La glycogénose de type 1a (GSD1a) est une maladie métabolique rare liée à une absence d’activité glucose‐6 phosphatase (G6Pase). La G6Pase est une enzyme clé de la production endogène de glucose (PEG) catalysant l’hydrolyse du G6P en glucose avant sa libération dans le sang. Cette fonction est restreinte au foie, aux reins et à l’intestin. La GSD1a est caractérisée par des hypoglycémies chroniques, une hépatomégalie associée à une stéatose hépatique et une néphromégalie. A plus longterme, la plupart des patients développent des adénomes. Un modèle murin de GSD 1a existe mais les souris ne survivent pas après le sevrage. Nous avons donc généré un modèle original de GSD1a, en invalidant le gène de la sous‐unité catalytique de la G6Pase spécifiquement dans le foie, grâce à une stratégie CRE‐LOX inductible (souris L‐G6pc‐/‐). Dans ce travail, nous avons montré que les souris L‐G6pc‐/‐ sont viables et reproduisent parfaitement la pathologie hépatique de la GSD1a, y compris le développement d’adénomes hépatiques après 9 mois d’invalidation. La viabilité des souris nous a permis de débuter des traitements par thérapie génique ciblant le foie à l’aide de vecteurs lentiviraux et AAV. La survie de ces souris, qui ne peuvent pas produire du glucose par le foie, repose la question du rôle relatif de la production hépatique de glucose dans la régulation de la glycémie Nous avons montré que les souris L‐G6pc‐/‐ sont capables de réguler leur glycémie, même au cours d’un jeûne prolongé. Ce maintien de l’homéostasie glucidique est due à une induction rapide de la néoglucogenèse rénale et intestinale, principalement par un mécanisme dépendant du glucagon / Glycogen storage disease type 1a (GSD1a) is a rare metabolic disorder due to an absence of glucose‐6 phosphatase (G6Pase) activity. G6Pase is the key enzyme of endogenous glucose production (EGP) and catalyzes the last step before the glucose release into the bloodstream. This function to produce glucose is restricted to the liver, the kidneys and the intestine. GSD1a is characterized by chronic hypoglycemia, hepatomegaly associated with hepatic steatosis and nephromegaly. The longterm complications of G6Pase deficiency include hepatocellular adenomas. The available animal model of GSD1a rarely survive over three months of age and the study of mechanisms of hepatocellular adenomas development cannot be investigated. So, we generated an original mouse model of GSD1a with a liver‐specific invalidation of catalytic subunit of G6Pase gene by an inducible CRE‐LOX strategy (L‐G6pc‐/‐ mice). In this work, we demonstrated that L‐G6pc‐/‐ were viable and totally reproduced the liver pathology of GSD1a, including the late development of hepatocellular adenomas. Then, we have begun liver gene therapy treatment using lentiviral and AAV vectors to correct the hepatic pathology. Finally, concerning glucose homeostasis, we have demonstrated that L‐G6pc‐/‐ were able to regulate blood glucose, during prolonged fast, even in the absence of hepatic glucose production. Rapidly, L‐G6pc‐/‐ mice were able to induce renal and intestinal gluconeogenesis thanks to a key role of glucagon and the development of a metabolic acidosis. These results provide evidence that the major role of the liver for EGP during fasting requires re‐examination

La pneumonie est la première cause de mortalité chez l’enfant dans le monde. Elle peut être provoquée par un certain nombre d’agents pathogènes connus mais 15 à 35% des pneumonies de l’enfant restent encore non renseignées d’un point de vue étiologique. L’utilisation d’un test moléculaire de découverte de nouveaux pathogènes nous a permis de découvrir de nouvelles espèces de Torque Teno Mini Virus (TTMV, Anelloviridae), nommées TTMV-LY, dans trois épanchements pleuraux provenant d’enfants hospitalisés avec une pleuro-pneumopathie, dont l’étiologie demeurait inconnue. Les TTMV sont des virus ubiquitaires dont l’implication dans une pathologie reste à déterminer. Les voies respiratoires ayant précédemment été décrites pour être un site d'infection des anellovirus, nous avons entrepris de caractériser ces nouveaux virus, ainsi que d’étudier leur potentiel rôle dans la pathogénèse.Les génomes complets de TTMV-LY ont été isolés, caractérisés puis répliqués in vitro. La réponse des cellules épithéliales alvéolaires, ainsi que des cellules présentatrices d’antigènes (CPA), impliquées dans l’inflammation, a été étudiée après infection par les virions néo-synthétisés.Ces travaux ont démontré que : i) les TTMV-LY peuvent coloniser les poumons en profondeur, ii) les cellules pulmonaires sont permissives aux TTMV-LY et permettent une réplication virale efficace, iii) l’infection virale module les réponses cellulaires et immunitaires des cellules pulmonaires en induisant des dérégulations de l’expression génique et la production de médiateurs inflammatoires, iv) les TTMV-LY seraient capables