Introdução: O sangramento por queda de escara é uma complicação potencialmente letal da ligadura elástica (LE) de varizes de esôfago. Os fatores relacionados a esse evento são pouco explorados na literatura, porém a coagulopatia, principalmente a plaquetopenia, do paciente com cirrose poderia estar implicada. O número e a função plaquetária têm particular relevância na manutenção da hemostasia, uma vez que a geração de trombina depende fortemente desses parâmetros. Entretanto, dados demonstram a preservação da função plaquetária como consequência de mecanismos compensatórios representados, principalmente, pelo aumento dos níveis do fator de von Willebrand (FVW) e diminuição de ADAMTS13. Deste modo, os pontos de corte para contagem plaquetária utilizados na prática clínica não refletiriam o risco de sangramento após procedimentos. Objetivos: O objetivo desse estudo foi descrever a função plaquetária em pacientes com cirrose e a sua influência no sangramento após LE de varizes de esôfago. Pacientes e Métodos: 1) Casuística. Foram incluídos pacientes com diagnóstico de cirrose, de diferentes etiologias, encaminhados para realização de LE como profilaxia primária ou secundária de sangramento por varizes de esôfago. Os critérios de inclusão foram: a) idade acima de 18 anos; b) pacientes com cirrose e varizes de esôfago com indicação de ligadura elástica eletiva e c) concordância em participar do estudo. Os critérios de exclusão foram: a) doenças pulmonares e cardíacas graves; b) carcinoma hepatocelular; c) insuficiência renal com uremia ou dialítica; d) uso de qualquer droga que interfere na coagulação. 2) Métodos. Imediatamente antes da realização da endoscopia digestiva com LE, foi coletada amostra de sangue de cada paciente para a realização dos seguintes testes: contagem de plaquetas, testes relacionados à função plaquetária (adesão e agregação medida pela superfície coberta (SC) com valor de referência: > 7,5% e tamanho do agregado (AS) com valor de referência: > 25um² pela tecnologia Impact- R®), antigeno de FVW (referência: 40-157%), atividade de FVW (referência: 38- 176%), proteinase ADAMTS13 (referência: 40-130%), P-selectina por citometria (34,9±2,32%) e P-selectina solúvel (92-212ng/mL). Os pacientes foram estratificados de acordo com número de plaquetas. O grau de comprometimento da função hepática foi avaliado pelos estadiamentos de Child-Pugh e MELD. O desfecho primário do estudo foi a ocorrência do sangramento atribuído à queda da escara da LE. Resultados: Foram incluídos 111 pacientes, divididos em três grupos: A) plaquetas < 50x10³/mm³ (n = 38; 34,2%); B) plaquetas entre 50x10³/mm³ e 100x10³/mm³ (n = 47; 42,4%) e C) plaquetas > 100x10³/mm³ (n = 26; 23,4%). Os três grupos não diferiram significativamente em relação aos seguintes parâmetros: gênero, etiologia e grau de disfunção hepática. Na comparação entre os grupos, os parâmetros hemoglobina e bilirrubina foram significantemente maior no grupo B (p=0,04 e p=0,009, respectivamente). Nos testes relacionados à função plaquetária, encontramos no Impact-R®, SC de 7 ± 4% e AS de 52 ± 24?m2. Na avaliação do FVW o valor encontrado foi de 369 ± 157% para o antígeno e 336 ± 149% para atividade. ADAMTS13 apresentou resultado 73 ± 24%. Na comparação entre os grupos: o parâmetro Impact-R® SC foi no grupo A: 4,9 ± 3%, no grupo B: 7,7 ± 4,6% e 9,1 ± 3,6 no grupo C (p < 0,005). O AS foi de 49,9 ± 22,4% no grupo A, no grupo B foi 55,1 ± 26,6% e 51,3 ± 20 no grupo C (p=0,599). Os outros parâmetros específicos relacionados à função plaquetária não foram significantes: o antígeno do FVW com p=0,926, a atividade do FVW com p=0,870 e ADAMTS13 com p=0,080. O resultado da P-selectina por citometria de fluxo foi de 37,8 ± 23% e P-selectina solúvel foi 182,3 ± 86 ng/mL. A maioria dos pacientes (58,5%) realizaram LE como profilaxia primária. A presença de sinais vermelhos ocorreu em 74% e a gastropatia hipertensiva foi vista em 95% dos pacientes. Houve sangramento após LE em seis (5,4%) pacientes, sendo duas ocorrências no grupo A, uma no grupo B e três no grupo C (p=0,316). O valor médio do MELD foi 13 ± 3,6, sendo 12,6 ± 3,3 no grupo sem sangramento e 16 ± 5,9 no grupo sem sangramento (p=0,025). Quando comparados os pacientes sem e com sangramento não encontramos diferença estatisticamente significante em nenhum parâmetro de função plaquetária. Conclusões: Os resultados dos testes de adesão e agregação plaquetária: SC e AS; FVW e ADAMTS13 demonstraram compensação funcional a despeito da plaquetopenia e não se correlacionaram com o risco de sangramento após LE de varizes de esôfago. O MELD foi significantemente maior nos pacientes que sangraram / Introduction: Bleeding caused by ulceration after band ligation of esophageal varices is a potentially fatal complication. Contributing factors to this event are little explored in the literature, although coagulopathy, principally thrombocytopenia, in patients with cirrhosis could be implicated. The number and function of platelets has particular relevance to the maintenance of hemostasis, since thrombin generation depends heavily on these parameters. However, data show that the preservation of platelet function is a consequence of compensatory mechanisms represented principally by an increase in von Willebrand factor (VWF) levels and a reduction in ADAMTS13. Because of this, the cutoff points for platelet count used in routine clinical practice do not reflect the risk of bleeding following invasive procedures. Objective: The aim of this study was to describe platelet function in patients with cirrhosis and its influence on the bleeding following band ligation of esophageal varices. Methodology: 1) Inclusion. Patients with cirrhosis of different etiologies, referred for band ligation as primary or secondary prophylaxis of bleeding from esophageal varices were included. Inclusion criteria were: a) age > 18 years; b) patients with cirrhosis and esophageal varices elegible for elective band ligation; c) agreement to participate in the study. The exclusion criteria were: severe pulmonary or cardiovascular disease; b) hepatocellular carcinoma; c) renal dysfunction with uremia or requiring dialysis; d) use of any medication that could interfere with coagulation. 