A sinalização da matriz extracelular (MEC) é essencial para a determinação do destino e comportamento de células epiteliais da glândula mamária. Entretanto, pouco é conhecido sobre os mecanismos moleculares envolvidos nesse processo. A via Hippo, uma cascata de sinalização que participa da regulação de diversos comportamentos celulares, incluindo o tamanho de órgãos, parece ser uma importante candidata a mediadora sinalização da MEC. Resultados preliminares do laboratório indicam que a arquitetura tecidual e a membrana basal, componente da MEC de epitélios e outros tecidos, influenciam a localização, concentração e atividade de YAP, uma proteína efetora da via Hippo, em células epiteliais mamárias. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi identificar as proteínas que interagem com Yap (ortólogo de YAP em camundongo) nas células epiteliais da glândula mamária em resposta à membrana basal. Foram utilizadas células EpH4, uma linhagem mamária não-tumoral murina, como modelo de diferenciação funcional e formação de ácinos em um ensaio de cultura tridimensional (3D). O tratamento de estruturas multicelulares 3D pré-formadas em placas nãoadesiva com uma matriz rica em laminina (lrECM) alterou a localização e o padrão subcelular de Yap, assim como a expressão gênica de membros da via Hippo e dos alvos de Yap, mas não alterou a expressão das proteínas da via em nível de proteína. O ensaio de co-imunoprecipitação (CoIP) seguida de análise por espectrometria de massas identificou um conjunto diferencial de proteínas que interagem com Yap na fração citoplasmática de células EpH4 cultivadas na ausência ou na presença de lrECM em um modelo de ECM-overlay. Uma análise realizada junto à database KEGG Pathways revelou que os possíveis interagentes Yap nas células cultivadas não-tratadas com lrECM participam de processos relacionados à proteólise mediada por ubiquitina, enquanto nas células expostas à lrECM os possíveis interagentes estão associados a processos metabólicos e são especialmente proteínas-chave do metabolismo de lipídios. A busca na plataforma de redes de interação STRING não identificou trabalhos que destaquem a interação de Yap com estas proteínas. A plataforma Vizit indica a participação de Yap em processos relacionados à síntese e atividade de lipídios e hormônios, o que reforça as evidências de que está pode ser uma nova função de Yap ainda não explorada em detalhes. A fim de se obter resultados complementares à CoIP, padronizamos o ensaio de identificação por biotinilação dependente de proximidade (BioID) em células embrionárias de rim humano da linhagem 293FT. As proteínas isoladas por pulldown foram identificadas por espectrometria de massas e uma análise junto à database Gene Ontology indicou que os possíveis interagentes de Yap nestas células são em sua maioria proteínas relacionadas à via Hippo, o que reforça a robustez do ensaio. Nós pretendemos transpor este sistema para as células EpH4. A expectativa é que, em conjunto, estes resultados nos orientem em projetos futuros para compreender os mecanismos de sinalização da MEC na morfogênese e diferenciação da glândula mamária. / Extracellular matrix (ECM)-signaling is crucial for determination of epithelial cell fate and behavior in the mammary gland. However, little is known about the molecular mechanisms involved in these processes. The Hippo pathway, a signaling cascade involved in the regulation of several cellular processes, including organ size, seems to be an important candidate as a mediator of this signaling. Our preliminary results indicate that the tissue architecture and the basement membrane, an ECM component of epithelia and other tissues, influence the location, level and activity of YAP, an effector of the Hippo pathway. In this context, the goal of this work was to identify the proteins that interact with Yap (ortholog of YAP in mouse) in mammary epithelial cells in response to the basement membrane. We used EpH4 cells, a nontumoral murine mammary cell, in a functional differentiation and acini-forming in tridimensional (3D) culture assay. Treatment of 3D multicellular structures pre-formed on nonadhesive plates with a laminin-rich extracellular matrix (lrECM) altered the subcellular localization and pattern of Yap, as well as gene expression of Hippo pathway proteins and Yap targets, but did not altered the expression of the pathway members at the protein level. Coimmunoprecipitation (CoIP) followed by mass spectrometry analysis identified a differential set of proteins interacting with Yap in cytoplasmic fractions of EpH4 cells in the absence or presence of lrECM in an ECM-overlay culture model. An analysis performed with the KEGG Pathways database revealed that putative Yap interactors in non-treated cells participate in processes related to ubiquitin-mediated proteolysis, whereas in cells exposed to lrECM Yap interactors are associated to metabolic processes and are mainly key-proteins of metabolism of lipids and carbohydrates. A search in interaction networks platform STRING did not identify previous works that showing the interaction of Yap with these proteins. Vizit platform indicated the participation of Yap in processes related to the synthesis and activity of lipids and hormones, which reinforces the evidences that Yap can play a novel poorly explored role. To obtain complementary results to CoIP, we devised the proximity-dependent biotinylation identification (BioID) assay on embryonic renal cells of 293FT cell line. Pulldown-isolated proteins were identified by mass spectrometry and an analysis performed with Gene Ontology database revealed that putative Yap interactors are Hippo pathway-related proteins, which reinforces the robustness of the assay. We intend to transpose this system to the EpH4 cells. We expect that, together, these results will guide us in future projects to understand the signaling mechanisms of ECM in mammary gland morphogenesis and differentiation.