d’interagir avec les CPA et de réguler ainsi différentiellement le processus inflammatoire.L’ensemble de ces résultats ont permis de mettre en évidence une implication potentielle des TTMV-LY dans la pathogénèse des pneumopathies, et souligné la complexité des mécanismes biologiques mis en jeu lors de l’infection par les virus de cette famille. / Pneumonia is the leading cause of death in children worldwide. It can be caused by a number of known pathogens, but 15-35% of childhood pneumonia are still not associated with an etiologic agent. A pathogen discovery assay allowed us to identify new species of Torque Teno Mini Virus (TTMV, Anelloviridae), named TTMV-LY, in three undiagnosed pleural effusions from children hospitalized with parapneumonic empyema. TTMV are ubiquitous orphan viruses, and their involvement in pathogenesis remains unknown. The respiratory tract was previously described to be a site of anellovirus detection. We investigated the role of these new species in the pathogenesis of severe pneumonia.Full-length TTMV-LY genomes were isolated and in vitro replicated. The response of alveolar epithelial cells, and antigen presenting cells (APC), both involved in the inflammation process, was studied after infection with neo-synthesized virions.This study showed for the first time that: i) TTMV-LY can deeply colonize lungs, ii) alveolar epithelial cells are permissive to the TTMV-LY and allow an efficient replication, iii) viral infection modulates cellular and innate immune responses of alveolar epithelial cells, by inducing gene expression deregulations and inflammatory mediators production, iv) TTMV-LY are able to interact with APC and thereby regulate differentially their inflammatory process.All these results allowed to highlight a potential involvement of TTMV-LY in the pathogenesis of severe pneumonia and brought out the complexity of the biological mechanisms taking place during infection by viruses of this family.

Cette thèse a pour l’objet l’étude des pressions de sélection qui s’appliquent sur les îlots CpG, courtes séquences génomiques qui échappent à la méthylation chez les mammifères. Nous avons tout d’abord étudié les caractéristiques génomiques des îlots CpG, notamment leurs liens avec l’initiation de transcription des gènes et les origines de réplication de l’ADN, en utilisant des jeux de données récemment publiés. Nous avons ensuite déterminé si les caractéristiques de séquence des îlots CpG (richesse en dinucléotides CpG et richesse en GC) étaient sous pression de sélection et pouvaient jouer un rôle dans les fonctions des îlots CpG. Nous avons montré que la richesse relative en dinucléotides CpG des îlots CpG résulte uniquement de la faible méthylation de ces séquences. De plus, la richesse en bases GC des îlots CpG n’est pas soumise à pression de sélection mais semble résulter d’un mécanisme neutre, la conversion génique biaisée vers GC. Nous discutons également du devenir des îlots CpG chez les primates, qui et avons montré que si le taux de GC de ces séquences est en train de diminuer, la richesse relative en CpG quant à elle reste stable / This thesis analyses selective pressures applying on CpG islands, short sequences which escape methylation in mammalian genomes. We first studied genomic characteristics of CpG islands. We namely studied their relationships with gene transcription start, and with DNA replication origins, using recently published data. We then determined wether base peculiar composition of CpG islands (high number of CpG dinucleotides, high GC content) may be under (negative or positive) selective pressures, and thus play a role in their function, or not. We showed that the relative CpG-richness of CpG islands is the mere consequence of the low methylation of these genomic regions. Moreover, we showed that the high GC content of CpG islands is not under selective pressures, and seem to result from a neutral mechanism, biased gene conversion toward GC. We also discussed the future of CpG islands and primates. We showed that the GC content of CpG islands is decreasing, while the relative CpG content remains constant

Le contrôle de la transparence de la cornée dépend de l'intégrité de l'endothélium cornéen mono-stratifié qui est classiquement considéré dès la naissance, dépourvu de capacité de régénération chez l’homme. Dans des conditions pathologiques conduisant à la cécité par œdème cornéen, les pertes significatives en cellules endothéliales (CE) ne sont pas remplacée efficacement, ce qui signifie que ni de nouvelles CE provenant de cellules souches (CS), ni la division des cellules voisines des lésions ne peuvent contribuer à la régénération endothéliale. Toutefois, plusieurs travaux ont prouvé depuis 25 ans que les CE possédaient une capacité proliférative résiduelle ex vivo et deux équipes ont suggéré l’existence de CS ou de progéniteurs à la périphérie de l’endothélium