O Brasil é líder absoluto no comércio internacional de suco de laranja concentrado congelado participando com 82% do volume comercializado no mundo. Guignardia citricarpa é um fungo Ascomiceto agente causal da Mancha Preta dos Citros (MPC), uma doença importante no contexto da Citricultura, causando lesões negras em frutos tornando-os impróprios para a exportação, já que não são aceitos na União Européia pois o patógeno é classificado como quarentenário. O presente trabalho teve como objetivo principal estabeler a metodologia de transformação genética de G. citricarpa para futuramente auxiliar no entendimento dos mecanismos de patogenicidade desta espécie, visando diminuir perdas na citricultura brasileira devido à MPC. Além disso, foi realizada uma análise do gene da enzima endopoligalacturonase, a qual está associada à capacidade de patógenos em colonizar plantas. Para elucidar esse fenômeno, foi realizada a busca de genes relacionados à patogenicidade em outros fungos fitopatogênicos previamente descritos e confirmados participarem no processo de doenças em diversas plantas. Considerando que esses genes possuem uma região conservada para esse fim, após o alinhamento dessas sequências foram construídos primers e o gene de endopoligalacturonase foi identificado no gênero Guignardia sp. Outra espécie pertencente a esse gênero é G. mangiferae, conhecida como endófito de citros, ou seja, coloniza os tecidos internos da planta hospedeira sem causar dano. Em análises enzimáticas foi observado que a quantidade de endopoligalacturonase produzida pela espécie patogênica é superior à da espécie endofítica, mostrando que essa enzima pode participar do processo de patogenicidade de G. citricarpa. Estudos para comprovar a participação de genes nos mecanismos de patogenicidade em diversas espécies utilizando reconhecimento de genes e genômica funcional, expressão e knockout de genes estão sendo realizados, permitindo uma visão geral da organização genômica do sistema patogênico. Pensando nisso, esse trabalho descreve pela primeira vez a metodologia de transformação genética de G. citricarpa via micélio e a obtenção de transformantes expressando a proteína verde fluorescente (GFP). Micélios do fungo foram transformados pelo sistema via Agrobacterium tumefaciens com o plasmídeo pFAT-gfp, contendo os genes de resistência à higromicina B (hgr) e da GFP. A otimização do protocolo de agrotransformação foi realizada a partir do teste de diferentes condições como: tipo de membrana, concentração de agente indutor e tempo de cocultivo. A melhor condição incluiu a utilização de membrana de éster de celulose; 200 PM de AS e 96 horas de co-cultivo. Os transformantes apresentaram alta estabilidade mitótica (82%) e tiveram a inserção do gene hgr confirmada por PCR e do gfp observada em microscopia óptica de epifluorescência. Além disso, foi acompanhado o desenvolvimento do fungo inoculado em frutos, mostrando a interação planta-patógeno. O estabelecimento do sistema de transformação por Agrobacterium para G. citricarpa possibilita o uso dessa ferramenta para estudos de mutagênese insercional e interrupção gênica visando a identificação de genes importantes, como os envolvidos com os mecanismos de patogenicidade utilizados por esse fungo. / Brazil is the world leader in the international trade of frozen orange juice concentrate, taking part with around 82% of the traded volume. Guignardia citricarpa (anamorph Phyllosticta citricarpa) is a fungal pathogen of citrus plants, being described as the causal agent of citrus black spot (CBS), one of the most important fungal diseases of citrus worldwide. Its symptoms are black lesions on fruit, making them unsuitable for the international fresh market, since they are included in the quarantine list of the European Plant Protection Organization (EPPO). Moreover, when the disease is severe it may cause extensive premature fruit drop that reduces yields of fruit for processing. Taking this into consideration, the current work aimed to improve the understanding on the pathogenic mechanisms of this fungus. Firstly, in an attempt to elucidate this phenomenon, it was performed a search for pathogenicity genes previously reported to some pathogenic fungi and confirmed to participate in the process of infection in many plants , especially endopolygalacturonase. Primers were designed using the conserved regions of the genes and allowed the identification of the Guignardia spp. endopolygalacturonase gene for the first time. This enzyme has been described as playing important role in the process of fungal diseases in plants. In the present work, enzymatic analysis showed that the pathogen G. citricarpa produced significantly greater amounts of endopolygalacturonase when compared to G. mangiferae, a closely related fungus described as a citrus endophyte. This result suggests that this enzyme may participate in the process of pathogenicity, characteristic of the pathogenic species. Genetic transformation methods have been used to prove the involvement of genes in pathogenic mechanisms, however, a suitable methodology for G. citricarpa has not been described yet. In this way, this study describes for the first time a methodology for genetic transformation of G. citricarpa via mycelia and the successful generation of transformants expressing the green fluorescent protein (GFP) and resistant to the hygromycin B antibiotic. Mycelia of the fungus were genetically transformed via Agrobacterium tumefaciens hosting the plasmid pFAT-gfp, which carries the genes for resistance to hygromycin B (hph) and for GFP (gfp). The protocol was optimized through different test conditions (type of membrane, concentration of the inducing agent acetosyringone and duration of the co-cultivation period). The higher transformation efficiencies were observed using cellulose ester membrane, 200 PM of acetosyringone and 96 hours of cocultivation. The transformants showed high mitotic stability (82%) and the insertion of the T-DNA was confirmed by PCR and GFP expression through epifluorescence microscopy observation. Moreover, it was observed the development of the fungus in inoculated oranges, showing the plant-pathogen interaction observed by epifluorescense microscopy. The establishment of the Agrobacterium-mediated transformation system for G. citricarpa represents an important step on the search for unveiling important genes of this fungus, such as those involved in the pathogenic mechanisms.

