Les CDK/cyclines jouent un rôle majeur dans la progression du cycle cellulaire et dans le maintien de la prolifération des cellules cancéreuses, constituant ainsi des biomarqueurs clés et des cibles pharmacologiques attractives. Plus particulièrement, l’activité de CDK4/cycline D, kinase responsable de la progression de la phase G1 et de la transition G1/S, est dérégulée dans de nombreux cancers dont le mélanome. Cette hyperactivation est associée à des mutations, à l’amplification ou à la surexpression de CDK4, cycline D, p16INK4a ou encore pRb.Comme aucune approche sensible et directe n’existe pour évaluer l’activité de CDK4/cycline D dans des conditions physiologiques et pathologiques, le premier objectif de ma thèse a consisté à développer un biosenseur fluorescent permettant d’étudier cette kinase in vitro et in cellulo. Une fois caractérisé et validé in vitro, le biosenseur a été appliqué à la détection d’altérations de CDK4/cycline D dans des biopsies de peau humaine et de xénogreffes de mélanome dans des essais fluorescents d’activité kinase, ainsi que dans des cellules cancéreuses vivantes par microscopie de fluorescence et vidéo microscopie.Par ailleurs, peu d’inhibiteurs sont actuellement disponibles pour inhiber CDK4/cycline D et la plupart d’entre eux ciblent la poche de fixation de l’ATP. C’est pourquoi le second objectif de ma thèse a consisté à identifier des inhibiteurs non compétitifs de l’ATP, soit par élaboration rationnelle de peptides, soit par criblage de petites molécules. A cette fin, deux biosenseurs fluorescents ont été développés qui permettent d’identifier respectivement des composés ciblant l’interface entre CDK4 et cycline D ou des inhibiteurs allostériques capables de perturber la dynamique conformationnelle de CDK4. Des essais de criblage par fluorescence réalisés avec ces biosenseurs ont conduit à l’identification de touches qui ont été validées et caractérisées in vitro et dans des essais de prolifération cellulaire, et qui constituent des candidats prometteurs pour une chimiothérapie sélective du mélanome. / CDK/cyclins play a central role in coordinating cell cycle progression, and in sustaining proliferation of cancer cells, thereby constituting established cancer biomarkers and attractive pharmacological targets. In particular, CDK4/cyclin D, which is responsible for coordinating cell cycle progression through G1 into S phase, is a relevant target in several cancers including melanoma, associated with mutation of CDK4, cyclin D, p16INK4a and pRb.As there are no sensitive and direct approaches to probe CDK4/cyclin D activity in physiological and pathological conditions, the first goal of my thesis has consisted in engineering a fluorescent biosensor to probe this kinase in vitro and in cellulo. Once characterized and validated in vitro, the biosensor was applied to detect CDK4/cyclin D alterations in biopsies from human skin and melanoma xenografts in fluorescence-based activity assays, and in living cancer cells by fluorescence microscopy and timelapse imaging.Moreover, only few inhibitors are currently available to target CDK4/cyclin D and most of them bind the ATP pocket. As such, the second major goal of my thesis project has consisted in identifying non-ATP competitive inhibitors, either through rational design of peptides or by screening small molecule libraries. To this aim, two fluorescent biosensors were engineered which discriminate compounds that target the interface between CDK4 and cyclin D, or that perturb the conformational dynamics of CDK4, respectively, from ATP-pocket binding compounds. Fluorescence-based screening assays performed with these biosensors lead to identification of hits, which were validated and characterized in vitro and in cell proliferation assays, and which constitute promising candidates for selective chemotherapy in melanoma.

En milieu forestier, la décomposition de la matière organique d’origine végétale et son assimilation par les microorganismes sont des processus essentiels au bon fonctionnement des sols et du cycle du carbone. Les mécanismes impliqués dans ces phénomènes de dégradation sont fortement contrôlés par les champignons saprotrophes qui sécrètent de nombreuses enzymes hydrolytiques afin d’accéder à leur principale source de nutriments qui se trouve sous la forme de polysaccharides (cellulose et hémicelluloses). L’hydrolyse enzymatique de ces polymères végétaux engendre une grande diversité de composés de faible poids moléculaire (mono- et oligosaccharides). Ces molécules pénètrent dans la cellule fongique via des systèmes de transporteurs membranaires dont la présence/absence et la spécificité de substrat contribuent à la versatilité métabolique de ces microorganismes du sol. La nature de l’essence forestière affecte fortement la diversité et la composition des communautés fongiques. Dans ce contexte, nous avons émis l’hypothèse que les communautés fongiques sélectionnées par les différentes essences forestières diffèrent entre elles par la diversité des mécanismes qu’elles mettent en place lors du processus de décomposition de la matière organique d'origine végétale et lors du transport des produits de dégradation ; et que de ce fait chaque communauté fongique est spécifiquement adaptée à la nature de la litière produite par l’espèce végétale considérée. Par des approches de séquençage haut-débit d’amplicons générés à partir d’ADNc environnementaux, nous avons analysé la diversité des transcrits codant des protéines fongiques impliquées à la fois dans la dégradation des polysaccharides végétaux et dans le transport des sucres issus de cette hydrolyse enzymatique au sein de sols localisés sous des forêts de hêtres et d’épicéas. L’analyse des données obtenues a mis en évidence des transcrits jusqu’alors inconnus et spécifiquement retrouvés pour plus 80% d’entre eux sous l’un des deux couverts végétaux conduisant ainsi à un effet significatif de l’essence forestière sur la composition des gènes exprimés par les communautés fongiques. Des transporteurs potentiellement spécifiques du mannose ont été détectés, pour la première fois, sous la forêt d’épicéas par une approche de crible fonctionnel dans la levure de banques d’ADNc environnementaux. Or, cette essence forestière est connue pour posséder d’importantes quantités de mannose au niveau de ses hémicelluloses. Les résultats obtenus au cours de cette thèse soulignent