0.3 and 17.12±1.1 in the elastic fiber system (p<0.007); and 29.7±1.9 and 25.1±2.4 in the collagen compartment (p<0.03). Smooth muscle cell volume was increased in BPH cases, 49.9±0.4 and 52.3±2.3 (not statistically significant). On other hand was 21.9±1.5 and 29.1±1.2 in the fibronectin (P < 0. 0001).

Submitted by Ana Lúcia Torres (bfmhuap@gmail.com) on 2017-09-25T19:01:03Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Caracterização histomorfométrica e esteriológica das fibras ... (dissertação - Filipe Moreira de Andrade).pdf: 755223 bytes, checksum: fd1e41efdcbec772c4c1b66378c0acbf (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Lúcia Torres (bfmhuap@gmail.com) on 2017-09-25T19:01:21Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Caracterização histomorfométrica e esteriológica das fibras ... (dissertação - Filipe Moreira de Andrade).pdf: 755223 bytes, checksum: fd1e41efdcbec772c4c1b66378c0acbf (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-25T19:01:21Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Caracterização histomorfométrica e esteriológica das fibras ... (dissertação - Filipe Moreira de Andrade).pdf: 755223 bytes, checksum: fd1e41efdcbec772c4c1b66378c0acbf (MD5) Previous issue date: 2010 / Universidade Federal de Viçosa. Departamento de Medicina e Enfermagem / A matriz extracelular é elemento essencial à função peniana, podendo ser acometida por doenças locais ou sistêmicas, embora pouco seja conhecido em relação aos seus componentes na glande peniana humana. Nesse trabalho foi realizado um estudo detalhado da organização morfológica e densidade volumétrica (Vv) das fibras do sistema elástico em glandes penianas de homens jovens saudáveis. Foram obtidos fragmentos de glande peniana de 5 (cinco) indivíduos jovens falecidos de causas não relacionadas ao sistema urogenital, com idade entre 18 e 30 anos (média: 24 anos). Os espécimes foram fixados em formalina, embebidos em parafina e processados histologicamente. As fibras do sistema elástico foram avaliadas sob microscopia óptica usando a técnica de coloração da resorcina-fucsina de Weigert após prévia oxidação pela oxona. Estudos morfométricos foram realizados através do método de contagem de pontos. A análise quantitativa foi expressa (% média) como densidade volumétrica (Vv) através da análise em 25 campos aleatórios para cada espécime. Verificou-se que os constituintes do tecido conjuntivo, em especial fibras do sistema elástico, foram abundantes. Uma rede irregular de fibras do sistema elástico é distribuída sob a mucosa da glande peniana. As fibras do sistema elástico apresentaram uma disposição longitudinal no corpo esponjoso e um perfil tortuoso envolvendo sinúsóides da glande. A Vv das fibras do sistema elástico na glande peniana é de 29.4% ±3.1. Os dados devem prover informação a ser avaliada em relação a disfunções eréteis, doenças endócrinas e envelhecimento. Os resultados apresentados fornecem subsídios para posteriores investigações em relação à matriz extracelular por métodos de estereologia / The extracellular matrix is a key element in penile function and pathology, yet little is known of its components in human glans. Herein we carried out a detailed study of all the factors that play a part in the morphological organization and volumetric density (Vv) of elastic fibers in the glans penis of young healthy men. Penile glans were obtained from 5 young men died of causes no related to the urogenital tract, between the age of 18 and 30 (mean = 24). Samples were fixed in formaline, embedded in paraffin, and histologically processed. The elastic system fibers were evaluated at light microscopy by using Weigert’s resorcin-fuchsin technique after previous oxidation with oxone. Morphometric studies were performed by the point-counting method. Quantities were expressed (%mean) as volumetric densities (Vv) and were determined on 25 random fields for each individual. Connective tissue elements, mainly elastic system fibers, were abundant. These fibers often had a tortuous profile and surrounded sinusoids in the glans penis. An irregular elastic fibers network was distributed beneath the glans penis mucosa, on the other hand, underneath the mucosa, the elastic fibers were observed longitudinal at corpus spongiosum. The Vv of the elastic system fibers in the glans penis is 29.4% ±3.1. The data should therefore provide important information for drawing parallels over patients with erectile dysfunction and alterations regarding endocrine diseases and aging. The results reported herein provide the base for continuous investigations on extracellular matrix by stereology