2) Methods. Immediately prior to digestive endoscopy with band ligation, a blood sample was taken from each patient to carry out the following coagulation tests: platelet count, platelet function test (adhesion and aggregation measured as surface coverage (SC) with normal range: > 7.5% and aggregate size (AS) with normal range: > 25um² by Impact-R® technology), antigen of VWF (normal range: 40- 157%), activity of VWF (normal range: 38-176%), protease ADAMTS13 (normal range: 40-130%), P-Selectin by cytometry (34.9±2.32%) and soluble P-Selectin (92- 212ng/mL). The degree of hepatic function was staged according to Child-Pugh and MELD. The principal clinical event assessed by the study was the occurrence of post-banding bleeding. Results: 111 patients were included in the study, divided into three groups: A) platelet count < 50x10³/mm³ (n=38; 34.2%); B) platelet count between 50x10³/mm³ and 100x10³/mm³ (n=47; 42.4%); and C) platelet count > 100x10³/mm³ (n=26; 23.4%). The three groups did not differ significantly in relation to the following parameters: gender, cirrhosis etiology and degree of hepatic dysfunction. The comparison among groups showed that the parameters hemoglobin and bilirubin were significantly higher in group B (p=0.04 and p=0.009, respectively). With regards to platelet function, in Impact-R® the mean SC was 7 ± 4%; in group A was 4.9 ± 3%, in group B was 7.7 ± 4.6% and 9,1 ± 3,6 in group C (p < 0.005). The AS was 52 ± 24?m2; in group A was 49.9 ± 22.4%, in group B was 55.1 ± 26.6% and 51.3 ± 20 in group C (p=0.599). The mean VWF value was 369 ± 157% for antigen and 336 ± 149% for activity. ADAMTS13 activity values were 73 ± 24%. The comparison among groups showed that the other specific parameters for platelet function were not significant: VWF antigen with p=0.926, VWF activity with p=0.870 and ADAMTS13 with p=0.080. The result of P-Selectin by flow cytometry was 37.8 ± 23% and soluble P-Selectin was 182.3 ± 86ng/mL. The majority of patients (58.5%) underwent band ligation as primary prophylaxis. Red signs appeared in 74%, and hypertensive gastropathy was seen in 95% of patients. There was bleeding following band ligation in 6 (5.4%) of patients, with 2 occurring in group A, 1 in group B, and 3 in group C (p=0.316). The mean MELD score was 13 ± 3.6, with 12.6 ± 3.3 in the group without bleeding, and 16 ± 5.9 in the group with bleeding (p=0.025). When patients with bleeding were compared with those without, there was no statistically significant difference in any parameter for platelet function. Conclusions: The results of the platelet function test SC and AS; VWF and ADAMTS13 tests showed functional compensation for thrombocytopenia, and did not correlate with the risk of bleeding following band ligation of esophageal varices. The MELD score was significantly higher in patients who suffered bleeding

A hemostasia previne a perda de sangue após uma lesão vascular e garante a fluidez sanguínea. Para isso há a participação de células carreadoras de fator tissular e também de plaquetas, além de fatores plasmáticos, cofatores, fosfolipídios e íons cálcio que resultam na liberação dos fibrinopeptídios do fibrinogênio e polimerização dos monômeros de fibrina, transformando-os em fibrina estável. Os polifosfatos também participam da ativação da via intrínseca da cascata de coagulação ativando o fator XII e a pré-calicreína plasmática. Os répteis possuem peculiaridades quanto ao mecanismo de coagulação, apresentando níveis altos de anticoagulantes circulantes e ausência ou deficiência de alguns fatores de coagulação. Pouco se sabe sobre a participação real dos trombócitos e polifosfatos no mecanismo hemostático de serpentes. Assim, o objetivo deste estudo foi investigar o mecanismo hemostático da serpente de C.d. terrificus, avaliando também o papel dos trombócitos e dos polifosfatos. Os testes de coagulação apresentaram tempos prolongados, mas o nível de fibrinogênio (227, 47 ± 20,38 g/dL) foi semelhante ao humano. Foi constatada a presença de FXII, que foi ativado pelos polifosfatos, reduzindo o tempo de coagulação em Rotem. Os trombócitos de C.d. terrificus (13,37 ± 1,22 x 109/L) são células nucleadas elipsoidais, que apresentam superfície lisa quando não estão ativados. Esses trombócitos agregaram com colágeno 5,84 ± 0,85 &Omega;) e cálcio ionóforo (24 ± 3,3 %). Porém, não ativaram com ADP, como previamente mostrado em outros répteis. A adesão trombocitária observada (1,25 ± 0,37 %) foi mais baixa do que em seres humanos (11%), lembrando que a adaptação do método usado não foi totalmente adequada às serpentes. Embora se saiba pouco sobre a importância das variações das características morfológicas das fibras de fibrina, que em C.d. terrificus diferem das de ratos, humanos e outras espécies descritas de mamíferos, o tipo dessa rede de fibrina pode estar influenciando no processo final da hemostasia, juntamente com a participação dos trombócitos. A eficácia do mecanismo hemostático em serpentes C.d. terrificus parece estar relacionada principalmente à ativação da coagulação pelo fator tissular. Assim, a fase de iniciação é tão eficiente quanto em mamíferos, diferindo mais na fase de propagação do coágulo, ou seja, na via intrínseca. A baixa concentração de alguns fatores de coagulação e níveis elevados de inibidores naturais, tais como a antitrombina, interfere nesse sistema mais lento e possivelmente diminui os riscos trombóticos / Hemostasis prevents blood loss after vascular injury and provides the blood flow. Platelets and tissue factor bearing cell, plasma factors, cofactors, phospholipids and calcium ions participate in this process that results in the release of fibrinogen fibrinopeptides and polymerization of fibrin monomers, converting to stable fibrin. Polyphosphates also participate in the activation of the intrinsic pathway of the coagulation cascade by activating factor XII and plasma prekallikrein. The peculiarities of blood coagulation of reptiles are high levels of circulating anticoagulants and absence or low level of some coagulation factors. The role of thrombocytes and polyphosphates in the hemostatic mechanism of snakes is not well known. The objective of this