O presente trabalho teve como objetivo o estudo da variabilidade genética e dos fatores de virulência de isolados de U. diversum. As cepas foram submetidas a sequenciamento dos genes da urease e 16S rRNA e a testes para verificar os fatores de virulência: cápsula, fosfolipase C, IgAse e adesão e invasão. A análise do sequênciamento parcial do gene 16S rRNA resultou na presença de polimorfismos em 44 posições da seqüência, que diferenciou as amostras em sete grupos. Em relação aos fatores de virulência, os dados mostraram que as cepas estudadas apresentaram uma camada densa ao redor da membrana celular dos microrganismos e atividade de fosfolipase C. No entanto, não foi observado a atividade de IgAse nas cepas. Em relação a atividade de invasão, observou-se que os ureaplasma estudados puderam ser visualizados no interior de células Hep-2 com apenas um minutos de infecção, sendo observados em uma região perinuclear, mas não no interior do núcleo. Além disto, pode verificar que entre 1% a 10% dos ureaplasmas estudos penetraram na célula pelo teste da gentamicina. / The aim of the present study was the study of genetic variability and virulence factors of U. diversum clinical isolates. The strains were submitted to sequencing for 16S rRNA and urease genes. Moreover, the strains were analyzed to the virulence factors: capsule, phospholipase C, IgA protease and adhesion and invasion into Hep-2 cells. The sequencing of parcial 16S rRNA gene showed polymorphic patterns into 44 positions. These polymorphisms clustered the strains in seven groups. For the virulence factors, ureaplasma cells showed a dense-stained external capsule-like structure surrounding the cell membrane. A high level of phospholipase C activity was also detected in 31 studied ureaplasma. However, no strains showed IgA protease activity. For the invasion assay, the isolates and strains used were detected inside the cells after infection of one minute. The invasions of the ureaplasmas surrounded the nuclear region but were not observed inside the nuclei. The gentamicin invasion assay detected that 1% to 10% of studied ureaplasmas were inside the infected cells.

Água purificada para uso em ambientes de saúde e preparação industrial de produtos médico-odonto-hospitalar deve ter uma carga reduzida de contaminação microbiológica e pirogênio. As amostras analisadas foram coletadas em 13 (treze) diferentes estágios de um sistema de purificação de água, sendo isoladas 78 colônias. Para a identificação dos microrganismos foram utilizados: (i) identification system for non-enteric gram-negative rods (api 20 NE, bio Mérieux) e (ii) identification system for enteric and nonfermenter (BBL crystal, Becton Dickinson). De acordo com os resultados pode-se observar uma maior prevalência para Pseudomonas aeruginosa 32,05% (25 colônias dentre as 78 isoladas); Pseudomonas picketti 23,08% (18); Pseudomonas vesiculares 12,82% (10); Pseudomonas diminuta 11,54% (09); Flavobacterium aureum 6,42% (05); Pseudomonas fluorescences 5,13% (04); Acinetobacter Iwoffi 2,56% (02); Pseudomonas putida 2,56% (02); Pseudomonas alcaligenes 1,28% (01); Pseudomonas paucimobilis 1,28% (01), Flavobacterium multivorum 1,28% (01). A eficácia dos agentes sanitizantes utilizados para higienização dos diferentes pontos foi determinada pela concentração inibitória mínima (CIM) e tempo de redução decimal (valor D). Como o hipoclorito de sódio é largamente utilizado na higienização do tanque de água de alimentação, tanque de estocagem da água purificada e nas linhas de distribuição aos pontos de uso, este foi testado frente a todos os microrganismos sendo observado menor resistência para Escherichia coli ATCC 25922 (0.06%=600mg/L), quando comparada a P. aeruginosa isolada e identificada (O,25%=2500mg/L). O tempo de redução decimal (Valor D) da Escherichia coli ATCC 25922 foi de 4 minutos e o valor D da P. aeruginosa isolada e identificada e isolada in house foi de 9 minutos. / The samples of water, which were taken directly from the public distribution water tank and at twelve different stages