Cepas de Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) estão entre os patógenos mais freqüentemente envolvidos em casos de diarréia. Este patotipo é subdividido em EPEC típicas e atípicas, sendo que as típicas possuem o gene eae (EPEC attaching and effacing) e o plasmídeo EAF (EPEC adherence fator), e as atípicas albergam somente o gene eae. A principal característica de sua patogênese é a formação de uma lesão histopatológica no epitélio intestinal denominada attaching and effacing (A/E), que resulta da adesão íntima da bactéria ao enterócito. A adesão é uma etapa crítica na patogênese bacteriana, sendo o primeiro pré-requisito para que as E. coli colonizem com sucesso a mucosa do hospedeiro. A ligação da bactéria a um ou mais componentes teciduais da matriz extracelular como colágeno I e IV, laminina, fibronectinas celular e plasmática são indícios de que essas moléculas estão sendo usadas como substrato de adesão e colonização do hospedeiro pela bactéria patogênica. Adesinas com capacidade de interagir com componentes da matriz extracelular já foram identificadas em bactérias patogênicas, no entanto, ainda não foi caracterizada nenhuma proteína de EPEC atípica com essa capacidade de adesão. Essa propriedade foi evidenciada em um isolado de EPEC atípica durante pesquisas em nosso laboratório e neste trabalho visamos identificar e caracterizar a(s) proteína(s) envolvida(s) nesta habilidade adesiva. As proteínas possivelmente envolvidas apresentam massas moleculares relativas de 107, 44 e 35 kDa e a pré-incubação do isolado 2103 com componentes de matriz extracelular provoca uma variação no seu padrão de adesão e influencia o número de bactérias aderidas a células epiteliais. No entanto, como esse patotipo é muito heterogêneo essa característica não pode ser extrapolada para todos os isolados dessa categoria. / Atypical Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) has been a leading cause of childhood diarrhea in developing countries. The main mechanism of atypical EPEC pathogenesis is a lesion called attaching and effacing (A/E), which is characterized by intimate adherence of the bacteria to the intestinal epithelium and destruction of microvillus. Nevertheless, it represents a heterogeneous group and other virulence factors may be involved in atypical EPEC pathogenesis. Previously, we have identified one isolate of atypical EPEC, serotype O26:H11, which secretes proteins that interact with ECM macromolecules. The interactions between pathogenic bacteria and ECM molecules such as fibronectin, laminin and collagen may play an important role in the bacterium adherence to and invasion of host cells. Adhesion is critical for successful E. coli colonization of gastrointestinal tract and is mediated by adhesins. The aim of this study is to identify and characterize putative adhesins that may contribute to the binding of the isolate of atypical EPEC to extracellular matrix components. The supernatant of the atypical EPEC isolate was submitted to a solid phase binding assay with matrigel (a mouse basement membrane composed mainly of laminin, collagen IV and fibronectin), the adhered proteins were stripped from the wells, separated by SDS-PAGE, transferred to nitrocellulose membranes and submitted to immunoblotting assay. Three major proteins of apparent molecular weights of 107, 44 e 35 kDa were recognized by the anti-proteins polyclonal serum (produced in rabbit immunized with the isolate\'s supernatant) through immunoblotting assay. Besides, we observed that in the presence of ECM components the isolate clearly changes its adherence pattern of the isolate to HEp-2 cells, and the number of adhered bacteria to epithelial cells. The atypical EPEC do not share a unique pattern of virulence, suggesting that many virulence factors may contribute to the pathogenesis. The identification of proteins involved in the adhesion with extracellular matrix components in one isolate of this category of diarrheagenic E. coli confirms the heterogeneity among the atypical EPEC.