study was to investigate the hemostatic mechanism of C.d. terrificus snake evaluating the role of thrombocytes and polyphosphates. Coagulation tests showed prolonged times, but the level of fibrinogen (227.47 ± 20.38 g/dL) was similar to human. It was also observed the presence of FXII activated by polyphosphates reducing the clotting time in Rotem. Thrombocytes of C.d. terrificus (13.37 ± 1.22 x 109/L) are ellipsoidal nucleated cells, which exhibit smooth surface when not activated. These thrombocytes were activated by collagen (5.84 ± 0.85 &Omega;) and calcium ionophore (24 ± 3.3%). However, they did not aggregate with ADP as previously shown in other reptiles. The thrombocytes adhesiveness observed (1.25 ± 0.37%) was lower than in humans (11%), probably, in part because the adaptation of the method used was not fully adequate to snakes. Although little is known about the importance of morphological characteristics of C.d. terrificus fibrin fibers, which differ from rat, human and other mammalian species described, possibly this type of fibrin network may influence the final stages of hemostasis, with thrombocytes participation. The efficacy of the hemostatic mechanism in C.d. terrificus snakes seems to be mainly related to the activation of coagulation by tissue factor. Thus, the initiation phase is as efficient as in mammals, differing in the propagation phase of coagulation or intrinsic pathway. The low concentration of some coagulation factors and high levels of natural inhibitors such as antithrombin may be interfering with that system, and also preventing thrombotic diseases

Introdução: Estudos iniciais sugeriram que o risco para tromboembolismo venoso (TV) era atribuído ao componente estrogênico dos contraceptivos de forma dose-dependente. Estudos epidemiológicos têm sugerido que o risco para TV é maior com contraceptivos combinados que contêm progestagênios de terceira geração (gestodeno, desogestrel) comparados com aqueles com progestagênios de segunda geração (levonorgestrel). Esses achados inesperados têm sido alvo de muitos debates sem uma explicação definitiva. Assim, a questão das diferenças nas propriedades de cada progestagênio sobre a hemostasia tem sido levantada. Apesar dos progestagênios não serem associados a alterações marcantes nos parâmetros hemostáticos, existem poucos estudos sobre os efeitos dessas drogas, especialmente os progestagênios de terceira geração, no sistema hemostático. Objetivo: Avaliar o efeito do implante subdérmico de etonogestrel sobre a agregação plaquetária de mulheres hígidas, em seis meses de tratamento. Casuística e Métodos: Vinte e quatro mulheres saudáveis e voluntárias foram selecionadas neste estudo longitudinal e prospectivo, para usar um implante contraceptivo subdérmico de etonogestrel (metabólito biologicamente ativo do desogestrel). A agregação plaquetária foi avaliada em todas as mulheres, exceto uma, no período pré-inserção e após um, três e seis meses da inserção do implante. A agregação plaquetária foi induzida com adrenalina 50 µM, colágeno 10 µg/ml, colágeno 5 µg/ml, ADP 35 µM e ADP 17,5 µM. A análise estatística foi feita com o teste de Wilcoxon para comparar a diferença entre cada período de tratamento com os valores pré-tratamento. Resultados: Houve uma redução transitória, estatisticamente significativa, na mediana do percentual máximo de agregação plaquetária de 27%, 14% e 11%, respectivamente, com colágeno 5 µg/ml, adrenalina 50 µM e colágeno 10 µg/ml, observada um mês após a inserção do implante comparado ao valor pré-inserção (p< 0,05). A agregação plaquetária com esses agonistas retornou ao seu valor basal, após seis meses da inserção. Com outros agonistas, como o ADP 35 µM e ADP 17,5 µM, não se observou o mesmo fenômeno. Conclusão: Os resultados deste estudo mostram, pela primeira vez, que o uso do implante de etonogestrel está associado à redução transitória, mas significativa, da agregação plaquetária, observada em um mês de uso do contraceptivo, a qual retorna a seus valores normais em seis meses da inserção do implante. / Introduction: Several studies have suggested that the risk of venous thromboembolism (VTE) is attributable to the estrogen component of a contraceptive in a dose-dependent manner. Recent epidemiological studies have suggested that the risk of VTE was higher with contraceptives containing third-generation progestagens (desogestrel, gestodene) when compared with second-generation progestagens (levonorgestrel). These unexpected findings have been the subject of many debates with no definitive explanation and the question of differences in hemostatic properties of each progestagen has been raised. Although progestagens are not associated with marked changes in hemostatic variables, there are few studies on the effects of these drugs, especially third-generation progestagens, on the hemostatic system. Objective: To evaluate the acute effect of a long-term contraceptive implant of etonogestrel on platelet aggregation in healthy women. Material and Methods: Twenty-four healthy volunteer women were enrolled in this prospective longitudinal study, to use a subdermal contraceptive implant of etonogestrel (the biologically active metabolite of desogestrel). Platelet aggregation was measured in all users, except one, at baseline and after 1, 3 and 6 months of treatment. Platelet aggregation was induced with 50 µM adrenalin, 10 µg/ml collagen, 5µg/ml collagen, 35 µM ADP and 17,5 µM ADP. Statistical analysis included the Wilcoxon test to compare differences between each period of treatment from baseline. Results: Statistically significant 27%, 14% and 11% reductions of platelet aggregation with 5 µg/ml collagen, 50 µM adrenalin e 10 µg/ml collagen, respectively, were observed at 1 month of treatment (p < 0,05). Platelet aggregation returned to baseline values at 6 months of treatment with these reagents. Platelet aggregation did not show any statistic difference with ADP. Conclusions: The result of this study shows for the first time that an etonogestrel implant is associated with a transitory, but significant, reduction in platelet aggregation after the first month of treatment, which returns to normal values by 6 months of therapy.

