A regulação da expressão gênica é essencial para os fungos se adaptarem às adversidades ambientais, como alterações no pH extracelular, escassez de nutrientes, força iônica e oscilações de temperatura. A resposta adaptativa ao pH ambiente é bem caracterizada em fungos modelo como Aspergillus nidulans, e envolve a via de transdução de sinal constituída pelos produtos dos genes pal e pacC. No dermatófito Trichophyton rubrum, o gene pacC foi inativado, e a linhagem mutante apresentou uma diminuição na atividade das queratinases, indicando que, de alguma forma, este gene está envolvido na regulação da atividade queratinolítica deste dermatófito, e consequentemente na sua virulência e patogenicidade. Além disto, a glicosilação protéica é uma importante forma de regulação pós traducional, estruturando e estabilizando glicoproteínas que podem ser da via secretória, da parede ou da membrana celular. O processo de glicosilação protéica sofre influência do pH extracelular e da fonte nutricional. Foi ainda relatado que este tipo de regulação pós traducional também sofre influência dos genes palB e pacC, indicando que estes genes tenham um papel na glicosilação de enzimas secretadas. O objetivo deste trabalho foi analisar a influência do pH e da fonte nutricional na expressão de genes que codificam enzimas de N- e O-manosilação, e sua possível modulação pela proteína PacC no dermatófito T. rubrum. Para tanto, foi analisado, por PCR em tempo real, o perfil transcricional destes genes nas linhagens H6 (controle) e pacC-1, utilizando-se como fonte de carbono glicose, glicose e glicina ou queratina em vários tempos de cultivo, em pH 5,0 ou 8,0. A análise da expressão gênica revelou que quando a linhagem controle é cultivada em queratina em pH 5,0 ocorre um aumento da expressão da O-manosiltransferase, comparado com o cultivo em glicina com glicose e glicose. Porém, nestas mesmas condições o gene da N-manosiltransferase da linhagem mutante apresenta maiores níveis de expressão que os da linhagem controle. Em pH 8,0 pode-se notar grande semelhança entre os perfis de expressão apresentados por estes dois genes. Os resultados obtidos indicam que o gene pacC tem um papel importante no sensoriamento de nutrientes em meio ácido, modulando a expressão destas transferases, nas condições avaliadas. Estas enzimas podem ativar proteínas que atuam na hidrólise da queratina, ou mesmo formar glicoproteínas de parede celular que são essenciais na adesão do fungo à célula do hospedeiro, sugerindo um papel das manosiltransferases no processo infeccioso. / Gene expression regulation is essential for fungi to adapt to environmental adversities, such as changes in the extracellular pH, nutrient starvation, ionic strength, and temperature. The adaptive response to ambient pH is well characterized in model fungi such as Aspergillus nidulans, and involves the signal transduction pathway consisting of the products of the pal and pacC genes. In the dermatophyte Trichophyton rubrum, the pacC gene was inactivated and the mutant strain showed a decreased activity of keratinases, indicating that, somehow, this gene is involved in the regulation of the keratonolytic activity of this dermatophyte, and consequently in its virulence and pathogenicity. Moreover, protein glycosylation is an important form of post-translational regulation, playing a role in protein folding and stability of glycoproteins of the secretory pathway, cell wall or membrane. The process of protein glycosylation is influenced by extracellular pH and nutritional source. It has also been reported that this type of post-translational regulation is also influenced by the palB and pacC genes, indicating that these genes have a role in glycosylation of secreted enzymes. The objective of this study was to analyze the influence of the pH and nutritional source in the expression of the genes coding for the N-and O-manosylation enzymes, and their possible modulation by PacC in the dermatophyte T. rubrum. To this end, the transcriptional profile of these genes was analyzed, by Real Time PCR, in the H6 (control) and pacC-1 strains, using glucose, glucose with glycine, or keratin as the carbon source, in several culture times, at pH 5.0 or 8.0. Gene expression analysis showed that when the control strain is grown in keratin at pH 5.0 there is an increased expression of the O-manosyltransferase encoding gene, compared to the cultivation in glucose and glucose with glycine. However, at the same conditions the gene coding for the N-manosyltransferase presented higher levels of expression in the mutant strain in relation to the control strain. At pH 8.0 there is a great similarity between the expression profile of these two genes. The obtained results indicate that pacC gene plays an important role in nutrient sensing at acidic pH by modulating the expression of these transferases in the conditions evaluated. These enzymes can activate proteins that play roles in the hydrolysis of keratin, or even forming cell wall glycoproteins that are essential for the adhesion of the fungus to the host cell, suggesting a role of the manosyltransferases in the infectious process.

