Des biomolécules telles que les protéines et les acides nucléiques sont d'un grand intérêt dans l'immunothérapie, la thérapie génique tels que des cancers, le traitement de SIDA, les troubles auto-immuns liés à la déficience immunitaire sévère et combinés à autres maladies. Afin de cibler ces objectifs, l'encapsulation et le ciblage sont incontestablement nécessaires pour protéger les biomolécules contre la dégradation rapide et aussi pour éviter les effets secondaires. Ainsi, dans le cadre de cette thèse, l'encapsulation de protéines et de l'ADN en utilisant le procédé basé sur la double émulsion évaporation de solvant a été étudiée. Mais avant de conduire l’étude expérimentale, l'état de l'art des procédés d'encapsulation a été effectué et une attention particulière a été consacrée à l’encapsulation de l'ADN et les protéines et aux procédés d’encapsulations basés sur la formulation des polymères biodégradables. En ce qui concerne l’étude expérimentale, une étude systématique des paramètres pertinents sur les propriétés physico-chimique et colloïdales des particules a été examinée. Cette étude a permis de mettre en évidence les facteurs clés capables d’affecter non seulement le procédé mais aussi les propriétés colloïdales des particules élaborées (taille, distribution en taille, propriétés électrocinétiques et stabilité colloïdale…). En second lieu, la formulation optimisée permettant l’obtention de tailles submicroniques a été utilisée pour l’encapsulation de l'ADN et les protéines. L'encapsulation de l'ADN a été étudiée en fonction de la concentration de l'ADN (sperme de saumon) et une encapsulation totale d'ADN a été observée sans modification ou altération des propriétés colloïdales des particules finales. L'encapsulation de protéines a été également examinée en utilisant HAS et une autre protéine fluorescente comme modèles. L'efficacité de l'encapsulation a été déterminée et trouvée de l’ordre de 100%. L'utilisation de la protéine fluorescente indique l'encapsulation totale avec une bonne répartition dans les cavités de la matrice polymère. En conclusion, le procédé de la double émulsion – évaporation de solvant est efficace pour l’encapsulation de l'ADN et des protéines sans modification des propriétés colloïdales des particules finales qui restent bien submicroniques / Biomolecules such as proteins and nucleic acids are of great interest in immunotherapy and gene therapy such as cancers, AIDS, autoimmune disorders, X-linked severe combined immune deficiency and many other diseases. In order to target such objectives, the encapsulation and the targeting are incontestably necessary principally to protect biomolecules against rapid degradation and also to avoid side effects. Then, in this thesis, the encapsulation of proteins and DNA using double emulsion solvent evaporation technique was performed. But before the encapsulation, the state of the art of the encapsulation processes was performed and special attention has been dedicated to DNA and proteins encapsulation. Firstly, systematic study of double emulsion solvent evaporation process was investigated in order to point out the key parameters controlling the particles size and the colloidal stability. Secondly, the optimized formulation conditions leading to submicron colloidal was used for DNA and Proteins encapsulation. The DNA encapsulation was investigated as a function of DNA concentration and it was found total encapsulation of DNA without any modification of the colloidal properties. The protein encapsulation was examined using HAS and fluorescent proteins as model. The encapsulation efficiency was found to be high and reaches 100%. The use of fluorescent protein shows the total encapsulation and good distribution of proteins in polymer matrix. As a general conclusion, the high encapsulation efficiency of DNA and protein, reveled the compatibility of the used process to encapsulated hydrophilic biomolecules even in submicron size biodegradable colloidal submicron particles

À la fois le sommeil et la privation de sommeil ont un impact sur la synthèse protéique au niveau du cerveau, mais la contribution des mécanismes traductionnels à la régulation de l’éveil et du sommeil n’a été que peu étudiée. Dans ce mémoire de maitrise, nous étudions le rôle de deux répresseurs de la traduction protéique, les protéines de liaison du facteur 4E d’initiation eucaryote 1 et 2, 4E-BP1 et 4E-BP2 dans l’architecture du sommeil et l’activité électroencéphalographique (EEG), ainsi que dans la réponse EEG et moléculaire à la privation de sommeil. Ces deux protéines inhibent la synthèse protéique en séquestrant une protéine nécessaire à l’initiation de la traduction, eIF4E. Activé par différentes voies de signalisation intra- et extracellulaires, mTORC1 phosphoryle les 4E-BP, ce qui relâche l’inhibition et permet l’initiation de la synthèse protéique. 4E-BP1 est très exprimé au niveau des noyaux suprachiasmatiques et est impliqué dans les rythmes circadiens. 