O aprendizado e o ensino da cirurgia veterinária envolvem o desenvolvimento de habilidades que podem ser obtidas em laboratórios, por meio de vários modelos já disponíveis, incluindo o treinamento em cadáveres. Nestes, quando comparados aos procedimentos em animais vivos, duas limitações são notadas e frequentemente mencionadas, e referem-se às alterações de consistência dos tecidos e à ausência de sangramento durante o treinamento cirúrgico. Este trabalho foi focado na superação destas questões, por meio da realização da simulação de circulação sanguínea em cadáveres adequadamente preservados, permitindo aos usuários do sistema a possibilidade de treinamento cirúrgico em um modelo mais próximo do animal vivo, viabilizando também o aprendizado e a prática da hemostasia. Depois de desenvolvido o sistema, o mesmo foi utilizado por estudantes de Medicina Veterinária com distintos níveis de experiência, que avaliaram todo o método por meio de questionário, ressaltando também os pontos positivos e negativos observados. Concluiu-se que é possível realizar a simulação de sangramento em cadáveres quimicamente preservados, e que tal sistema foi bem aceito por quem o utilizou, sendo mais uma alternativa para melhor preparar estudantes para as experiências em animais vivos que necessitem de intervenções cirúrgicas. / Veterinary surgery demands skills acquisition and refinement that can be obtained in laboratories using several available models, including training on cadavers. Those, when compared to live animal procedures, two limitations are noted and often mentioned, and are due to tissue consistency alterations and absence of bleeding during surgical training. This work was focused on overcoming these issues, by performing blood flow simulation in properly chemically preserved cadavers, giving users of this system the possibility of surgical training in a model closer to live animal, also enabling learning and practice of hemostasis. After developed the system, it was used by veterinary students with distinct experience levels, evaluating the whole method through a questionnaire, emphasizing positive and negative aspects. It was concluded that bleeding simulation in chemically preserved cadavers is possible, and that such a system was well accepted by those who used it, being an alternative to better prepare students for experiments on live animals that require surgical interventions.

Orientador: Márcia Ferreira da Rosa Sobreira / Coorientador: Annelise Carla Camplesi / Banca: Fábio Nelson Gava / Banca: Sabryna Gouveia Calazans / Resumo: Tumores mamários são frequentes em cadelas e apresenta comportamento biológico semelhante aos que ocorrem nas mulheres, tornando a cadela um excelente modelo de estudo comparativo. Os distúrbios hemostáticos são achados comuns em pacientes humanos com câncer, e os mecanismos que conduzem a ativação da coagulação no câncer envolvem o fator tissular, o fator procoagulante do câncer e as citocinas inflamatórias. E já está bem estabelecido que os componentes da hemostasia, como as plaquetas, proteínas da coagulação e da fibrinólise apresentam um papel importante no crescimento e na progressão do tumor. Assim, o objetivo deste estudo foi realizar a caracterização clínica, hematológica e histopatológica de cadelas acometidas por carcinoma mamário, bem como avaliar a integridade do sistema hemostático, através da mensuração do fibrinogênio plasmático, da contagem total de plaquetas, dos tempos de tromboplastina parcial ativada e de protrombina. Para tanto, foram utilizadas 62 cadelas. Sendo 32 acometidas por carcinoma mamário e 30 cadelas clinicamente e laboratorialmente saudáveis como grupo controle. Foram formados quatro subgrupos de acordo com o tipo e o grau histopatológico, estadiamento clínico e tamanho do tumor. Todas as cadelas acometidas por lesões mamárias foram submetidas ao exame físico das glândulas mamárias, exames de hemograma, testes de coagulação e ao exame de histopatológico. E os proprietários submetidos à anamnese por meio de questionário. A apresentação clínica ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Mammary tumors are frequently found in female dogs. These tumors have shown a biological behavior similar to breast cancer in woman. This makes female dogs an excellent comparative study model. Coagulation disorders are common in human patients with cancer. Hemostasis is activated by inflammatory cytokines, tissue and procoagulant factors. It is well established that coagulation components as platelets and coagulation and fibrinolytic proteins have an important function in the growth an progression of tumors. Thus, the aim of this paper was to characterize clinical, hematological and histopathology female dogs with mammary carcinoma and evaluate the integrity of the hemostatic system by measuring the plasma fibrinogen, the total platelet count, and the activated partial thromboplastin and prothrombin time in female dogs. Sixty-two female dogs were used in this study. Thirty-two had mammary carcinoma and thirty were laboratorial and clinically healthy to be used as the control group. Four groups were formed according to histological type and grade, clinical stage and tumor size. The 32 female dogs with carcinoma were submitted to physical mammary gland, blood count, histopathological examinations and coagulation tests and their owners were submitted to a questionnaire. The clinical characteristics of the diseased dogs were older age, pure breed, not spayed with multiple stage one nodules. Grade I and II mixed carcinomas were the most frequent. In this study, significant diffe... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Aborto espontâneo recorrente (AER) é definido pela presença de três ou mais abortos espontâneos e consecutivos que ocorreram até a 20ª semana de gestação. O AER possui origem multifatorial. Dentre os diversos fatores associados ao AER, alterações na hemostasia podem comprometer o fluxo sanguíneo na placenta e com isso pode aumentar o risco de complicações obstétricas, como o aborto. O objetivo geral deste estudo foi investigar se existe associação entre polimorfismos genéticos (no gene do fibrinogênio (FGB -455G>A e -148C>T), da trombomodulina (THBD 1418C>T), do fator V (F5 1691G>A), da protrombina (F2 20210 G>A), do PAI-1 (SERPINE1 4G/5G) e do TAFI (CPB2<i/> c.505G>A)) e os abortos espontâneos recorrentes (primários e secundários). Os objetivos específicos desse estudo foram: 1- avaliar se existe associação entre os sete polimorfismos e o período em que ocorreram as perdas fetais (precoce ou tardia) e o número de abortos recorrentes; 2- determinar se os haplótipos dos polimorfismos FGB -455G>A e FGB -148C>T estão ou não associados aos abortos primários e secundários. Foram incluídas 256 mulheres com história de abortos espontâneos recorrentes, provenientes do Ambulatório de Obstetrícia da Clínica Obstétrica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP e 264 mulheres saudáveis, sem história de aborto espontâneo e que tiveram pelo menos duas gestações normais (grupo controle), pareadas segundo as idades. Amostras de sangue foram obtidas para realização das genotipagens dos polimorfismos por meio de PCR em tempo real (FGB -148C>T, FGB -455G>A, THBD 1418C>T e CBP2 c.505G>A), e PCR-RFLP (SERPINE14G/5G, F5 1691G>A e F2 20210 G>A). As frequências dos genótipos e de alelos para os sete polimorfismos foram semelhantes entre os grupos aborto primário, aborto secundário e grupo controle. Entretanto, quando foi realizada um modelo de regressão logística multivariada saturada, que incluiu as variáveis independentes: F5 1691G>A (referência GG vs GA), F2 20210G>A (referência GG vs GA), CBP2 c.505G>A (referência GG + GA vs AA), THBD 1418C>T (referência CC + CT vs TT), SERPINE1 4G/5G (referência 5G/5G vs 4G/4G + 4G/5G) FGB -455G>A (referência GG vs GA vs AA) e FGB -148C>T (referência CC vs CT vs TT), apenas o polimorfismo FGB -148C>T foi associado ao maior risco de ter aborto primário (OR: 2,91, IC 95% 1,02 - 8,29, p=0,045). Quando os haplótipos para os polimorfismos FGB -455G>A e FGB 148C>T foram considerados, foi observada maior frequência de haplótipo 455G/148T em mulheres com AER primário (3,4%) do que no grupo controle (1,1%), (p=0,030); porém esse efeito não foi observado no AER secundário. Em relação ao número de abortos consecutivos, houve uma tendência (p=0,060) a maior frequência de genótipo TT para o polimorfismo FGB -148C>T no grupo de aborto primário com até três perdas quando comparado com as mulheres do mesmo grupo, porém com número maior de perdas (>3). Em conclusão, os sete polimorfismos quando analisados separadamente, não foram associados ao AER; no entanto, em modelo multivariado de regressão logística, o genótipo TT do polimorfismo FGB 148C>T foi associado com o aumento do risco de ter AER primário. Além disso, foi encontrado maior frequência do haplótipo 455G/148T para os polimorfismos FGB -455G>A e FGB -148C>T em mulheres com aborto primário. / Recurrent pregnancy loss (RPL) is defined by the presence of three or more consecutive losses prior to 20 weeks of gestation. The RPL has multifactorial origin. Among several factors associated with RPL, changes in hemostasis may impair the blood flow in the placenta and thus may increase the risk of obstetric complications, such as pregnancy loss. The general aim of this study was to investigate the association between genetic polymorphisms (in the genes of fibrinogen (FGB -455G>A and -148C>T), thrombomodulin (THBD 1418C>T), factor V (F5 1691G>A), prothrombin (F2 20210 G>A), PAI-1 (SERPINE1 4G/5G) and TAFI (CPB2 c.505G>A)) and recurrent pregnant losses (primary and secondary). The specific aims of this study were: 1 - to evaluate the association between the seven polymorphisms and the period in which the fetal losses occurred (early or late) and the number of recurrent losses; 2 - to determine if the haplotypes of polymorphisms FGB -455G>A and FGB -148C>T present association with primary and secondary pregnant losses. We included 256 women with a RPL history, from the Ambulatory of Obstetrics from Clinical Hospital of the Medical School of USP and 264 healthy women without losses history that have had at least two normal pregnancies (control group), matched according to age. Blood samples were obtained to perform the genotyping of polymorphisms by real-time PCR (FGB -148C>T, FGB -455G>A, THBD 1418C>T and CBP2 c.505G>A), and PCR-RFLP (SERPINE1 4G/5G, F5 1691G>A and F2 20210G>A). The frequencies of genotypes and alleles for the seven genetic polymorphisms were similar in 3 groups. However, when it was performed a model of multivariate logistic regression, which included the independent variables: F5 1691G>A (GG vs GA reference), F2 20210G>A (GG vs GA reference), CBP2 c.505G>A (GG + GA reference vs AA), THBD 1418C>T (reference CC + CT vs TT), SERPINE1 4G/5G (reference 5G/5G + 4G/5G vs 4G/4G), FGB -455G>A (GG reference vs GA vs AA) and FGB - 148C>T (reference CC vs CT vs TT), only the polymorphism FGB 148C>T polymorphism was associated with a higher risk of having primary losses (OR: 2.91, 95% CI 1.02 to 8.29, p = 0.045). When the haplotypes for the polymorphisms FGB -455G>A and FGB -148C>T were considered, had a