A podridão floral dos citros (PFC) é uma doença causada pelo fungo Colletotrichum acutatum responsável por causar grandes danos à produção de citros no Brasil. A doença surge apenas em botões florais com 8mm de comprimento ou maiores, levando a formação de lesões alaranjadas nas pétalas, lesões necróticas no estigma, promove a queda prematura dos frutos e a retenção do cálice e pedúnculo, sendo este último sintoma denominado estrelinha. Este trabalho tem por objetivo: observar o modo de penetração do fungo no hospedeiro Citrus sinensis Valência e os estágios posteriores da colonização, verificar se há fatores estruturais e químicos pré-formados que expliquem o porquê do fungo não conseguir infectar botões florais com menos de 8mm, caracterizar anatomicamente o sintoma estrelinha e estigmas lesionados, investigar ultraestruturalmente pétalas inoculadas, analisar se há o estabelecimento de uma infecção quiescente nos tecidos foliares, analisar grãos de pólen após a inoculação in vivo e in vitro com o fungo. Botões florais sadios, pétalas e estigmas com e sem lesões, foram submetidos às técnicas convencionais de microscopia de luz e eletrônica. Folhas e grãos de pólen foram inoculados e analisados. Foi desenvolvida uma nova técnica de coloração para tecidos vegetais infectados por fungos. A resistência dos botões florais menores que 8mm pode estar associada às barreiras químicas e estruturais pré-formadas. O ápice, nesses botões, apresenta papilas entremeadas, cristais de oxalato de cálcio no mesofilo e câmara subestomática e cavidades de óleo localizadas muito próximas umas das outras. Botões com 8mm e 12mm possuem, no ápice, papilas com arranjo frouxo, ausência de cristais e maior distanciamento entre as cavidades de óleo. No ápice da pétala, verificou-se que as células papilosas são osmóforos. No sintoma estrelinha, nota-se sob a região de abscisão do ovário a instalação de um meristema de cicatrização. A lignificação das paredes das células da medula do receptáculo e do pedúnculo floral está associada à retenção destas estruturas na planta. Nas pétalas infectadas, o C. acutatum pode penetrar intra, intercelularmente e via estômato. O fungo pode crescer de modo subcuticular e intramural e coloniza todos os tecidos da pétala. A nova técnica de coloração se mostrou muito útil nas análises histopatológicas. O fungo associa-se aos tecidos vasculares. Acérvulos ocorrem em ambas as faces das pétalas. A cutícula nos estágios mais avançados da lesão apresenta-se alterada, ou seja, ocorre a perda da ornamentação estriada e maior deposição de material lipofílico. A síntese de materiais lipofílicos envolve o retículo endoplasmático liso e rugoso e plastídios. Vesículas provenientes de dictiossomos e de corpos multivesiculares são observadas ao longo da parede celular e estão associadas ao depósito de material lipofílico na cutícula. No estigma lesionado há a formação de uma camada de proteção. O fungo apresenta quimiotropismo e cresce em direção aos grãos de pólen infectando-os 24 horas após a inoculação. Sugere-se que C. acutatum pode utilizar grãos de pólen para a sua dispersão. Após 48 horas da inoculação as folhas apresentam conídios germinados com apressórios. / The postbloom fruit drop (PFD) is a disease caused by Colletotrichum acutatum responsible for causing great damage to citrus crops in Brazil. The disease appears only in flower buds 8 mm in length or greater, leading to orange lesions in petals, necrotic lesions on the stigma, promoting the young fruit drop and the retention of the calyx and peduncle, which is called buttons. In this context, this study aimed to: observe the fungus penetration mode into the host Citrus sinensis \'Valência\' and the later stages of colonization; study the presence of preformed structural and chemical factors to explain why the fungus cannot infect floral buds with less than 8 mm in length; characterize anatomically the symptom \"buttons\" and injured stigmas; investigate the ultrastructural changes in tissues of inoculated petals; analyze whether there is the establishment of a quiescent infection in leaf tissues, analyze pollen grains after inoculation in vivo and in vitro with the fungus. Healthy buds, petals and stigmas with and without lesions, were processed and analyzed using conventional light and electron microscopy techniques. Leaves and pollen grains were also inoculated and analyzed with light microscopy. It was developed a new staining method for fungal-infected plant tissues. The resistance of flower buds smaller than 8mm may be associated with preformed structural and chemical barriers. These buttons display the apex with interspersed papillae, with crystals in mesophyll and substomatic chamber and oil cavities, which are located very close to each other on the abaxial surface. In 8mm and 12mm flower buds, the papilas in the apex become weakly interspaced, the crystals are not observed and there is the increase of the distance between the oil cavities. The papillose cells are osmophores. In the symptom \"button\", it is noted in the abscission of the ovary, an installation of wound meristem. There is also the lignification in the pith of receptacle and pedicel that can be associated with the retention of these structures in the plant. In infected petals, it was found that C. acutatum can penetrate intra and intercelullar or via stomata. The fungus may grow subcuticular and intramural and colonize all tissues of petal. The new staining technique developed has proved very useful for histopathological analysis. The fungus is closely associated with vascular tissues. The acervulli occur on both surfaces of petals. The cuticle in the later stages of the lesion is altered, i.e., there is loss of striated ornamentation and increased deposition of lipophilic material. The synthesis of lipophilic materials involves rough and smooth endoplasmic reticulum and plastids. Vesicles from dictyosomes and multivesicular bodies were observed throughout the cell wall and are associated with the deposit of lipophilic material in the cuticle. There is the formation of protective layer over the stigma damaged area. The fungus shows chemotropism and grows toward the pollen infecting it 24 hours after inoculation. It is suggested that C. acutatum can use pollen grains for dispersal. After 48 hours of inoculation, the leaves have germinated conidia with appressoria.