cornéen. Dans notre travail de thèse, nous avons tout d'abord optimisé, en la systématisant, une technique d’immunomarquage spécialement adaptée à l'endothélium cornéen intact de cornées montées à plat. A l’issue de ces développements, nous disposons de protocoles simples de fixation à température optimale et de démasquages antigéniques susceptibles de permettre la révélation de nombreuses protéines. A partir d’une importante série de cornées humaines non conservées et d’autres conservées en organoculture, et grâce à cet outil désormais efficace, nous avons étudié le cycle cellulaire des CE et la localisation de potentielles CS sur l’endothélium cornéen humaine. Nos résultats démontrent que dans ces conditions, les CE expriment de façon homogène des régulateurs positifs (PCNA, MCM2, cycline D1, cycline E et cycline A) et des régulateurs négatifs du cycle cellulaire (P16, P27); certaines particularités ont par ailleurs pu être décrites de façon innovante, comme la localisation cytoplasmique diffuse de MCM2, paranucléaire de la cycline D1, l’absence de P21. L’ensemble des marquages pourrait suggérer que les CE sont arrêtées en fin de G1, après le point de restriction et que de nombreux mécanismes de réparation de l’ADN sont mis en jeux dans les CE exposées à un stress oxydant important tout au long de l’existence. Nous avons identifié une nouvelle organisation de la micro-anatomie de la périphérie et de l'extrême périphérie de l’endothélium où des cellules regroupées en multiples clusters pluristratifiés semblent alimenter des colonnes de CE radiaires longues d'un millimètre. Ces éléments, associés à l’observation d'une moindre différenciation et d’une compétence proliférative plus élevés en périphérie suggèrent un nouveau modèle d’homéostasie endothéliale humaine in vivo: toute la vie, des CS périphériques alimentent de façon très lente la périphérie cornéenne en CE qui migrent de façon centripète pour assurer la stabilité du centre cornéen dont les propriétés optiques primordiales sont sous-tendues par un endothélium qui ne perd que 0,6% de CE par an. A la différence de l’épithélium cornéen, ce système ne peut être accéléré lors de circonstances pathologiques. Les perspectives de nos travaux sont désormais d’essayer d’isoler de l’extrême périphérie les CS endothéliales ou les progéniteurs et de les cultiver en recréant un microenvironnement favorable. La possibilité de produire un grand nombre de CE in vitre non pas à partir de CE sénescentes prélevées sur la totalité de l’endothélium comme cela a été tenté par la passé, mais cette fois à partir de CS ou des progéniteurs ouvriraient la voie d'une véritable thérapie cellulaire endothéliale. L'enrichissement des greffons pendant la durée de leur conservation à la banque de cornée pourrait constituer une première étape majeure avant d’envisager créer de novo un endothélium sur un support greffable pour une greffe endothéliale du 3e type qui deviendrait ainsi enfin indépendante des aléas de la découpe du greffon. Enfin, l’ïdentification de la CS endothéliale et de son microenvironnement permettra aussi d'envisager une thérapie cellulaire in vivo pour traiter les stades précoces des pathologies endothéliales cornéennes / The control of corneal transparency depends on the integrity of the mono-stratified corneal endothelium, which is considered devoid of regenerative capacity after birth in humans. In pathological conditions leading to blindness by irreversible corneal edema, the significant losses of endothelial cells (ECs) are not replaced efficiently, indicating that neither new ECs derived from stem cells (SC) nor the division of ECs neighboring the lesions can contribute to a form of regeneration. However, several works of the last 25 years demonstrated that ECs possess residual capacity of proliferation ex vivo, and more recently, two teams suggested the existence of SC or endothelial progenitors located in the corneal periphery. In this thesis work, we have firstly optimized an immunostaining technique specially adapted to intact endothelium of flat mounted whole corneas. Consequently, we now have simple protocols of fixation at the right temperature, and of antigen retrieval that allow detecting multiple proteins with a clear subcellular localization. Using important series of non-stored and of organ cultured corneas, and thanks to this technique, we investigated the cell cycle status of ECs and the location of potential SC in human corneal endothelium. Our results indicate that ECs homogeneously express positive regulators (PCNA, MCM2, cyclin D1, cyclin E and cyclin A) as well as negative regulators of the cell cycle (P16, P27); several original descriptions have been made: diffuse cytoplasmic location of MCM2, paranuclear location of cyclin D1, absence of P21. The expression patterns suggest that ECS could be arrested after the restriction point of the G1 phase and