l’importance d’étudier la diversité fonctionnelle des communautés fongiques pour comprendre l’impact du couvert végétal sur leur composition et le fonctionnement des écosystèmes forestiers / The degradation of plant biomass is an essential process for the proper functioning of forest soils and terrestrial carbon cycling. Mechanisms involved in these processes are strongly controlled by saprotrophic fungi which secrete several hydrolytic enzymes to access at their primary nutrient sources found under the form of polysaccharides (cellulose and hemicelluloses). Enzymatic hydrolysis of plant polymers releases a high diversity of low molecular weight compounds (mono- and oligosaccharides). These molecules enter in fungal cell using transmembrane transporter systems. Consequently, the presence/absence and the substrate specificity of these transporters might contribute to the metabolic versatility of soil fungi. Several studies have demonstrated that tree species strongly affect diversity and composition of fungal communities. In this context, we hypothesized that the fungal communities selected by the different tree species expressed specific lignocellulolytic enzymes and sugar transporters; and thereby each fungal community was specifically adapted to the nature of litter produced by the tree species considered. We assessed, by the high-throughput sequencing of gene-fragments amplified from soil cDNA, the impact of tree species (Beech vs Spruce) on the diversity of genes encoding either lignocellulolytic enzymes or sugar porters expressed by soil fungi in two mono-specific forests. Our results revealed that most detected genes, encoding either lignocellulolytic enzymes or sugar transporters, have an unknown origin and are specifically found (for more than 80% of them) in one of the two forest soils. This work showed a significant “tree species effect” on the composition of functional genes expressed by soil fungi and suggests that beyond the species level, functional diversity of fungal communities must be addressed to better understand ecosystem functioning. Moreover, by using a functional metatranscriptomic approach, we identified functional transporter sequences differing with respect to their substrate specificities. From a spruce cDNA library, and for the first time, we identified high affinity or mannose specific transporters. Coincidently, as opposed to beech, spruce is indeed a tree species with a large proportion of mannose in its hemicelluloses

L'ovocyte se développe au sein d'un follicule, en contact étroit avec des cellules d'origine somatique, les cellules de cumulus (CC). Ces deux types cellulaires communiquent entre eux via des jonctions intercellulaires, permettant ainsi la régulation et la coordination du métabolisme pendant le développement et la maturation de l'ovocyte. Notre hypothèse est que l'expression et la régulation des gènes dans les CC joue un rôle crucial dans des fonctions essentielles pour la croissance de l'ovocyte et l'acquisition de sa compétence. Mes travaux de thèse comportent deux parties. Dans la première partie nous avons utilisé le séquençage haut débit pour examiner le répertoire des microARN (communément appelés miRNA) dans les cellules de cumulus et dans l'ovocyte. Les miRNA, séquences d'ARN non codantes dont la longueur varie entre 19 et 25 nucléotides, ont émergé récemment comme régulateurs majeurs de nombreux processus biologiques, dont le vieillissement. Nous avons identifié 32 miRNA spécifiquement dans les cellules de cumulus humains et seulement 3 dans l'ovocyte MII. Dans la seconde partie de nos travaux, nous avons analysé l'impact de l'âge maternel sur l'expression des gènes dans les cellules de cumulus. Alors qu'une baisse de la compétence de l'ovocyte avec l'avancement de l'âge maternel est bien établie, les bases moléculaires de ce phénomène demeurent peu connues. Dans une première étape pour aborder cette question, nous avons utilisé des puces à ADN pour analyser les profils d'expression des gènes des CC en fonction de l'âge maternel. De façon remarquable l'âge maternel impacte significativement l'expression de gènes qui sont critiques pour la maturation de l'ovocyte tels que les gènes impliqués dans l'angiogenèse, les voies de signalisation de TGF-ß et de l'insuline. Par l'utilisation d'outils bioinformatiques, nous avons aussi identifié des miRNA potentiels régulateurs de gènes impliqués dans des processus ou des voies impactés par l'âge ; ils pourraient constituer de nouveaux biomarqueurs pour prédire un vieillissement ovarien prématuré ainsi que la qualité et la compétence de l'ovocyte. / The oocyte develops into a follicle where it is in close contact with cumulus cells (CCs), of somatic origin. The two cell types undergo a bidirectional communication via gap junctions, which results in the regulation and coordination of the metabolism during oocyte development and maturation. We assume that gene expression and regulation in the CCs play a crucial role in functions that are essential for oocyte growth and competence acquisition. The present study may be subdivided in two parts. In the first part we used deep sequencing to investigate the repertoire of miRNAs in the cumulus cells and the oocyte. MicroRNAs that are noncoding RNA sequences whose length is approximately 19-25 nucleotides have emerged as important regulators in many biological processes including aging. Our data showed that 32 miRNAs were specifically expressed in human cumulus cells while only 3 miRNAs were identified in MII human oocyte. The impact of maternal age on gene expression in cumulus cells was addressed in a second part of my thesis work. While the correlation of oocyte competence decline with advancing maternal age is well established, little is known on its molecular basis. In a first attempt to address this issue, we used microarrays to study gene expression profiles of human cumulus cells according to maternal age. Remarkably, maternal age greatly impacted expression of genes that are critical for oocyte maturation such as genes involved in angiogenesis, TGF-β signaling, and insulin signaling pathways. Also, using bioinformatic tools, we identified miRNAs that potentially target some of the genes involved in the aging-impacted processes and pathways; this could candidate them as new biomarkers to predict premature ovarian aging and oocyte quality and competence.