Os implantes utilizados para regeneração tecidual ainda falham na tentativa de mimetizar as propriedades da matriz extracelular (ECM), o que compromete a viabilidade e aplicabilidade do material. Além disso, permanece o desafio de desenvolver um método de aplicação minimamente invasivo para evitar danos teciduais adicionais (Badylak et al., 2015; Crapo et al., 2011; Xing et al., 2014). Assim, o objetivo do projeto é desenvolver um hidrogel injetável composto de ECM de pericárdio, tendão e osso bovino enzimaticamente digerida e reticulada com glutaraldeído, ésteres ativados de NHS e derivados de polietilenoglicol (PEG). O protocolo de digestão foi modificado de Willians (Williams et al., 2015), utilizando tripsina, pepsina e colagenase. A quantificação de GAGs e peptídeos mostrou que, independentemente do substrato e enzima utilizados, o processo em etapas gerou uma maior concentração de estruturas em relação ao processo contínuo. Adicionalmente, a análise de dicroísmo circular mostrou que o processo em etapas preservou mais estruturas secundárias. O perfil proteico das ECMs foi analisado como descrito em Flores (Flores et al., 2016), e foi verificado que ele é altamente diverso e tecido - específico. A ECM do pericárdio possui 94 tipos diferentes de proteínas, seguidas pela ECM do tendão (48) e pela ECM óssea (35), sendo o colágeno α1 (1) e o colágeno α2 (1) presentes em todas elas. Além disso, os produtos digeridos ECMp aumentaram a proliferação e diferenciação de células-tronco mesenquimais da medula óssea a osteoblastos maduros. A cinética do processo de gelificação, bem como as propriedades mecânicas do gel são dependentes do tipo de agente reticulante, assim como da concentração da gelatina. Este novo material é altamente personalizável e adaptável à aplicação biológica desejada. / The implants used for tissue regeneration still fail to mimic properties of extracellular matrix. It compromises the material viability and applicability. Furthermore, the challenge to manufacture a minimally invasive delivery system for it to avoid extra tissue damage still remains (Badylak et al., 2015; Crapo et al., 2011; Xing et al., 2014). Thus, the project goal is to develop an injectable hydrogel composed of pericardium, tendon and bovine bone ECM enzymatically digested and crosslinked with glutaraldehye, activated esters of NHS and polyethylene glycol (PEG) derivatives. The digestion protocol was modified from Willians (Williams et al., 2015), using trypsin, pepsin and collagenase as lytic enzymes. GAGs and peptides quantification showed that regardless of the substrate and enzyme, the stepwise process yields a higher amount of GAGs and peptides in comparison with the continuous process. In addition, circular dicroism analysis showed that the stepwise process preserves more secondary structures of proteins. ECMs protein profile was analyzed as in Flores (Flores et al., 2016) and verified that it is the highly diverse and tissue-specific. Pericardium ECM has 94 different types of proteins, followed by tendon ECM (48) and bones ECM (35), being collagen α1(1) and collagen α2(1) present in all of them. Furthermore, the ECMp digested products enhanced bone marrow mesenchymal stem cells proliferation and differentiation in mature osteoblast. The kinetics of the gelification process, as well as mechanical properties of the gel is dependent of the type of crosslinker and concentration of gelatin. This new material is highly customizable and adaptable to the biological application.

Made available in DSpace on 2015-03-03T11:52:45Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-24Bitstream added on 2015-03-03T12:07:05Z : No. of bitstreams: 1 000807414.pdf: 4353720 bytes, checksum: 64776914c46d543dc56331a0b9006668 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A prevalência de Incontinência Urinária (IU) em gestantes diabéticas é significantemente elevada e permanece alta 2 anos após o parto cesárea. Esses achados evidenciam que o diabete na gestação é fator de risco para o desenvolvimento de IU nas mulheres que não tiveram a influência da via de parto. Os estudos desse binômio diabete e IU na gestação são escassos na literatura. A incontinência pode ser a consequência mais comum da hiperglicemia comparada a outras complicações, assim, identificar os fatores de risco para o desenvolvimento da IU em diabéticas é o maior objetivo na prevenção desta condição tão comum. Pesquisas recentes apontam que não apenas o músculo mas também a matriz extracelular (MEC) uretral desempenham importante papel no mecanismo da continência urinária. Os trabalhos translacionais do nosso grupo de pesquisa evidenciaram que o diabete na prenhez de ratas lesa a matriz extracelular e o músculo estriado uretral, o que pode explicar a alta prevalência de IU e disfunção do assoalho pélvico em mulheres com diabete mellitus gestacional. O diabete exerce efeito na expressão, organização e modificação nos componentes da MEC em diversos órgãos e a remodelação do tecido e a fibrose parecem ser uma consequência direta do diabete. Assim, entendendo o impacto de fatores de risco modificáveis como o diabete, implica que o uso de estratégias preventivas pode reduzir as taxas de IU e melhorar a qualidade de vida das mulheres, especialmente na gestação e no pós-parto / FAPESP: 10/10740-3