Orientador: Fernanda da Cruz Landim / Resumo: As células-tronco mesenquimais (MSCs) exercem seus efeitos terapêuticos predominantemente pela sua atividade parácrina. Como o secretoma desempenha um papel direto nas atividades biológicas das MSCs, a análise de seus componentes proteicos é um passo fundamental para identificar os principais responsáveis no controle e regulação dos muitos processos biológicos desenvolvidos por essas células. O secretoma de MSCs pode ser modificado e melhorado de forma in vitro para estimular efeitos celulares específicos desejados para aplicações terapêuticas, e uma maneira de modificá-lo é por meio de modificações nas condições de cultura. No presente estudo, objetivou-se descrever o secretoma de células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo (AD-MSCs) de gatos e cães submetidos a diferentes condições de cultivo, identificamos e comparamos os efeitos exercidos por diferentes modificações de cultivo. Para a produção de meio condicionado, as células foram descongeladas e cultivadas com meio DMEM/F12 com 20% de FBS, suplementado com antibióticos e antimicóticos em uma incubadora com umidade controlada a 37,5 °C, e 5% de CO2. Após atingir pelo menos 70% de confluência, as garrafas foram lavadas três vezes com solução salina balanceada Hanks (HBSS) e foram cultivadas em quatro condicionamentos distintos. O meio condicionado foi colhido após 4 dias, centrifugado por 10 min/300 g, filtrado em um filtro 0,22 μm e congelado a -80 °C. Foram realizadas a extração e concentração proteica de to... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: It is now known that mesenchymal stem cells (MSCs) exert their therapeutic effects predominantly through their paracrine activity. Since the secretome plays a direct role in the biological activities of MSCs, the analysis of their protein components is a fundamental step in identifying the main responsible for the control and regulation of the many biological processes developed by these cells. The MSCs secretome can be modified and improved in vitro to stimulate specific cellular effects desired for therapeutic applications, and one way of modifying it is through modifications in the culture conditions. In the present study, in addition to describing for the first time the secretome of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue (AD-MSCs) in feline species, we identified and compared the effects exerted by different culture modifications, such as the use of serum-free medium and hypoxia in the protein production by AD-MSCs in canines and felines. For the conditioned media production, the cells were thawed and cultured with DMEM/F12 medium with 20% fetal bovine serum (FBS), supplemented with antibiotics and antimycotics in controlled incubator ay 37.5 °C with 5% CO2. After reaching at least 70% confluency, the flasks were washed three times with Hanks balanced salt solution (HBSS) and were grown in four different conditions. Conditioned media were collected after 4 days, centrifuged for 10 min/300 g, filtered on a 0.22 μm filter and frozen at -80 °C. Protein extraction... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

The renewal rate of stromal and myofibrillar proteins defines muscle growth, and can affect the quality of meat, by affecting collagen turnover and proteolytic rate. There is a lack of information on changes in the muscle protein remodeling process in response to the recovery weight gain rate observed during \"realimentation\" after undernutrition, which may be altered in older animals. Changes in muscle tissue during the recovery period may be indicated by the differential expression profile of genes after RNA sequencing. The objectives of this study were to evaluate transcriptome changes in the muscle of Nellore cull cows subjected to: 1) recovery weight gain under grazing conditions; and 2) recovery from undernutrition at different weight gain rates. In the first experiment, the animals were divided into two groups and subjected to one of two nutritional managements under grazing conditions: maintenance (maintenance of weight and high body condition score under grazing conditions) and recovery gain (recovery from low body condition score with moderate body weight gain of 0.6 kg/day under grazing conditions). In the second experiment, the animals were divided into three groups and subjected to one of three nutritional managements under feedlot conditions: control (slaughtered at low body condition score), moderate recovery gain (MG; 0.6 kg of daily live weight gain) during the dry season, and high recovery gain (HG; 1.2 kg of daily live weight gain) during the dry season. In both experiments, samples of longissimus dorsi muscle were collected after slaughter and immediately frozen until sequencing analysis