4E-BP2, très exprimé au niveau du cerveau, est nécessaire pour la mémoire et la plasticité synaptique. Des électrodes EEG et électromyographiques (EMG) ont été implantées chez des souris mutantes pour les gènes encodant 4E-BP1 ou 4E-BP2 (Eif4ebp1-/- et Eif4ebp2-/-). Les souris ont été enregistrées pendant 48h et soumises à une privation de sommeil de 6h au début de la seconde journée d’enregistrement. L’effet de la privation sur l’expression de certains gènes a également été mesuré dans le cortex préfrontal des souris. Les souris Eif4ebp1-/- diffèrent des souris sauvages dans la quantité et la qualité du sommeil et de l’éveil. De légères différences au niveau de l’expression génique après privation ont également été trouvées. Les souris Eif4ebp2-/- présentaient, quant à elles, seulement des changements dans la qualité de l’activité EEG en éveil, révélé suite à la privation de sommeil. Les résultats de mon projet de maitrise suggèrent une implication de la machinerie de traduction protéique dans la régulation du sommeil et de l’éveil, et pointent vers des rôles différents des deux répresseurs de la traduction. / Albeit it is known that sleep and sleep loss are impacting protein synthesis in the brain, several unknowns persist about the contribution of the mechanisms of translational control to wakefulness and sleep regulation. In this master project, we studied the role of two suppressors of protein synthesis, the eukaryotic initiation factor 4E-binding protein 1 and 2 (4E-BP1 and 4E-BP2) in sleep architecture and electroencephalographic (EEG) activity as well as in the EEG and molecular responses to acute sleep loss. These two proteins normally repress cap-dependent translation initiation by binding eIF4E. When activated by extracellular and intracellular signaling, mTORC1 phosphorylates 4E-BPs leading to their dissociation from eIF4E, thus allowing the translation initiation. 4E-BP1 is highly expressed in the suprachiasmatic nucleus and implicated in circadian rhythms. 4E-BP2, widely expressed in the brain, is critical for memory and plasticity. Yet, there is no data on their implication in sleep regulation. Mutant mice for the genes encoding 4EBP1 or 4E-BP2 (Eif4ebp1-/- and Eif4ebp2-/- mice) were implanted with EEG and electromyographic (EMG) electrodes and recorded under undisturbed conditions and following a 6-h sleep deprivation (SD). The effect of SD on the expression of genes known to respond to SD was also assessed in the prefrontal cortex of Eif4ebp1-/- and Eif4ebp2-/- mice. Mice lacking Eif4ebp1 differed from wildtype mice regarding the quantity and quality of their sleep and wakefulness, and more subtly in the gene expression response to SD. Moreover, Eif4ebp2-/- mice differed from wild-type mice only for wakefulness and sleep quality, changes in EEG spectral activity generally revealed during and after SD. The results of my master project point towards an implication of the translation machinery in the regulation of wakefulness and sleep and of synchronized cortical activity and suggest different roles of effectors of translational control.

Le but de la première partie de ce travail était de mieux comprendre la tumorigenèse thyroïdienne à<p>partir de modèles murins transgéniques développant des tumeurs de la thyroïde. Nous avons ainsi<p>analysé par microarrays l’expression génique au sein de thyroïdes de souris Tg-RP3 exprimant le<p>réarrangement RET/PTC3, responsable de cancers papillaires de la thyroïde chez l’homme (PTC), et<p>de souris Tg-E7 exprimant l’oncogène E7, responsable de cancers du col de l’utérus chez la femme.<p>Ces deux gènes étaient exprimés exclusivement dans la thyroïde grâce à un promoteur thyroglobuline.<p>Nous avons comparé les profils d’expression entre les différents génotypes (sauvages, Tg-RP3 et Tg-<p>E7) mais également entre différents âges (2, 6 et 10 mois). Sur le plan histologique, les souris Tg-E7<p>développaient d’énormes goitres avec une dysplasie de plus en plus marquée, mais n’ont pas démontré<p>de réelles lésions de carcinomes aux différents âges étudiés. Les thyroïdes de souris Tg-RP3<p>démontraient quand à elle une prolifération cellulaire et une croissance plus modérées, mais des<p>remaniements tissulaires plus importants, présents dès 2 mois, avec apparition de lésions de carcinome<p>chez de nombreux animaux essentiellement à 6 et 10 mois. Les résultats de l’analyse de l’expression<p>génique par microarrays rejoignaient ces observations histologiques. Dans les thyroïdes E7, ce sont<p>essentiellement les gènes impliqués dans le cycle cellulaire qui ont démontré une surexpression<p>significative. Dans les thyroïdes RP3, les processus cellulaires les mieux représentés par les gènes<p>surexprimés étaient déjà décrits comme des processus ayant un rôle important dans la tumorigenèse<p>thyroïdienne humaine :l’inflammation, le remodelage du milieu extracellulaire et l’angiogenèse. De<p>plus, plusieurs gènes classiquement surexprimés dans les PTC humains, l’étaient également dans les<p>thyroïdes RP3. Parmi ceux-ci le récepteur de la vitamine D (VDR) et la 1-alpha-hydroxylase<p>(CYP27B1), responsable de la conversion de la 25-hydroxyvitamine D3 en 