Orientador: Renée Laufer Amorim / Coorientador: Rosemeri de Oliveira Vasconcelos / Banca: Carlos Eduardo Fonseca Alves / Banca: Andrigo Barboza De Nardi / Banca: Felipe Augusto Ruiz Sueiro / Banca: Antonio Carlos Alessi / Resumo: O câncer é uma doença complexa que precisa de um microambiente favorável para seu crescimento e progressão. Esse microambiente tumoral esta constituido por células neoplásicas, vasos sanguíneos, células imunes, fibroblastos e a matriz extracellular (MEC). Geralmente, as células neoplásicas apresentam modificações nas suas vias de sinalização. No homem, a via mTOR/4E-BP1/eIF4E foi descrita como alterada em diferentes tumores, incluindo o câncer de próstata (CP).Além do homem, o cão é espécie doméstica que desenvolve com mais frequência o CP, sendo considerada um potencial modelo para estudos na área de Oncologia Comparada. Devido à limitada informação sobre a via mTOR/4E-BP1/eIF4E e os componentes da MEC nos CP caninos, o objetivo deste estudo foi avaliar a expressão gênica e protéica de mTOR, 4E-BP-1 e eIF4E neste tipo de tumor. Outrossim, avaliar a expressão dos colágenos (C-I e C-III) pela técnica Picrosirius (PSR) e imuno-histoquímica no tecido prostático normal e neoplásico. Foram utilizadas 35 amostras de tecido prostático caninos. Identificou-se alta expressão protéica de p-mTOR e eIF4E nos CP caninos com alto GS (≥ 8), assim como, correlação positiva entre essas proteínas. Nos colágenos não foi observada diferença de expressão quando comparadas amostras de próstata normal e CP canino. De forma similar com o CP humano, estes resultados sugerem que p-mTOR e eIF4E podem ser bons marcadores para o processo carcinogênico prostático canino e estão correlacionados com alto GS... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Cancer is a complex disease that needs a favorable microenvironment for its growth and progression. This tumor microenvironment consists of neoplastic cells, blood vessels, immune cells, fibroblasts and extracellular matrix (ECM). Generally, neoplastic cells show modification in their signaling pathways. In men, the mTOR/4EBP1/eIF4E pathway has been described as altered in different tumors, including prostate cancer (PC). Apart from men, the dog is the only species that develops with high frequency the PC, being considered a potential model for comparative oncology initiatives. Due to limited information on this pathway and ECM components in canine tumors, this study aimed to investigate mTOR, 4E-BP1 and eIF4E gene and protein expression in canine PC. Additionally, to evaluate the expression of collagens (C-I and C-III) by Picrosirius Red and Immunohistochemistry in normal samples and canine PC. Were used a total of 35 formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) samples from canine prostatic tissue. We identified higher p-mTOR and eIF4E protein levels in the canine PC with higher GS (≥ 8), as well as, significant positive correlation between these proteins. No difference statistical was observed in the collagen expression between normal samples and canine PC. Similar to human PC; our data suggested that p-mTOR and eIF4E good markers for canine prostatic carcinogenic process and are correlated with higher GS. Also, the distribution and collagen levels are similar in normal and neo... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Glioblastoma multiforme é a forma mais comum e agressiva de tumor cerebral que apresenta um severo crescimento e um comportamento altamente invasivo. Linhagens de células de glioma em cultura apresentam alta atividade da enzima ecto-5’-nucleotidase que metaboliza AMP em adenosina. Em adição, ela também interage com componentes da matriz extracelular como molécula adesiva. Neste trabalho, nós avaliamos o efeito de diferentes componentes da matriz extracelular sobre a atividade da ecto-5’-nucleotidase, proliferação, adesão e migração celular na linhagem de células de glioma humano U138-MG. Os resultados obtidos mostraram uma inibição da atividade enzimática da ecto-5’- nucleotidase quando tratada com laminina sozinha e com fibronectina ou laminina em co-tratamento com dextran sulfato. O dextran sulfato mostrou reduzir a proliferação em 37%. O mesmo efeito foi observado para os co-tratamentos entre dextran/laminina (29%) e dextran/colágeno (28%). A presença de adenosina diminuiu a adesão celular em torno de 40% e o APCP aumentou a adesão em 75%. Laminina inibiu a adesão celular, já a condroitina sulfato aumentou em 70%. As células U138 apresentaram uma redução da adesão e migração celular quando tratadas apenas com dextran e também no co-tratamento deste com adenosina e APCP. Diante dos resultados podemos sugerir a modulação da atividade da ecto5’-nucleotidase e assim uma modulação da produção de adenosina por moléculas da matriz extracelular, afetando assim eventos celulares envolvidos no comportamento invasivo destas células tumorais. / Glioblastoma multiforme is the most aggressive form of brain tumor that shows a severe growth and highly invasiveness behavior. Glioma cell lines in culture present a high activity of the ecto-5’-nucleotidase (ecto-5’-NT/CD73) which metabolizes AMP to adenosine. In addition, ecto-5’-NT/CD73 also has contact with extracellular matrix components like adhesive molecule. In the present paper, we evaluate the effect of distinct extracellular matrix components on the ecto-5’- NT/CD73 activity, proliferation, adhesion and migration in U138-MG human glioma cell line. The results showed an inhibition of enzymatic activity of ecto-5’NT/CD73 in the presence of laminin, fibronectin plus dextran sulfate and laminin plus dextran sulfate. In the proliferation assay it was observed that dextran sulfate reduced the proliferation in 37% and in association with collagen type I or laminin, the proliferation was reduced too (28% and 29%, respectively). The presence of adenosina decreased of adhesion at about 40% and when treated with APCP increased in 75%. Laminin inhibited the cell adhesion and chondroitin sulfate increased in 70%. U138 cells presented reduction of adhesion and cell migration in the presence of dextran sulfate alone and in the presence of adenosine and APCP. Taken together these results suggest the modulation of ecto-5’-NT/CD73 activity and production of adenosin by extracellular matrix molecules, affecting cell events involved in the invasiveness behavior this tumor cells.