could be performed. In the first experiment, genes related to inflammatory response, such as semaphorin 4A (SEMA4A), solute carrier family 11 member 1 (SLC11A1), ficolin-2 (FCN2), and placental growth factor (PGF), were expressed at higher levels during recovery gain. In the second experiment, osteonectin (SPARC) and collagen type IV subunits 1 (COL4A1) were expressed at higher levels in both recovery gain and connective tissue remodeling. For MG, structural myofibrillar proteins such as myosin IE (MYO1E), myosin, heavy chain 11 (MYH11), myogenin (MYOG), and actinin, alpha 4 (ACTN4) were identified. In the HG treatment, the B-cell CLL/lymphoma 9 (BCL9), peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARA), diacylglycerol O-Acyltransferase 2 (DGAT2), and phosphatidylinositol 4-Kinase, catalytic, and beta (PI4KB) genes indicated more deposition of adipose tissue. In summary, we observed that muscular deposition during recovery weight gain involved the regulation of expression of several genes related to the extracellular matrix (ECM), corroborating the inflammatory and -like models observed in mature animals. Moreover, in the HG group, genes related to collagen synthesis and fat deposition were also found, indicating the important contribution of connective tissue during muscle growth. These results are important for understanding tissue development as a whole, and will assist in the progress of scientific knowledge on muscle remodeling during recovery weight gain and its influence on protein structures and intracellular routes. / A taxa de renovação do estroma e proteínas miofibrilares define o crescimento muscular, e pode afetar a qualidade da carne, afetando turnover de colágeno e taxa proteolítica. Há uma falta de informação sobre as mudanças no processo de remodelação de proteína muscular em resposta à taxa de recuperação do ganho de peso, observada durante a \"realimentação\" depois de subnutrição, o que pode ser alterado em animais mais velhos. Alterações no tecido muscular durante o período de recuperação pode ser indicada pelo perfil de expressão diferencial de genes, pela técnica de sequenciamento de RNA. Os objetivos deste trabalho foram avaliar as alterações do transcriptoma na musculatura de vacas de descarte Nelore submetidas a: 1) a recuperação do peso em condições de pastejo; e 2) a recuperação da desnutrição em diferentes taxas de ganho de pesos. No primeiro experimento, os animais foram divididos em: grupo de manutenção (manutenção de peso e de alta escore corporal); Recuperação do ganho (recuperação de baixo escore corporal com o ganho de peso corporal moderado em 0,6 kg / dia sob pastejo). No segundo experimento, os animais foram divididos em três grupos em confinamento: Controle (abatidos com baixo escore de condição corporal), ganho moderado (0,6 kg de ganho de peso vivo por dia) durante a estação seca e alta recuperação de ganho (1,2 kg de ganho de peso vivo por dia) durante a estação seca. Nos dois estudos, amostras do Longissimus dorsi foram coletadas após o abate e imediatamente congeladas até à análise de sequenciamento ser realizada. No primeiro experimento, os genes encontrados no tratamento de recuperação do ganho foram relacionados com a resposta inflamatória como: 4A semaphorin (SEMA4A), solute carrier family 11 member 1 (SLC11A1), Ficolin 2 (FCN2) e placental growth factor (PGF). No segundo experimento, o osteonectina (SPARC), colágeno tipo IV subunidades 1 (COL4A1) foram alguns dos genes mais expressos para ambas as taxas de ganho de recuperação de remodelação do tecido conjuntivo. Para ganho moderado, foram identificadas proteínas miofibrilares estruturais como: Myosin IE (MYO1E), Myosin, Heavy Chain 11 (MYH11), (MYOG) and actinin, alpha 4 (ACTN4). No tratamento de alta recuperação de ganho, genes como CLL de célula B / 9 linfoma (BCL9), peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARA), Diacylglycerol O-Acyltransferase 2 (DGAT2) and Phosphatidylinositol 4-Kinase, Catalytic, Beta (PI4KB) indicam maior deposição de tecido adiposo. Em resumo, observou-se que a deposição muscular durante a recuperação do ganho de peso envolve a regulação da expressão de vários genes relacionados com a matriz extracelular (ECM), corroborando com modelos de inflamação e similar a fibrose observada em animais maduros. Além disso, no grupo HG, genes relacionados com a síntese de colágeno e a deposição de gordura, também foram encontrados, indicando contribuição do tecido conjuntivo durante o crescimento muscular. Estes resultados são importantes para a compreensão do desenvolvimento do tecido como um todo, e auxiliam no progresso do conhecimento científico sobre a remodelação muscular durante a recuperação do ganho de peso e sua influência sobre estruturas de proteínas e vias intracelulares.