that numerous mechanism of DNA repair are stimulated in ECs exposed to an important oxidative stress throughout live. We identified a novel organization of the micro-anatomy of the endothelial periphery and extreme-periphery, where cells accumulate in multiple small multilayered clusters connected radial centripetal cell rows of nearly 1 mm of length. Associated with the observation of a lesser differentiation and an increased proliferation capacity in this area, these elements suggest a novel model of endothelial homeostasis in humans: during life, SC continuously and extremely slowly sustain the endothelial periphery with new ECs that migrate toward centre forming cells rows. These cells ensure the stability of the center, which optical fundamental properties require a perfect stability, as indicated by an annual cell loss of only 0.6%. Contrary to the corneal epithelium, this system is incapable of accelerations in case of important cell loss. Further studies are necessary to understand this limitation. Our works offer several perspectives: the next step is to isolate the SC or the progenitors from the extreme periphery and to cultivate them in an adapted microenvironment. The possibility to cultivate endothelial cells directly from SC or progenitors and not, as previously tried in the past, from senescent EC from the whole endothelium open the way of a true endothelial cell therapy. The increase of endothelial cell density during corneal storage by eye banks could be a first step before developing bioengineered endothelium on a specific carrier that could be implanted in the recipient eye. Finally, the identification of SC and of its microenvironment would allow developing the basis of an in vivo cell therapy able to treat early stages of endothelial dysfunctions

Le transfert de gènes dans les cellules souches hématopoïétiques par des vecteurs lentiviraux s’inscrit dans les protocoles actuels de traitement par thérapie génique de plusieurs maladies monogéniques (B-thalassémie, Adrénoleucodystrophie, SCID…). De même, le transfert de gènes dans les lymphocytes T et B ouvre des perspectives tant au niveau de la thérapie génique que pour l’immunothérapie. Nous avons mis au point des vecteurs lentiviraux pseudotypés par des glycoprotéines chimérique (BaEV/TR) et mutante (BaEVRLess) du rétrovirus endogène de babouin. Nous avons montré que ces nouveaux vecteurs peuvent transduire de manière plus efficace les cellules souches hématopoïétiques stimulées et quiescentes que les vecteurs pseudotypés par la glycoprotéine du virus de la stomatite vésiculaire (VSV-G). Il en est de même pour les vecteurs développés récemment et pseudotypés par les Glycoprotéines H et F du virus de la rougeole. Nous avons aussi comparé la capacité de ces derniers vecteurs à ceux pseudotypés par les glycoprotéines BaEV/TR et BaEVRLess dans le transfert de gènes dans les lymphocytes B et T ainsi que dans l’ensemble des cellules de la lignée T. Nous sommes désormais en mesure de proposer des vecteurs adaptés au transfert de gènes à chaque étape de la différenciation des cellules CD34+ en thymocytes ainsi qu’en lymphocytes T matures. Ceci pourrait permettre de proposer de nouveaux protocoles cliniques en thérapie génique avec une co-transplantation de cellules souches génétiquement modifiées et de cellules T différenciées à partir de ces cellules. Ceci permettrait notamment de réduire les phases d’aplasie actuellement nécessaires pour la greffe de cellules souches. / Lentiviral vectors and their ability to transfer gene into hematopoietic stem cells are currently evaluated for the cure of several single-gene diseases (eg : B-thalassemia, Adrenoleucodystrophy, SCID). Likewise, gene transfer into B and T lymphocytes is of major interest in gene therapy and immunotherapy. We engineered new lentiviral vectors pseudotyped by some chimeric (BaEV/TR) and mutant (BaEVRLess) glycoproteins from the baboon endogenous retrovirus. We demonstrated that these new vectors can transduce more efficiently resting and mild stimulated hematopoietic stem cells than obtained with lentivectors pseudotyped by the glycoprotein G from the vesicular stomatitis virus (VSV-G). It is the same with the recently developed lentiviral vectors pseudotyped by the H and F glycoprotein from measles virus (H/F-LVs). We also compared the ability of the H/F-LVs with the BaEV/TR and BaEVRLess lentiviral vector pseudotype to transfer genes into B and T lymphocytes and into the whole T lineage. From now on, we are able to propose adapted vectors for gene transfer at each stage of differentiation from CD34+ cells to thymocytes and mature T cells. This could allow us to propose some new clinical protocols in gene therapy with a co-transplantation of genetically modified stem cells and their differentiated T progenitors in order to reduce the aplasia stage induced by current transplantation protocols.