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-10-01T22:07:36Z No. of bitstreams: 1 Andressa Moraes Guimarães da Silva.pdf: 6335373 bytes, checksum: a2c35eb3696b4a81ce4e63f9767befbf (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-01T22:07:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Andressa Moraes Guimarães da Silva.pdf: 6335373 bytes, checksum: a2c35eb3696b4a81ce4e63f9767befbf (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A silicose é uma doença pulmonar, de caráter restritivo, causada pela inalação de partículas de sílica cristalina. Se caracteriza pela indução de uma inflamação crônica associada à intensa proliferação de fibroblastos e acúmulo exacerbado de componentes de matriz extracelular, e para a qual não há um tratamento eficaz. Os fibroblastos são considerados alvos cruciais em doenças de natureza fibrótica e o desenvolvimento de sistemas que permitam avaliar a reatividade destas células é de fundamental importância na busca por terapias anti-fibróticas. No presente estudo foi desenvolvido um sistema de cultura primária em 3D (esferóides), utilizando fibroblastos provenientes do pulmão de camundongos normais e silicóticos objetivando analisar comparativamente os aspectos morfológicos/funcionais de ambas as populações celulares. Os fibroblastos foram obtidos a partir da dissociação mecânica/enzimática dos pulmões de camundongos Swiss-Webster 7 dias após a instilação intranasal de salina (controle) ou sílica (10 mg/animal). Após a terceira passagem, as células foram cultivadas em placas de 96 poços, revestidas com agarose, na ausência ou presença de IL-13 (40 ng/mL), sendo os esferóides avaliados quanto a aspectos morfológicos (tamanho/diâmetro médio/constituição), e funcionais tais como: proliferação, produção de citocinas (TGF-b e quimiocinas (MCP-1)) e de colágeno. Através da análise por microscopia de luz invertida, verificamos que os esferóides contendo fibroblastos de animais normais e silicóticos mostraram progressiva diminuição do tamanho/diâmetro, e maior densidade, ao longo do tempo analisado (1 – 4 dias), com os silicóticos apresentando valores sempre superiores aos dos controles. A estimulação com IL-13 induziu claro aumento de tamanho/diâmetro em ambas as populações de esferóides. A análise por microscopia eletrônica de varredura (MEV) revelou haver diferenças morfológicas importantes entre os grupos normal e silicótico, no que tange ao formato e à constituição celular, com expressivo aumento no conteúdo de matriz extracelular detectado na condição de estimulação com IL-13. De forma interessante, foi observado que os esferóides silicóticos apresentaram níveis basais aumentados de proliferação celular e secreção de TGF-b, assim como de colágeno, em comparação aos dos controles. Tanto esferóides normais quanto silicóticos foram sensíveis à estimulação com IL-13, sendo verificado aumento equivalente na taxa de proliferação e nos níveis de TGF-b e MCP-1 em ambos os grupos. No que tange a produção de colágeno, os esferóides normais mostraram-se responsivos à IL-13 enquanto os silicóticos não. Em conjunto, nossos achados mostraram que os fibroblastos pulmonares de camundongos adultos são: (i) passíveis de serem cultivados em sistema de cultura 3D; (ii) responsivos à estimulação com IL-13 e que; (iii) os esferóides silicóticos apresentam características de ativação em comparação aos normais. Além disso, este modelo mostrou-se reprodutível e promissor quanto a possibilidade de utilização futura na busca por compostos com atividade antifibrótica. / Silicosis is a restrictive pulmonary disease caused by inhalation of crystalline silica particles, which is characterized by chronic inflammation associated with intense fibroblast proliferation and exacerbated accumulation of extracellular matrix components. There is no effective treatment for this disease. Fibroblasts are considered crucial cells in fibrosis, and the development of systems which lead to evaluate their reactivity is important in the search for anti-fibrotic therapy. In this study we aimed to establish a system of primary cell culture in 3D (spheroids) using lung fibroblasts from normal and silicosis mice, in order to perform a comparative analysis of morphological/functional aspects of both cell populations. Fibroblasts were obtained after mechanical/enzymatic dissociation of the lung tissue from Swiss- Webster mice, 7 days after intranasal instillation of saline (control) or silica (10 mg / animal). After the third passage, the cells were cultured in 96-well plates coated with agarose, in the absence or presence of IL-13 (40 ng/ml) and the spheroids were evaluated regarding the morphological (size/diameter/constitution) and functional parameters (proliferation and generation of cytokine (TGF-b), chemokine (MCP-1) and collagen. By means of inverted light microscopy, we noted that spheroids containing fibroblasts from normal and silicotic animals showed a progressive reduction in size/ diameter and increase in density when analyzed for 1 - 4 days of culture. Those from silicotic mice showed themselves bigger as compared to controls. Stimulation with IL-13 induced an increase in size/diameter of both cell populations. The analysis by scanning electron microscopy (SEM) revealed significant morphological differences between normal and silicotic groups, with a significant increase in the content of extracellular matrix being detected under condition of stimulation with IL-13. Interestingly, we observed that spheroids with cells from silicotic mice showed increased basal levels of cell proliferation and secretion of TGF-b and collagen as compared to the controls. Both spheroid populations were sensitive to IL-13 stimulation as attested by increased cell proliferation as well as TGF-b and MCP-1 levels. Increased collagen production was detected only in the case of normal cells. Altogether, our findings show that adult mouse lung fibroblasts grow in a 3D culture system, that they are responsive to IL-13 stimulation and that those from silicotic mice showed an activated phenotype as compared to the controls. Thus, this experimental model seems to be reproducible and promising in the case of searching for anti-fibrotic compounds.