O conhecimento do potencial citotóxico, das reações histológicas e propriedades clínicas é imprescindível para a escolha do material na terapia pulpar de dentes decíduos. O estudo teve como objetivo avaliar o efeito de fármacos desta terapia quanto à citotoxicidade e distribuição in vitro de proteínas da matriz extracelular e do citoesqueleto de fibroblastos da polpa humana. Os grupos foram: pasta Guedes- Pinto, pasta Óxido de Zinco e Eugenol (OZE), Vitapex®, Calen® e Calen PMCC®. Os extratos brutos dos fármacos foram testados na concentração 0,2g/ml de meio DMEM/F12 (ASTM, 1992), nas diluições 10, 100 e 1000x. A citotoxicidade foi analisada pela viabilidade (24hs) e sobrevivência celular (24, 48 e 72hs) que se baseou na atividade mitocondrial de fibroblastos da polpa humana (FP5) pelo método de redução do MTT. O grupo controle foi utilizado como 100% de células viáveis. Os resultados foram submetidos à análise de variância, e teste de Tukey como contraste. O efeito dos fármacos na distribuição in vitro de proteínas da matriz extracelular (fibronectina, tenascina, colágeno I) e de citoesqueleto (vimentina) nas FP5 também foi analisado por imunofluorescência. Os resultados demonstraram que na viabilidade celular, as pastas Guedes-Pinto, pasta OZE, e Calen® foram mais citotóxicas que o grupo controle somente na maior concentração (p<0,05), sendo que esse efeito perdurou para a pasta OZE nas menores concentrações em relação ao grupo controle (p<0,05). As diferenças de citotoxicidade entre os fármacos só foram observadas na maior concentração, onde a pasta Guedes-Pinto teve maior efeito tóxico que a pasta Calen®, Calen PMCC® e Vitapex® (p<0,05), mas similar à pasta OZE. Na análise da sobrevivência celular em 72hs, todos os grupos apresentaram mesma capacidade proliferativa que o grupo controle em 24 e 48hs (p>0,05). As diferenças entre os fármacos foram observadas ao final do tempo experimental quando a Pasta Guedes-Pinto não manteve a mesma capacidade de proliferação celular que o grupo controle na maior e menor concentração (p<0,05). Na imunofluorescência, não houve diferença entre os grupos para a distribuição de proteínas da matriz extracelular e citoesqueleto nas FP5. A vimentina, proteína do citoesqueleto de células mesenquimais, encontrou-se distribuída na forma de filamentos ao longo do citoplasma celular. A fibronectina obteve marcação positiva, formando uma rede reticular no citoplasma. A tenascina e colágeno I apareceram como pequenos pontos (vesículas) distribuídos homogeneamente no citoplasma e na região perinuclear. Concluiu-se que, todos os fármacos estudados foram biocompatíveis em relação à citotoxicidade e à distribuição in vitro de proteínas da matriz extracelular e citoesqueleto de fibroblastos da polpa humana. / When electing a material to be used in deciduous pulp therapy, it is essential to acquire knowledge regarding the materials potential toxicity, histological reactions and clinical properties. This study aims at analyzing the effect of different drugs used in pulp therapy in relation to their cytotoxicity and in vitro protein distribution of extracellular matrix and cytoskeleton from human dental pulp fibroblasts. The groups were: Guedes-Pinto Paste, Zinc Oxide and Eugenol paste (ZOE), Vitapex®, Calen® e Calen PMCC®. The materials were tested using the following concentration: 0.2g/mL of culture medium (DMEM/F12) (ASTM, 1992), diluted in 10x, 100x and 1000x. The cytotoxicity was evaluated by cellular viability (24hs) and survival (24, 48 and 72hs), which was based on mitochondrial activity (MTT reduction test) of human dental pulp fibroblasts (FP5). The control group was considered to have 100% of viable cells. Data were submitted to variance analysis, using Tukey test as contrast. The drugs effect on in vitro expression of extracellular matrix proteins (fibronectin, tenascin, type I collagen) and cytoskeleton (vimentin) from FP5 were also evaluated using immnunofluorescence. The results demonstrated that, concerning cellular viability, Guedes-Pinto paste, ZOE paste, and Calen® were more cytotoxic than the control group only in their highest concentration (p<0.05), an effect observed for ZOE paste in all dilutions (p<0.05). Differences regarding cytotoxicity between groups were only observed in the highest concentration where Guedes-Pinto Paste was more toxic than Calen®, Calen PMCC® e Vitapex® (p<0.05), but was similar to ZOE paste (p>0.05). Cellular survival analysis after 72 h showed that all groups presented a similar proliferative capacity compared to the control group at 24 and 48h (p>0.05). Differences were only observed in the end of experimental period (72hs), when Guedes-Pinto paste did not maintain the same proliferative capacity than the control group in its lowest and highest concentrations (p<0.05). In immnunofluorescence tests, there was no difference between all groups for extracellular matrix and cytoskeleton proteins distribution from FP5. Vimentin, a protein from the cytoskeleton of mesenchymal cells, was distributed as filaments throughout the cytoplasm. Fibronectin was positively marked, forming a reticular net in the cytoplasm. Tenascin and Collagen I appeared punctually (as vesicles) and were homogeneously distributed in the cytoplasm and peri-nuclear region. It was concluded that all studied drugs investigated were biocompatible regarding cytotoxicity and in vitro distribution of extracellular matrix proteins and cytoskeleton proteins from human dental pulp fibroblasts.

