Orientador: Josimeri Hebling / Resumo: Dentes bovinos têm sido utilizados como substitutos aos dentes humanos, especialmente em pesquisas sobre adesão. Entretanto, ainda não foi demonstrada se a degradação do colágeno de ambos os substratos ocorre na mesma intensidade/velocidade. Portanto, esse estudo comparou a atividade de metaloproteinases da matriz (MMPs) e a degradação da matriz dentinária de dentes bovinos versus humanos. A coroa de dentes humanos e bovinos foram seccionadas para a obtenção de espécimes de dentina (0,5x1,0x4,0 mm). Todos os espécimes (n=30/tipo de dente) foram completamente desmineralizados em ácido fosfórico. Quinze espécimes foram aleatoriamente selecionados para a análise da atividade total de MMPs por método colorimétrico, e os restantes foram utilizados para a análise de perda de massa seca em balança microanalítica. Concluídas as análises iniciais, os espécimes foram armazenados em saliva e as análises, perda de massa seca e MMPs, foram repetidas após 7, 14 e 21 dias. Em cada período, a saliva foi coletada para a análise da liberação de hidroxiprolina por meio de teste colorimétrico. Os dados foram submetidos aos testes de Friedman, Wilcoxon para medidas repetidas e Mann-Whitney (p<0,05). A atividade inicial de MMPs foi similar dentre os dois substratos, com redução significante em função do tempo, especialmente após 7 dias de armazenamento. Aos 7, 14 e 21 dias de análise, a atividade de MMPs foi mais intensa para a dentina bovina. Aos 7 dias houve elevada liberação de hidroxiprolina p... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Bovine teeth have been often used as a substitute for human teeth in studies about enamel and dentin adhesion. However, it has not yet been shown if the degradation of collagen of both substrates occurs at the same intensity and rate. Therefore, this study compared the total activity of matrix metalloproteinases (MMPs) and the degradation rate of dentin matrix from bovine versus human teeth. The crowns of human and bovine teeth were sectioned to obtain specimens of dentin (0.5x1.0x4.0mm). All specimens (n=30/tooth type) were completely demineralized in phosphoric acid. Fifteen specimens were randomly selected for the total MMPs activity analysis by a colorimetric method, while the remaining specimens were used to determine the loss of dry mass in a microanalytical balance. Once the initial analyses were concluded, the specimens were stored in saliva-like solution, and both analyzes, dry mass and MMPs activity, were repeated after 7, 14 and 21 days. In each period, the saliva was collected to determine the amount of hydroxyproline released by means of a colorimetric assay. The data were submitted to Friedman, repeated-measures Wilcoxon and Mann-Whitney tests (p<0.05). Similar initial MMP activity was seen between the two substrates, with a significant reduction over time, especially after 7 days. At 7, 14 and 21 days, bovine dentin had a higher proteolytic activity. After 7 days, there was a high hydroxyproline release for both substrates, with significantly higher amounts see... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Prof. Dr. Jorge R. Ribas Timi / Coorientador: Prof. Dr. Jorge Eduardo Fouto Matias / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Clínica Cirúrgica. Defesa: Curitiba, 08/07/2016 / Inclui referências: f. 66-71 / Área de concentração : Nutrição e cicratização / Resumo: INTRODUÇÃO: a cicatrização de feridas é um processo dinâmico que envolve vários fenômenos biológicos e bioquímicos os quais podem ser minimizados em condições patológicas ou melhorados pela oferta de fatores de crescimento ou de condições de crescimento teciduais. O óxido nítrico como o produto da reação de óxido-redução da arginina (ARG) estimula a proliferação dos angioblastos, células precursoras do endotélio. Consequentemente ocorre formação de novos vasos sanguíneos no tecido e possivelmente coopera para a melhora do processo cicatricial. OBJETIVO: avaliar os efeitos da arginina na cicatrização da parede abdominal em ratos Wistar. MÉTODO: utilizaram-se vinte ratos Wistar, submetidos à laparotomia-laparorrafia e separados em dois grupos. No grupo arginina receberam tratamento diário, por cinco dias, com ARG (300mg/kg/dia) via intraperitoneal. No grupo controle foram tratados diariamente com solução tampão fosfatos em dose equivalentes ao peso, pela mesma via do grupo arginina. No sétimo dia pósoperatório coletaram-se amostras de sangue e a cicatriz da parede abdominal de ambos os grupos. Avaliaram-se o nível sérico de nitratos e nitritos, a evolução cicatricial pelas dosagens de hidroxiprolina tecidual, formação de tecido de granulação, determinação da porcentagem de colágeno maduro e imaturo, densidade de miofibroblastos e angiogênese. Empregaram-se os testes de ANOVA e T-Student com p 0,05 para as comparações entre os grupos. RESULTADOS: entre os grupos controle e tratado por arginina, não ocorreram diferenças significantes nas dosagens de nitratos e nitritos (p=0,9903), hidroxiprolina tecidual (p=0,1315) e na densidade de miofibroblastos (p=0,0511). O grupo arginina apresentou maior densidade microvascular (p=0,0008), maior porcentagem de colágeno tipo I (p=0,0064) e melhora na formação do tecido de granulação com melhores índices de proliferação angiofibroblástica (p=0,0007) e reepitelização das bordas (0,0074). CONCLUSÃO: na avaliação cicatricial da parede abdominal de ratos Wistar sob tratamento com arginina por sete dias não houve alteração do nível sérico de nitratos e nitritos, da deposição de colágeno total e da densidade de miofibroblastos. Verificaram-se aumento da maturação de colágeno do tipo I, da densidade microvascular e melhora na formação do tecido de granulação cicatricial pelas melhores reepitelização de bordas e proliferação angiofibroblástica. Descritores: arginina, cicatrização, hidroxiprolina, angiogênese, CD34, miofibroblastos, colágeno tipo I, picro-sirius, anti actina alfa, nitratos e nitritos, ratos Wistar, parede abdominal. / Abstract: INTRODUCTION: wound healing is a dynamic process involving several biological and biochemical phenomena which can be minimized in pathological conditions or improved if a correct supply of growth factors or proper tissue growing conditions are in course. Nitric oxide as the product of the arginine (ARG) reduction reaction stimulates the proliferation of angioblasts, endothelial cell precursors. Consequently there is formation of new blood vessels in the reparation tissue that, probably, improves the healing process. OBJECTIVE: to evaluate the effects of arginine on the abdominal wall healing process in rats. METHOD: the study was approved by the Ethics Committee for Animal Research according to the 012/11 HAC protocol. Twenty Wistar rats underwent laparotomy-laparorrhaphy and were separated into two groups. In the arginine group 10 rats received daily treatment for five days, with ARG (300mg / kg / day) intraperitoneally. In the control group the other 10 rats were treated daily with phosphate buffer solution at a dose equivalent to the weight, by the same administration way of the arginine group. On the seventh postoperative day blood samples and the surgical wound of the abdominal wall were collected in both groups. Serum levels of nitrates and nitrites, the scar evolution by measurements of tissue hydroxyproline, granulation tissue formation, the percentage of mature and immature collagen, myofibroblast density and angiogenesis were evaluated. ANOVA and T-Student tests with p 0.05 were employed for comparisons between groups. RESULTS: there were no significant differences in dosages of nitrates and nitrites (p=0,9903), tissue hydroxyproline (p=0,1315) and myofibroblast density (p=0,0511) between the groups. The arginine group had a higher microvascular density (p=0,0008), higher percentage of type I collagen (p=0,0064) and improve in the granulation tissue formation with better angiofibroblastic proliferation index (p=0,0007) and better edges re-epithelialization of the wound (0,0074). CONCLUSION: wound healing evaluation in the abdominal wall of Wistar rats under treatment with arginine, there were no changes in serum levels of nitrates and nitrites, the total collagen deposition and myofibroblasts density. There were increase of type I collagen maturation, microvascular density and improved granulation tissue formation by better edges reepitelization and angiofibroblastic proliferation. Keywords: arginine, wound healing, hydroxyproline, angiogenesis, CD34, myofibroblasts, collagen type I, Sirius red, anti actin alpha, nitrates and nitrites, Wistar rats, abdominal wall.

O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da remoção seletiva da lesão de cárie utilizando laser de Er:YAG, seguida da biomodificação da dentina com quitosana. Os objetivos específicos foram: 1) Avaliar os elementos químicos e a morfologia da superfície dentinária, bem como, a microdureza da subsuperfície (experimento 1) e 2) Avaliar a resistência de união da interface resina/dentina e sua morfologia após 24h, 6 e 12 meses de envelhecimento dos espécimes, a perda de massa seca e a resistência à degradação do colágeno (experimento 2). Lesões de cárie em dentina foram criadas pelo método de ciclagem do pH (14 dias) em 208 espécimes bovinos. Os espécimes foram divididos de acordo com método de remoção seletiva da lesão de cárie: broca (em baixa rotação) ou laser de Er:YAG (250 mJ/4Hz). Os espécimes receberam ácido fosfórico a 35%, e foram subdivididos de acordo com a biomodificação da dentina: sem biomodificação ou quitosana a 2,5%. No experimento 1, os espécimes foram submetidos às análises de Espectroscopia Eletrônica de Análise Química (EDS) e Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) da superfície e microdureza da subsuperfície dentinária. No experimento 2, os espécimes foram submetidos a resistência de união à microtração e MEV da interface adesiva após 24h, 6 e 12 meses de armazenamento em água, avaliação da perda de massa seca e liberação de hidroxiprolina (HYP). Os dados foram analisados por meio de testes paramétricos e não paramétricos (=0.05). A remoção seletiva da lesão de com laser de Er: YAG promoveu aumento da microdureza da dentina afetada (p=0,03) e redução na quantidade de Ca (0<0,0001) e P (0<0,0001). A biomodificação com quitosana não influenciou a microdureza (0,0796) e a porcentagem atômica dos elementos Ca (p=0,2269) e P (p=0,8842) presentes na dentina residual. A análise em MEV mostrou alterações morfológicas na superfície de dentina (p>0,05). Após 24h, os maiores valores de resistência de união foram obtidos para a broca em