Avaliamos a capacidade de indução de migração, invasão e secreção de protease pelo peptídeo derivado da laminina, C16 (KAFDITYVRLKF, cadeia g1) em linhagem celular (CAC2) de carcinoma adenóide cístico humano. Laminina g1 foi imunolocalizada no carcinoma adenóide in vivo e in vitro. Ensaio de ferida, em câmara bipartite e em vídeo microscopia (time-lapse) mostraram que C16 estimula migração em células CAC2. C16 também estimulou invasão em ensaio com câmaras bipartites cobertas com Matrigel. Invasão depende de atividade de protease. Zimografia mostrou que C16 aumentou secreção de MMPs 2 e 9. Diferentes vias de sinalização podem estar relacionadas com os efeitos de C16. Immunoblot revelou que C16 aumentou a fosforilação de AKT e ERK. Para o estudo de possíveis receptores do peptídeo, preparações de membrana foram passadas em colunas de afinidade com C16 acoplado. Banda de 40kDa foi eluída e analisada por espectrometria de massa (LC-MS/MS) que identificou a cadeia a1 do colágeno. O fragmento de colágeno eluído poderia ser parte de um complexo protéico envolvendo C16. Integrinas são receptores de colágeno e candidatas a fazerem parte desse complexo. Células CAC2 expressaram as integrinas av, a5, b3 and b1. Silenciamento dessas integrinas promoveu redução da migração e secreção de protease induzidas por C16. Sugerimos que C16 estimularia migração, invasão e secreção de protease em células de carcinoma adenóide cístico através de integrinas a5b1 e avb3. O sinal gerado por C16 seria transduzido pelas vias AKT e ERK1/2. / We studied induction of migration, invasion and protease activity by laminin-derived peptide C16 (KAFDITYVRLKF, g1 chain) in a cell line (CAC2) from adenoid cystic carcinoma. Laminin g1 was immunolocalized in adenoid cystic carcinoma in vivo and in vitro. C16 increased migratory activity of CAC2 cells, as shown by monolayer wound assay, Transwell migration assay and time-lapse video microscopy. This peptide also stimulated cell invasion in Transwell chambers coated with Matrigel. Invasion depends on protease activity. Zymograms showed that C16 increased secretion of MMPs 2 and 9. Different signaling pathways could be related to C16 regulation in CAC2 cells. Immunoblot showed that C16 increased phosphorylation of both AKT and ERK compared to controls. To study putative receptors of this peptide we used affinity chromatography. Membrane preparations were run through C16-affinity columns. A 40kDa band was eluted and analyzed by mass spectrometry (LC-MS/MS) identifying a collagen a1 chain. The collagen fragment eluted could be part of a protein complex involving C16. This protein complex may include integrins, which are collagen receptors. CAC2 cells exhibited av, a5, b3 and b1 integrins. siRNA knockdown of these integrins inhibited both C16-induced migration and protease activity. We propose that C16 increases migration, invasion and protease activity of a human salivary gland adenoid cystic carcinoma cell line through a5b1 and avb3 integrins. The signal generated by C16 is transduced by AKT and ERK1/2 signaling pathways.

Introdução: A doença intersticial pulmonar é um importante fator prognóstico na esclerose sistêmica (ES). O prognóstico das pneumonias intersticiais não específicas (NSIP) associadas às colagenoses tem sido descrito como melhor do que o da forma idiopática. Levanta-se a hipótese de que o processo de remodelamento e reparo do parênquima pulmonar nessas duas formas da doença sejam diferentes. Objetivos: Comparar os mecanismos de reparo e remodelamento entre a NSIP associada a ES e a NSIP idiopática. Observar o impacto dos mesmos nas provas de função pulmonar e na sobrevida. Métodos: Foram analisadas 40 biópsias de pacientes com o diagnóstico de NSIP (18 biópsias de NSIP associada a ES e 22 na forma idiopática). As informações clínicas e as provas de função pulmonar foram obtidas através da revisão dos prontuários. As lâminas foram revisadas por três patologistas. Foram comparadas as densidades epitelial, vascular, bem como a atividade vascular dos dois grupos utilizando o método de imuno-histoquímica. Para isso foram utilizados os anticorpos anti- citoqueratina 7 (CK-7), anti- proteína-a do surfactante (SP-A), antimarcador de célula endotelial CD-34 (CD34), e anti-molécula da adesão vascular 1 (VCAM-1). Também foi comparado o padrão de remodelamento da matriz septal e vascular, usando os métodos histoquímicos da resorcina (fibras elásticas) e picrosírius (colágeno). Uma análise estatística foi realizada comparando os resultados dos dois grupos, o