higher frequency of the haplotype 455G/148T in women with primary RPL (3.4%) than in the control group (1.1%) (p = 0.030); but this effect was not observed in secondary RPL. Regarding the number of successive pregnant losses, there was a trend (p = 0.060) to higher frequency of the TT genotype for FGB -148C>T polymorphism in the group with primary RPL up to three losses when compared with women of the same group, but with loss number higher than three. In conclusion, when the seven genetic polymorphisms were evaluated separately, they do not show association with RPL, however, in multivariate logistic regression analysis, the TT genotype of the FGB -148C>T polymorphism was associated with increased risk for primary RPL. Furthermore, it was found higher frequency of the haplotype 455G/148T for the FGB -455G>A and FGB -148 C>T polymorphisms in women with primary RPL.

A Coagulação Intravascular Disseminada (CID) é uma síndrome caracterizada pela ativação sistêmica da coagulação sanguínea, levando à trombose microvascular difusa e podendo comprometer a função de múltiplos órgãos. O acelerado consumo de plaquetas e fatores de coagulação pode, no entanto, dar origem a um estado de hipocoagulabilidade, o que confere à CID uma característica paradoxal na qual o excesso de coagulação pode causar uma diátese hemorrágica. Doenças que levam à Síndrome de Resposta Inflamatória Sistêmica (SIRS) estão entre os principais gatilhos da CID. A pancreatite é uma dessas doenças. O maior desafio para o médico veterinário é diagnosticar a CID na fase precoce, silenciosa e de hipercoagulabilidade, visto que os testes laboratoriais de rotina, como contagem de plaquetas, tempo de protrombina (TP) e tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA), detectam apenas o estado de hipocoaguabilidade, que se estabelece na fase mais avançada da síndrome. Nesse contexto ganham importância os analisadores tromboelastográficos, equipamentos que avaliam a coagulação em sangue total e que, ao menos em tese, podem informar a velocidade de formação do coágulo, a força máxima que ele atinge e os padrões de sua dissolução. Este estudo é o primeiro realizado em cães com o aparelho ReoRox G2 (MediRox), uma da marcas disponíveis no mercado. Limites de referência para as variáveis do aparelho foram definidos a partir da análise do sangue de 49 animais clinicamente saudáveis para três tipos de reação: acelerada com fator tecidual (TF), acelerada com TF e um antagonista de agregação plaquetária (abciximab) e apenas com sangue recalcificado. Em seguida, foram comparados a esse intervalo de referência os valores obtidos pela análise tromboelastográfica do sangue de seis pacientes com pancreatite recém-diagnosticada. Nos três tipos de reação pelo menos 50% dos pacientes do Grupo Pancreatite apresentaram alterações sugestivas de hipercoagulabilidade. A variável MAXELAST (força máxima do coágulo) foi a que esteve alterada com mais frequência entre os animais doentes. Não houve alteração nos marcadores de velocidade de fibrinólise. Estudos prospectivos que associem outras variáveis de trombose, protocolos de tratamento e prognóstico de pacientes com doenças subjacentes que predisponham à CID são necessários para que se possa afirmar que o traçado obtido pela tromboelastografia realmente representa um estado de hipercoagulabilidade in vivo em pacientes com pancreatite. / Disseminated Intravascular Coagulation (DIC) is a syndrome characterized by systemic activation of blood clotting, leading to diffuse microvascular thrombosis and may compromise multiple organ function. The accelerated consumption of platelets and coagulation factors may, however, originate a state of hypocoagulability, which gives the DIC a paradoxical characteristic in which excess coagulation can lead to a hemorrhagic diathesis. Diseases which cause Systemic Inflammatory Response Syndrome (SIRS) are among the major triggers of DIC, including pancreatitis. The greatest challenge for veterinarians is to diagnose DIC in the early, silent and hypercoagulable phase, since routine laboratory tests, such as platelet count, prothrombin time (PT) and activated partial thromboplastin time (APTT), detect only the state of hypocoagulability, which occurs in the most advanced stage of the syndrome. In this context, thromboelastography analyzers stand out. They are equipment which evaluate coagulation in whole blood and, at least in theory, inform the speed of clot formation, its maximum force and how it dissolves. This is the first study performed in dogs with the ReoRox G2 (MediRox), one of the brands available in the market. Limits of reference were defined from blood analysis of 49 healthy animals for three reaction types: accelerated with tissue factor (TF), accelerated with TF and a platelet aggregation antagonist (abciximab) and with only recalcified blood. Next, values obtained by blood thromboelastographic analysis of six patients with newly diagnosed pancreatitis were compared to this reference range. In all three types of reactions, at least 50% of patients in the Pancreatitis Group presented alterations suggestive of hypercoagulability. The variable MAXELAST (maximum clot strength) was the one that was most frequently altered among ill animals. There was no change in fibrinolysis rate markers. Prospective studies associating other thrombosis variables, treatment protocols, and prognosis of patients with underlying diseases predisposing to DIC are necessary to confirm that the pathway obtained by thromboelastography actually represents a state of hypercoaguability in vivo in patients with pancreatitis.