A presença de IFN-<font face=\"symbol\">g, NO, OPN e MMPs foi avaliada em camundongos infectados com o fungo Paracoccidioides brasiliensis (Pb). Aos 15 dias, IFN-<font face=\"symbol\">g foi observado em granulomas (Gr), aumentando em resistentes (A/J) aos 120d. Suscetíveis (B10.A) tiveram mais macrófagos e células gigantes (CGs) OPN+, alta carga fúngica e baixo NO aos 15d. A/J tiveram aumento em OPN, maior NO e menor carga fúngica do que B10.A aos 120d. Camundongos infectados apresentaram MMP9 em macrófagos, GCs e Pb e atividade de MMP9 e MMP2. Aos 15d, KOiNOS tiveram Gr com necrose, debris de Pb e OPN e seus controles, Gr com muitos Pbs e OPN. Aos 120d, os controles apresentaram Gr extensos contendo muitos Pbs e expressão de OPN; KOiNOS tiveram Gr compactos com células OPN+ ou lesões residuais com pouca OPN e baixa carga fúngica. Maiores níveis de OPN foram detectados em KOiNOS. A OPN está associada com gravidade no início da infecção, mas com certo controle na fase tardia e no desenvolvimento e organização do Gr. Sugere-se que a presença de MMPs exerça influência no padrão do Gr e na disseminação fúngica. / We studied IFN-<font face=\"symbol\">g, NO, OPN and MMPs in mice infected with the fungus Paracoccidioides brasiliensis (Pb). IFN-<font face=\"symbol\">g was found in granulomas (Gr) at 15d and increased in resistant mice (A/J) at 120d. At 15d, macrophages and giant cells (MGCs) were more OPN+ in susceptible mice (B10.A) which had high fungal load and low NO. At 120d, A/J had numerous intensely stained OPN(+) cells and higher NO and lower fungal load than B10.A. MMP9 was found in macrophages, MGCs and Pb of infected mice, which had MMP9 and MMP2 activity. At 15d, KOiNOS had Gr with necrosis, altered Pb and OPN; controls had Gr with many Pb and OPN. At 120d, controls had large Gr with many Pb and OPN expression; KOiNOS had compact Gr with OPN+ cells or residual Gr with weak OPN and decreased fungal load. More OPN levels were detected in KOiNOS. OPN is associated with infection severity at the beginning and with some control at later stages of infection and is involved in Gr development and organization. We show the presence of MMPs and suggest their influence in Gr pattern and in Pb dissemination.

Este trabalho tem o objetivo avaliar o efeito da adrenalectomia bilateral no processo neurodegenerativo e cicatricial na via nigro estriatal dopaminérgica lesada pela 6- hidroxidopamina (6-OHDA) em ratos, e deste modo contribuir para a interpretação dos efeitos dos hormônios adreno esteróides nos processos neurodegenerativos e neurotróficos nas lesões do sistema nervoso central. Ratos Wistar adultos jovens foram submetidos à cirurgia de retirada bilateral das glândulas adrenais ou cirurgia simulada para a mesma. Após 2 dias, os animais foram submetidos à cirurgia estereotáxica para lesão do sistema nigro estriatal dopaminérgico através da injeção unilateral de 6-OHDA na substância negra. Os animais receberam diariamente doses de reposição hormonal de corticosterona (10mg/kg) ou solução veículo. Após um período de 72 horas, 1 semana e 3 semanas, os animais foram sacrificados por decapitação, e as regiões do mesencéfalo ventral e corpo estriado foram dissecados bilateralmente. O tecido foi processado para o método de Western blot onde foram analisados os seguintes marcadores: tirosina hidroxilase (TH enzima que participa da via de conversão da dopamina), proteína ácida fibrilar glial (GFAP proteína do filamento intermediário do citoesqueleto do astrócito), bem como as moléculas da matriz extracelular fosfacan, neurocan, sulfato de condroitina e NG2, a proteína Laminina e finalmente, o fator de crescimento fibroblástico-2 (FGF-2) na região do mesencéfalo ventral, onde observa-se ações tróficas nos neurônios dopaminérgicos nigras que podem exercer efeitos no processo inflamatório pelas suas ações gliogênica e angiogênica. Deste modo, a neurodegeneração dopaminérgica foi avaliada pelos níveis da TH, a ativação astrocitária pelos níveis da GFAP, o processo de cicatrização pela regulação das moléculas da matriz extracelular e as respostas tróficas pelo FGF-2. Pelos resultados obtidos é possível que hormônios glicocorticóides adrenais modulem os elementos envolvidos na neurodegeneração e reparo e cicatrização do sistema dopaminérgico. / This study has the objective to evaluate the effect of the bilateral adrenalectomy in the neurodegenerative process and cicatrization on the nigroestriatal pathway injury through 6-hydroxydopamine (6-OHDA) in rat, and in this way contribute for the interpretation of the adreno esteroides hormones effects in the neurodegenerative and neurotrophics process in the central nervous system.injury Adult rats wistar were submitted in a surgery