impacto do remodelamento nas provas de função pulmonar e a influência na sobrevida. Resultados: A densidade das células epiteliais foi menor na NSIP-ES, do que na forma idiopática (p<0,0001). Já os pneumócitos tipo II e as células de Clara encontraram-se diminuídos no grupo idiopático (p=0,02). Uma diminuição na densidade vascular foi encontrada na NSIP-ES quando comparada à forma idiopática (p<0,0001); no entanto, a atividade vascular medida pelo VCAM-1 foi maior no grupo da NSIP-ES (p<0.0001). O conteúdo das fibras elásticas e colágeno septal, bem como o das fibras elásticas na parede vascular, estavam aumentados no grupo da ES quando comparados à forma idiopática (p=0,01; p=0,001 e p<0,0001, respectivamente). Não houve diferença estatística entre o colágeno da parede vascular, no grau de obstrução vascular ou associação entre os parâmetros de remodelamento e reparo do parênquima pulmonar na sobrevida dos dois grupos. Dentre as provas de função pulmonar, a DCO/Hb foi mais afetada no grupo da ES (59% do valor predito na ES e 97% no grupo idiopático). Foi observada uma associação direta entre a densidade vascular e a DCO/Hb (p=0,02). Após o seguimento de 36 meses, não foi observada diferença no prognóstico dos dois grupos. Conclusão: Os processos de remodelamento e reparo do parênquima pulmonar parecem ser diferentes entre os dois grupos. Apesar de o processo fibrótico ser mais intenso na NSIP-ES, isso parece não estar associado a um pior prognóstico, como tem sido descrito na forma idiopática. Como o processo de elastose e a expressão do VCAM-I são mais intensos na ES, isso sugere que o processo inflamatório tem um papel mais importante na patogênese e no processo de remodelamento e reparo da ES do que na forma idiopática. No entanto, outros estudos são necessários para validar a importância desses resultados e sua utilização para fins terapêuticos e de prognóstico / Background: The presence of Interstitial lung disease is a well recognized prognostic factor in systemic sclerosis (SSc). As the prognosis in nonspecific interstitial pneumonia (NSIP) has been described to be better in collagen vascular disorders compared to the idiopathic forms, it is conceivable that the mechanisms of repair and remodeling are different between these two forms of the disease. Objectives: To compare the mechanisms of repair and remodeling between SSc associated nonspecific pneumonia and the idiopathic form, as well as their impact on pulmonary function tests and survival rates. Methods: Biopsies from 18 patients with SSc-associated NSIP and 22 with idiopathic NSIP were analyzed. Clinical data and pulmonary function test results were obtained by retrospective chart review. All H&E slides were reviewed by three pathologists. The epithelial and vascular densities and vascular activity were compared between the two groups by immunohistochemistry with antibodies directed against cytokeratin-7, surfactant protein-a, CD34, and VCAM-1, as well as septal and vascular matrix remodeling using histochemical stains (picrosirius and resorcin). Statistical analyses were performed to compare the results of these various studies with clinical parameters (e.g. pulmonary function tests) and survival between the groups. Results: Epithelial cell density was lower in SSc-NSIP when compared with idiopathic-NSIP (p<0.0001). Type II pneumocytes and Clara cells were reduced in idiopathic NSIP (p=0.02). A decrease in microvessel density was found in SSc-NSIP compared to idiopathic-NSIP (p<0.0001). The vascular activity measured by VCAM-1 expression was higher in NSIP-SSc when compared to the idiopathic group (p<0.0001). A direct association between vascular density and DLCO/HB was found (p=0.02). Among pulmonary function tests the DLCO/HB was affected to a greater extent in the SSc group (59% of the predicted value in SSc and 97% in the idiopatic group). The content of septal collagen and elastic fibers, as well as the elastic fibers in the vascular wall, were higher in the SSc group (p=0.01, p=0.001 and p<0.0001, respectively). There were no differences in the collagen content of the vascular wall, vascular grade, or survival between the two groups. There was no difference in the survival rate between the two groups after a follow-up of 36 months. Conclusions: Alterations in the pulmonary epithelium and vasculature seem to differ in the SSc-NSIP when compared to the idiopathic form of the disease. Although the fibrotic process is more intense in the SSc group, it does not seem to affect the prognosis of these patients, contrary to what has been described in idiopatic lung fibrosis. Because the elastotic process and VCAM-1 expression are higher in the SSc group, this might suggest that inflammatory mechanisms affecting the elastic fiber system and vasculature could play a greater role in the pathogenesis and pulmonary remodeling process of SSc-NSIP than in idiopathic-NSIP. Further studies may be required to assess the significance of these findings and explore if they can provide prognostic and/or treatment information