O Lopap é um ativador de protrombina da lagarta L. obliqua, pertence à família das lipocalinas e apresenta atividade antiapoptótica. O Lopap foi obtido na forma recombinante (rLopap), na levedura P. pastoris, por metodologia escalonável, e sua atividade foi avaliada in vitro e in vivo. O tratamento com rLopap reduziu o tempo de sangramento em animais anticoagulados com enoxaparina. Por outro lado, um peptídeo derivado do Lopap, designado antiapoptotic peptide (AP), foi capaz de induzir a síntese de colágeno em cultura de fibroblastos e na derme de animais. A região correspondente a AP apresentou propriedades físicas e estruturais semelhantes a seqüências relacionadas em outras lipocalinas com atividade antiapoptótica. Estes resultados abrem perspectivas para aplicações do Lopap, como uma molécula procoagulante, e de AP, através de sua ação na modulação celular, como um componente cosmético, no reparo e remodelamento tecidual e em disfunções que envolvem morte celular e perda de colágeno. / Lopap is a prothrombin activator from the L. obliqua caterpillar, belongs to the lipocalin family, and displays antiapoptotic activity. Lopap was obtained in the recombinant form (rLopap) in the P. pastoris yeast, by a scaled up methodology, and its activity was evaluated in vitro and in vivo. Treatment with rLopap reduced the bleeding time in animals anticoagulated with enoxaparin. On the other hand, a Lopap-derived peptide, designated antiapoptotic peptide (AP), was able to induce collagen synthesis in fibroblast culture and in the animal dermis. The region corresponding to AP had similar physical and structural properties when compared with other antiapoptotic lipocalins. These results open perspectives for the use of Lopap, as a procoagulante molecule, and the use of AP, based on its cell modulation effects, as a cosmetic component, aiding tissue repair and in dysfunctions involving cell death and loss of collagen.

As serinoproteases de peçonha de serpentes (SVSPs) agem sobre pontos específicos do sistema circulatório, sendo consideradas promissoras para o tratamento de uma diversidade de desordens hemostáticas. No presente estudo, é descrita a expressão de uma serinoprotease de Crotalus durissus collilineatus (Collineina-1) em Pichia pastoris, bem como a purificação dessa toxina a partir da peçonha de C. d. collilineatus e a caracterização estrutural e enzimática da Collineina-1 nas formas nativa e recombinante. O cDNA que codifica a serinoprotease foi amplificado a partir da biblioteca de cDNA da glândula de peçonha de C. d. collilineatus e ligado ao vetor pPICZ A. A linhagem KM71H de P. pastoris foi transformada com o plasmídeo recombinante e as colônias foram selecionadas por resistência à zeocina. A expressão heteróloga foi realizada em meio mínimo suplementado com metanol, resultando em um rendimento de 56 mg de proteína por litro de cultura. A proteína recombinante foi purificada por um protocolo baseado em técnicas cromatográficas de troca iônica e fase reversa. A purificação da serinoprotease a partir da peçonha de C. d. collilineatus foi realizada pela combinação de técnicas de cromatografia de exclusão molecular, troca iônica e fase reversa, e resultou no isolamento de duas isoformas, denominadas Collineina-1 e 2. Quando analisada por espectrometria de massas, a Collineina-1 recombinante apresentou massa molar de 28.868 Da, enquanto as enzimas Collineina-1 e 2 apresentaram massas de 29.475 Da e 29.388 Da, respectivamente. A partir do alinhamento das sequências parciais das serinoproteases, foi possível determinar 100% de identidade dos aminoácidos para a Collineina-1 nativa e recombinante. O alinhamento múltiplo da sequência deduzida de aminoácidos da Collineina-1 indica uma semelhança estrutural dessa proteína com outras serinoproteases de peçonha de serpente. As enzimas nativa e recombinante mostraram efeitos similares sobre fibrinogênio bovino por clivarem preferencialmente a cadeia A do fibrinogênio, liberando o fibrinopeptídeo A. Ambas as enzimas induziram a coagulação do plasma bovino de forma dose-dependente, sendo que a Collineina-1 recombinante apresentou maior potencial coagulante, com uma dose mínima coagulante (DMC) de 0,08 mg/uL contra 0,225 mgu/L para a proteína nativa. As serinoproteases foram capazes de hidrolisar os substratos cromogênicos S-2222, S-2238 e S2302, embora ambas as enzimas tenham demonstrado maior atividade sobre o substrato S-2302. A atividade esterásica sobre o TAME foi avaliada em diferentes condições de temperatura e na presença de íons divalentes. As duas enzimas demonstraram alta termoestabilidade e tiveram a atividade inibida na presença dos íons Zn2+ e Cu2+. A cinética enzimática de ambas as serinoproteases seguiram o modelo de Michaelis-Menten. A Collineina-1 nativa apresentou um valor de Km de 1,43 mM, contra 1,682 mM para a proteína recombinante, indicando que a proteína nativa apresenta maior afinidade pelo substrato TAME. No entanto, as enzimas apresentaram valores similares de Kcat/Km (250,69 mM.min-1 para a Collineina-1 e 248,03 mM.min-1 para a rCollineina-1), sugerindo que as serinoproteases não diferem significativamente na eficiência em hidrolisar o substrato. Estes resultados demonstraram a adequação do sistema de escolha na produção heteróloga da Collineina-1, já que a proteína recombinante foi expressa com integridade funcional sobre os parâmetros avaliados. / Snake venom serine proteases (SVSPs) act on specific points of the circulatory system and are promising for the treatment of a variety of hemostatic disorders. In the present study, we describe the expression