Made available in DSpace on 2014-12-05T18:41:16Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) ellen_contreiras_ioc_dout_2000.pdf: 498931 bytes, checksum: e1cd4415e0ee25940a50108c1801ed6f (MD5) Previous issue date: 2014-11-18 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Neste trabalho, estudamos timos de eqüinos, incluindo aspectos morfológicos e o microambiente tímico em fetos, e em animais após o nascimento, assim como eqüinos com anemia infecciosa eqüina (AIE). Utilizamos 56 animais: 6 (2-10 meses de gestação), 42 (6 meses -18 anos de idade) e 8 (5-20 cavalos com AIE). Os timos foram analisados por técnicas histológicas, imuno histoquímica para detecção de proteínas de matriz extracelular tais como, fibronectina, laminina e colágeno tipo IV, e ainda por microscopia eletrônica. Nos animais após o nascimento, classificamos a involução tímica dependente da idade em cinco graus. Atrofias graus I e II, ocorriam predominantemente entre 6 a 18 meses de idade; atrofia III, de 18 meses até 4 anos de idade; atrofias IV e V, de 4-5 anos de idade até 18 anos. Esta atrofia não ocorre uniformemente, no mesmo timo, demonstrando variação local de um lóbulo para outro, sugerindo variabilidade de microambiente.Espaços perivasculares (PVS) foram observados contendo, linfócitos os quais formavam uma camada celular ou eram dispostos em cordões, sugerindo comunicação funcional com a camada periférica de células epiteliais do compartimento intraparenquimal A matriz extracelular no timo eqüino apresenta distribuições definidas na cápsula, septos e espaço perivascular (colágenos intersticiais, proteoglicanos, fibras elásticas e fibronectina); membrana basal lobular e vascular (laminina e colágeno tipo IV); intersticial ou intraparenquimal colágeno tipo III e fibronectina. Isto é semelhante ao que foi observado em timo de outras espécies de mamíferos. Hematopoese intratímica não linfóide é um acontecimento freqüente em cavalos. Eosinófilos se diferenciam dentro do timo uma vez que tem formas imaturas como mielócitos e metamielócitos. Eosinopoese foi observada em timos eqüinos, em todas as idades estando entretanto em menor número em animais idosos. A eosinófilos imaturos e maduros foram encontrados em várias regiões dos lóbulos tímicos (dispersos ou formando agregados), particularmente nos espaços perivasculares, nas regiões cortical e medular. É interessante destacar que grânulos de eosinófilos não apresentam o típico cristaloide como outras espécies de mamíferos. Avaliamos também fetos eqüinos. Aspectos morfológicos foram descritos, em relação ao aparecimento seqüencial de certos eventos fundamentais, assim como a definição córtico-medular, e maturação dos corpúsculos de Hassall Esses são similares àqueles descritos em humanos e outras espécies animais. Entretanto, os fetos eqüinos, apresentavam intensa eosinofilia intratímica e hematopoese de outras linhagens. Adicionalmente, vasos linfáticos bem definidos repletos de linfócitos foram vistos nos timos fetais. Nossos resultados demonstraram que comparando várias características morfológicas com timos de outros mamíferos, o timo fetal eqüino exibe aspectos particulares, sugerindo representar um interessante modelo adicional para estudos de hematopoese não linfóide intratímica em mamíferos, assim como a origem e destino de linfócitos encontrados dentro de vasos linfáticos tímicos. Finalmente, estudamos timos de cavalos com AIE. Observamos uma severa e acelerada atrofia tímica, com formação de grandes corpúsculos de Hassall cistificados, assim como um aumento da deposição dos componentes de matriz extracelular e da rede vascular quando comparados aos timos de animais normais. Concluindo, nosso estudo enfatizou ainda a importância de se analisar vários modelos animais, de forma a evitarmos o víés de percebermos o sistema imune baseando-se somente ou, em sua maioria, no modelo de camundongo / n this work, we studied morphological aspects and the equine thymic microenvironment in fetuses, and in the normal post -natal development, as well as in horses undergoing Equine Infectious Anemia (EIA). This study comprised 56 animals in different ages. These thymuses were analyzed by conventional histology, immunohistochemistry for de tection of extracellular matrix proteins. In post-natal animals, we classified the equine age -dependent thymic involution or atrophy in five grades. Atrophies of grades I and I I occurred predominantly from 6 to 18 months old; atrophy III, from 18 months to 4 years old; atrophies IV and V, from 4-5 to 18 years old. This atrophy does not occur uniformly, e ven in the same thymus, showing local variation from one lobule to another, thus suggesti ng microenvironmental variability. Perivascular spaces (PVS) were observed and lymphoc ytes formed a cell layer or were arranged in strands, suggesting a functional commun ication with the peripheral layer of epithelial cells from the intraparenchymal compartm ent. The extracellular matrix in the equine thymus prese nted four basic distribution profiles in capsular, septal and perivascular (interstitial collagens, proteoglycans, elastic fibers and fibronectin); lobular and vascular basement membran e (laminin and type IV collagen); interstitial or intraparenchymal type III colagen a nd fibronectin. In general, this is similar to what has been previously seen in the thymus of othe r mammalian species. Intrathymic non-lymphoid hematopoiesis is a frequen t event in horses. Eosinophils differentiate within the equine thymus since immatu re forms such as myelocytes and metamyelocytes are often detected. Eosinopoiesis we re observed in the equine thymus in all ages being however less numerous in the older anima ls. These immature and mature eosinophils were found in various regions of the th ymic lobules (scattered or forming clusters), particularly in the