No presente trabalho, foi utilizada uma coleção de 14 isolados de Sporisorium scitamineum coletados em diferentes regiões canavieiras, para estudar a diversidade genética por RFLP da região telomérica de maneira comparativa a marcadores AFLP. Os teliósporos, esporos de resistência do fungo, foram coletados a partir do sintoma mais característico da planta infectada que é formação do chicote. Os teliósporos são diplóides e quando germinam dão origem ao probasídio, onde, por meiose formam-se os esporídios haplóides. Estes quando compatíveis sexualmente voltam a se fundir formando um micélio dicariótico infectivo. A fase do ciclo de vida escolhida para as análises foram os derivados haplóides de cada linhagem dicariótica obtida a partir dos teliósporos. Na técnica de AFLP foram encontrados 40 loci polimórficos (3%) entre 1311 analisados obtidos a partir de 2 enzimas de corte raro, 1 de corte frequente e 19 combinações de primers. A técnica de RFLP da região telomérica foi comparativamente mais eficiente, no qual foram utilizadas três enzimas de restrição que geraram 102 loci, sendo 36 polimórficos (34,3%). O agrupamento com base nos coeficientes de similaridade e os resultados de atribuição pelo programa Structure revelaram dois grupos genotípicos homogêneos, tanto quando os marcadores foram analisados separadamente como na análise conjunta. Não houve agrupamento por localidade, mas ficou claro que o fluxo desses isolados é baixo. Os derivados haplóides de tipos de reação sexual opostos de cada linhagem dicariótica (teliósporo) permaneceram dentro do mesmo grupo, com exceção de uma única linhagem. Desta forma, de maneira geral na natureza, a fusão entre os esporídios deve acontecer entre aqueles que estão mais próximos. Uma análise molecular de diversidade genética em isolados obtidos em diferentes regiões do mundo por outros autores revelou uma alta homogeneidade entre eles, de forma que somente em localidades da Ásia foi possível revelar, com os marcadores utilizados, alguma diversidade genética. Nossos resultados indicam que a escolha do marcador foi fundamental para revelar diversidade entre os isolados de S. scitamineum, sendo que o RFLP-tel revelou um fingerprinting de DNA quase que específico para cada isolado, sendo assim mais apropriado do que os descritos anteriormente. A quantidade de loci AFLP necessária para revelar polimorfismo foi mais alta do que para RFLP-tel. Uma segunda contribuição deste trabalho foi a detecção de heterozigotos quando consideramos a análise conjunta de derivados haplóides por teliósporo. Um alto grau de homozigosidade foi detectado quando as análises foram realizadas considerando o comportamento dicariótico como diplóide, no entanto, loci heterozigotos puderam ser encontrados. Esta é a primeira vez que um estudo desta natureza foi realizado com isolados de Sporisorium scitamineum do Brasil. / The genetic diversity of Sporisorium scitamineum, the sugarcane smut agent, was characterized in a 14 isolates collection. The isolates were obtained from various sugarcane growing areas and RFLP of the telomeric region was used as molecular marker, compared with AFLP. Teliospores were collected from the whip of infected plants. Teliospores are diploids and germinate producing a probasidium where meiosis takes place originating four haploid cells. These cells if sexually compatible can fuse and a dikaryotic mycelium is formed. The haploid phase, derived from each dikaryotic line obtained from teliósporos, was used to perform the analysis. Our results showed that 40 polymorphic loci (3%) were described among 1,311 analyzed. These were obtained with two rare-cutter restriction enzymes, one frequent-cutter restriction enzyme and 19 primers combinations. The RFLP markers were more efficient when compared to AFLP to reveal polymorphisms. Three restriction enzymes produced 102 loci, from which 36 were polymorphic (34.3%). Clustering using similarity coefficients and results obtained by Structure software revealed two genotypic groups. The analyses were performed with individual markers and combining RFLP and AFLP markers. Locations were not responsible for clustering, and low flux of isolates was evident. The opposite sexual types haploid derivatives originated from the same teliospore were clustered together, with only one exception. This implies that sporideos that are located close together are more likely to fuse. Our data suggest that choosing RFLP as markers were the key for unrevealing diversity among isolates of S. scitamineum. RFLP-tel revealed almost unique DNA fingerprintings to various isolates. A second contribution of this work was that heterozygous were detected when considering a combined analyses of haploids derivatives from the same teliospore. This is the first time a study of this nature was organized with Brazilian isolates of S. scitamineum.

A ferrugem alaranjada da cana-de-açúcar (Puccinia kuehnii) foi relatada pela primeira vez no Brasil em dezembro de 2009. Em países onde a doença já ocorre, danos de até 40% foram relatados. Diante da presente situação, os objetivos deste estudo foram: (i) verificar a germinação de esporos sob diferentes temperaturas, in vitro, (ii) verificar aspectos epidemiológicos da ferrugem alaranjada sob diferentes períodos de molhamento foliar e temperaturas, in vivo, sob condições controladas, e (iii) desenvolver mapa de zona de risco de epidemia para o Estado de São Paulo. Para a germinação de esporos, in vitro, foram utilizadas lâminas de vidro, vertidas com ágarágua, onde foi espalhada suspensão de conídios sobre o meio de cultura, mantidas em câmara úmida por até 22 h e foram avaliados a porcentagem de esporos germinados e o comprimento dos tubos germinativos. No experimento in vivo, plantas de um mês de idade da variedade suscetível CL85-1040 foram inoculadas e destinadas a 36 tratamentos que representaram a interação entre seis temperaturas (10, 15, 20, 25, 30 e 35°C) e seis períodos de molhamento foliar (0, 4, 8, 12, 18 e 24 h). O experimento foi realizado duas vezes. A severidade da doença foi medida pela contagem de número de lesões na folha zero. Também foram medidos diâmetros das lesões, no último dia de avaliação. Para o desenvolvimento do mapa de zona de risco para o Estado de São Paulo, foram empregados dados meteorológicos dos anos de 2002 a 2005. Modelos de previsão foram utilizados para gerar índices e para calcular as porcentagens de dias favoráveis à infecção. No experimento in vitro observou-se que há germinação de urediniósporos a 10, 15, 20 e 25°C. No entanto, o crescimento do tubo germinativo é mais rápido conforme a temperatura aumenta, apresentando redução do crescimento na temperatura de 25°C ou superior. No experimento in vivo observou-se aparecimento da doença apenas nos tratamentos submetidos a 20 e 25°C, e que a 25°C o tamanho das lesões foi maior que a 20°C. O período de incubação e de latência variaram de 11 a 16 dias. O patógeno requereu o mínimo de 8 h de período de molhamento foliar para o sucesso de sua infecção e a ferrugem foi mais severa em períodos de molhamento a partir de 12 h. A zona de maior favorabilidade de epidemia para ferrugem alaranjada da cana-de-açúcar para o Estado de São Paulo é o Centro-norte. Esses resultados colaboram para o entendimento da epidemiologia da doença e favorecem subsídio para o seu manejo. / Sugarcane orange rust, caused by Puccinia kuehnii, was reported for the first time in Brazil in December of 2009. In countries where the disease already occurs, there were related damages around 40%. The objective of this study was: (i) to verify the spore germination under different temperatures in vitro; (ii) to verify the epidemiological aspects of orange rust under different leaf wetness duration and temperatures, in vivo, under controlled conditions; and (iii) to develop risk maps for the disease epidemic for Sao Paulo State. For spore germination, in vitro, water agar was poured on slides and spores suspension was spread on the media and kept under wet chamber for up to 22 h. In the in vitro evaluations, there was recorded the percentage of spore germination and the length of the germ tubes. For the in vivo experiment, pots with one-month-old plants of the susceptible variety CL85-1040 were inoculated and submitted to 36 treatments that represented the interaction of six temperatures (10, 15, 20, 25, 30 and 35°C) and six leaf wetness duration (0, 4, 8, 12, 18 and 24 h). This experiment was repeated twice. The severity of the disease was measured counting the number of lesions on the zero leaf. Diameter of lesions was also recorded on the last day of assessment. For the development of risk zones maps for the disease epidemic for Sao Paulo State, we used meteorological data from the years 2002 to 2005. Forecast models were used to create indexes and to calculate the percent of favorable days for the infection. The in vitro experiment shows that the urediniospores germinate at 10, 15, 20 and 25°C. However, the germ tube growth is faster as the temperature increases, reducing the growth as the temperature reaches 25°C or more. In the in vivo experiment, the disease just occurred at 20 and 25°C, and at 25°C the size of the lesions is superior than at 20°C. The incubation and latent period varied from 11 to 16 days, depending on the treatment. The pathogen required at least 8 h of leaf wetness duration for the success of the infection, and the disease was more severe at over 12 h of leaf wetness duration. The most favorable zone for orange rust epidemic in the Sao Paulo State is the North Central area.