1,25-dihydroxyvitamine<p>D3, ont particulièrement retenu notre attention étant donné une littérature croissante sur les effets antiprolifératifs<p>et immuno-modulateurs de la 1,25-dihydroxyvitamine D3 (calcitriol). Nous avons donc<p>étudié dans la deuxième partie de notre travail les effets anti-prolifératifs et transcripionnels du<p>calitriol sur plusieurs modèles thyroïdiens in vitro et in vivo. Si nous n’avons pu démontrer d’effets<p>concluants sur des lignées de cancers thyroïdiens humains, nous avons par contre démontré un effet<p>anti-prolifératif, le plus souvent dose-réponse, du calcitriol sur des cultures primaires de thyroïdes de<p>souris sauvages, Tg-RP3, Tg-E7 et humaines. Seule la 24-hydroxylase, intervenant dans l’inactivation<p>de la vitamine D, et le récepteur à la TSH ont démontré une surexpression significative en présence de<p>calcitriol par RTQ-PCR. Une étude d’expression génique par microarrays sur des cultures primaires de<p>thyroïdes RP3 et humaines traitées par éthanol (contrôle) ou calcitriol a permis de mettre en évidence<p>3 gènes significativement régulés dans le même sens, en l’occurrence sous-exprimés, en présence de<p>calcitriol :la nébulette, la thymopoïétine et la cycline E2. Le rôle exact joué par ces trois protéines<p>dans l’effet anti-prolifératif observé reste à déterminer. Les études in vivo de carence alimentaire en<p>vitamine D de souris Tg-RP3 n’ont pas démontré de différences significatives entre le groupe carencé<p>et non carencé que ce soit en termes de croissance glandulaire ou d’expression génique, après 2 ou 6<p>mois de carence. Seule la 1-alpha-hydroxylase est apparue significativement surexprimée après 2<p>mois, surexpression disparaissant après 6 mois. Cette régulation pourrait témoigner d’un mécanisme<p>d’adaptation de la thyroïde qui tente de contrer la carence en vitamine D circulante en augmentant la<p>concentration locale de vitamine D active. Ce phénomène disparaissant à 6 mois, il serait intéressant<p>de prolonger la carence au-delà de 6 mois pour assurer une réelle carence locale en 1,25-<p>dihydroxyvitamin D3. Nous avons ensuite traité des souris Tg-RP3 puis Tg-E7 par des doses variables<p>de CD578, un analogue « non calcimimétique » du calcitriol. Il est apparu que la dose ayant un effet<p>significatif au niveau transcriptionnel (surexpression de la 24-hydroxylase) était également la dose la<p>plus toxique, entrainant une hypercalcémie parfois létale. Le protocole principal a du être écourté en<p>raison d’un excès de mortalité. Le petit nombre d’animaux ayant survécu ne nous a pas permis de<p>conclure à une différence d’expression significative du Ki67 dans les thyroïdes de souris traitées par<p>CD578 par rapport aux souris contrôles. De nouvelles expériences devront donc être réalisées aux<p>doses les moins toxiques, administrées sur une plus longue période et sur un plus grand nombre<p>d’animaux, afin d’augmenter la probabilité d’observer un effet sur la prolifération, voire la<p>différenciation tissulaire. / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est un syndrome neuromusculaire dû à des mutations dans le gène dmd qui conduisent à la perte d’expression des dystrophines, protéines normalement exprimée dans différents tissus y compris le cerveau. Le profil cognitif des patients est hétérogène et la présence d’une déficience intellectuelle dépend de la position des mutations dans le gène. Cette variabilité s’explique par la complexité du gène dmd qui comprend plusieurs promoteurs internes permettant l’expression cérébrale de plusieurs dystrophines de tailles différentes. Dans ce travail de thèse, nous nous sommes intéressés à deux dystrophines : la dystrophine complète (Dp427), normalement exprimée dans le muscle et le cerveau et absente chez tous les patients DMD, et la forme la plus courte de dystrophine, la Dp71, produit cérébral majeur du gène dmd absente dans un sous-groupe de patients. Ces deux dystrophines ont des fonctions cellulaires différentes : La Dp427, normalement exprimée dans les synapses inhibitrices en interaction avec les récepteurs du GABA, joue un rôle dans la plasticité synaptique, l’apprentissage et la mémoire. Sa perte conduit à des déficits cognitifs modérés. La Dp71, majoritairement exprimée dans les astrocytes périvasculaires, contribue à l’ancrage de canaux ioniques impliqués dans l’homéostasie cérébrale et joue aussi un rôle dans la synapse glutamatergique. La perte de Dp71 aggrave fortement les déficits associés à la perte de Dp427 chez les patients et conduit à une déficience intellectuelle sévère. Les relations génotypes-phénotypes restent à préciser et on suppose qu’au-delà de la sévérité des déficits, la nature même des altérations cognitives, ainsi que que la présence de troubles sensoriels, cognitifs, exécutifs et neuropsychiatriques, dépendent des formes de dystrophines touchées. Pour étudier le rôle de ces deux dystrophines, nous avons utilisé deux modèles murins : la souris mdx uniquement déficiente en Dp427, et la souris Dp71-null uniquement déficiente en Dp71. Une étude comportementale à