Cepas de Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) estão entre os patógenos mais freqüentemente envolvidos em casos de diarréia. Este patotipo é subdividido em EPEC típicas e atípicas, sendo que as típicas possuem o gene eae (EPEC attaching and effacing) e o plasmídeo EAF (EPEC adherence fator), e as atípicas albergam somente o gene eae. A principal característica de sua patogênese é a formação de uma lesão histopatológica no epitélio intestinal denominada attaching and effacing (A/E), que resulta da adesão íntima da bactéria ao enterócito. A adesão é uma etapa crítica na patogênese bacteriana, sendo o primeiro pré-requisito para que as E. coli colonizem com sucesso a mucosa do hospedeiro. A ligação da bactéria a um ou mais componentes teciduais da matriz extracelular como colágeno I e IV, laminina, fibronectinas celular e plasmática são indícios de que essas moléculas estão sendo usadas como substrato de adesão e colonização do hospedeiro pela bactéria patogênica. Adesinas com capacidade de interagir com componentes da matriz extracelular já foram identificadas em bactérias patogênicas, no entanto, ainda não foi caracterizada nenhuma proteína de EPEC atípica com essa capacidade de adesão. Essa propriedade foi evidenciada em um isolado de EPEC atípica durante pesquisas em nosso laboratório e neste trabalho visamos identificar e caracterizar a(s) proteína(s) envolvida(s) nesta habilidade adesiva. As proteínas possivelmente envolvidas apresentam massas moleculares relativas de 107, 44 e 35 kDa e a pré-incubação do isolado 2103 com componentes de matriz extracelular provoca uma variação no seu padrão de adesão e influencia o número de bactérias aderidas a células epiteliais. No entanto, como esse patotipo é muito heterogêneo essa característica não pode ser extrapolada para todos os isolados dessa categoria. / Atypical Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) has been a leading cause of childhood diarrhea in developing countries. The main mechanism of atypical EPEC pathogenesis is a lesion called attaching and effacing (A/E), which is characterized by intimate adherence of the bacteria to the intestinal epithelium and destruction of microvillus. Nevertheless, it represents a heterogeneous group and other virulence factors may be involved in atypical EPEC pathogenesis. Previously, we have identified one isolate of atypical EPEC, serotype O26:H11, which secretes proteins that interact with ECM macromolecules. The interactions between pathogenic bacteria and ECM molecules such as fibronectin, laminin and collagen may play an important role in the bacterium adherence to and invasion of host cells. Adhesion is critical for successful E. coli colonization of gastrointestinal tract and is mediated by adhesins. The aim of this study is to identify and characterize putative adhesins that may contribute to the binding of the isolate of atypical EPEC to extracellular matrix components. The supernatant of the atypical EPEC isolate was submitted to a solid phase binding assay with matrigel (a mouse basement membrane composed mainly of laminin, collagen IV and fibronectin), the adhered proteins were stripped from the wells, separated by SDS-PAGE, transferred to nitrocellulose membranes and submitted to immunoblotting assay. Three major proteins of apparent molecular weights of 107, 44 e 35 kDa were recognized by the anti-proteins polyclonal serum (produced in rabbit immunized with the isolate\'s supernatant) through immunoblotting assay. Besides, we observed that in the presence of ECM components the isolate clearly changes its adherence pattern of the isolate to HEp-2 cells, and the number of adhered bacteria to epithelial cells. The atypical EPEC do not share a unique pattern of virulence, suggesting that many virulence factors may contribute to the pathogenesis. The identification of proteins involved in the adhesion with extracellular matrix components in one isolate of this category of diarrheagenic E. coli confirms the heterogeneity among the atypical EPEC.