of a typical purification system, were analyzed for the identification of isolated bacteria. The efficacy of the chemical sanitizers used in the stages of the system, over the isolated and identified bacteria in the sampling water, was valuated by the minimum inhibitory concentration (MIC and decimal reduction time (D-values). According to the miniature kits used in the identification, there was a prevalence of isolation by P. aeruginosa 32,05 % , P. picketti (Ralstonia picketti) 23,08%, P. vesiculares 12,82%, P. diminuta 11.54%, F.aureum 6,42%, P.fluorescens 5,13%, A.lowffi 2,56%, P.putida 2,56%, P. alcaligenes 1,28%, P.paucimobilis 1,28%, and F. multivorum 1,28%. The efficacy of the agents varied with the concentration and time of contact to reduce a decimal logarithmic (loglO) population (n cycles): (i) 0.5% citric acid (0= 4 min) for 30 min reduced n=7 cycles; (ii) 0.5% chloridric acid (0= 6 min) for 30 min reduced n= 4 cycles; (iii) 70% alcohol (0= 9 min) for 1.0 min (n=0.2 cycles); (iv) 0.5% sodium bisulphite (0= 6 min) for 90 min (n=14 cycles); (v) 0.4% sodium hydroxide (0= 8 min) for 30 min (n=3.0 cycles); (vi) 0.5% sodium hypochlorite (0=9 min) for 180 min (n = 19 cycles); (vii) mixture of hydrogen peroxide (2,2%) plus peracetic acid (0.45%), 0= 6 min, contact time of 180 min, reduced n = 32 cycles of the population. The sterility assurance level (SAL) of 10-6 was attained for the 0.5% sodium hypochlorite solution applied in the water purified storage tank and distribution loop; and for the mixture of H2O2 plus peracetic acid, used in the reverse osmose and in the deionizator systems.

Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac), uma bactéria gram negativa, é a causadora da doença Cancro Cítrico que ocasiona enormes prejuizo na citricultura brasileira. Com o seqüenciamento do genoma deste patógeno foram encontradas inúmeras sequências codificadores com funções desconhecidas. Assim com a finalidade de estudos funcionais do genoma de Xac, foram gerados mutantes randômicos usando o transposon EZ::TN, que induziu disrupção aleatoria de seus genes com o intuito de avaliar que genes inativados afetam a patogenicidade da bactéria. Para o mapeamento do local de inserção do transposon foi desenvolvida uma metodologia baseada na técnica de PCR touchdown utizando oligonucleotídeos semidegenerados. A confiabilidade deste novo método foi comprovada através do mapeamento por Southem blot de alguns mutantes. Conseguiu-se mapear 90 mutantes randômicos com este método. Os testes de patogenicidade em citros mostraram mutantes com sua patogenicidade afetada observando-se variações nos sintomas da doença. Mutantes interessantes contendo uma ORF hipotética inativada ou tendo uma inserção num espaço intergênico foram achadas, sendo também detectados alguns mutantes com nocaute de genes nos seus plasmídeos pXac33 e pXac66. / Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac), a gram-negative bacteria, is the causer of the Citrus Canker disease that produces enormous losses to the brazilian citrus sector. Many coding sequences with unknown functions were found in the genome sequence of this pathogen. Therefore, with the goal of functional studies of Xac\'s genome, random mutants using the EZ::TN transposon, have been generated, which carry aleatory disruptions of their genes, with the aim of evaluating inactived genes that potentially affect bacterial pathogenicity. A method based in the PCR touchdown technique using semidegenerate primers was developed for the mapping of the transposon insertion site. The reliability of this new method was tested by means of mapping some mutants using Southern blot. Ninety random mutants were mapped with this method. The pathogenicity tests in citrus showed mutants with their pathogenicity affected and variations in the disease symptoms were observed. Interesting mutants containing an inactive hypothetical ORF or with an insertion in intergenic regions have been found, and also some mutants with inactivated genes in their plasmids pXac33 and pXac66 were detected.