large spectre nous a permis de mieux caractériser le phénotype associé à la perte de Dp427 et de Dp71, en précisant l’intégrité de la perception et du traitement des stimuli sensoriels auditifs, des réponses émotionnelles et de la réactivité au stress, des performances d’apprentissage, ainsi que de certaines composantes des fonctions exécutives, comme la mémoire de travail spatiale et la flexibilité comportementale. Ce travail a été complété par des études collaboratives visant à caractériser le rôle de la Dp71 dans la plasticité corticale et à développer une approche de thérapie génique pour restaurer la fonction de la Dp427 chez la souris mdx. Nous montrons que la perte de Dp427 perturbe les fonctions GABAergiques, les réponses émotionnelles induites par un stress ainsi que la mémoire émotionnelle et la mémoire à long terme, sans altération majeure des fonctions sensorielles et exécutives. Nous montrons aussi qu’une thérapie génique basée sur des injections systémiques d’oligonucléotides antisens, porteurs de chimies spécifiques et passant la barrière hémato-encéphalique, est capable de restaurer une Dp427 fonctionnelle par la technique du saut d’exon et de compenser les altérations émotionnelles des souris mdx. La perte de Dp71 a un impact différent : Elle altère la balance excitation/inhibition et la plasticité synaptique corticale et perturbe l’apprentissage, la flexibilité comportementale et la mémoire de travail dans des tâches d’apprentissage spatial. Notre étude de ces modèles murins a donc permis de clarifier les relations génotype-phénotype et les bases neurobiologiques de cette maladie, et d’identifier des phénotypes utiles pour valider l’efficacité de traitements ciblant le cerveau dans des études précliniques. / Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a neuromuscular syndrome caused by mutations in the dmd gene, leading to the loss of dystrophin proteins, which are normally expressed in various tissues including the brain. Patients exhibit heterogenous cognitive profiles and the presence of intellectual disability depends on the location of the mutation within the gene. This variability can be explained by the complexity of the dmd gene, which includes several internal promoters leading to the cerebral expression of several dystrophins of different sizes. In this thesis work, we focused on two dystrophins : the full-length dystrophin (Dp427) normally expressed in muscle and brain and lost by all DMD patients, and the shortest dystrophin, Dp71, major cerebral product of the dmd gene that is absent in a subgroup of patients. These two dystrophins have distinct cellular functions : Dp427, normally interacting with GABA receptors in inhibitory synapses, plays a role in synaptic plasticity, learning and memory. Its loss leads to mild cognitive deficits. Dp71, mostly expressed in perivascular astrocytes, contributes to the anchoring of ionic channels involved in brain homeostasis and also plays a role in glutamatergic synapses. Dp71 loss strongly aggravate the deficits associated with the loss of Dp427 in patients and lead to severe intellectual disability. Genotype-phenotype relationships need be further specified and it is assumed that beyond deficits severity, the actual nature of cognitive alterations, as well as the presence of sensorial, cognitive, executive and neuropsychiatric disturbances, depend on the specific forms of dystrophin affected by mutations. To study the role of these two dystrophins, we used two mouse models : the mdx mouse that only lacks Dp427, and the Dp71-null mouse that only lacks Dp71. A extensive behavioral study allowed us to better characterize the phenotype associated with the loss of Dp427 and Dp71, detailing integrity of perception and processing of auditory sensory stimuli, of emotional responses and stress reactivity, of learning performance, and of components of executive functions, such like spatial working memory and behavioral flexibility. The work has been completed by collaborative studies aimed at characterizing the role of Dp71 in cortical plasticity and at developing gene therapy approaches to rescue Dp427 function in the mdx mouse. We demonstrate that Dp427 loss perturbs GABAergic functions, stress-induced emotional responses, as well as emotional and long-term memories, without major alterations of sensory and executive functions. We also show that a gene therapy based on systemic injections of antisens oligonucleotides holding specific chemistries and crossing the blood-brain barrier enables Dp427 functional rescue by exon-skipping strategy and alleviates emotional disturbances in mdx mice. The loss of Dp71 has a distinct impact : It alters cortical excitation/inhibition balance and plasticity and disrupt learning, behavioral flexibility and working memory in spatial learning tasks. Our study of these mouse models therefore enabled to clarify the genotype-phenotype relationships and neurobiological bases of this disease, and identified valuable phenotypes to validate treatment efficacy in future brain-targeting preclinical studies.