Introdução: A doença intersticial pulmonar é um importante fator prognóstico na esclerose sistêmica (ES). O prognóstico das pneumonias intersticiais não específicas (NSIP) associadas às colagenoses tem sido descrito como melhor do que o da forma idiopática. Levanta-se a hipótese de que o processo de remodelamento e reparo do parênquima pulmonar nessas duas formas da doença sejam diferentes. Objetivos: Comparar os mecanismos de reparo e remodelamento entre a NSIP associada a ES e a NSIP idiopática. Observar o impacto dos mesmos nas provas de função pulmonar e na sobrevida. Métodos: Foram analisadas 40 biópsias de pacientes com o diagnóstico de NSIP (18 biópsias de NSIP associada a ES e 22 na forma idiopática). As informações clínicas e as provas de função pulmonar foram obtidas através da revisão dos prontuários. As lâminas foram revisadas por três patologistas. Foram comparadas as densidades epitelial, vascular, bem como a atividade vascular dos dois grupos utilizando o método de imuno-histoquímica. Para isso foram utilizados os anticorpos anti- citoqueratina 7 (CK-7), anti- proteína-a do surfactante (SP-A), antimarcador de célula endotelial CD-34 (CD34), e anti-molécula da adesão vascular 1 (VCAM-1). Também foi comparado o padrão de remodelamento da matriz septal e vascular, usando os métodos histoquímicos da resorcina (fibras elásticas) e picrosírius (colágeno). Uma análise estatística foi realizada comparando os resultados dos dois grupos, o impacto do remodelamento nas provas de função pulmonar e a influência na sobrevida. Resultados: A densidade das células epiteliais foi menor na NSIP-ES, do que na forma idiopática (p<0,0001). Já os pneumócitos tipo II e as células de Clara encontraram-se diminuídos no grupo idiopático (p=0,02). Uma diminuição na densidade vascular foi encontrada na NSIP-ES quando comparada à forma idiopática (p<0,0001); no entanto, a atividade vascular medida pelo VCAM-1 foi maior no grupo da NSIP-ES (p<0.0001). O conteúdo das fibras elásticas e colágeno septal, bem como o das fibras elásticas na parede vascular, estavam aumentados no grupo da ES quando comparados à forma idiopática (p=0,01; p=0,001 e p<0,0001, respectivamente). Não houve diferença estatística entre o colágeno da parede vascular, no grau de obstrução vascular ou associação entre os parâmetros de remodelamento e reparo do parênquima pulmonar na sobrevida dos dois grupos. Dentre as provas de função pulmonar, a DCO/Hb foi mais afetada no grupo da ES (59% do valor predito na ES e 97% no grupo idiopático). Foi observada uma associação direta entre a densidade vascular e a DCO/Hb (p=0,02). Após o seguimento de 36 meses, não foi observada diferença no prognóstico dos dois grupos. Conclusão: Os processos de remodelamento e reparo do parênquima pulmonar parecem ser diferentes entre os dois grupos. Apesar de o processo fibrótico ser mais intenso na NSIP-ES, isso parece não estar associado a um pior prognóstico, como tem sido descrito na forma idiopática. Como o processo de elastose e a expressão do VCAM-I são mais intensos na ES, isso sugere que o processo inflamatório tem um papel mais importante na patogênese e no processo de remodelamento e reparo da ES do que na forma idiopática. No entanto, outros estudos são necessários para validar a importância desses resultados e sua utilização para fins terapêuticos e de prognóstico / Background: The presence of Interstitial lung disease is a well recognized prognostic factor in systemic sclerosis (SSc). As the prognosis in nonspecific interstitial pneumonia (NSIP) has been described to be better in collagen vascular disorders compared to the idiopathic forms, it is conceivable that the mechanisms of repair and remodeling are different between these two forms of the disease. Objectives: To compare the mechanisms of repair and remodeling between SSc associated nonspecific pneumonia and the idiopathic form, as well as their impact on pulmonary function tests and survival rates. Methods: Biopsies from 18 patients with SSc-associated NSIP and 22 with idiopathic NSIP were analyzed. Clinical data and pulmonary function test results were obtained by retrospective chart review. All H&E slides were reviewed