Les virus entériques sont l'une des principales causes d'épidémies de gastroentérites chez l'Homme. Ces virus sont essentiellement excrétés dans les selles et sont donc observés en grande quantité au sein des eaux usées. L'abattement viral est très variable en fonction des types de traitements mis en place dans les stations d'épurations (STEP). Malgré ces traitements, la grande majorité des STEP rejettent d'importantes quantités de virus entériques dans l'environnement. L'objectif de ce travail a été d'apporter des éléments de réponse concernant la circulation des virus entériques humains dans un environnement hydrique urbain. Pour cela, des méthodes d'analyse ont été mises au point afin de permettre la détection d'un large panel de virus entériques dans différentes matrices hydriques susceptibles d'être étudiées dans l'environnement. Trois contrôles ont été développés afin de vérifier le bon déroulement de cette méthode et donc de valider les résultats obtenus. Une campagne d'échantillonnage a été réalisée au niveau d'un tronçon de la Seine impacté par les affluents naturels et des effluents de STEP. La prise en compte des débits au niveau des différents points de prélèvement a permis de calculer les flux viraux qui correspondent à la quantité de virus circulant en un point au cours d'une unité de temps. Cette approche a permis de démontrer la contribution majeure des effluents de STEP dans la contamination virale du milieu récepteur. Parmi l'ensemble des virus entériques recherchés, les adénovirus, les norovirus, les astrovirus et les rotavirus présentaient les charges virales les plus importantes dans les effluents de STEP et dans les eaux de surface. Leurs quantités au sein de ces matrices d'eau étaient les plus importantes durant la période hivernale ce qui était cohérent avec les données épidémiologiques. Un lien étroit entre l'état sanitaire de la population humaine reliée au réseau d'assainissement et la concentration en virus entériques des effluents de STEP et des eaux de surface a pu être établi. Sur ces mêmes prélèvements, l'étude de la diversité des astrovirus et des norovirus de génogroupes I et II a été réalisée par pyroséquençage. Cette approche a permis d'établir un profil des différents génotypes circulant dans les effluents de STEP. Au regard des données épidémiologiques recueillies sur la même période par le Centre National de Référence des virus entériques, un grand nombre de génotypes communs ont pu être observés entre ces deux jeux de données. Ce constat met en évidence le caractère informatif de l'analyse des effluents de STEP qui fournit un profil relativement pertinent des virus entériques circulant dans l'environnement mais aussi dans la population humaine. La présence de virus entériques présente dans les eaux de surface, ressources utilisées pour la potabilisation, est un réel problème de santé publique. C'est pourquoi la dernière partie de ce travail s'intéresse à évaluer leur persistance dans l'eau de surface et l'eau destinée à la consommation humaine, mais aussi face à des traitements de désinfection, fréquemment utilisés dans les usines de potabilisation et parfois en sortie de STEP. L'absence de modèle cellulaire pour la plupart de ces virus nous a conduit à développer une approche basée sur l'emploi d'agents intercalants permettant d'évaluer l'intégrité de la capside des particules virales détectées par PCR en temps réel. L'utilisation de ces agents intercalants s'est avérée pertinente à partir du moment où les conditions conduisent à une dégradation des capsides virales. Par conséquent, leur emploi sur des échantillons d'eau potabilisée a permis une meilleure estimation du risque sanitaire associé à la consommation de l'eau produite. En conclusion, ce travail propose des méthodes d'analyse qui ont permis de mettre en exergue les relations existantes entre la circulation des virus entériques dans l'environnement et l'état sanitaire de la population humaine / Enteric viruses are a major cause of gastroenteritis outbreaks in humans. These viruses are mainly excreted in the faeces and are therefore observed in large amounts in wastewater. Depending on the types of treatments, virus removal from effluent may vary from one wastewater treatment plants (WWTP) to another. Despite these treatments, most of the WWTP releases significant quantities of enteric viruses in the environment. The aim of this study was to better understand the circulation of human enteric viruses in urban rivers. For this purpose methods have been developed to enable the detection of a broad panel of enteric viruses in various water matrices that may be collected from the environment. Since there is important inhibition observed in this type of water samples, three controls were developed to verify the success of this method, from the sample concentration to the PCR quantification, and thus to validate the results. A sampling campaign was carried out at the Seine River section (Paris area) affected by its natural tributaries and WWTP effluents. The river and effluent flows at the different sampling points were used to calculate the viral flows as the amount of virus circulating at a point during a time unit. This approach has demonstrated the major implication WWTP effluents in the viral contamination of the Seine River. Among all the targeted enteric viruses, adenoviruses, norovirus, astrovirus and rotavirus showed the most significant viral loads in WWTP effluents and consequently in river waters. Their quantities in WWTP effluents and surface water were the most important during the winter period which was consistent with the epidemiological data from the French Reference Center for enteric viruses. A close connection between the health status of the Parisian population and enteric virus concentration in WWTP effluents and in the Seine River could be established. The study of the diversity of astrovirus and norovirus of genogroups I and II was carried out by pyrosequencing on WWTP effluent and Seine river samples to develop a profile of the different genotypes circulating in the environment. Many common genotypes were observed between the effluent dataset and the epidemiological data collected over the same period by the French Reference Center. These results highlight the complementarity of the two datasets, and the fact that WWTP effluents provide a relevant profile of enteric viruses circulating in the environment