Les précédents travaux menés au laboratoire avaient permis d’obtenir des lipides cationiques biolabiles dérivés d’un constituant naturel des membranes cellulaires, la DOPC, en masquant temporairement sa charge négative par l’introduction d’un substituant, clivable sous stimuli acide ou enzymatique. Ce concept s’était révélé efficace pour la délivrance, in vitro et in vivo, d’acides nucléiques, avec un impact toxicologique minimisé. Ce doctorat est la transposition de ce système à une approche thérapeutique du cancer, à l’aide de constructions dérivées d’alkylphospholipides (APLs), des lipides antitumoraux. De nombreuses prodrogues biolabiles (pro-APLs) ont été développées à partir de trois APLs prometteurs : miltéfosine, périfosine et érufosine. L’évaluation et l’optimisation de l’activité biologique des pro-APLs ont conduit à des formulations performantes pour la délivrance in vitro d’un ADN thérapeutique TRAIL et la production in situ d’APLs, pour une combothérapie antitumorale. / Previous work in the laboratory had resulted in biolabile cationic lipids derived from a naturally cell membrane component, DOPC, by temporarily masking its negative charge by the introduction of a cleavable substituent, under acidic or enzymatic stimuli. This concept was particularly efficient for the delivery, in vitro and in vivo, of nucleic acids such as DNA plasmid or siRNA, with a minimized toxicological impact for cells. The present study is the transposition of this system to a therapeutic approach to cancer, using constructions derived from alkylphospholipids (APLs), a recent class of antitumor lipids. Biolabile prodrugs (pro-APLs) have been developed from three promising APLs: miltefosine, perifosine and erufosine. The biological evaluation of pro-APLs activity and the optimization of various parameters led to efficient formulations for the in vitro delivery of a therapeutic DNA plasmid, related to TRAIL, and the in situ APLs production for a potential antitumor combotherapy.

Au cours de la méiose, les points chauds de recombinaison sont le siège de la formation de cassures double-brin de l’ADN. Ces dernières sont ensuite réparées par un processus qui, chez de nombreuses espèces, favorise la transmission des allèles G et C : la conversion génique biaisée vers GC (gBGC). L’intensité de cet important distorteur de la ségrégation méiotique varie fortement entre espèces mais les facteurs déterminant son évolution sont toujours inconnus. Nous avons donc voulu quantifier directement le biais de transmission chez la souris et comparer les paramètres dont il dépend avec d’autres mammifères. Dans cette étude, en couplant des développements bioinformatiques à une technique de capture ciblée d’ADN suivie de séquençage haut-débit (capture-seq), nous avons réussi à mettre au point une approche qui s’est révélée 100 fois plus performante pour détecter les événements de recombinaison que les méthodes existant actuellement. Ainsi, nous avons pu identifier 18 821 crossing-overs (COs) et non-crossovers (NCOs) à très grande résolution chez des individus uniques, ce qui nous a permis de caractériser minutieusement la recombinaison chez la souris. Chez cette espèce, les points chauds de recombinaison sont ciblés par la protéine PRDM9 et sont donc soumis à une deuxième forme de conversion génique biaisée (BGC) : le biais d’initiation (dBGC). La quantification du dBGC et du gBGC à partir de nos données nous a permis de mettre en lumière le fait que, au moment où des populations structurées s’hybrident, le gBGC des lignées parentales est propagé par un phénomène d’auto-stop génétique (genetic hitchhiking) provenant du dBGC. Nous avons ensuite pu observer que, chez les souris mâles, seuls les NCOs — et plus particulièrement les NCOs contenant un seul marqueur génétique— contribuent à l’intensité du gBGC. En comparaison, chez l’Homme, à la fois les NCOs et au moins une part des COs (ceux qui présentent des tracts de conversion complexes) distordent les fréquences alléliques. Ceci suggère que la machinerie de réparation des cassures double-brin qui induit le biais de conversion génique (BGC) présente des variations au sein des mammifères. Nos résultats sont aussi en accord avec l’hypothèse selon laquelle une pression de sélection limiterait l’intensité de ce processus délétère à l’échelle de la population. Cela se traduirait par une compensation de la taille efficace de population à de multiples niveaux : par le taux de recombinaison, par la longueur des tracts de conversion et par le biais de transmission. Somme toute, notre travail a permis de mieux comprendre la façon dont la recombinaison et la conversion génique biaisée opèrent chez les mammifères. / During meiosis, recombination hotspots host the formation of DNA double-strand breaks (DSBs). DSBs are subsequently repaired through a process which, in a wide range of species, is biased towards the favoured transmission of G and C alleles: GC-biased gene conversion (gBGC). The intensity of this fundamental distorter of meiotic segregation strongly varies between species but the factors dictating its evolution are not known. We thus aimed at directly quantifying