of a serine protease from Crotalus durissus collilineatus (Collineina- 1) in Pichia pastoris, the purification of the native toxin from C. d. collilineatus venom and the structural and enzymatic characterization of Collineina-1 in native and recombinant forms. The cDNA encoding the serine protease was amplified from cDNA library of C. d. collilineatus venom gland and cloned into pPICZ A vector. KM71H P. pastoris strain was transformed with the recombinant plasmid and colonies were selected by zeocin resistance. Heterologous expression was carried out in minimal medium supplemented with methanol, resulting in a yield of 56 mg of protein per liter of culture. The recombinant protein was purified by ion exchange and reverse phase chromatography. Purification of the native serine protease was accomplished by combining techniques of molecular exclusion, ion exchange and reversed phase, and resulted in the isolation of two isoforms, named Collineina-1 and 2. When analyzed by mass spectrometry, the recombinant Collineina-1 showed a molar mass of 28,868 Da, while Collineina-1 and 2 presented masses of 29,475 and 29,388 Da, respectively. The alignment of partial sequences of the enzymes resulted in 100% of amino acid identity between native and recombinant Collineina-1. The multiple alignment of deduced amino acid sequence of Collineina-1 indicates structural similarity with other snake venom serine proteases. The native and recombinant forms of the enzyme showed similar effects on bovine fibrinogen by cleaving preferentially A chain, releasing fibrinopeptide A. Both enzymes induced coagulation of bovine plasma in a dose-dependent way, though recombinant Collineina-1 presented a higher coagulant potential, with a minimum coagulant dose (MCD) of 0.08 mg/uL against 0.225 mg/uL for the native form. The serine proteases hydrolyzed S- 2222, S-2238 and S2302 chromogenic substrates, although both enzymes demonstrated increased activity upon S-2302. The esterase activity on TAME was evaluated at different temperatures and in the presence of divalent ions. Both enzymes showed high thermostability and their activity were inhibited in the presence of Zn2+ and Cu2+. The enzyme kinetics of both serine proteases followed Michaelis-Menten model. The native Collineina-1 showed a Km value of 1.43 mM, against 1.682 mM for the recombinant form, indicating that the native protein has a higher affinity for TAME substrate. However, enzymes had similar values for Kcat/Km (250.69 mM.min-1 for Collineina-1 and 248.03 mM.min-1 for rCollineina-1), suggesting that the serine proteases did not differ significantly in the efficiency to hydrolyze the substrate. These results demonstrated the adequacy of the system of choice in producing the snake venom serine protease, since the recombinant protein was expressed with functional integrity on the evaluated parameters.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The objective of this experiment was to document the postoperative evolution of New Zealand rabbits that underwent a hemi laminectomy surgery (T13-L1) and received a graft of autogenous muscle as an hemostatic agent into the spinal canal. These animals were followed for a period of 14 and 28 days with daily neurological assessments and, at the end of their follow-up period, were euthanized in order to remove the graft site to be examined microscopically. The animals were divided into 6 groups such as the control group A and B, C and D treated with 25% decrease of the medullary canal and, E and F treated with 50% decrease of the medullary canal. All groups were evaluated neurologically every day until euthanasia. Groups A, C and E were euthanized at 14 days after the surgery and groups B, D and F at 28 days. The segments T11-L3 vertebral column of all the rabbits were collected and sent for histopathological examination. In order to evaluate the neurological postoperative effect, the animals were classified daily by the Tarlov scale and the results were compared by nonparametric Kruskal-Wallis test for each time (days). There was no statistical difference among the groups. Histopathological examination showed the presence of muscle grafted in the spinal canal and the spinal cord compression caused by the graft. / A hemorragia é uma preocupação importante em pacientes submetidos a intervenção cirúrgica descompressiva da medula espinhal ou de estabilização na coluna vertebral. O objetivo desse experimento foi documentar a evolução pós-operatória de coelhos Nova Zelândia que sofreram hemilaminectomia (T13-L1) e receberam um segmento de músculo autógeno como agente hemostático dentro do canal vertebral. Os animais foram separados em seis grupos sendo os grupos A e B controle, C e D tratados com diminuição de 25% do canal medular e E e F tratados com diminuição de 50% do canal medular. Todos os coelhos tiveram avaliação neurológica diária até a eutanásia. Aqueles dos grupos A, C e E sofreram eutanásia aos 14 dias de pós-operatório e os demais (B, D e E) aos 28 dias. Os segmentos T11-L3 da coluna vertebral contendo a medula espinhal de todos os coelhos foram coletados e enviados para exame histopatológico. Para avaliação neurológica no pós-operatório, os animais foram classificados diariamente pela escala de Tarlov e os resultados foram comparados entre eles pelo teste não paramétrico de Kruskal-Wallis para cada tempo (dia). Não houve diferença estatística da avaliação neurológica entre os grupos estudados. O exame histopatológico demonstrou a presença do músculo transplantado no canal vertebral e a compressão da medula espinhal provocada pelo enxerto.