but also in the human population. The amount of enteric viruses present in drinking water resources such as surface waters is a real public health problem. Therefore, it is important to evaluate viral persistence in surface waters during tertiary treatment and in drinking water, but also the viral persistence after usual disinfection treatments such chlorination and ultraviolet treatment. The absence of cell model for culture of most enteric viruses, has led us to develop a method using intercalating dyes to assess the capsid integrity of the viral particles quantified by real time PCR. The use of these intercalating agents was relevant when the environmental conditions and disinfection treatments caused a degradation of the viral capsid. Consequently, their use for the analysis of water samples from drinking water plants allowed to prevent an overestimation of the risk of transmission to humans by the consumption of tap water. In conclusion, this work provides development of analysis methods highlighting the relationships between the circulation of infectious enteric viruses in the environment and the health status of the human population

La spectrométrie de masse fait partie des technologies haut débit et offre à ce titre un regard inédit, à une échelle nouvelle, sur les protéines contenues dans divers échantillons biologiques. Les études biomédicales utilisant cette technologie sont de plus en plus nombreuses et visent à détecter de nouveaux biomarqueurs de différents processus biologiques, notamment de processus pathologiques à l'origine de cancers. Cette utilisation comme outil de criblage pose des questions quant à la capacité même des expériences de spectrométrie de masse dans cette détection. La puissance statistique traduit cette capacité et rappelle que les études doivent être calibrées pour offrir des garanties suffisantes de succès. Toutefois, cette exploration de la puissance statistique en spectrométrie de masse n'a pas encore été réalisée. L'objet de cette thèse est précisément l'étude des déterminants de la puissance pour la détection de biomarqueurs en spectrométrie de masse. Une revue de la littérature a été réalisée, reprenant l'ensemble des étapes nécessaires du traitement du signal, afin de bien comprendre les techniques utilisées. Les méthodes statistiques disponibles pour l'analyse du signal ainsi traité sont revues et mises en perspective. Les situations de tests multiples, qui émergent notamment de ces données de spectrométrie de masse, suggèrent une redéfinition de la puissance, détaillée par la suite. La puissance statistique dépend du plan d'expérience. La taille d'échantillon, la répartition entre groupes étudiés et l'effet différentiel ont été investigués, par l'intermédiaire de simulations d'expériences de spectrométrie de masse. On retrouve ainsi les résultats classiques de la puissance, faisant notamment ressortir le besoin crucial d'augmenter la tailles des études pour détecter des biomarqueurs, particulièrement lorsque ceux-ci présentent un faible effet différentiel. Au delà de ces déterminants classiques de la puissance, des déterminants propres à la spectrométrie de masse apparaissent. Une chute importante de puissance est mise en évidence, due à l'erreur de mesure des technologies de spectrométrie de masse. Une synergie péjorative existe de plus entre erreur de mesure et procédure de contrôle du risque de première espèce de type FDR. D'autre part, les méthodes de détection des pics, par leurs imperfections (faux pics et pics manqués), induisent un contrôle suboptimal de ce risque de première espèce, conduisant à une autre chute de puissance. Ce travail de thèse met ainsi en évidence trois niveaux d'intervention possibles pour améliorer la puissance des études : la meilleure calibration des plans d'expérience, la minimisation de l'erreur de mesure et l'amélioration des algorithmes de prétraitement. La technologie même de spectrométrie de masse ne pourra conduire de façon fiable à la détection de nouveaux biomarqueurs qu'au prix d'un travail à ces trois niveaux. / Mass-spectrometry (MS) belongs to the high-throughput technologies and therefore offers an originalperspective on proteins contained in various biological samples, at a new scale. Biomedicalstudies using this technology are increasingly frequent. They aim at detecting new biomarkersof different biological processes, especially pathological processes leading to cancer. This use asa screening tool asks questions regarding the very detection effectiveness of MS experiments.Statistical power is the direct translation of this effectiveness and reminds us that calibratedstudies are required to offer sufficient guarantees of success. However, this exploration of statisticalpower in mass-spectrometry has not been performed yet. The theme of this work is preciselythe study of power determinants for the detection of biomarkers in MS studies.A literature review was performed, summarizing all necessary pretreatment steps of thesignal analysis, in order to understand the utilized techniques. Available statistical methods forthe analysis of this pretreated signal are also reviewed and put into perspective. Multiple testingsettings arising from MS data suggest a power redefinition. This power redefinition is detailed.Statistical power depends on the study design. Sample sizes, group repartition and the differentialeffect were investigated through MS experiment simulations. Classical results of statisticalpower are acknowledged, with an emphasis on the crucial need to increase sample sizes forbiomarker detection, especially when these markers show low differential effects.Beyond these classical power determinants, mass-spectrometry specific determinants appear.An important power drop is experienced when taking into account the high measurement variabilityencountered in mass-spectrometry. A detrimental synergy exists between measurementvariability and type 1 error control procedures (e.g. FDR). Furtheremore, the imperfections ofpeak detection methods (false and missed peaks) induce a sub-optimal control of this type 1error, leading to another power drop.This work shows three possible intervention levels if we want to improve power in MS studies: a better study design, measurement variability minimisation and pretreatment algorithmsimprovements. Only a work at these three levels can guarantee reliable biomarker detections inthese studies.