O Eucalyptus é o gênero mais importante para a indústria brasileira de papel e celulose. Eucalyptus grandis Hill ex. Maiden e seus híbridos são preferencialmente usados pela indústria devido ao rápido crescimento e alta produtividade volumétrica. Embora possua características adequadas à utilização comercial, vários estresses abióticos e bióticos influenciam sua produção. O IPGRI (International Plant Genetic Resources Institute) destaca a Puccinia psidii como sendo a maior ameaça para a cultura nos tempos atuais. A doença não co-evoluiu com o hospedeiro e por essa razão, torna o patógeno um elemento potencial a vencer as barreiras impostas pelo hospedeiro. O fungo ataca plantas jovens, incluindo mudas em viveiros, plantas em jardins clonais e plantações comercias com até 2 anos de idade. Com o objetivo de identificar proteínas diferencialmente expressas e avaliar as mudanças ocorridas na composição química da parede celular das folhas, o presente trabalho analisou o impacto da presença do fungo sobre os clones comerciais, resistentes (7) e suscetíveis (24), de eucalipto. Os clones de E. grandis, 7 e 24, previamente inoculados com uredósporos de P. psidii, foram utilizados para extração de proteínas após 24 horas de interação com o fungo. As análises foram realizadas com auxílio de SDS-PAGE de primeira e segunda dimensão, em gradiente de pH na faixa de 4-7, utilizando-se 750 µg de proteínas. As imagens dos géis, em triplicata, analisadas pelo programa (Image Master Elite v. 3.01), possibilitaram a identificação de 466 spots. A comparação entre os perfis eletroforéticos dos clones que foram analisados e os controles não inoculados, mostrou que o processo de infecção do fungo nas plantas induziu o aparecimento de 72 spots exclusivos para o clone 7 além de alterações do volume de outros 115 spots. Já para o clone 24, a exposição ao fungo promoveu o aparecimento de 22 spots exclusivos e alterações de outros 98. Os perfis eletroforéticos dos clones controle, que não foram expostos ao fungo, mostraram diferenças genéticas entre os clones 7 e 24. O clone resistente, apresentou grande concentração de spots na região entre 14 a 45 kDa. Já para o clone suscetível, os spots se concentraram na região entre 25 a 97 kDa. A avaliação do conteúdo de carboidratos e ácidos urônicos da parede celular mostrou alterações no conteúdo dos açúcares no material inoculado com P. psidii, após 24 horas, 6 e 12 dias de inoculação. Os teores de glicose observados para os clones 7 e 24, já após 24 horas da inoculação, mostraram-se bastante alterados, indicando que esse açúcar possui papel chave no processo de formação da parede celular e conseqüentemente no mecanismo de defesa vegetal. / Eucalyptus is the most important genus for the Brazilian pulp and paper industry. Eucalyptus grandis Hill ex. Maiden and hybrids are preferentially used by the industry due to its rapid growth and high volumetric productivity. Although they possess characteristics adequate for commercial use, various biotic and abiotic stresses influence production. IPGRI (International Plant Genetic Resources Institute) highlight Puccinia psidii as the largest current threat to the culture. The disease did not co-evolve with the host and for this reason has become the pathogen with most potential to overcome the barriers imposed by the host. The fungus attacks young plants, including saplings in nursery, clonal gardens and commercial plants up to 2 years-old. With the objectives of identifying the proteins differentially expressed and evaluate the changes occurring in the chemical composition of the cell walls in the leaves, the present work analyzed the impact of the presence of the fungus on the commercial eucalyptus clones, resistant (7) and susceptible (24). The E. grandis clones (7 and 24) were inoculated with P. psidii urideospores and proteins extracted after 24 hours interaction with the fungus. The analyses were carried out using a pH gradient (4-7) in the first and SDS-PAGE in the second dimension, loading 750 µg onto the gel. The gel images, in triplicate, were analyzed using the software Image Master Elite v. 3.01, allowing the identification of 466 spots. The electrophoretic profiles for each clone were analyzed and compared to the uninoculated controls, showing that the fungal infection process induced the appearance of 72 exclusive spots in clone 7 and an alteration in the volume of another 115 spots. In clone 24, exposure to the fungus induced the appearance of 22 exclusive spots and altered another 98. The electrophoretic profiles of the control clone, not exposed to the fungus, demonstrated genetic differences between the 7 and 24. The resistant clone (7) presented a large concentration of spots around 14 to 45 kDa. In contrast, the susceptible clone (24) presented a concentration of spots around 25 to 97 kDa. Evaluation of the carbohydrate and uronic acid content of the cell wall showed an alteration in the sugar content in the material exposed to P. psidii after 24 hour, 6 and 12 days after inoculation. The glucose levels observed for clones 7 and 24 were considerable altered 24 hours after inoculation, indicating that this sugar has a key role in cell wall formation and consequently in the plant defense mechanism.