to take the bilateral adrenal gland or a simulate surgery of the same. After 2 days the animals was involved into a stereotaxic surgery to nigroestriatal dopaminergic lesion with a unilateral injection of the 6-OHDA in the nigra. The animals received daily corticosterone hormonal (10mg/kg) or vehicle solution. After a period of 72 hours, 1 week and 3 weeks, the animals were decapitated, and the regions of the ventral midbrain and striatum it was bilaterally dissected. The tissue was processed by Western blot method and analyzed for the following markers: tyrosine hydroxylase (TH - enzyme that join of the dopamine conversion pathway), glial fibrilar acid protein (GFAP protein of the intermediary filament of the astrocyte citoesqueleto, the moleculars extracellular matrix phosphacan, neurocan, chondroitin sulfate and NG2, the Laminin protein and finally, the neurotrophic factor (FGF-2) in the region of ventral midbrain, where watched trophic actions in the dopaminergic neurons that could have effects in the inflammatory processes by your gliogenic and angiogenic actions. In this way, the dopaminergic neurodegeneration was evaluated by the TH levels, the astrocytary activation by the GFAP levels, the cicatrization processes by the molecules regulation of the extracellular matrix and the trophics FGF-2 answers. By the results it is possible that adrenal glucocorticoid hormones modulate the elements involved in neurodegeneration, repair and cicatrization of the dopaminergic system.

O estudo de macrointeraçães na matriz extracelular (ECM) foi abordado em três modelos; a interação colágeno/colagenase, a interação colágeno/fibronectina e finalmente, a evolução da família enzimática das metaloproteinases de matriz (MMP). As MMP se caracterizam por sua notável especificidade contra componentes da ECM. As colagenases intersticiais, os membros mais estudados, clivam os colágenos intersticiais em um único ponto da molécula produzindo dois fragmentos característicos. Usando a hipótese da hidropaticidade complementar, a qual estipula que peptídeos codificados por sequências nucleotídicas complementares podem interagir entre si, foi possível caracterizar a sequência SQNPVQP em colagenase de fibroblasto ou SSNPIQP em colagenase de neutrófilo como importantes na interação das respectivas enzimas com o colágeno nativo. O fato da fibronectina, outro componente da ECM, ligar-se no mesmo domínio do colágeno clivado pelas colagenases possibilitou a utilização da mesma abordagem acima (hidropaticidade complementar) no estudo da interação colágeno/fibronectina. Sendo assim, foi possível caracterizar a sequência TNEGVMY da fibronectina como importante na interação com o colágeno. Adjacente a este sítio na fibronectina, existe uma sequência (AAHEEIC) que é homóloga ao sítio de ligação ao zinco presente nas MMP. Isto originou a possibilidade de que zinco pudesse modular a interação colágeno/fibronectina. De fato, zinco aumentou especificamente a ligação entre colágeno e fibronectina. Finalmente, abordou-se alguns aspectos filogenéticos da família das MMP. Foi caracterizada uma relação filogenética entre o núcleo enzimático das MMP e o domínio correspondente tanto na protease de Serratia como na protease B de Erwinia chrysanthemi, membros da mesma família de metaloproteinases bacterianas. Sendo assim, a atividade catalítica das MMP pode ter sido herdada das metaloproteinases bacterianas, enquanto a especificidade ao substrato talvez se constitua em uma aquisição das MMP eucarióticas. / The study of extracellular matrix (ECM) macrointeractions was approached in three models: the collagen/collagenase interaction, the collagen/fibronectin interaction and the molecular evolution of the matrix metalloproteinase (MMP) family of enzymes. MMP is characterized by its remarkable specificity against ECM components. Interstitial collagenases, the best studied members, attack interstitial collagens at a unique site producing two fragments. Using the complementary hydropathy hypothesis that states that peptides encoded by complementary nucleotide sequence can interact one to another, it was possible to characterize the sequence SQNPVQP (in fibroblast collagenase) or SSNPIQP (in neutrophil collagenase) as important in the interaction of the respective enzymes with collagen. The fact that fibronectin, another ECM component, binds at the same domain on collagen that is cleaved by collagenases arose the possibility of using the same approach (complementary hydropathy) in the study of collagen/fibronectin interaction. It was possible to characterize the fibronectin sequence TNEGVMY as important in the interaction with collagen. Adjacent to this site, there is a sequence (AAHEEIC) that shows an homology to the zinc-binding site present in several MMP. Therefore, zinc could be a modulator the collagen/fibronectin interaction. Finnaly, some phylogenetic aspects of the MMP family were studied. It was characterized a phylogenetic relationship between the catalytic core of MMP and the corresponding domain in Serratia protease and protease B from E. chrysanthemi, members of the same family of bacterial metalloproteinases. The catalytic activity of MMP can have evolved from the bacterial metaloproteinases whereas the substrate specificity is an acquisition of eukaryotic MMP