Les genres Anisakis, Pseudoterranova, Hysterothylacium et Contracaecum, membres de la famille des Anisakidae, sont des nématodes dont les larves sont présentes chez de nombreuses espèces de poissons et céphalopodes. Ces larves peuvent induire des pathologies digestives et/ou allergiques chez l’Homme. En France, la consommation des produits de la pêche, surtout crus ou peu cuits est en augmentation. Ce travail de thèse s’intègre dans le programme ANR Fish-Parasites, financé par l’ANR (ANR-10-ALIA-004). Il a pour but d’évaluer les risques liés à la consommation des produits de la pêche et pour objectif principal d’étudier la répartition des Anisakidae dans les produits de la pêche. _x000D_Le plan d’échantillonnage a été établi suite à une analyse de type risk-ranking utilisant les données de consommation, l’origine géographique, des données de prévalence déjà existantes sur les Anisakidae. Au total, 1768 poissons appartenant à 18 espèces ont été collectés. L’ensemble des organes a été disséqué pour isoler les parasites. Ceux-ci ont été identifiés selon 2 méthodes : i) analyse individuelle par séquençage Sanger pour les organes ayant moins de 11 nématodes ii) analyse en pool par séquençage à haut débit (HTS) pour le reste. Le développement de plusieurs outils (création d’une base de séquences de référence, conception des amorces, mise au point de la préparation de matrice de séquençage et développement d’un pipeline d’analyse automatisé) a été nécessaire pour la mise en place de la méthode HTS. A partir des résultats obtenus, une acquisition et une structuration des données de prévalence des parasites potentiellement pathogènes pour l’Homme et présents dans les produits de la pêche couramment consommés a pu être réalisée.Sur 1 768 poissons échantillonnés, deux espèces n’étaient pas du tout parasitées : plies (Pleuronectes platessa) et saumon Atlantique (Salmo salar) d’élevage. 43,30 % des poissons n’étaient pas infectés par des Anisakidae. Sur la totalité des poissons, 28,62 % étaient infectés au niveau des viscères ; 22,96% dans les viscères et les filets et 5,49 % n’étaient infectés par des Anisakidae que dans les filets.Les cinq espèces de poisson dont la prévalence dans les filets était la plus élevée étaient : la lingue bleue (100 %), la cardine franche (70 %), le lieu noir (63 %), la baudroie (61 %) et le merlu (60 %).Les Anisakidae les plus identifiés étaient : Anisakis simplex, Anisakis pegreffii, Hysterothylacium aduncum, Pseudoterranova krabbeii.Anisakis a été retrouvé dans toutes les localisations et généralement de façon plus importante, Contracaecum a été retrouvé principalement dans le foie, Hysterothylacium dans la cavité corporelle et Pseudoterranova dans les filets et la cavité corporelle.Anisakis simplex était présent dans toutes les zones de pêches sauf dans le golfe du Lion. La zone des eaux féringiennes était la zone dans laquelle la diversité des Anisakidae était la plus importante sur une seule espèce de poisson échantillonnée (lingue bleue).L’étude statistique logistique multivariée a montré que la variable espèce et la variable taille du poisson influencent la prévalence d’Anisakis et Pseudoterranova dans les filets.Le HTS sur le PGM™ Ion Torrent s’est révélé être un outil puissant et innovant permettant l’analyse d’un grand nombre d‘échantillons d’Anisakidés à moindre coût, en peu de temps et avec un résultat équivalent à la méthode individuelle par séquençage Sanger. / Anisakis, Pseudoterranova, Hysterothylacium and Contracaecum genera, members of the Anisakids family, are nematodes which larvae are recovered from numerous fish and cephalopods species. These larvae may induce digestive and/or allergic pathologies in human being. In France, the consumption of fishery products, mostly raw or undercooked is increasing. This PhD work is part of the research program Fish-Parasites funded by the ANR (ANR-10-ALIA-004). It aimed to assess risks related to fishery products consumption and its main goal was to study the distribution of Anisakids in fishery products.The sampling plan was based on a risk-ranking analysis using data on fishery products consumption, fishing areas and prevalence data from previous work on Anisakids. A total of 1 768 fish from 18 species were collected. All the organs were dissected for parasites isolation. Parasites were identified using two approaches : i) single analysis by Sanger sequencing for organs containing less than 11 nematodes ii) pooled analysis by high throughput sequencing (HTS) for the remaining. The development of numerous tools (database creation with reference sequences, primers design, set up of the sequencing template preparation and development of an automatic analytical pipeline) was necessary for the HTS method set up. From the sequencing results, acquisition and structuring of the prevalence data has been carried out on parasites potentially pathogenic for human being and recovered from commonly consumed fishery products.On 1 768 sampled fish, two species were not parasitized at all: plaice (Pleuronectes platessa) and aquacultured Atlantic salmon (Salmo salar). 