perivascular spaces, both in the regions cortical and medular. Interestingly, eosinophil granules do not exhibit t he typical crystalloid from other mammalian species. We also evaluated the equine fetal thymus. The morphological aspects described, plus the sequential appearance of certain fundament al events, such as cortical-medullar definition, the appearance and the maturation of Ha ssall’s corpuscles, are similar to those described in humans and other animals species . However, the equine fetal thymuses show intense intrathymic eosinophilia and hematopoiesis of other lineages. Additionally, clear-cut lymphatic vessels full of l ymphocytes were seen in these fetal thymuses. Our results show that despite sharing sev eral morphological features with the thymus from other mammals, the equine fetal thymus exhibits particular aspects, suggesting that it may represent an interesting mod el for further studies on mammalian intrathymic non-lymphoid hemopoiesis as well as the origin and fate of lymphocytes found within thymic lymphatic vessels. Finally we studied thymuses from horses undergoing equine infectious anemia. we observed a severe an accelerated thymic atrophy, wi th formation of large cystic hassall's corpuscles, as well as an augmentation in the depos ition of extracellular matrix components and the vascular network when compared with normal animals. In conclusion, our study also emphasizes the import ance of analyzing various animal models, in order to avoid a skew view of the immune system, based only or mainly on the mouse model.

Made available in DSpace on 2016-04-04T12:35:26Z (GMT). No. of bitstreams: 2 debora_silva_ioc_mest_2013.pdf: 3213514 bytes, checksum: 23b0b96b076b7cdac7fa65cff13f886c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A hanseníase é uma doença infecciosa crônica que afeta a pele e os nervos periféricos, causando deformidades e incapacidades físicas devido aos danos nos nervos. A hanseníase é causada pela micobactéria Mycobacterium leprae, um patógeno intracelular obrigatório. A resposta a infecções bacterianas, virais ou parasitárias é acompanhada por diversas alterações relacionadas à hemostasia, como por exemplo, aumento nos níveis de fibrinogênio. Compreender de que modo essas alterações são induzidas nessas condições pode ser relevante para o desenvolvimento de novas ferramentas terapêuticas. Na preparação do soro de pacientes hansênicos observarmos algumas vezes a formação de um sólido coágulo lipídico, que aqui denominamos Coágulo Hansênico. Inicialmente atribuímos a uma exacerbação dos lipídios séricos a formação desse coágulo. Dos cerca de 2000 pacientes que foram atendidos no ambulatório Souza Araújo, entre os anos de 2009 e 2013, 35 apresentaram o coágulo hansênico (1,75%), dos quais 35% estavam em reação tipo II (ENH) na data da coleta. A análise desse coágulo por cromatografia em camada delgada de alta performance (HPTLC), eletroforese e espectrometria de massa, mostrou que além de uma grande concentração de lipídeos, o coágulo hansênico contém alto teor de fibrina/fibrinogênio e de imunoglobulinas Diante disso, o principal objetivo deste trabalho foi realizar a análise proteômica do coágulo hansênico e quantificar, no soro e plasma dos pacientes multibacilares em reação tipo II ou multibacilares não reacionais, moléculas que poderiam estar envolvidas na formação desse coágulo. Verificamos que a presença de coágulo hansênico está associada a níveis elevados de fator de von Willebrand e fator tecidual. Além disso, pacientes multibacilares reacionais apresentaram maiores níveis de fibrinogênio quando comparados aos pacientes multibacilares não reacionais. Acreditamos que nos pacientes multibacilares a alta carga bacilar e a resposta imune à mesma são responsáveis pelo dano tecidual e consequente liberação de moléculas de matriz extracelular, acarretando a exacerbação do processo de coagulação observada nos mesmos / Leprosy is a chronic infectious disease that affects the skin and peripheral nerves, causing deformities and disabilities due to nerve damage. Leprosy is caused by Mycobacterium leprae an obligate intracellular pathogen. Responses to bacterial, viral or parasitic infections ar e accompanied by several changes on hemostasis parameters, such as increased levels of fibrinogen. Understanding how these changes are induced in these conditions may be relevant to the development of new therapeutic tools. In prep aring serum of leprosy pa tients, sometimes it was observed formation of a lipid ic solid clot, here called Leprosum Clot, initially attributed to an exacerbation of serum lipids. Of the approximately 2000 patients treated in Souza Araújo Ambulatory (IOC/Fiocruz), between the years 2009 and 2013, 35 showed the leprosu m clot (1.75%), of w hich about 3 5% were in type II reaction (ENL) on the collect date. The analysis of such clot by high - performance thin layer chromatography (HPTLC), electrophoresis and mass spectrometry showed that in addition a high lipid contents, the leprosum clot conta ins high fibrin/fibrinogen and immunoglobulin levels. Therefore, the aim of this study was to perform a proteomic analysis of leprosum clot and quantify, in serum and plasma from multibacillary type II reactional patients and multibacillary not reactive on es, molecules that could be involved in the generation of this clot. It was observed that formation of leprosum clot is associated to elevated levels of von Willebrand factor and tissue factor. However, reactional multibacillary patients showed fibrinogen higher levels when compared to not reactive ones. We believe that in multibacillary patients the high bacterial load and immune response to it are responsible for tissue damage and subsequent release of extracellular matrix molecules, resulting in the coag ulation exacerbation observed in these patients.