Leptospiras são bactérias espiroquetas altamente móveis dotadas de estratégias que possibilitam grande eficiência nos processos de invasão e disseminação no hospedeiro. Nosso grupo demonstrou previamente que leptospiras patogênicas secretam proteases capazes de clivar e inativar moléculas-chave do sistema complemento humano, o que confere a essas bactérias a capacidade de driblar os mecanismos de defesa do sistema imune inato. Dada a rápida disseminação das leptospiras durante o processo de infecção, aventou-se a hipótese de que essas proteases secretadas pudessem alvejar uma gama maior de moléculas do hospedeiro. No presente estudo, a atividade proteolítica de proteínas secretadas por leptospiras sobre um painel de moléculas da matriz extracelular e do plasma foi avaliada. O sobrenadante de cultura da estirpe virulenta L. interrogans sorovar Kennewicki Fromm degradou fibrinogênio humano, fibronectina plasmática, colágeno Tipo I, e as proteoglicanas decorina, biglicam e lumicam. A atividade proteolítica foi inibida por 1,10-fenantrolina, sugerindo o envolvimento de metaloproteases. Laminina, matrigel, plasminogênio e trombina não foram clivados por proteases presentes nos sobrenadantes. Ainda, os dados indicam que a produção de proteases deve ser um determinante de virulência importante, uma vez que os sobrenadantes de estirpes saprófitas ou patogênicas atenuadas em cultura não apresentaram atividade proteolítica sobre componentes da matriz ou do plasma. A análise dos genomas de leptospiras disponíveis nos levou à identificação de quatro termolisinas, metaloproteases presentes apenas nas espécies patogênicas. Uma delas, codificada pele LIC13322, foi produzida na forma recombinante e apresentou atividade proteolítica sobre fibrinogênio, biglicam e decorina. Em paralelo, foram também realizadas análises comparativas dos exoproteomas das estirpes Fromm e Patoc I. Algumas metaloproteases que podem estar envolvidas na degradação de moléculas do hospedeiro foram identificadas. A capacidade de clivar moléculas do tecido conjuntivo e proteínas da cascata de coagulação pode certamente contribuir para a invasão e a destruição tecidual observadas durante a infecção por Leptospira. / Leptospires are highly motile spirochetes equipped with strategies for efficient invasion and dissemination within the host. Our group previously demonstrated that pathogenic leptospires secrete proteases capable of cleaving and inactivating key molecules of the human complement system, allowing these bacteria to circumvent host´s innate immune defense mechanisms. Given the successful dissemination of leptospires during infection, we wondered if such proteases would target a broader range of host molecules. In the present study, the proteolytic activity of secreted leptospiral proteases against a panel of extracellular matrix and plasma proteins was assessed. The culture supernatant of the virulent L. interrogans serovar Kennewicki strain Fromm degraded human fibrinogen, plasma fibronectin, collagen Type 1, and the proteoglycans decorin, biglycan, and lumican. Proteolytic activity was inhibited by 1,10-phenanthroline, suggesting the participation of metalloproteases. Laminin, matrigel, plasminogen and thrombin were not cleaved by proteases present in the supernatants. Moreover, production of proteases might be an important virulence determinant since culture-attenuated or saprophytic Leptospira did not display proteolytic acticity against ECM or plasma components. A search against Leptospira genomes allowed identification of four thermolysins, which are metalloproteases found exclusively in pathogenic species. One of them, encoded by LIC13322, was produced in the recombinant form and displayed proteolytic activity against fibrinogen, biglycan and decorin. Comparative exoproteomic analyses using Fromm and Patoc I strains were also performed and allowed identification of a few metalloproteases that could be involved in the degradation of host components. The ability to cleave connective tissue molecules and coagulation cascade proteins may certainly contribute to invasion and tissue destruction observed upon infection with Leptospira.