43.30 % of the fish were not infected by Anisakids. Concerning infected fish, 28.62% were contaminated in the visceral organs; 22.96% in both visceral organs and fillets and, finally, 5.49% of the fish were infected by Anisakids only in fillets.The five fish species with an elevated prevalence in their fillets were by decreasing values: blue ling (100 %), megrim (70 %), saithe (63 %), monkfish (61 %) and hake (60 %). The most identified Anisakids were: Anisakis simplex, Anisakis pegreffii, Hysterothylacium aduncum, Pseudoterranova krabbeii.Anisakis has been recovered in all the localisations and generally in higher quantities, Contracaecum has mainly been recovered from the liver, Hysterothylacium from the corporal cavity and Pseudoterranova from both fillets and corporal cavity. Anisakis simplex was isolated from all the fishing areas except for the Lion Gulf and it was the genus with the most important number of individuals. The zone of Feroan waters was the region with the most important diversity of Anisakids into a single sampled fish species (blue ling).The multivariate logistic statistical study showed that the fish species and size affect the prevalence of Anisakis and Pseudoterranova in fish fillets.HTS with the PGM™ Ion Torrent proved to be a powerful and innovative tool for the analysis of large numbers of Anisakids samples with low cost, in a shorter time and with a result equivalent to the individual method of Sanger sequencing.

Le mélanome cutané est l’affection de la peau la plus meurtrière. Afin de pouvoir être traité efficacement, ce cancer nécessite un diagnostic et une exérèse chirurgicale précoce des lésions primitives non-invasives. En effet, les patients atteints de métastases ont peu de chance de survivre car les lésions de mélanome développent rapidement des résistances aux thérapies et possèdent une forte propension à disséminer des métastases dans de nombreux organes. Le franchissement de la lame basale de la peau appelée jonction dermo épidermique est la première étape cruciale dans l’invasion précoce du mélanome cutané. Notre équipe étudie cette étape depuis plusieurs années et a démontré que l’expression de la tétraspanine 8 (TSPAN8) apparait lors de la progression de ce cancer et permet l’acquisition d’un phénotype invasif par les cellules tumorales. Plusieurs membres de la famille des protéines tétraspanines sont connus pour leurs implications dans divers cancers, mais notre connaissance de leurs régulations transcriptionnelles est encore assez réduite. Les travaux présentés dans cette thèse ont permis d’identifier les premiers régulateurs transcriptionnels connus de TSPAN8, et également de commencer l’étude fonctionnelle de ces régulations sur l’invasion dépendante de TSPAN8 par le mélanome cutané. En particulier, nous montrons que l’invasion dépendante de TSPAN8 est entre autres régulée par le membre du complexe Mediator LCMR1/MED19 et par le suppresseur de tumeur p53. Ainsi, ces travaux apportent une meilleure compréhension de l’invasion précoce du mélanome cutané, ce qui devrait permettre une meilleure prise en charge des patients à l’avenir / Cutaneous melanoma is the deadliest skin condition. Curing this cancer requires an early diagnosis and surgical excision of the non-invasive primary lesions. Indeed, patients with metastasis have few chances to survive this cancer since the melanoma lesions rapidly develop treatment resistances, and can disseminate metastasis in numerous organs. Crossing the skin basal membrane called the dermal epidermal junction is the first crucial step of early melanoma invasion. Our team has studied the early invasion of melanoma for many years, and demonstrated for the first time the implication of Tetraspanin (TSPAN8) in melanoma early invasion. Indeed, the expression of this gene and the protein that it codes appears with the progression of melanoma and confers the tumor cells an invasive phenotype. Several members of the tetraspanin protein family are known for their implication in various cancers, yet their transcriptional regulation remains poorly understood. In the case of TSPAN8, nothing was known regarding its transcriptional regulation in melanoma. The experiments presented in this thesis allowed us to identify the first known regulators of TSPAN8 transcriptional expression, and also to begin the functional study of the regulators impact on TSPAN8 dependent invasion of human cutaneous melanoma. Amongst these regulators are the member of the Mediator Complex MED19/LCMR1 and the tumor suppressor p53. The results presented in the present manuscript allow a better understanding of cutaneous melanoma early invasion and should help improving the treatments against this cancer in the future

La déficience intellectuelle (DI) est définie par un QI < 70. La DI, répartie en formes non syndromiques et en formes syndromiques, est observée dans 3 % de la population. Des anomalies chromosomiques sont identifiées dans 15 % des DI syndromiques. Les translocations chromosomiques réciproques (TR) apparemment équilibrées sont observées chez 1 individu sur 1000 et seul 6 % des patients avec une TR de novo apparemment équilibrée ont une DI. Plusieurs mécanismes chromosomiques peuvent expliquer la DI syndromique associée à une TR : (i) un microremaniement déséquilibré identifié par l'utilisation de techniques plus résolutives, (ii) la formation d'un gène de fusion, (iii) un effetde position, (iv) la modification d’une région soumise à une empreinte parentale, (v) une interruption d'un gène au niveau d'un ou des deux points de cassure, (vi) une mutation génique sans rapport avec la TR, (vii) ou encore une cause acquise ou multifactorielle. Nous rapportons l'étude de 12 patients avec DI et porteurs d'une TR de