the transmission bias in mice and comparing the parameters on which it depends with other mammals. Here, we coupled capture-seq and bioinformatic techniques to implement an approach that proved 100 times more powerful than current methods to detect recombination. With it, we identified 18,821 crossing-over (CO) and non-crossover (NCO) events at very high resolution in single individuals and could thus precisely characterise patterns of recombination in mice. In this species, recombination hotspots are targeted by PRDM9 and are therefore subject to a second type of biased gene conversion (BGC): DSB-induced BGC (dBGC). Quantifying both dBGC and gBGC with our data brought to light the fact that, in cases of structured populations, past gBGC from the parental lineages is hitchhiked by dBGC when the populations cross. We next observed that, in male mice, only NCOs — and more particularly single-marker NCOs — contribute to the intensity of gBGC. In contrast, in humans, both NCOs and at least a portion of COs (those with complex conversion tracts) distort allelic frequencies. This suggests that the DSB repair machinery leading to gBGC varies across mammals. Our findings are also consistent with the hypothesis of a selective pressure restraining the intensity of the deleterious gBGC process at the population-scale: this would materialise through a multi-level compensation of the effective population size by the recombination rate, the length of conversion tracts and the transmission bias. Altogether, our work has allowed to better comprehend how recombination and biased gene conversion proceed in the mammalian clade

La rhinosinusite chronique (RSC) est une maladie inflammatoire des sinus suffisamment prévalente au Canada et pouvant avoir un impact significatif sur la qualité de vie des patients. Depuis plusieurs années, cette maladie complexe constitue un terrain fertile pour la recherche scientifique. Bien qu’elle soit bien comprise au niveau syndromique, plusieurs mystères persistent quant aux mécanismes physiopathologiques sous-jacents. Ces questionnements pourraient potentiellement expliquer les différences cliniques observées, particulièrement dans les réponses thérapeutiques. Considérant les lacunes persistantes dans la compréhension entière de la maladie, le présent mémoire tente de faire le point sur les endotypes épithéliaux ainsi que sur le pathobiome de la RSC. Dans un premier temps, l’analyse transcriptomique de cellules épithéliales cultivées en laboratoire de patients avec RSC a permis d’identifier deux groupes distincts en termes de marqueurs inflammatoires et de signature épithéliale. Ceci laisse supposer que ces mécanismes physiopathologiques seraient grandement impliqués dans la maladie. Dans un deuxième temps, et dans un objectif exploratoire et de faisabilité, le séquençage d’échantillons de RSC a permis de détecter la présence de virus, laissant présager que ceux-ci pourraient avoir un rôle dans la physiopathologie de la maladie et combler les mystères résiduels dans sa compréhension globale. En conclusion, les endotypes déterminés par le profil d’expression génique permettraient une meilleure classification de la RSC et une meilleure personnalisation des thérapies. De plus, la présence tangible de virus dans la RSC est certainement prometteuse et ouvre une grande porte de recherche. Toutefois, d’autres études seront nécessaires pour mieux caractériser leur nature et leur rôle. / Chronic rhinosinusitis (CRS) is a complex inflammatory disease of the sinuses that is prevalent in Canada and that can significantly affect patients’ quality of life. For several years now, this heterogenous disease have been in the scope of many scientific research. While CRS is clinically well understood, much remains unknown concerning the underlying pathophysiological mechanisms. This could potentially explain the notable clinical differences observed between patients, especially in terms of therapeutic responses. In hope of bridging the gaps in understanding CRS, the present thesis aims to discuss epithelial endotypes as well as the feasibility and potential role of viruses in CRS. Firstly, gene expression profiling revealed two distinct clusters of CRS patients: a group with severe non-Type 2 inflammation and epithelial dysfunction, and a group characterised by moderate non-Type 2 inflammation and epithelial dysfunction. This highlights that these two different mechanisms are involved in the development of CRS. Secondly, and with an exploratory intent, next-generation sequencing and transcriptomic assembly of CRS samples have confirmed the presence of viruses, suggesting that viruses are present in CRS and could possibly play a role in the pathogenesis of this disease, potentially addressing the shortcomings in CRS. To summarize, epithelial endotypes identified by gene expression profiling could aid in better classifying CRS to provide a tailored therapeutic option. The presence of viruses in CRS samples unfolds an interesting chapter in this field. However, larger populations will be required to better characterize the nature of these viruses and to assess their intrinsic role in CRS.