Made available in DSpace on 2016-04-15T12:59:56Z (GMT). No. of bitstreams: 2 melissa_pereira_ioc_dout_2009.pdf: 8311387 bytes, checksum: fc500887f8ee4dfdef6441b8f9d7d150 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A tuberculose (TB) ocupa o segundo lugar em causa de morte por doença infecciosa de notificação compulsória. Uma das estratégias para seu controle é a vacinação, e a única vacina disponível é o BCG (Bacilo de Calmette-Guèrin). Embora utilizada mundialmente, a vacina BCG apresenta diversas limitações. O Brasil utiliza a cepa Moreau para produção da vacina, sendo o único país do mundo autilizar, desde os anos 1930, esta cepa para vacinação. Como observado para outros patógenos intracelulares, a imunidade celular desempenha papel importante na proteção do hospedeiro contra a TB. O IFNy, secretado por células T, é descrito como uma citocina particularmente importante participando na resposta imune protetora, e é empregado como correlato de proteção, embora sua utilidade seja ainda questionável, sobretudo em populações adultas. Isto evidencia a necessidade de buscar biomarcadores adicionais que permitam uma correlação de proteção mais confiável. As proteínas extracelulares micobacterianas estão entre as primeiras moléculas a interagirem com o sistema imune do hospedeiro, e uma melhor compreensão de seu papel imunomodulatório poderá contribuir para o desenvolvimento de novos alvos para o controle e erradicação da TB. Uma estratégia para a identificação de proteínas imunologicamente relevantes é a análise do imunoproteoma, que combina a abordagem proteômica com uma apresentação imunológica dos dados. A caracterização de soros, provenientes de indivíduos vacinados, muitas vezes revela diferentes padrões de reconhecimento que podem ser indicativos dos diferentes graus de proteção conferidos pela vacina em uma população heterogênea Empregamos assim esta tecnologia, combinando a separação por eletroforese bi-dimensional (2DE) de antígenos protéicos extracelulares da cepa vacinal brasileira seguida de western-blot, para avaliar o perfil imunoproteômico da resposta humoral de indivíduos saudáveis, PPD negativos, revacinados com BVG Moreau e classificados como alto e baixo produtores de IFNy. Nossos resultados revelam um padrão de reconhecimento claramente distinto entre os grupos avaliados, correlacionado com o perfil de produção de IFNy. Dentre as proteínas imunoreativas identificadas, um grupo (antígenos do complexo 85) foi reconhecido por todos os soros incluídos no estudo, inclusive controles. Alguns antígenos foram reconhecidos exclusivamente pelos indivíduos classificados como alto produtores de IFNy e outros somente pelos indivíduos enquadrados no grupo de baixo produtores. Algumas proteínas foram selecionadas e produzidas sob a forma recombinante em Escherichia coli possibilitando sua avaliação mais detalhada frente aos soros individualizados. Entre os antígenos diferencialmente reconhecidos, as proteínas Mpb70 e Mpb83 se destacaram como potenciais correlatos da proteção oferecida pela vacinação com BCG Moreau, tendo sido reconhecidos somente pelos indivíduos produtores de elevados níveis de IFNy. Estudos adicionais são necessários para determinar a aplicabilidade efetiva de tais antígenos como potenciais correlatos da proteção conferida pela vacinação com BCG Moreau. Este é o primeiro relato que detalha o perfil de reconhecimento sorológico por indivíduos revacinados com BCG Moreau frente a antígenos extracelulares da cepa homóloga, e contribui para uma melhor compreensão da cepa vacinal brasileira contra a TB / Tuberculosis (TB) holds the second place as cause o f death by an infectious disease of obligatory notification. One of the stra tegies for its control is vaccination, and the only vaccine available is BCG (Bacillus Cal mette-Guerin). Although used worldwide, BCG shows various limitations. Brazil us es the Moreau strain for vaccine production, being the only country in the world to use, since the 1930s, this strain for vaccination. As observed for other intracellular pa thogens, cellular immunity plays an important role in host protection against TB. IFN γ secreted by T cells is described as a particularly important cytokine participating in protective immune responses, being used as a correlate of protection, although its uti lity remains questionable, especially in adult populations. This highlights the need to s eek additional biomarkers yielding better surrogates of protection. Mycobacterial extr acellular proteins are among the first molecules to interact with the host immune sy stem and a better understanding of their immunomodulatory role may contribute to the d evelopment of new targets for the control and eradication of TB. A strategy for t he identification of immunologically relevant proteins is the analysis of the immunoprot eome, combining a proteomic approach with an immunological presentation of the data. The characterization of sera from vaccinated individuals often reveals diff erent patterns of recognition that may