Condições climáticas desfavoráveis, durante o período final de maturação da soja, têm ocasionado problemas na qualidade das sementes, devido a maturação forçada ou morte prematura da planta, que pode resultar no aparecimento de sementes esverdeadas. Os fungicidas do grupo das estrobilurinas apresentam efeitos fisiológicos sobre o desempenho das plantas, com reflexos na produtividade, principalmente, por retardar a senescência das plantas. Assim, este trabalho objetivou avaliar o efeito de fungicidas, principalmente, do grupo da estrobilurina e da doença ferrugem asiática na produtividade e na qualidade de sementes de soja, com destaque para a ocorrência de sementes esverdeadas. Os tratamentos foram constituídos pela testemunha e aplicações dos fungicidas flutriafol + tiofanato metílico, pyraclostrobim + epoxiconazol e metconazol, sendo os produtos aplicados nos estádios fenológicos R2 e R5.1, individualmente e, também, em aplicações combinadas. Os experimentos foram conduzidos em campo, em três locais (Alto Garças-MT, Londrina-PR e Piracicaba-SP) durante os anos agrícolas de 2007/08 e 2008/09. Três diferentes cultivares foram utilizadas para cada um dos locais. A qualidade das sementes foi avaliada por meio dos testes de germinação, tetrazólio, envelhecimento acelerado, condutividade elétrica, sanidade, comprimentos de plântula e de hipocótilo e, também, por meio da fluorescência de clorofila nas sementes do segundo ano agrícola. As análises foram realizadas imediatamente após a colheita e sete meses após o armazenamento. O delineamento experimental utilizado foi em blocos ao acaso, com 7 tratamentos e 3 cultivares, para cada local e ano experimental. As médias foram comparados pelo teste de Tukey, à 5% de probabilidade. O fungicida a base de estrobilurina não interfere na produtividade e não apresenta efeitos diretos na qualidade das sementes e ocorrência de sementes esverdeadas. Em condições climáticas favoráveis à maturação das sementes, a alta severidade da doença ferrugem asiática interfere na produtividade, mas não influencia no seu potencial fisiológico. A ferrugem asiática, associada às condições climáticas desfavoráveis na fase final de maturação, proporciona a ocorrência de sementes esverdeadas, que compromete o vigor das sementes após o armazenamento. / Unfavorable weather conditions, during the late soybean maturation, have caused problems in seed quality due to \"forced maturation\" or premature plant death, which can result in the appearance of green seeds. Strobilurin group fungicides have physiological effects on plant performance, reflected in production, mainly by delaying the plant senescence. This study aimed to evaluate the effect of fungicides, especially the strobilurin group and rust disease on yield and quality of soybean seeds, with focus in the occurrence of green seeds. The treatments were control and applications of flutriafole + thiophanate, methyl, pyraclostrobin + epoxiconazole and metconazole fungicides, and the products were applied in R2 and R5.1 growth stages, individually and also in combined applications. The experiments were carried out under field conditions in three locations (Alto Garças-MT, Londrina-PR and Piracicaba-SP) during the 2007/08 and 2008/09 crops. Three different cultivars were used for each location. Seed quality was evaluated by means of the germination, tetrazolium, accelerated aging, electrical conductivity, sanitary, radicle and hypocotyl length tests, and also by means of chlorophyll fluorescence in the seeds of the second crop year. Analyses were performed immediately after harvest and after seven months of storage. The experimental design was randomized blocks with seven treatments and three cultivars, location and year for each trial. Means were compared by Tukey test at 5% probability. The strobilurin fungicide does not affect the production and has no direct effects on seed quality and in the occurrence of green seed. Under favorable weather conditions for seed maturation, the severity of soybean asiatic rust disease interferes with the production, but does not influence on its physiological potential. The soybean asiatic rust disease associated with unfavorable weather conditions during the final stage of maturation provides the occurrence of green soybean seeds, that compromises the vigor after storage.

A ocorrência das doenças de final de ciclo causadas pelos fungos Septoria glycines e Cercospora kikuchii é facilmente observada no campo. Entretanto, são necessárias informações precisas sobre a quantificação de danos e perdas na produtividade, bem como, a definição da melhor época para aplicação de fungicidas. A falta de um método padrão de quantificação visual pode levar a estimativas imprecisas da severidade das mesmas, induzindo a conclusões erradas. Com os objetivos de elaborar e validar uma escala diagramática para a quantificação das doenças de final de ciclo da soja, avaliar o efeito dessas doenças sobre a produtividade, identificar o melhor estádio fenológico da cultura para o controle dessas doenças, verificar a relação entre a severidade dessas doenças e a produtividade e avaliar os efeitos das mesmas sobre a duração e absorção da área foliar sadia das plantas de soja, foram instalados experimentos na Fazenda Areão (ESALQ/USP), localizada em Piracicaba - SP. Utilizou-se o cultivar de soja MG/BR - 46 (Conquista), considerado suscetível a essas doenças, adotando-se o delineamento experimental de blocos ao acaso, no esquema fatorial 2 x 3 (dois fungicidas: benomyl e tebuconazole e três momentos fenológicos de pulverização: R4, R5.3 e R6) com três tratamentos adicionais (testemunha, pulverização quinzenal de benomyl e pulverização quinzenal de tebuconazole), repetidos três vezes. Determinou-se a severidade dessas doenças; o número de vagens e de sementes por planta; a massa de 1000 sementes e a produtividade. Para quantificação da severidade dessas doenças foi elaborada uma escala diagramática a partir de folhas coletadas em campo, apresentando diferentes níveis de severidade. A área de cada folha e sua correspondente severidade foram determinadas e, seguindo-se a "Lei do Estímulo de Weber-Fechner", elaborou-se a escala com os níveis de severidade de doença: 2,4; 15,2; 25,9; 40,5 e 66,6%. A validação foi realizada por nove avaliadores, sem experiência na avaliação das doenças de final de ciclo, os quais estimaram a severidade de 30 folíolos de soja com sintomas destas doenças. A precisão das avaliações variou de acordo com o avaliador (0,84<R 2 <0,65), bem como a acurácia (0,00<a<3,40; 0,90<b<1,29), não ocorrendo erro sistemático na superestimativa ou subestimativa da doença entre os avaliadores. Com base nos