Les systèmes toxine-antitoxine (TA) sont de petits modules génétiques largement présents dans les génomes bactériens. Ils codent pour une petite protéine toxique et une antitoxine. Ils sont classés en six types en fonction de la nature et du mode d'action de l'antitoxine. Ce travail a porté sur l'étude du type I, pour lequel l'antitoxine est un ARN antisens qui cible l'ARNm de la toxine afin de réprimer son expression. Au cours de cette thèse, nous avons étudié le système aapA3/IsoA3, codé sur le chromosome du pathogène gastrique humain Helicobacter pylori. À ce jour, la plupart des systèmes TA ont été étudiés à l'aide de systèmes d'expression artificiels, qui ne permettent pas de caractériser la régulation transcriptionnelle ou post-transcriptionnelle. En utilisant la létalité induite par l’expression chromosomique de la toxine obtenue en absence d’antitoxine, nous avons développé une sélection génétique de mutants suppresseurs révélés par séquençage haut-débit. Cette approche, appelée FASTBAC-Seq, nous a permis de cartographier une myriade de déterminants de toxicité localisés dans les régions codantes et non codantes du gène de la toxine AapA3. En particulier, certaines de ces mutations ont révélé l'existence de tige-boucles ARN transitoires qui agissent de manière co-transcriptionnelle pour empêcher l'initiation de la traduction pendant la synthèse de l'ARNm codant pour la toxine. Ces structures ARN métastables fonctionnelles sont nécessaires pour découpler les processus de transcription et de traduction et permettent la présence de ces gènes toxiques sur le chromosome bactérien. Bien que les ARNm non traduits deviennent rapidement instables, nos travaux ont également révélé l'existence de deux tige-boucles protectrices situées aux deux extrémités de l'ARNm. Ces structures secondaires empêchent des activités exonucléolytiques agissant en 5' et 3'. Dans l’ensemble, notre travail met en évidence les conséquences de la forte pression de sélection pour limiter l'expression des toxines sous laquelle évoluent les systèmes TA. Cela nous a permis de mieux comprendre l’influence du repliement secondaire des ARNm, non seulement lors de la régulation posttranscriptionnelle, mais aussi co-transcriptionnelle de l’expression de cette famille particulière de gènes. Ces caractéristiques de régulation basées sur l'ARN peuvent être exploitées à l'avenir pour des applications biotechnologiques (p. ex., production accrue de protéines par stabilisation d'ARNm) ou biomédicales (p.ex., développement de stratégies antimicrobiennes alternatives pour l'activation de la synthèse de toxines). / Toxin-antitoxin (TA) systems are small genetic modules widely present in bacterial genomes. They usually code for a small toxic protein and its cognate antitoxin and can be classified into six types depending on the nature and mode of action of the antitoxin. This work focuses on the study of type I, for which the antitoxin is an antisense RNA that targets the toxin mRNA to inhibit its expression. We characterized the aapA3/IsoA3 system, encoded on the chromosome of the human gastric pathogen Helicobacter pylori. To date, most TAs have been studied using artificial expression systems, which do not allow the characterization of transcriptional or post-transcriptional regulation. Taking advantage of the lethality induced by the toxin chromosomal expression in the absence of antitoxin, we developed a high-throughput genetic selection of suppressor mutations revealed by Next-Generation Sequencing. This approach, named FASTBAC-Seq, allowed us to map a myriad of toxicity determinants located in both, coding and noncoding regions, of the aapA3 toxic gene. More precisely, some suppressor mutations revealed the existence of transient RNA hairpins that act co-transcriptionally to prevent translation initiation while the toxinencoding mRNA is being made. Such functional RNA metastable structures are essential to uncouple the transcription and translation processes and allow the presence of these toxic genes on bacterial chromosomes. Although untranslated mRNAs become rapidly unstable, our work also revealed the presence of two protective stem-loops located at both mRNA ends that prevent from both, 5’ and 3’ exonucleolytic activity. Altogether, our work evidenced the consequences of the strong selection pressure to silence toxin expression under which the TAs evolve, and highlighted the key role of mRNA folding in the co- and post-transcriptional regulation of this family of genes. These RNA-based regulatory mechanisms may be exploited in the future for biotechnological (e.g., increased protein production through mRNA stabilization) or biomedical (e.g., development of alternative antimicrobial strategies aiming at the activation of toxin synthesis) applications.