Água purificada para uso em ambientes de saúde e preparação industrial de produtos médico-odonto-hospitalar deve ter uma carga reduzida de contaminação microbiológica e pirogênio. As amostras analisadas foram coletadas em 13 (treze) diferentes estágios de um sistema de purificação de água, sendo isoladas 78 colônias. Para a identificação dos microrganismos foram utilizados: (i) identification system for non-enteric gram-negative rods (api 20 NE, bio Mérieux) e (ii) identification system for enteric and nonfermenter (BBL crystal, Becton Dickinson). De acordo com os resultados pode-se observar uma maior prevalência para Pseudomonas aeruginosa 32,05% (25 colônias dentre as 78 isoladas); Pseudomonas picketti 23,08% (18); Pseudomonas vesiculares 12,82% (10); Pseudomonas diminuta 11,54% (09); Flavobacterium aureum 6,42% (05); Pseudomonas fluorescences 5,13% (04); Acinetobacter Iwoffi 2,56% (02); Pseudomonas putida 2,56% (02); Pseudomonas alcaligenes 1,28% (01); Pseudomonas paucimobilis 1,28% (01), Flavobacterium multivorum 1,28% (01). A eficácia dos agentes sanitizantes utilizados para higienização dos diferentes pontos foi determinada pela concentração inibitória mínima (CIM) e tempo de redução decimal (valor D). Como o hipoclorito de sódio é largamente utilizado na higienização do tanque de água de alimentação, tanque de estocagem da água purificada e nas linhas de distribuição aos pontos de uso, este foi testado frente a todos os microrganismos sendo observado menor resistência para Escherichia coli ATCC 25922 (0.06%=600mg/L), quando comparada a P. aeruginosa isolada e identificada (O,25%=2500mg/L). O tempo de redução decimal (Valor D) da Escherichia coli ATCC 25922 foi de 4 minutos e o valor D da P. aeruginosa isolada e identificada e isolada in house foi de 9 minutos. / The samples of water, which were taken directly from the public distribution water tank and at twelve different stages of a typical purification system, were analyzed for the identification of isolated bacteria. The efficacy of the chemical sanitizers used in the stages of the system, over the isolated and identified bacteria in the sampling water, was valuated by the minimum inhibitory concentration (MIC and decimal reduction time (D-values). According to the miniature kits used in the identification, there was a prevalence of isolation by P. aeruginosa 32,05 % , P. picketti (Ralstonia picketti) 23,08%, P. vesiculares 12,82%, P. diminuta 11.54%, F.aureum 6,42%, P.fluorescens 5,13%, A.lowffi 2,56%, P.putida 2,56%, P. alcaligenes 1,28%, P.paucimobilis 1,28%, and F. multivorum 1,28%. The efficacy of the agents varied with the concentration and time of contact to reduce a decimal logarithmic (loglO) population (n cycles): (i) 0.5% citric acid (0= 4 min) for 30 min reduced n=7 cycles; (ii) 0.5% chloridric acid (0= 6 min) for 30 min reduced n= 4 cycles; (iii) 70% alcohol (0= 9 min) for 1.0 min (n=0.2 cycles); (iv) 0.5% sodium bisulphite (0= 6 min) for 90 min (n=14 cycles); (v) 0.4% sodium hydroxide (0= 8 min) for 30 min (n=3.0 cycles); (vi) 0.5% sodium hypochlorite (0=9 min) for 180 min (n = 19 cycles); (vii) mixture of hydrogen peroxide (2,2%) plus peracetic acid (0.45%), 0= 6 min, contact time of 180 min, reduced n = 32 cycles of the population. The sterility assurance level (SAL) of 10-6 was attained for the 0.5% sodium hypochlorite solution applied in the water purified storage tank and distribution loop; and for the mixture of H2O2 plus peracetic acid, used in the reverse osmose and in the deionizator systems.