resultados obtidos em três safras agrícolas consecutivas (1999/2000, 2000/2001 e 2001/2002), pôde-se concluir que: a) a escala diagramática desenvolvida é adequada para a quantificação da severidade das doenças de final de ciclo em soja; b) as doenças de final de ciclo, quando em severidade inferior a 10%, não afetam o número de vagens e sementes produzidos por planta mas, causam redução na produtividade da soja; c) os fungicidas benomyl e tebuconazole podem ser utilizados no controle dessas doenças; d) não foi possível determinar a época fenológica mais adequada para a pulverização de fungicidas, que proporcionasse aumentos na produtividade da soja; e) em severidade dessas doenças abaixo de 10%, não existe relação entre esta variável, a massa de 1000 sementes e a produtividade; f) a absorção da área foliar sadia é a variável que melhor expressa a relação entre a severidade dessas doenças e a produtividade da soja. / The occurrence of late season leaf diseases caused by the fungus Septoria glycines and Cercospora kikuchii is easily identified in field. However, there is a need of precise information to quantify the damage and yield losses as well as to define the best occasions for fungicide applications. The lack of a standardized visual method may lead to inaccurate estimates of their severity, inducing inexact conclusions. With the purposes: to elaborate and validate a diagrammatic scale to assess late season leaf soybean diseases; to evaluate the effect of theses diseases on yield; to identify the best soybean growth stages for chemical control; to verify the relation between severity of theses diseases and yield and to evaluate the effect of theses diseases on healthy leaf area duration and healthy leaf area absorption, were installed field experiments at Fazenda Areão (ESALQ/USP), in Piracicaba - SP. The soybean cultivar MG/BR - 46 (Conquista), susceptible to both diseases was sown in a complete randomized blocks design in factorial 2 x 3 (two fungicides: benomyl and tebuconazole and three application stages: R4, R5.3 e R6) and three extra treatments (control without application, fortnightly application of benomyl and fortnightly application of tebuconazole), at three replications. The severity, the pod number per plant, the seed number per pod, the mass of 1,000 seed and yield were determined. To quantify the severity of these diseases it was elaborated a diagrammatic scale, from leaves collected in the field presenting different levels of severity. The area of each leaf and its correspondent severity were determined, and following the "Stimulus Law by Weber-Fechner" a scale was elaborated with the severity levels: 2.4, 15.2, 25.9, 40.5 and 66.6%. The validation was carried out by nine appraisers, without previous practice in assessing late season leaf diseases, who estimate the severity on 30 leaflets of soybean with disease symptoms. The evaluation precision varied according to the appraiser (0.84<R 2 <0.65), as well as the accuracy (0.00<a<3.40; 0.90<b<1.29), do not occurring systematic mistakes in the super or underestimation of the disease among the appraisers. Based on the obtained results in three consecutive crop seasons (1999/2000, 2000/2001 e 2001/2002), it was possible to conclude that: a) the developed diagrammatic scale is appropriate to quantify the late season leaf diseases severity of soybean; b) the late season leaf diseases, when in severity below 10%, do not affect the number of pod and seeds per plant but cause reduction of yield; c) the fungicides benomyl and tebuconazole may be used to control these diseases; d) it was not possible to determine the most appropriate growth stage for fungicide application, which result in yield gain; e) under severity below 10% there are not relation between this variable and the mass of 1,000 seed and yield; f) the healthy leaf area absorption is the variable which most express the relation between the severity of this diseases and the soybean yield.

O objetivo do trabalho foi determinar o efeito da temperatura e período de molhamento no processo de infecção de Colletotrichum gloeosporioides e C. acutatum em goiaba e folhas de citros, respectivamente, além de evidenciar o processo de colonização de C. gloeosporioides. Para determinar o processo de infecção em diferentes combinações de temperatura e períodos de molhamento, suspensões de conídios de C. gloeosporioides foram depositadas em placas de poliestireno e incubadas sob temperaturas de 10, 15, 20, 25, 30, 35 e 40 °C, com período de molhamento de 6, 12, 24, 36 e 48 horas. Para C. acutatum, as placas foram incubadas sob temperaturas de 5, 10, 15, 20, 25, 30 e 35 °C, com períodos de molhamento de 6, 12, 24, 36 e 48 horas. In vivo, suspensões de conídios de C. gloeosporioides foram depositadas na superfície de goiabas que foram incubadas sob temperaturas de 10, 15, 20, 25 e 30 °C e períodos de molhamento de 6, 12 e 24 horas. Folhas de citros foram inoculadas com suspensões de dois isolados de C. acutatum e incubadas sob temperatura de 15, 20, 25 e 30 °C e períodos de molhamento de 12, 24 e 48 horas. Para os estudos do processo de colonização, goiabas com 110 dias após a queda das pétalas foram inoculadas e incubadas a 25 °C e períodos de molhamento de 48, 72, 96 e 120 horas. Posteriormente, frutos com 10, 35, 60 e 85 dias também foram inoculados e incubados a 25 °C por 48 horas. Para visualizar estruturas do tecido vegetal e fenóis, secções de frutos com as diferentes idades foram coradas com azul de toluidina e ACN. As temperaturas ótimas in vitro para germinação de C. gloeosporioides, apressórios formados e melanizados foram, respectivamente, 22,7, 20,6 e 23 °C. Para o isolado KLA-MGG-1 de C. acutatum foi 23,9 °C para germinação e 23,5 °C para formação de apressórios, enquanto para o isolado FSH-CLB-2 foi 21,6 °C para ambas as variáveis. Em goiaba, as temperaturas ótimas para germinação de C. gloeosporioides e formação de apressórios foram 22,4 e 23,3 °C, respectivamente. Em folhas de laranjeira, as temperaturas ótimas para os isolados KLA-MGG-1 e FSH-CLB-2 foram, respectivamente, 24,1 e 24 °C para germinação e 21,2 e 23 °C para formação de apressórios. Para folhas de limoeiro, foram 18,1 °C para germinação e 16,2 °C para formação de apressórios do isolado KLA-MGG-1. Para o isolado FSH-CLB-2, as temperaturas ótimas foram 24,4 e 23,7 °C, respectivamente. A estratégia de colonização de C. gloeosporioides foi intracelular hemibiotrófica. Em amostras com 48 h após a inoculação, foi verificado o peg de penetração. Com 72 horas, observou-se a formação da vesícula de infecção. As hifas foram observadas em amostras com 96 h após inoculação. As mesmas estruturas fúngicas alcançaram