Parmi les différents minéraux argileux, la sépiolite, qui est un silicate fibreux naturel, est un potentiel nano-transporteur prometteur pour le transfert non-viral de biomolécules. Il a en effet été montré que la sépiolite interagissait avec des molécules biologiques telles que les lipides, les polysaccharides et les protéines. Dans ce travail, nous démontrons que la sépiolite interagit également efficacement avec différents types de molécules d'ADN (génomique, plasmidique, oligonucléotides simple et double brin), et nous présentons la première étude détaillée sur les mécanismes d'interaction entre la sépiolite et l'ADN, ainsi qu’une caractérisation physico-chimique de bionanocomposites ADN-sepiolite. Une analyse spectroscopique a montré tout d’abord que l’interaction de l'ADN avec la sépiolite était plus forte en présence de polycations, la valence de ces derniers accroissant le rendement d’absorption, et deuxièmement, que l'ADN ainsi adsorbé pouvait être récupéré avec un rendement modulé par la présence d’EDTA, la structure de l'ADN et son activité biologique étant conservées. Par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) nous avons identifié les groupes silanol externes comme les principaux sites d'interaction avec l'ADN. Nous avons ensuite prouvé qu'il est possible d'utiliser la sépiolite pour extraire l'ADN de bactéries, pour la purification de l'ADN et pour la purification de toute contamination bactérienne. En combinant la microscopie à fluorescence, la microscopie électronique à transmission (MET), la vidéo-microscopie et l’analyse par cytométrie en flux (FACS), nous avons montré que la sépiolite peut être spontanément internalisée dans des cellules de mammifère par le biais de deux voies, l’endocytose et la macropinocytose. En tant que preuve de concept, nous montrons que la sépiolite est capable de transférer de manière stable l'ADN de plasmide dans des bactéries et des cellules de mammifères. Il a également été prouvé qu’en incubant des bactéries avec des bionanocomposites ADN-sepiolite, initialement préparés en présence d'une faible concentration en cations divalents et avec de la sépiolite traitée aux ultrasons (sSep), il était possible d'augmenter l'efficacité de la transformation bactérienne 20 à 30 fois par rapport aux méthodes basées sur l'«effet Yoshida». En outre, nous montrons que l'efficacité du transfert de gènes par la sépiolite peut être optimisée : l'utilisation de sSep et l'exposition à la chloroquine augmentent d’un facteur 100 et 2, respectivement, l’efficacité de transfection. Ces résultats ouvrent la voie à l'utilisation de bionanocomposites à base de sépiolite comme de nouveaux potentiels nano-transporteurs hybrides potentiels, à la fois pour la thérapie génique et le développement de nouveaux modèles biologiques en sciences fondamentales et appliquées. / Among the various clay minerals, sepiolite, which is a natural fibrous silicate, isa potential promising nanocarrier for the non-viral transfer of bio-molecules. Indeed,sepiolite has been shown to interact with biological molecules such as lipids,polysaccharides and proteins. Here, we show that sepiolite efficiently binds differenttypes of DNA molecules (genomic, plasmid, single strand and double strandoligonucleotides), introducing the first detailed study on the interaction mechanismsbetween sepiolite and DNA, as well as the physicochemical characterization of theresulting DNA-sepiolite bionanocomposites. The interaction mechanisms aresuggested to be electrostatic interactions, van der Waals forces, cation bridges, andhydrogen bonding. Spectroscopy analysis showed that the binding of DNA to sepiolitewas increased by polycations with valence dependent efficiency, and the DNApreviously adsorbed could be recovered with an efficiency that could be modulatedusing a chelating agent (EDTA), preserving the DNA structure and biological activity.Fourier-transform infrared spectroscopy identified the external silanol groups as themain sites of interaction with the DNA. It was proved that it is possible to use sepiolitefor extracting DNA from bacteria, for DNA purification and for purification from bacterialcontamination. By combining fluorescence microscopy, transmission electronmicroscopy (TEM), time-lapse video microscopy and flow cytometry analysis (FACS),we show that sepiolite can be spontaneously internalized into mammalian cells throughboth endocytic and non-endocytic pathways. As a proof of concept, we show thatsepiolite is able to stably transfer plasmid DNA into bacteria and mammalian cells. Itwas also proved that with the incubation of bacteria with the Sep/DNAbionanocomposite initially prepared in the presence of a low concentration of divalentcation, and using sonicated sepiolite (sSep), it is possible to increase the bacterialtransformation efficiency from 20 to 30-fold compared to previously reported methodswhich are based in the “Yoshida effect”. Additionally, we show that the efficiency ofsepiolite-mediated gene transfer can be optimized: the use of sSep and the exposureto the endosome disrupter chloroquine 100-fold and 2-fold stimulated DNA transfectionefficiency, respectively. These results open the way to the use of sepiolite-basedbionanocomposites as a novel class of hybrid nanocarriers for both potential genetherapy and the development of novel biological models of interest for academic andapplied sciences.