be indicative of the different degrees of prote ction conferred by the vaccine in a heterogeneous population. We have thus employed thi s technology, combining the separation by two-dimensional electrophoresis (2DE) of extracellular proteins from the Brazilian vaccine strain, followed by Western b lot to assess the immunoproteomic profile of the humoral response in healthy, PPD negative subjects, re-vaccinated with BCG Moreau and classified as hig h or low producers of IFN γ . Our results reveal a clearly distinct recognition patte rn between the evaluated groups, correlating with the profile of IFN γ production. Among the immunoreactive proteins identified, one group (85 complex antigens) was rec ognized by all sera included in the study, including controls. Some antigens were r ecognized only by individuals classified as high producers of IFN γ and others only by the individuals included in the group of low producers. Some proteins were selected and produced in recombinant form in Escherichia coli allowing for their further evaluation against the individual sera. Among the antigens differentially recognized, Mpb70 and Mpb83 proteins stood out as potential correlates of protection offered b y vaccination with BCG Moreau, and vi were only recognized by individuals producing high levels of IFN γ . Additional studies are needed to determine the effective applicability of these antigens as potential correlates of protection provided by vaccination wi th BCG Moreau. This is the first report detailing the serologic recognition profile of individuals re-vaccinated with BCG Moreau against extracellular antigens of the homolo gous strain, and contributes to a better understanding of the Brazilian vaccine strai n against TB.

Nosso estudo tem como objetivo verificar a presença e distribuição das fibras do sistema elástico na mucosa do bulbo duodenal humano normal. Para isso, foram realizadas biópsias endoscópicas do bulbo duodenal de nove homens adultos voluntários, as quais foram histologicamente processadas e coradas seletivamente para as fibras do sistema elástico, e observadas através de microscopia óptica. As técnicas de coloração seletiva utilizadas para fibras do sistema elástico foram: orcinol-neofucsina, para fibras elásticas; resorcina-fucsina de Weigert sem oxidação prévia, para fibras elaunínicas e elásticas; e resorcina-fucsina de Weigert com oxidação prévia, para fibras oxitalánicas, elaunínicas e elásticas. Através destas técnicas, nosso estudo revelou a presença de: a) descontínuas e curtas fibras elásticas localizadas somente na muscular da mucosa, exibindo características que sugerem tratar-se de estruturas fibrosas da parede dos vasos sangüíneos presentes nesta camada; b) fibras elaunínicas dispostas em uma linha subepitelial ao nível das vilosidades, ao redor das glândulas de Lieberkühn e de Brunner, e na muscular da mucosa; c) fibras oxitalânicas dispostas em uma linha subepitelial ao nível das vilosidades, ao redor das glândulas de Lieberkühn e de Brunner, e na muscular da mucosa. Esta distribuição pode sugerir a participação das fibras oxitalânicas e elaunínicas nas importantes e necessárias funções de suporte mecânico e mobilidade da mucosa bulbar. Estes resultados nos permitiram a realização de um desenho esquemático da distribuição das fibras oxitalânicas, elaunínicas e elásticas na mucosa do bulbo duodenal humano normal. / Our objective by means of this study is checking up on the presence and distribution of the elastic system fibers in the normal human duodenal bulta mucosa. For this purpose, were performed endoscopic biopsies on duodenal bulb of nine voluntary adult men, being such biopsies histologically processed and selective coloring for the fibers of the elastic system, and observed through optical microscopy. The techniques of selective coloration used for elastic system fibers were as follows: orcinol-new fuchsin, to elastic fibers; Weigerfs resorcin-fuchsin without oxidation, to elaunin and elastic fibers; and Weigerfs resorcin-fuchsin with previous oxidation, to oxytalan, elaunin and elastic fibers. Through these techniques, our investigations revealed the presence of: a) short and discontinuous elastic fibers localized only on the muscularis mucosae, exhibiting characteristics which suggest to be fibrous structures frora the walls of blood vessels present in this stratum; b) elaunin fibers disposed in a subepitelial line at the levei of the villosities, around Lieberkühn•s and Brunner,s glands, and in the muscularis mucosae; c) oxytalan fibers disposed in a subepitelial line at the levei of the villosities, around Lieberkühn's and Brunner's glands, and in the muscularis mucosae. This distribution may suggest the participation of the oxytalan and elaunin fibers in the important and necessary functions of mechanical support and mobility of the bulbar mucosa. These results gave us the possibility of realizing a schematic drawing of the distribution of oxytalan, elaunin and elastic fibers on the normal human duodenal bulb mucosa.