as células parenquimáticas com 120 horas após inoculação. O peg de penetração foi observado apenas em frutos com 85 e 110 dias. Estruturas do tecido vegetal e fenóis foram alterados com a idade dos frutos. / The objective of this study was to determine the effect of temperature and the wetness periods in the infection process of Colletotrichum gloeosporioides and C. acutatum in guava and citrus leaves, respectively, besides evidencing the colonization process of C. gloeosporioides. To determine the infection process at different temperature and wetness periods combinations, conidial suspensions of C. gloeosporioides were deposited on polystyrene dishes and incubated at 10, 15, 20, 25, 30, 35 and 40 °C with wetness periods of 6, 12, 24, 36 and 48 h. For C. acutatum, the dishes were incubated at 5, 10, 15, 20, 25, 30 and 35 °C, with wetness periods of 6, 12, 24, 36 and 48 h. In vivo conidial suspensions of C. gloeosporioides were placed on the surface of guavas which were incubated at 10, 15, 20, 25 and 30 °C with wetness periods of 6, 12 and 24 h. The citrus leaves were inoculated with suspensions of two isolates of C. acutatum and incubated at 15, 20, 25 and 30 °C with wetness durations of 12, 24 and 48 h. For the analysis on the colonization process, physiological mature guava fruits were inoculated and incubated at 25 °C with wetness periods of 48, 72, 96 and 120 h. Afterward, fruits with 10, 35, 60 and 85 days were also inoculated and incubated at 25 °C for 48 hours. To visualize the structures of vegetal tissues and phenols, sections of fruits at different ages were colored in toluidine blue and ACN. Optical temperature for conidial germination, appressoria formation and appressoria melanization for C. gloeosporioides were, respectively, 22.7, 20.6 and 23.0 °C. For C. acutatum isolate KLA-MGG-1, they were 23.9 °C for germination and 23.5 °C for appressoria formation and for isolate FSH-CLB-2 it was 21.6 °C for both variable. In guava, the temperatures for germination of C. gloeosporioides and appressoria formation were 22.4 and 23.3 °C, respectively. In leaves of orange trees, the optimal temperatures for the isolates KLA-MGG-1 and FSH-CLB-2 were, respectively, 24.1 and 24 °C for germination and 21.2 and 23 °C for appressoria formation. In leaves of lemon trees, they were 18.1 °C for germination and 16.2 °C for appressorial production of isolate KLA-MGG-1. For isolate FSH-CLB-2, the optimal temperatures were 24.4 and 23.7 °C, respectively. The colonization strategy of C. gloeosporioides was intracellular hemibiotrophic. The penetration peg was verified in samples 48 h after inoculation. After 72 h, it was observed formation of infection vesicle. The hyphae were observed in samples 96 h after inoculation. The same fungal structures reached the parenchymal cells 120 hours after inoculation. The penetration peg was observed only in fruits with 85 and 110 days. Structures of guava tissues and phenols were changed with the fruit aging.

Entre as principais culturas do Brasil, a cana-de-açúcar é afetada por doenças responsáveis por reduções na produção. Entre elas, a ferrugem alaranjada, causada por Puccinia kuehnii relatada recentemente no país, tem merecido atenção dos Programas de Melhoramento Genético da cultura. Neste trabalho avaliaram-se parâmetros epidemiológicos monocíclicos da ferrugem alaranjada em duas variedades de cana, sob duas condições de temperatura. Plantas com 40 dias de idade das variedades SP891115 e RB855156, que se comportam como suscetível e medianamente resistente respectivamente, foram inoculadas com urediniósporos coletados de plantas com sintomas típicos da doença e colocadas em condições de alta umidade e 22 °C por 24 horas. Em seguida, as plantas foram transferidas para câmaras de crescimento com temperaturas de 18 oC e 25°C. Dois experimentos idênticos foram conduzidos, sendo que no primeiro o inóculo foi proveniente de plantas do campo, no segundo foi obtido em condições controladas. Avaliaram-se período de incubação, período de latência, germinação de esporos e formação de apressórios, freqüência de infecção, tamanho de pústula, severidade, esporulação e viabilidade dos esporos produzidos. O uso de inóculo produzido em condições controladas mostrou-se mais adequado para estudos dos parâmetros monocíclicos. A temperatura de 25 oC foi mais adequada para a manifestação da doença, em todas as variáveis avaliadas. A variedade RB 855156 mostrou maior nível de resistência poligênica que a variedade SP 891115, revelada por períodos de incubação e latência mais longos, menor frequência de infecção e menor área das pústulas. No caso das variáveis frequência de infecção e área das pústulas, a variedade RB 855156 mostrou menores valores somente a 18 oC, revelando que a resistência é influenciada pela temperatura. Não houve efeito da variedade de cana na esporulação ou na viabilidade dos esporos produzidos. / Among the main crops in Brazil, sugar cane is affected by several diseases responsible for reductions in yield. Among them, orange rust caused by Puccinia kuehnii, which was recently reported in the country, has deserved special attention by the breeding programs. In this work it were evaluated the monocyclic parameters of orange rust on two different varieties, under two conditions of temperature. Fortydays plants of SP891115 and RB855156 varieties, which are considered respectively susceptible and moderately resistant were inoculated with urediniospores collected from infected plants and kept in wet chamber at 22 °C for 24 hours. Then the plants were transferred to growth chambers with temperatures of 18 °C and 25 °C. Two identical experiments were conducted. Inoculum used in the first experiment was collected on naturally infected plants in the field while for the second experiment it was obtained through artificial inoculations. It were evaluated incubation and latency periods, spores germination and appressoria formation, frequency of infection, pustules size, severity, sporulation and viability of spores produced on each condition. The use of artificially obtained inoculums proved to be more suitable for monocyclic parameters study. Temperature of 25 °C was more suitable for disease development in all variables evaluated. Variety RB 855156 showed higher level of polygenic resistance than variety SP 891115 as revealed by longer incubation and latency periods, as well as by higher infection frequency and pustules area. Variety RB 855156 showed lower levels of infection frequency and pustules area only at 18 °C, revealing that its resistance is influenced by temperature. No effects of sugarcane variety on sporulation or spores viability were observed.