O glioblastoma multiforme (GBM) é uma neoplasia do sistema nervoso central (SNC), caracterizada por uma elevada capacidade proliferativa e migratória. O desenvolvimento do tumor provoca uma remodelação da matriz extracelular (MEC) que facilita a migração tumoral. Eicosanóides são moléculas lipídicas importantes na carcinogênese e a sua síntese está correlacionada com o grau de desenvolvimento do tumor. As prostaglandinas são eicosanóides envolvidas na estimulação da angiogênese, na adesão celular e proliferação celular. Este estudo tem por objetivo avaliar in vitro o efeito da PGE2 na expressão moléculas da MEC e das moléculas de adesão envolvidas na migração, em células U87MG e U251MG. As células U251MG e U87MG foram tratadas com PGE2 (10&#181;M) e Ibuprofeno (25&#181;M), por um período 48hs. As proteínas da MEC foram analisadas por RT-qPCR após o tratamento. Foram realizadas reações de imunohistoquímica para as moléculas da MEC. As alterações foram encontradas na expressão de laminina, fibronectina, colágeno tipo IV e as integrinas &alpha;v , &alpha;3 e &alpha;5 para células U87MG . Observamos imunomarcação nas linhas celulares para colágeno tipo IV, laminina e fibronectina. Concluímos que o tratamento com IBU e PGE2, afeta a expressão gênica de moléculas de MEC. / Glioblastoma Multiforme (GBM) is a neoplasm of the central nervous system (CNS), characterized by a high proliferative and migratory capacity. Tumor development leads to extracellular matrix (ECM) remodeling and facilitating the migration of these cells. Eicosanoids are important lipid molecules in carcinogenesis, and their synthesis often correlates with the degree of tumor development. Prostaglandins are eicosanoids involved in the stimulation of angiogenesis, cell adhesion and cell proliferation. This study is aimed to evaluate the expression of several ECM molecules involved in migration after altering the concentration of prostaglandins, using human glioma cell lines as an in vitro model. The cell lines U87MG and U251MG were treated with PGE2 (10&#181;M) and Ibuprofen (25&#181;M), for a predetermined period of 48hs. Proteins involved in extracellular matrix were analyzed by RT-qPCR after treatment in vitro. Immunohistochemical reactions were also performed for the ECM molecules. Changes were found in the expression of laminin, fibronectin, type IV collagen and &alpha;v, &alpha;3 and &alpha;5 integrins in cells U87MG. We observed immunostaining in cell lines to type IV collagen, laminin and fibronectin. In conclusion, Ibuprofen and PGE2, affects gene expression of ECM molecules.

Diabetes mellitus (DM) é caracterizado pela hiperglicemia crônica (HG), responsável por diversas complicações de longo prazo, como por exemplo a cicatrização deficiente. Nós investigamos os efeitos da HG na migração de fibroblastos dérmicos sobre colágeno e fibronectina, utilizando substratos bidimensional (2-D) e tridimensional (3-D). Observamos que a HG reduziu a velocidade de migração em ambas as matrizes. O tratamento sistêmico com antioxidantes preveniu esses efeitos. A velocidade de formação das protrusões celulares não foi afetada, mas houve uma redução na estabilidade das mesmas, sugerindo comprometimento das adesões. De fato, a HG reduziu a adesão celular sobre colágeno e fibronectina, enquanto o espraiamento celular estava reduzido sobre o colágeno e aumentado sobre fibronectina. Adicionalmente, a distribuição das subunidades <font face=\"Symbol\">a1, <font face=\"Symbol\">av e <font face=\"Symbol\">a5 de integrinas foi afetada pela HG. Esse estudo mostrou que os efeitos da HG sobre a migração celular envolvem mecanismos básicos comuns a vários substratos, mas também mecanismos especificamente relacionados com a adesão à fibronectina, envolvendo possivelmente o estresse oxidativo e vias de sinalização iniciadas nas adesões. / Diabetes mellitus (DM) is characterized by chronic hyperglycemia (HG), which causes several complications, including impaired wound healing. We investigated the effects of HG on the migration of primary dermal fibroblasts on collagen and fibronectin, using two-dimensional (2-D) and three-dimensional (3-D) substrates. We observed that HG reduced migration velocity on both matrices. Systemic treatment with antioxidants prevented these effects. The velocity of protrusion formation was unaffected, but a decrease in protrusion stability was observed. HG slightly interfered with cell adhesion on collagen and fibronectin, but cell spreading was reduced on collagen and increased on fibronectin. Accordingly, the distribution of the integrin subunits <font face=\"Symbol\">a1, <font face=\"Symbol\">av and <font face=\"Symbol\">a5 was affected by HG. This study shows that the effects of HG on cell migration involve basic mechanisms common to various substrates, as well as mechanisms specifically related to fibronectin, possibly involving oxidative stress and adhesion signaling.