Infecção do Trato Urinário (ITU) é o segundo tipo de infecção bacteriana mais comum em crianças. Nesse estudo amostras de urina de 6012 pacientes pediátricos foram analisadas, a prevalência de ITU foi determinada, os uropatógenos foram identificados e o perfil antimicrobiano dos mesmos foi determinado. Os resultados mostraram que a prevalência de ITU varia de acordo com o sexo e a idade do paciente. Bactérias Gram-negativas foram responsáveis por 89 % de todos os casos de ITU e Escherichia coli foi a espécie mais prevalente. Os uropatógenos foram resistentes a ampicilina 63 %, a nitrofurantoina 37 % e ao trimethoprim-sulfamethoxazole 28 %. Todavia, 99 % deles foram sensíveis a cefalexina e 96 % ao cloranfenicol. Resultados obtidos com a caracterização de 90 isolados de E. coli, mostraram que todas as amostras foram positivas para os marcadores fimA e fimH, 53 % para pap, 32 % para sfa, 10 % para o marcador genético da toxina pic e 29 % foram capazes de produzir hemolisina-a. Esses isolados se distribuíram entre os grupos filogenéticos da seguinte maneira: B2 42 %, D 25 %, A 21 % e B1 11 %. Dessas amostras 19 % não foram tipáveis (ONT), 15,56 % pertenceram ao sorogrupo O2 e 12,22 % aos sorogrupos O6 e OR. A maioria dos isolados de E. coli aderiu às células epiteliais, poliestireno e PVC. / Urinary Tract Infection (UTI) is the second most common type of bacterial infection in children. In this study, 6012 urine samples from pediatric patients were analyzed, the prevalence of UTI was determined, the uropathogens were identified and their antimicrobial profile was determined. The results have shown that the prevalence of UTI varies according to the sex and age of the patient. Gram negative bacteria were responsible for 89 % of all cases of UTI and E. coli was the most prevalent species. The uropathogens were resistant to: ampicillin 63 %, nitrofurantoin 37 % and trimethoprim-sulfamethoxazole 28 %. However, 99 % of them were sensitive to cephalexin and 96 % to chloramphenicol. Results obtained with the characterization of 90 isolates of E. coli showed that all of them were positive for fimA and fimH, 53 % were positive for pap, 32 % were positive for sfa, 10 % were positive for the genetic marker of pic and 29 % were able to produce hemolysin-a. These isolates were distributed between the phylogenetic groups as follows: B2 42 %, D 25 %, A 21 % and B1 11 %. Nineteen percent of these samples were untypeable (ONT), 15.56 % belonged to O2 serogroup and 12,22 % belonged to the O6 and OR serogroups. Most E. coli isolates were able to adhere to epithelial cells, polystyrene and PVC.