Suite à la pandémie de COVID-19, l’utilisation de l’ARNm en tant qu’agent thérapeutique s’est révélé prometteur pour la lutte contre les maladies infectieuses. Cependant, l’un des principaux défis à surmonter est la nécessité de préserver l’intégrité de l’ARNm contre la dégradation enzymatique qui peut entraver son efficacité thérapeutique. L’utilisation du chitosane comme vecteur de livraison a engendré beaucoup d’intérêt dû à ses propriétés de biocompatibilité, biodégradation et de faible toxicité. Lorsqu’il est associé à l’ARNm, le chitosane forme des nanoparticules grâce à une interaction électrostatique entre la charge positive du chitosane et la charge négative de l’ARNm. Notre laboratoire a synthétisé un nanovecteur composé de CH-DIPEA₅₃-PEG₁.₁₅ avec des modifications incorporées sous forme d’ajout de groupes DIPEA et PEG. Ces modifications sont conçues pour augmenter la stabilité et prolonger la demi-vie des nanoparticules. Le but de notre projet est de développer une nouvelle nanoplateforme vaccinale basée sur l’utilisation de nanoparticules CH-DIPEA₅₃-PEG₁.₁₅/ARNm qui permettra de protéger l’ARNm contre la dégradation enzymatique et à faciliter sa livraison à son site d’action in vitro. Les nanoparticules CH-DIPEA₅₃-PEG₁.₁₅/ARNm ont été caractérisées par DLS pour mesurer la taille ainsi que le potentiel zêta. Ensuite, des essais ont été réalisés sur la complexation, l’encapsulation et la libération de l’ARNm du polymère CH-DIPEA₅₃-PEG₁.₁₅. Ces derniers ont montré une complexation totale à ratio N/P 3 :1 ainsi qu’une efficacité d’encapsulation de 95%. Par la suite, des évaluations de cytotoxicité ont été effectuées sur trois lignées cellulaires : les Caco-2, RAW 264.7 et HEKa. Les nanoparticules ont montré une viabilité cellulaire de 98.58 ± 8.1%, 91.52 ± 4.25% et 97.65 ± 4.3% respectivement. Les essais de stabilité ont montré que ces nanoparticules étaient capables de protéger l’ARNm contre la dégradation par les RNases pendant une période allant jusqu’à 48h. Enfin, des études de transfection ont été confirmées par microscopie confocale. Nos nanoparticules ont montré une bonne capacité de protection ainsi qu’une efficacité d’internalisation dans les trois lignées cellulaires. Cependant, il n’a pas été possible d’observer l’expression protéique de la protéine EGFP correspondant à l’ARNm utilisé. On suggère que c’est dû aux fortes interactions entre le chitosane et l’ARNm qui empêche sa libération une fois qu’il est internalisé. Il est donc nécessaire de poursuivre les recherches pour améliorer les modifications apportées au vecteur CH-DIPEA₅₃-PEG₁.₁₅ afin de trouver un équilibre entre la protection de l’acide nucléique et sa libération. / Due to the COVID-19 pandemic, the use of mRNA as a therapeutic agent in fighting infectious illnesses has shown a great potential. However, one of the key hurdles to overcome is the requirement to protect mRNA against enzymatic degradation, which might impair its therapeutic efficacy. Because of its biocompatibility, biodegradability, and low toxicity, the use of chitosan as a delivery vector has gained significant interest. When associated with mRNA, chitosan forms nanoparticles through electrostatic interaction between the positive charge of chitosan and the negative charge of mRNA. Our laboratory has synthesized a nanocarrier composed of CH-DIPEA₅₃-PEG₁.₁₅ with incorporated modifications in the form of DIPEA and PEG groups. These modifications are intended to improve nanoparticle stability and lengthen their half life. Our project’s objective is to create a novel vaccine nanoplatform based on the use of CH-DIPEA₅₃-PEG₁.₁₅/mRNA nanoparticles that will protect mRNA from enzymatic degradation and enable its delivery to its in vitro location. DLS was used to determine the size and zeta potential of the CH-DIPEA₅₃-PEG₁.