A soja é a cultura agrícola com maior extensão de área plantada no Brasil, país que se destaca no cenário mundial como o segundo maior produtor e exportador desta oleaginosa. A ferrugem asiática (FA), causada pelo fungo Phakopsora pachyrhizi, apresenta-se como um dos mais graves problemas fitossanitários da cultura da soja no Brasil, principalmente por não existirem, até o presente momento, cultivares com níveis de resistência satisfatórios. Com o objetivo de melhor se conhecer a biologia de Phakopsora pachyrhizi e alguns fatores relacionados ao processo infeccioso em soja, no presente trabalho foram avaliados: (1) Métodos de preservação de urediniósporos; (2) Influência da descontinuidade do molhamento foliar no processo infeccioso dos urediniósporos; (3) Influência da luminosidade e da superfície foliar no processo infeccioso de urediniósporos de P. pachyrhizi; (4) Influência do estádio fenológico da soja na infecção de P. pachyrhizi. Os resultados obtidos mostraram que a desidratação dos esporos proporcionou maior viabilidade destes ao longo do tempo, para todas as condições de armazenamento testadas. No deep freezer foi possível preservar os esporos por até 231 dias, independente da sua condição de hidratação. No ambiente, os esporos não desidratados e desidratados permaneceram viáveis por 16 e 22 dias, respectivamente. A reversão de dormência dos esporos foi efetiva ao empregar hidratação (24h de câmara úmida) seguida ou não por choque térmico (40&#176;C/5 minutos). Em todos os tratamentos onde se aplicou molhamento foliar descontínuo, a severidade de FA foi sempre inferior quando comparada ao molhamento contínuo, principalmente quando a interrupção do molhamento se deu após 4 horas de câmara úmida inicial. A interrupção temporária do molhamento afetou os esporos que haviam germinado, pois os mesmo não foram aptos a infectar após novo período de molhamento. Com relação à luminosidade, os urediniósporos foram aptos a infectar plantas de soja tanto na luz quanto no escuro. Porém, severidade maior foi observada quando se inoculou a superfície adaxial, com posterior incubação das plantas no escuro. Os experimentos in vitro mostraram que, na ausência de luz, houve maior germinação e maior formação de apressórios. O teor de cera epicuticular e o seu aspecto ultra-estrutural não apresentaram diferenças entre as superfícies adaxial e abaxial no cultivar BRS 154. Os cultivares BRS 154 e BRS 258, no estádio fenológico reprodutivo, R5, apresentaram menor severidade em relação aos estádios V3 e R1. O período latente médio (PLM) da FA foi 8 e 9 dias para os cultivares BRS 154 e BRS 258, respectivamente. O PLM não se diferenciou em função do estádio fenológico para ambos cultivares. Quanto à influência da idade da folha na suscetibilidade à FA, a folha 1, considerando-se o sentido base-ápice da planta, mostrou maior suscetibilidade e freqüência de infecção de P. pachyrhizi . Os resultados apresentados são essenciais, tanto por disponibilizarem informações sobre a biologia e epidemiologia do fungo, quanto por servirem como base para novos estudos, nas mais diversas áreas sobre este importante patossistema. / Soybean is the agricultural crop with the largest planted area in Brazil. The country stands out in the world scenario as the second-largest producer and exporter of this oilseed crop. The Asian rust (AR), caused by the fungus Phakopsora pachyrhizi, is one of the most serious phytosanitary problems of soybean in Brazil, especially because no cultivars exist so far with satisfactory resistance levels. In order to acquire better knowledge about the biology of Phakopsora pachyrhizi and some factors related to its infectious process in soybean, the following were evaluated in the present work: (1) Uredospore preservation methods; (2) Influence of leaf wetness discontinuity on the infectious process of uredospores; (3) Influence of luminosity and leaf surface on the infectious process of P. pachyrhizi uredospores; (4) Influence of phenological stage of soybean on infection by P. pachyrhizi . The results obtained showed that spore dehydration provided greater spore viability with time, in all storage conditions tested. Spores could be preserved for up to 231 days in the deep freezer, regardless of their hydration condition. At room temperature, non-dehydrated and dehydrated spores remained viable for 16 and 22 days, respectively. Spore dormancy reversion was effective when hydration was used (24h in humid chamber), followed or not by thermal shock (40&#176;C/5 minutes). In all treatments where discontinuous leaf wetting was applied, AR severity was always lower when compared with continuous wetting, especially when wetting was interrupted after 4 hours of initial treatment in the humid chamber. Temporary wetness interruption affected spores that had already germinated, as these were not able to infect after a new wetness period. As to luminosity, uredospores were capable of infecting soybean plants both in the light and in the dark. However, higher severity was observed when the adaxial surface was inoculated, with later incubation of the plants in the dark. The in vitro experiments showed that there was greater germination and greater formation of appressoria in the absence of light. Epicuticular wax content and its ultrastructural aspect did not show differences between the adaxial and abaxial surfaces in cultivar BRS 154. At the R5 reproductive phenological stage, cultivars BRS 154 and BRS 258 showed smaller severity in relation to stages V3 and R1. The AR mean latent period (MLP) was 8 and 9 days for cultivars BRS 154 and BRS 258, respectively. MLP differences due to phenological stage were not detected in any of the cultivars. As to the influence of leaf age on AR susceptibility, leaf 1 showed greater susceptibility and frequency of infection by P. pachyrhizi, considering the plant base-apex direction. The results herein presented are essential, either because they make information available on the biology and epidemiology of the fungus, or because they serve as a foundation for new studies on the most diverse areas about this important pathosystem.