by three pathologists. The epithelial and vascular densities and vascular activity were compared between the two groups by immunohistochemistry with antibodies directed against cytokeratin-7, surfactant protein-a, CD34, and VCAM-1, as well as septal and vascular matrix remodeling using histochemical stains (picrosirius and resorcin). Statistical analyses were performed to compare the results of these various studies with clinical parameters (e.g. pulmonary function tests) and survival between the groups. Results: Epithelial cell density was lower in SSc-NSIP when compared with idiopathic-NSIP (p<0.0001). Type II pneumocytes and Clara cells were reduced in idiopathic NSIP (p=0.02). A decrease in microvessel density was found in SSc-NSIP compared to idiopathic-NSIP (p<0.0001). The vascular activity measured by VCAM-1 expression was higher in NSIP-SSc when compared to the idiopathic group (p<0.0001). A direct association between vascular density and DLCO/HB was found (p=0.02). Among pulmonary function tests the DLCO/HB was affected to a greater extent in the SSc group (59% of the predicted value in SSc and 97% in the idiopatic group). The content of septal collagen and elastic fibers, as well as the elastic fibers in the vascular wall, were higher in the SSc group (p=0.01, p=0.001 and p<0.0001, respectively). There were no differences in the collagen content of the vascular wall, vascular grade, or survival between the two groups. There was no difference in the survival rate between the two groups after a follow-up of 36 months. Conclusions: Alterations in the pulmonary epithelium and vasculature seem to differ in the SSc-NSIP when compared to the idiopathic form of the disease. Although the fibrotic process is more intense in the SSc group, it does not seem to affect the prognosis of these patients, contrary to what has been described in idiopatic lung fibrosis. Because the elastotic process and VCAM-1 expression are higher in the SSc group, this might suggest that inflammatory mechanisms affecting the elastic fiber system and vasculature could play a greater role in the pathogenesis and pulmonary remodeling process of SSc-NSIP than in idiopathic-NSIP. Further studies may be required to assess the significance of these findings and explore if they can provide prognostic and/or treatment information

Avaliamos a capacidade de indução de migração, invasão e secreção de protease pelo peptídeo derivado da laminina, C16 (KAFDITYVRLKF, cadeia g1) em linhagem celular (CAC2) de carcinoma adenóide cístico humano. Laminina g1 foi imunolocalizada no carcinoma adenóide in vivo e in vitro. Ensaio de ferida, em câmara bipartite e em vídeo microscopia (time-lapse) mostraram que C16 estimula migração em células CAC2. C16 também estimulou invasão em ensaio com câmaras bipartites cobertas com Matrigel. Invasão depende de atividade de protease. Zimografia mostrou que C16 aumentou secreção de MMPs 2 e 9. Diferentes vias de sinalização podem estar relacionadas com os efeitos de C16. Immunoblot revelou que C16 aumentou a fosforilação de AKT e ERK. Para o estudo de possíveis receptores do peptídeo, preparações de membrana foram passadas em colunas de afinidade com C16 acoplado. Banda de 40kDa foi eluída e analisada por espectrometria de massa (LC-MS/MS) que identificou a cadeia a1 do colágeno. O fragmento de colágeno eluído poderia ser parte de um complexo protéico envolvendo C16. Integrinas são receptores de colágeno e candidatas a fazerem parte desse complexo. Células CAC2 expressaram as integrinas av, a5, b3 and b1. Silenciamento dessas integrinas promoveu redução da migração e secreção de protease induzidas por C16. Sugerimos que C16 estimularia migração, invasão e secreção de protease em células de carcinoma adenóide cístico através de integrinas a5b1 e avb3. O sinal gerado por C16 seria transduzido pelas vias AKT e ERK1/2. / We studied induction of migration, invasion and protease activity by laminin-derived peptide C16 (KAFDITYVRLKF, g1 chain) in a cell line (CAC2) from adenoid cystic carcinoma. Laminin g1 was immunolocalized in adenoid cystic carcinoma in vivo and in vitro. C16 increased migratory activity of CAC2 cells, as shown by