Xylella fastidiosa (Xf) e Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) são gama proteobactérias gram negativas, responsáveis por grandes perdas econômicas no setor citrícola brasileiro. Com seus genomas seqüenciados e anotados, fizemos uma análise comparativa entre suas composições gênicas e seus ambientes de vida. Xac apresenta um genoma de 5.2Mb contra 2.7Mb de Xf Isto reflete no número de genes (4432 contra 2838) que acabam refletindo em uma maior complexidade metabólica de Xac, caracterizada por: uma extensa gama de genes de degradação de parede celular (44), biossíntese de proteases (92), genes de funções regulatórias (296), um completo metabolismo energético (209), quimiotático (inexistente em Xf) e secretório (presença dos tipos I, II, III e IV , sendo o II em duplicata), além de um grande número de genes envolvidos com captação de ferro (65), fazem de Xac um patógeno de alto poder invasivo e de rápida propagação e virulência Em contrapartida, Xf por não possuir a complexidade supracitada, parece ter seus recursos adaptados ao ambiente em que vive, como por exemplo um alto número de genes envolvidos com biossíntese de pili, que associado à biossíntese de goma, favorecem sua adesão nas glândulas salivares do vetor (cigarrinha) e a formação de aglomerados celulares responsáveis pelo entupimento dos vasos que levam às patologias decorrentes do evento. / Xylella fastidiosa (Xf) and Xanthomonas axonopodis pv. citri Xac are gram negative gamma proteobacteria, responsible for great economical losses in the Brazilian citrus sector. With their sequenced and annotated genomes, we have done a comparative analysis between their genetic composition and life habitat. Xac displays a genome of 5.2Mb against 2. 7Mb of Xf. This reflects the number of genes (4432 against 2838) which results in a greater metabolic complexity of Xac, characterized by: a wide range of genes of cell wall degradation (44), biosynthesis of proteases (92), many genes of regulatory functions (296), a complex energy metabolism (209), chemotatic (absent in Xf) and secretory systerns (presence of types I, II, III and IV, type II in duplicate), besides a great number of genes involved in iron acquisition (65), make of Xac a pathogen of high invasive power and of quick spreading and virulence. In the other hand Xf, due to the lack of the complexity just cited, seems to have its resources adapted to the habitat in which it lives, as for example a large number of genes involved in pili biosynthesis, that associated with gum biosynthesis, favor its adhesion to the salivary glands of the vector (sharpshooter) and the formation of cellular agglomerations responsible for the blockage of the vessels which leads to the pathologies resulted from this event.

O presente trabalho teve como objetivo o estudo da variabilidade genética e dos fatores de virulência de isolados de U. diversum. As cepas foram submetidas a sequenciamento dos genes da urease e 16S rRNA e a testes para verificar os fatores de virulência: cápsula, fosfolipase C, IgAse e adesão e invasão. A análise do sequênciamento parcial do gene 16S rRNA resultou na presença de polimorfismos em 44 posições da seqüência, que diferenciou as amostras em sete grupos. Em relação aos fatores de virulência, os dados mostraram que as cepas estudadas apresentaram uma camada densa ao redor da membrana celular dos microrganismos e atividade de fosfolipase C. No entanto, não foi observado a atividade de IgAse nas cepas. Em relação a atividade de invasão, observou-se que os ureaplasma estudados puderam ser visualizados no interior de células Hep-2 com apenas um minutos de infecção, sendo observados em uma região perinuclear, mas não no interior do núcleo. Além disto, pode verificar que entre 1% a 10% dos ureaplasmas estudos penetraram na célula pelo teste da gentamicina. / The aim of the present study was the study of genetic variability and virulence factors of U. diversum clinical isolates. The strains were submitted to sequencing for 16S rRNA and urease genes. Moreover, the strains were analyzed to the virulence factors: capsule, phospholipase C, IgA protease and adhesion and invasion into Hep-2 cells. The sequencing of parcial 16S rRNA gene showed polymorphic patterns into 44 positions. These polymorphisms clustered the strains in seven groups. For the virulence factors, ureaplasma cells showed a dense-stained external capsule-like structure surrounding the cell membrane. A high level of phospholipase C activity was also detected in 31 studied ureaplasma. However, no strains showed IgA protease activity. For the invasion assay, the isolates and strains used were detected inside the cells after infection of one minute. The invasions of the ureaplasmas surrounded the nuclear region but were not observed inside the nuclei. The gentamicin invasion assay detected that 1% to 10% of studied ureaplasmas were inside the infected cells.