₁₅/mRNA nanoparticles. Following that, experiments on the complexation, encapsulation and release of mRNA from CH-DIPEA₅₃-PEG₁.₁₅ were performed. These experiments showed full complexation at N/P ratio of 3:1 and and an encapsulation efficiency of 95%. Following that, three cell lines were tested for cytotoxicity: Caco-2, RAW 264.7, and HEKa. The cell viability of nanoparticles was 98.58 ± 8.1%, 91.52 ± 4.25% and 97.65 ± 4.3%, respectively. Stability tests showed that these nanoparticles could protect mRNA from RNase degradation for up to 48 hours. Finally, transfection studies were confirmed by confocal microscopy. In all three cell lines, our nanoparticles showed good protection and internalization efficiency. However, it was not possible to observe the protein expression of the EGFP protein corresponding to the used mRNA. It is suggested that this is due to strong interactions between chitosan and mRNA, preventing its release once internalized. As a result, more study is required to optimize the modifications made to the CH-DIPEA₅₃-PEG₁.₁₅ vector in order to achieve a balance between nucleic acid protection and release.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Les ARN produits chez la bactérie Escherichia coli sont généralement amenés vers deux voies distinctes. Le plus souvent, l' ARN naissant se dissocie de la matrice, durant sa synthèse, afin d'être fonctionnel. Celui-ci peut alors servir de matrice pour les ribosomes qui le traduisent en polypeptides, ou alors il peut servir de matériau de structure dans la composition des ribosomes. Le second type de transcrit trouve son utilité lorsque l' ARN demeure attaché à la matrice ADN afin d'amorcer la réplication. Ce type d' ARN est très court et il est immédiatement utilisé comme amorce par la polymérase ADN de la cellule. Récemment, il a été démontré que les hybrides ARN­ADN peuvent aussi être impliqués dans la recombinaison. Plusieurs travaux menés sur la formation de ces structures hybrides indiquent que celle-ci dépend généralement du surenroulement de l' ADN et de certains paramètres de transcription. La formation d'hybrides ARN-ADN durant la transcription démontre bien que la compréhension des mécanismes de transcription serait évidemment incomplète sans y inclure la topologie de l' ADN. L'étude de la transcription révèle un mécanisme dynamique très complexe, finement régulé à plusieurs niveaux, tant à l'initiation, l'élongation, que la terminaison. La topologie de l' ADN, ainsi que les topoisomérases ADN ont été caractérisées comme des modulateurs importants dans toutes les étapes de l'expression génique, allant de la reconnaissance spécifique des promoteurs jusqu'au déplacement de l' ARN naissant ou de son attachement à la matrice ADN. De plus, la transcription est l'évènement génétique le plus fréquent dans une cellule. Selon le travail présenté ici, un des rôles essentiels de la topoisomérase I semble être l'inhibition de la formation d'hybrides ARN-ADN durant la transcription chez Escherichia coli. Ceux-ci semblent survenir principalement au niveau des opérons ribosomaux. Le couplage entre la traduction et la transcription, chez les ARNm, aide à prévenir la formation d'hybrides ARN-ADN. La croissance à basse température favorise l'appariement de l' ARN à l' ADN. La suite des travaux décrits propose que le rôle essentiel de la topoisomérase I chez Escherichia coli n'est pas la relaxation du surenroulement global de l' ADN, mais plutôt l'élimination du surenroulement local généré durant la transcription. Ce surenroulement semble responsable de l'initiation de la formation de structures hybrides ARN-ADN, alors que la gyrase provoquerait leur élongation. Ces observations permettent de suggérer de nouveaux rôles pour la topoisomérase I et la gyrase chez les bactéries.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.