monolayer wound assay, Transwell migration assay and time-lapse video microscopy. This peptide also stimulated cell invasion in Transwell chambers coated with Matrigel. Invasion depends on protease activity. Zymograms showed that C16 increased secretion of MMPs 2 and 9. Different signaling pathways could be related to C16 regulation in CAC2 cells. Immunoblot showed that C16 increased phosphorylation of both AKT and ERK compared to controls. To study putative receptors of this peptide we used affinity chromatography. Membrane preparations were run through C16-affinity columns. A 40kDa band was eluted and analyzed by mass spectrometry (LC-MS/MS) identifying a collagen a1 chain. The collagen fragment eluted could be part of a protein complex involving C16. This protein complex may include integrins, which are collagen receptors. CAC2 cells exhibited av, a5, b3 and b1 integrins. siRNA knockdown of these integrins inhibited both C16-induced migration and protease activity. We propose that C16 increases migration, invasion and protease activity of a human salivary gland adenoid cystic carcinoma cell line through a5b1 and avb3 integrins. The signal generated by C16 is transduced by AKT and ERK1/2 signaling pathways.

Orientador: Claudio Chrysostomo Werneck / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T08:25:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_DanielleSousa_M.pdf: 8911447 bytes, checksum: c9bf5559a19db5c16b953e4b7a760966 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: MAGP1 (Microfibril-Associated GlycoProtein1) é um os constituintes das microfibrilas. Numerosos estudos têm demonstrado que MAGP1 interage com outras moléculas in vitro e sua expressão é de grande importância para o desenvolvimento vascular em zebrafish. Dados obtidos em nosso laboratório a partir do modelo fotoquímico de indução de trombo em animais deficientes em MAGP1 sugerem a importância deste componente da microfibrila no processo trombótico. Entre as técnicas para indução da formação de trombo, têm-se o cloreto férrico. Tal mecanismo, quando aplicado em pequenos animais, gera uma lesão endotelial de alta intensidade em apenas dois minutos. Além disso, com o auxílio da microscopia intravital, o cloreto férrico permite a captura de imagens do vaso sanguíneo em tempo real. A microscopia intravital possibilita a análise do processo de formação do trombo e as possíveis diferenças deste processo nos camundongos deficientes em MAGP1. Sendo assim, o presente trabalho objetivou estabelecer a técnica de trombose arterial induzida por cloreto férrico e assistida por microscopia intravital, a fim de verificar a função de MAGP1 no processo de formação do trombo. Para isto, as células brancas e as plaquetas de animais selvagens e deficientes em MAGP1 foram coradas com Rhodamina 6G e analisadas por microscopia intravital / Abstract: MAGP1 (Microfibril - Associated GlycoProtein1) is a constituent of the microfibrils. Numerous studies have shown that MAGP1 interact with other molecules in vitro and its expression is of importance for vascular development in zebrafish. Data obtained in our laboratory from the photochemical model of thrombus induction in animals deficient in MAGP1 suggest the importance of this component of the microfibril in the thrombotic process. Among the techniques for inducing thrombus formation, it has been ferric chloride. This mechanism when applied in small animals generates a high intensity endothelial injury in just two minutes. Furthermore, with the aid of intravital microscopy, ferric chloride enables the capture of blood vessel images in real time. The intravital microscopy allows the analysis of the process of thrombus formation and possible differences of this process in mice deficient in MAGP1. Therefore, this study aimed to establish the technique of arterial thrombosis induced by ferric chloride and assisted intravital microscopy, in order to verify the function of MAGP1 in the process of thrombus formation. For this, white cells and platelets MAGP1 deficient and wild animals were stained with Rhodamine 6G e analyzed by intravital microscopy / Mestrado / Bioquimica / Mestra em Biologia Funcional e Molecular