Bordetella pertussis e Bordetella parapertussis são os principais agentes causadores da coqueluche no homem. O óxido nítrico é fundamental para o controle de diversos processos fisiopatológicos. Neste trabalho analisamos sinais moleculares envolvidos na produção de NO em macrófagos derivados de medula óssea murina (BMDMO) infectadas por Bpertussis e Bparapertussis. Nossos resultados mostraram que BMDMO de C57BL/6 estimulados com Bpertussis não sintetizaram níveis significativos de nitrito, ao contrário da infecção com Bparapertussis. BMDMO de C57BL/6 infectados por Bpertussis e Bparapertussis produziram níveis elevados de arginase e de TGFb e esta produção foi dependente de TLR4, porém a produção de NO pelos BMDMO de C3H/HeJ infectados com Bparapertussis foi independente deste receptor. A adição exógena de PT em BMDMO infectados com Bparapertussis reduziu a quantidade de NO sintetizada. Concluímos que TGFb e arginase contribuem para o controle da produção de NO durante a infecção in vitro de BMDMO com Bpertussis e este mecanismo depende de LPS envolvendo TLR4 e PT. / Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis are the main etiologic causes of human whooping cough. Nitric oxide (NO) is crucial for several physiopathologic events. Herein we analyzed the molecular signals required for NO production by murine bone marrow-derived macrophages (BMDM) infected with Bpertussis or Bparapertussis. Our data show that BMDM obtained from C57Bl/6 mice was not able to produce measurable levels of nitrite when stimulated with Bpertussis while infection of these cells with Bparapertussis induced high levels of nitrite. Arginase and TLR4-dependent TGF-b were produced in response to infection with either Bpertussis or Bparapertussis. NO production by BMDM obtained from C3H/HeJ mice occurred after Bparapertussis infection in the absence of TLR4. Addition of pertussis toxin to the C57Bl/6 BMDM cultures infected with Bparapertussis decreased NO levels. In conclusion, TGF-b and arginase play a role controlling NO production by BMDM during in vitro infection by Bpertussis. This effect depends on the presence of LPS-TLR4 and PT signaling pathways.

Fímbrias do tipo IV estão associadas a diversos fenótipos em bactérias gram-negativas, e o presente estudo consistiu na caracterização da fímbria Pil e investigação de seu papel na adesão bacteriana de isolados de EPEC atípica. Por PCR e RT-PCR foram investigadas a presença e a funcionalidade do operon Pil e os resultados demonstraram que este está sendo transcrito somente nos isolados BA558 e BA956. Os genes pilS e pilV foram clonados em vetor de expressão para obtenção das proteínas Pil recombinantes e produção de anticorpos policlonais. A análise qualitativa dos testes de inibição da adesão utilizando os soros anti-PilS e anti-PilV juntos demonstraram que o isolado BA558 apresentou mudança de fenótipo de adesão. Esses resultados nos permitem concluir que o operon Pil está funcional em BA558 e BA956, e a expressão da fímbria Pil nessas cepas não está relacionada à formação de biofilme e autoagregação, porém a proteína fimbrial PilS juntamente com a adesina PilV parecem exercer uma função acessória importante na interação de BA558 às células HEp-2. / Type IV fimbriae are associated with several phenotypes in gram-negative bacteria. The aim of this study was the characterization of the Pil fimbria and its role in the interaction of atypical EPEC isolates in bacterial adhesion. Using PCR and RT-PCR, we investigated the presence and functionality of the pil operon genes. The results showed that these genes are transcribed only in the BA558 and BA956 isolates. The pilS and pilV genes were cloned into an expression vector for recombinant proteins and polyclonal antibodies production. Qualitative analysis of the adherence inhibition assays using both rabbit sera changed to localized-like the phenotype of BA558 isolate adhesion. Together, these results allow us to conclude that the Pil operon is functional only in the BA558 and BA956 isolates and that the expression of Pil fimbriae in aEPEC is not related to biofilm formation and autoaggregation but, the fimbrial PilS protein together with PilV adhesin seem to play an important accessory function in the interaction between the BA558 and epithelial cells in vitro.

Graduation date: 2004