novo apparemment équilibrée. L'analyse systématique par puces à ADN de ces individus a été réalisée avec une résolution de 25 kb. Un déséquilibre infracytogénétique au niveau des points de cassure ou ailleurs dans le génome a été observé chez 3/12 patients. Chez les 9 patients sans anomalies sur puces à ADN, nous avons étudié les points de cassure des remaniements de novo apparemment équilibrés. En dehors de la technique de marche sur le chromosome par FISH, deux autres approches ont été mises en oeuvre : (i) l'Array-Painting qui correspond à l'hybridation sur puces à ADN de chacun des dérivés chromosomiques préalablement séparés par Cytométrie en Flux, (ii) et le séquençage haut débit (WGS - Whole Genome Sequencing). Grâce à l'Array-Painting, nous avons identifié (i) chez 2 patients, des interruptions de gènes pouvant expliquer leur phénotype, à savoir les gènes : KIF1A, AUTS2 et EPHA6 ; (ii) et chez 1 patiente, un point de cassure entraînant une dérégulation de la transcription du gène MEF2C. L'étude par WGS a permis (i) chez 1 patiente, de diagnostiquer un déséquilibre plus complexe que celui observé par puce à ADN ; (ii) chez 2 patients, de mettre en évidence unchromothripsis, qui pourrait avoir un impact dans les pathologies constitutionnelles par interruption de gènes et/ou par effet de position ; (iii) et chez 2 autres patients, de caractériser précisément les points de cassure. Ainsi, grâce aux résultats obtenus par ces différentes techniques, plusieurs mécanismes physiopathologiques responsables de DI sont mis en évidence permettant un conseil génétique adéquat. Cependant, aucun mécanisme chromosomique commun ne peut être identifié hormis le chromothripsis observé chez patients. Finalement, ce travail nous permet principalement de comparer les techniques mises en oeuvre qui se sont avérées complémentaires. En conclusion, nous proposons une démarche diagnostique pour explorer un remaniement chromosomique apparemment équilibré chez des patients à phénotype anormal / Intellectual disability (ID) is defined by an IQ <70. ID, observed in 3% of the population, and displays heterogeneous origins, including acquired etiology (toxicologic, pathologic, traumatic) or genetic disorders with non-syndromic and syndromic forms. Numerical or structural chromosomal abnormalities are observed in 15% of patients with ID. Reciprocal balanced chromosomal translocations (RT) are observed in one individual in 1000. However, only 6% of patients carrying a de novo apparently balanced RT present ID. The relation between these balanced rearrangements and ID could be explained by different mechanisms namely (i) subtle rearrangement, (ii) gene fusion, (iii) position effect, (iv) disturbance of parental imprinting, (v) gene disruption at the breakpoints, (vi) mutation in gene unrelated to the translocation, (vii) or acquired or multifactorial cause. We report a chromosomal study of 12 patients with DI and carrying a de novo apparently balanced reciprocal translocation. A systematic analysis by microarrays was performed in all individuals (using a resolution of 25 kb). For three patients, a microdeletion was observed at the breakpoints or elsewhere in the genome. For the 9 remaining cases, we hypothesize that the phenotype is due to a disruption of gene(s) located at the breakpoint(s). In this context, we studied the breakpoints of the apparently balanced de novo rearrangements in these patients. Outside FISH walking, two approaches have been implemented namely Array-Painting, which combines flow chromosome sorting in an attempt to isolate derivative chromosomes from each other and DNA microarrays as well as Whole Genome Sequencing (WGS). Using Array-Painting, we identified (i) in 2 patients, a gene disruptions: in the KIF1A, AUTS2 and EphA6 genes; (ii) and in 1 patient, a breakpoint resulting in deregulation of transcription of the gene MEF2C. The WGS technology has permitted (i) in 1 patient, to diagnose more complex imbalance than that observed by micro-array; (ii) in 2 patients, to show a chromothripsis, (iii) and 2 other patients, to characterize precisely breakpoints. In conclusion, taking together, these results highlight different physiopathological mechanisms responsible for DI allowing adequate genetic counseling. However, no common chromosomal mechanism can be identified except for chromothripsis observed in 2 patients. In addition, this work allows us especially to compare the used techniques which seem to be complementary. Finally, we propose a pipeline to elucidate the etiology of the abnormal phenotype in patients carrying an apparently balanced rearrangement