Au cours de la transcription, plusieurs facteurs sont assemblés sur les ARN messagers pour former des Ribonucléoparticules de messagers (mRNPs), et contrôler leur maturation, leur stabilité et leur devenir dans le cytoplasme. Afin d’assurer la production de protéines fonctionnelles, la cellule dispose de plusieurs mécanismes de régulation et de contrôle de qualité assurant la fidélité de l’information génétique transmise au niveau ARN messager et protéine.Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, un ensemble de protéines associées au pore nucléaire, incluant la SUMO protéase Ulp1, a été impliqué dans un contrôle de qualité des mRNPs régulant leur export vers le cytoplasme. Ces données suggéraient que l’export des ARN messagers pourrait être contrôlé par la modification post-traductionnelle par le polypeptide SUMO d’un ou de plusieurs effecteurs au sein des mRNPs. Afin de mieux comprendre ces processus, nous avons combiné plusieurs approches visant à identifier ces protéines SUMOylées. En particulier, nous avons mis en place un crible protéomique visant à identifier les protéines dont l’association sur les mRNPs dépend d’Ulp1. Ce crible nous a permis de mettre en évidence une régulation par Ulp1 de l’assemblage du complexe THO sur les ARN messagers. Ce complexe, recruté sur les gènes et les mRNPs, est connu pour contribuer à l’efficacité de la transcription, prévenir l’instabilité génétique liée à la formation d’hybrides ADN matrice – ARN messager (dénommés R-loops) et permettre l’export des mRNPs. En combinant l’analyse biochimique de différentes catégories de mRNPs à des expériences d’immunoprécipitation de l’ARN, nous avons montré que l’activité de la SUMO-protéase Ulp1 est nécessaire à l’association du complexe THO sur différents ARN messagers. De plus, nous avons montré que le complexe THO est SUMOylé sur le domaine C-terminal de sa sous-unité Hpr1, et que Ulp1 régule cette modification. Enfin, cet événement de SUMOylation du complexe THO régule son association avec les mRNPs. L’analyse fonctionnelle de mutants affectant la SUMOylation du complexe THO révèle que des défauts de SUMOylation de ce complexe compromettent ses fonctions dans la transcription sans affecter l’export. De manière intéressante, nous avons observé que la présence d’un intron sur des rapporteurs LacZ diminue la sensibilité de leur expression à des inactivations ou des défauts de SUMOylation du complexe THO. Ce phénotype entraine une augmentation relative des niveaux d’ARN pré-messagers dans ces mutants, un phénomène rendant compte de la fuite cytoplasmique apparente d’ARN non épissés précédemment observée dans le mutant ulp1. L’ensemble de ces données caractérise pour la première fois un rôle de la SUMOylation dans le contrôle de l’assemblage et du devenir cellulaire des mRNPs. / During transcription, several factors associate with mRNA to form messenger Ribonucleoparticles (mRNPs), thereby controlling their processing, their stability, and their cytoplasmic fate. To ensure the production of functional proteins from these mRNAs, eukaryotic cells contain numerous regulatory and quality control systems in order to prevent aberrant mRNP accumulation and export.In the yeast Saccharomyces cerevisiae, several nuclear pore associated proteins, including the SUMO isopeptidase Ulp1, have been involved in a mRNP quality control regulating their nuclear export. These data suggested that post-translational modification by SUMO of one or several mRNP components could regulate mRNA export. In order to understand the molecular mechanisms underlying this process, we undertook several approaches to identify these SUMOylated factors. In particular, we have set up a proteomic screen to identify mRNP components whose assembly onto mRNPs depends on Ulp1 activity.This proteomic survey revealed an Ulp1-dependent regulation of THO complex assembly to mRNPs. This complex, recruited to transcribed genes and mRNPs, is known to regulate transcription elongation by preventing DNA-RNA hybrids formation (termed R-loops), and mRNP export. Through a combination of proteomic analysis of mRNPs assembled in Ulp1 mutant cells, with RNA / chromatin immunoprecipitation experiments, we demonstrate that Ulp1 controls specifically the recruitment of the THO complex within mRNPs. SUMOylation analysis further reveals that Ulp1 targets the THO complex subunit Hpr1 on its C-terminal domain for deSUMOylation. We further show that this SUMOylation event regulates THO complex association within mRNPs. Finally, functional analysis reveal that impaired deSUMOylation of the THO complex do not affect mRNP export, but disturbs expression of LacZ reporter genes, a phenotype classically associated with THO complex dysfunction. Intriguingly, the transcriptional effect of inactivation or impaired deSUMOylation of the THO complex on LacZ expression is alleviated by the presence of an intron, providing a molecular basis for previously reported pre-mRNA leakage phenotypes. Our data therefore unravels for the first time a function of SUMO in the control of mRNP assembly contributing to proper mRNP homeostasis.