Les mécanismes de régulation de l’expression génétique sont essentiels pour l’adaptation du comportement cellulaire face à son environnement (différenciation, développement, réponse à un stimulus). Les études moléculaires décrivent une grande diversité de facteurs impliqués dans ce phénomène (TFs, marques épigénétiques, nucléosomes) et plusieurs niveaux de régulation (initiation, élongation, épissage, maturation) qui expliquent la complexité du transcriptome cellulaire. Durant ma thèse, nous nous sommes intéressés aux processus de régulation de la transcription en nous appuyant sur le modèle de la différenciation lymphocytaire murine. Nos études décrivent le recrutement des GTFs et une activité transcriptionnelle caractéristique aux promoteurs des gènes et sur les enhancers. Nous montrons également que les ilots CpG (CGIs) sont des éléments régulateurs majeurs chez les mammifères et qu’ils contribuent de manière transcription-indépendante à la déplétion nucléosomale observée aux promoteurs de certains gènes. Nos collaborations nous ont également permis d’aborder des sujets relatifs à l’élongation de la transcription, l’épissage alternatif, ou les combinatoires de PTMs que peuvent exhiber le CTD de l’ARN Pol II et les queues d’histones. Dans un contexte de transition de l’ère pré-génomique vers des approches expérimentales pangénomiques (s’appuyant notamment sur les technologies de séquençage haut débit), une proportion importante de ma période doctorale fut consacrée au développement d’outils bioinformatiques pour le traitement et les analyses de données expérimentales, issues de ChIP-on-chip puis de HTS (ChIP-Seq, MNase-Seq, RNA-Seq). / Mechanisms underlying the regulation of genetic expression are crucial for cell maintenance and adaptation to environment (differentiation, development...). Molecular approaches reveal a great diversity of factors involved in this process (TFs, epigenetics, nucleosomes) and several layers of regulation (transcription initiation, elongation, splicing, maturation) which contribute to the observed transcriptome complexity. During my thesis, we studied the mechanisms of transcription regulation in mammals during lymphocyte differentiation. Briefly, we described the recruitment of GTFs and the transcriptional activity occurring on promoters and enhancers. We also reveal that CpG islands (CGIs) are major regulator elements in mammals, which contribute to nucleosome depletion in a transcription-independent manner on a significant amount of promoters. Together with our collaborators, we also studied the mechanisms of transcription elongation, alternative splicing, or the complex combinatorial patterns of PTMs that can be set on the CTD of RNA Polymerase II and on histone tails. In the context of transition from pre-genomic studies to genome-wide experiments, an important part of my work consisted in the development of bioinformatics tools for the processing and analysis of experimental datasets from ChIP-on-chip, and HTS technologies (ChIP-Seq, MNase-Seq, RNA-Seq).

Le but de cette étude est de trouver un matériau catalytique pour la réduction catalytique sélective des NOx par les hydrocarbures (HC-SCR) dans l’échappement Diesel par une approche haut débit (HTE : high throughput experiments). Ce matériau doit être actif à basse température et stable hydrothermiquement à hautes températures. Une bibliothèque de 150 catalyseurs a été synthétisée. Les catalyseurs sont constituées d’Ag, Au, Cu supportés sur Al2O3, TiO2, ZrO2, CeO2 qui peuvent être dopés (Ga, Mo…). Ceux-ci sont testés en parallèle dans un dispositif constitué de 16 réacteurs (SWITCH-16) au cours réaction à température programmée (TPR) avec un flux modèle (100ppm NO / 350ppm C3H6 / 15% O2 /11% H2O). Le meilleur catalyseur 5%Ag/1%P/Al2O3, testé plus avant, montre une température de light-off de 50°C en dessous de celle d’un catalyseur commercial de référence et celui-ci est stable après un vieillissement de 16h à 750°C en présence d’eau. Ce catalyseur est ensuite enduit par voie sol-gel sur un monolithe (1*2 pouces et 300 cpsi) et testé sur un mini-pilote. Les tendances obtenues en réacteur à lit fixe montés en parallèle sont confirmées sur mini-pilote. En parallèle une approche microcinétique expérimentale des étapes élémentaires de surface impliquées dans la HC-SCR du NO sur un catalyseur Ag/Al2O3 a été utilisée pour déterminer les étapes élémentaires contrôlant la conversion du NO en prenant en compte l’adsorption compétitive entre NO et CO présent dans le gaz d’échappement Diesel. Nous avons identifié l’élimination des espèces Oads adsorbées sur des sites Ag° comme étape limitante pour la production de N2 et suggéré une nouvelle orientation possible pour l’étude HTE. / The aim of this study was to discover a catalytic material for NOx reduction by HC-SCR in Diesel exhaust which is active at the lowest temperatures and hydro thermally stable at high temperatures by using High Throughtput experiments (HTE). A library of 150 catalysts was synthesized. Catalysts are supported Ag, Au, Cu on Al2O3, TiO2, ZrO2, CeO2 and further doped with different dopants (Ga, Mo, …). They were tested in a 16-parallel reactor (SWITCH-16) using a Temperature Program Reaction (TPR) protocol with a model feed (100ppm NO / 350ppm C3H6 / 15% O2 /11% H2O). The best catalyst formulation 5%Ag/1%P/Al2O3, which was further improved, exhibits a light off temperature of 50°C lower than a reference commercial catalyst and is stable after ageing at 750°C in presence of water for 16 hrs. For pilot testing, the best catalyst was deposited by sol-gel method on a 1x2 inch monolith (300 cpsi). We showed the consistency of catalytic results obtained in the parallel fixed beds match with monolith bench testing. In parallel a experimental microkinetic approach of surface elementary steps involved in the HC-SCR of NO on Ag/Al2O3 catalyst has been performed to reveal the elementary steps controlling the conversion of the NO reactant taking into account the competitive chemisorption between NO and CO that is present in an exhaust gas. We identified the elimination of Oads species adsorbed on Ag° sites as the limiting step for the N2 production and suggested a new orientation of a HTE study.