L’enzyme méthionine synthase (MTR) catalyse la reméthylation de l’homocystéine en méthionine, le précurseur du donneur universel de groupe méthyle S-Adenosylmethionine (SAM), impliqué dans des mécanismes de régulations épigénétiques. Des polymorphismes de MTR sont associés à des défauts métaboliques et des défauts de développement embryonnaire. Afin d’étudier les conséquences d’une déficience en MTR, nous avons généré des modèles murins d’invalidation conditionnelle du gène MTR de manière constitutive ou inductible dans le foie et dans le cerveau. L’invalidation constitutive ou inductible ciblée dans le foie pendant l’embryogenèse n’est pas viable, suggérant un rôle limitant de la méthionine synthase sur le développement précoce et l’organogenèse en lien probable avec les conséquences sur la prolifération cellulaire. Dans les périodes post-natales, nous avons utilisé le modèle inductible complété par une hépatectomie pour étudier les altérations de la régénération hépatique liée aux effets sur le stress cellulaire ainsi que l’expression et l’activation des cyclines. Le KO dans le cerveau induit principalement une perte des fonctions de mémorisation de l’apprentissage hippocampo-dépendant. Au total, nos résultats illustrent les effets différents de l’invalidation de MTR en fonction de l’organe considéré. Le foie est un organe très plastique avec une capacité de régénération très importante. Les effets sur les étapes de l’organogénèse et sur l’inhibition de la régénération confirment l’hypothèse du rôle majeur et limitant de la méthionine synthase dans la régulation du cycle cellulaire. Le modèle d’invalidation au niveau du cerveau confirme le rôle très important de la voie de reméthylation de l’homocystéine catalysée par la méthionine synthase, rôle qui a déjà été illustré par d’autres travaux sur les rats carencés en donneur de méthyle et sur la souris transgénique KO cd320 / The enzyme methionine synthase (MTR) catalyzes the remethylation of homocysteine to methionine, the precursor of the methyl donor S-universal Adenosylmethionine (SAM), involved in epigenetic regulation mechanisms. We generated mouse models with conditional invalidation of the mtr gene in a constitutive or inducible manner to delete the gene expression specifically in the liver and brain. Constitutive invalidation during embryonic life is not sustainable when targeted to the liver, suggesting a limiting role of methionine synthase in early organogenesis and probably on cell proliferation. We performed hepatectomy to study regeneration-related effects on the cellular stress and found dramatic effects on cell proliferation through altered expression and activation of cyclins. The constitutive model in brain highlighted the behavioral anomalies related to a loss of learning and memory. This suggested major effects in the hippocampus. Overall, our findings highlighted the specific effects of the invalidation of methionine synthase in both organs. The liver is a plastic member with a very high regenerative capacity. The effects on organogenesis and inhibition of regeneration confirm the hypothesis for a major role of methionine synthase in cell cycle regulation. The invalidation model in the brain confirms the important role of the remethylation pathway catalysed by methionine synthase, a role which has been shown by other studies in rats deprived in methyl donors and in cd320 KO transgenic mice

L'analyse bioinformatique des données de transcriptomique a pour but d'identifier les gènes qui présentent des variations d'expression entre différentes situations, par exemple entre des échantillons de tissu sain et de tissu malade et de caractériser ces gènes à partir de leurs annotations fonctionnelles. Dans ce travail de thèse, je propose quatre contributions pour la prise en compte des connaissances du domaine dans ces méthodes. Tout d'abord je définis une nouvelle mesure de similarité sémantique et fonctionnelle (IntelliGO) entre les gènes, qui exploite au mieux les annotations fonctionnelles issues de l'ontologie GO ('Gene Ontology'). Je montre ensuite, grâce à une méthodologie d'évaluation rigoureuse, que la mesure IntelliGO est performante pour la classification fonctionnelle des gènes. En troisième contribution je propose une approche différentielle avec affectation floue pour la construction de profils d'expression différentielle (PED). Je définis alors un algorithme d'analyse de recouvrement entre classes fonctionnelles et ensemble des références, ici les PEDs, pour mettre en évidence des gènes ayant à la fois les mêmes variations d'expression et des annotations fonctionnelles similaires. Cette méthode est appliquée à des données expérimentales produites à partir d'échantillons de tissus sains, de tumeur colo-rectale et de lignée cellulaire cancéreuse. Finalement, la mesure de similarité IntelliGO est généralisée à d'autres vocabulaires structurés en graphe acyclique dirigé et enraciné (rDAG) comme l'est l'ontologie GO, avec un exemple d'application concernant la réduction sémantique d'attributs avant la fouille. / Bioinformatic analyses of transcriptomic data aims to identify genes with variations in their expression level in different tissue samples, for example tissues from healthy versus seek patients, and to characterize these genes on the basis of their functional annotation. In this thesis, I present four contributions for taking into account domain knowledge in these methods. Firstly, I define a new semantic and functional similarity measure which optimally exploits functional annotations from Gene Ontology (GO). Then, I show, thanks to a rigorous evaluation method, that this measure is efficient for the functional classification of genes. In the third contribution, I propose a differential approach with fuzzy assignment for building differential expression profiles (DEPs). I define an algorithm for analyzing overlaps between functional clusters and reference sets such as DEPs here, in order to point out genes that have both similar functional annotation and similar variations in expression. This method is applied to experimental data produced from samples of healthy tissue, colorectal tumor and cancerous cultured cell line. Finally the similarity measure IntelliGO is generalized to another structured vocabulary organized as GO as a rooted directed acyclic graph, with an application concerning the semantic reduction of attributes before mining.