comparação ao laser Er:YAG (p<0,001). Após 6 meses, os métodos foram semelhantes (p=0,432) e após 12 meses a resistência de união à dentina irradiada foi significativamente maior do que à dentina tratada com broca (p=0,025). A biomodificação com quitosana aumentou significativamente a resistência de união à dentina após 6 (p=0,011) e 12 meses (p<0,001). A análise em MEV mostrou que a biomodificação com quitosana preservou a interface adesiva após 12 meses de armazenamento. A perda de massa seca (p>0,664; p>0,263) e a liberação de hidroxiprolina (p>0,6347; p>0,4274) não foram influenciadas, respectivamente, pelo método de remoção da cárie ou pela biomodificação dentinária. A remoção seletiva da dentina cariada com o laser de Er: YAG aumentou a microdureza da dentina afetada por cárie, alterando sua morfologia superficial e composição química. A biomodificação com quitosana não influenciou a composição estrutural e química da dentina residual. Após 24h de armazenamento em gua, a resistência de união da resina composta à dentina foi afetada pelo laser de Er:YAG. No entanto, a resistência de união à dentina irradiada foi mantida, enquanto a dentina tratada com broca apresentou redução contínua. A biomodificação com quitosana, independente do método de remoção utilizado, preservou a resistência de união e a interface adesiva ao longo de 12 meses. O laser de Er:YAG e a biomodificação com quitosana não influenciaram na perda de massa seca e na liberação de hidroxiprolina / The aim of this study was to evaluate the effect of Er:YAG laser for selective removal of carious lesion, followed by biomodification with chitosan. The specific objectives were: 1) To evaluate the chemical elements and the morphology of the dentin surface, as well as, the subsurface microhardness (Experiment 1). 2) To evaluate the microtensile bond strength (TBS) and adhesive interface after 24h, 6 and 12 months of water storage, the dry mass loss and dentin collagen degradation (Experiment 2). Dentinal caries lesions were created in 208 bovine specimens by pH-cycling method (14 days). Specimens were divided according to the carious removal method: bur (low-speed handpiece) or Er:YAG laser (250 mJ/4Hz). Specimens were treated with 35% phosphoric acid and were subdivided according to dentin biomodification: without chitosan (control) and 2.5% chitosan. For the experiment 1, specimens were submitted to Energy Dispersive X-Ray Spectroscopy (EDS) and Scanning Electron Microscopy (SEM) and subsurface microhardness of the dentin. For the experiment 2, specimens were submitted to microtensile bond strength and SEM analysis of the adhesive interface after 24h, 6 and 12 months of storage in water, evaluation of dry mass loss and hydroxyproline release (HYP). Data were analyzed by parametric and non-parametric tests (=0.05). The selective caries removal with Er:YAG laser increased the microhardness value of caries-affected dentin (p=0.03) and reduced the amounts of Ca (0<0.0001) and P (0<0.0001). The biomodification with chitosan did not influence the microhardness (0.0796) and atomic percentage of Ca (p=0.2269) and P (p=0.8842) of residual dentin. SEM analysis showed morphological changes on dentin surface (p>0.05). After 24h, the highest bond strength values were found for bur compared to Er:YAG laser (p<0.001). After 6 months, methods were similar (p=0.432) and after 12 months, the highest bond strength values were found for Er:YAG laser-irradiated dentin (p=0.025). Biomodification with chitosan significantly increased bond strength to dentin after 6 (p=0.011) and 12 months (p<0.001). SEM analysis showed that the biomodification with chitosan preserved the adhesive interface after 12-month storage. The dry mass loss (p>0.664; p>0.263) and HYP release (p>0.6347; p>0.4274) were not influenced, respectively, by the carious removal method or by dentin biomodification. The selective removal of carious dentin with Er:YAG laser increased microhardness of residual caries-affected dentin changing its surface morphology and chemical composition. The biomodification with chitosan did not influence the structural and chemical composition of residual dentin. After 24 hours of water storage, the composite resin bond strength to dentin was affected by Er:YAG laser. However, the bond strength to irradiated-dentin was maintained, while the bur-treated dentin showed a continuous reduction. Biomodification with chitosan, regardless of removal method used, preserved the bond strength and adhesive interface over 12 months. The dry mass and the hydroxyproline release were not influenced

As metaloproteinases da matriz (MMPs) são uma família de endopeptidades cálcio e zinco dependentes que participam da degradação de praticamente todos os componentes da matriz extracelular. Com o pressuposto de que estas enzimas podem estar relacionadas à progressão da erosão dental e que os agentes ácidos causadores da erosão podem influenciar na ativação das MMPs, o objetivo desse estudo in vitro foi avaliar a influência do pH sobre a atividade funcional das MMP-2 e -9 presentes na dentina coronária e radicular humana. O pó das dentinas coronária e radicular, provenientes de terceiros molares inclusos recém extraídos foi obtido separadamente e submetido ao protocolo de extração das proteínas, com ácido fosfórico a 1%. Após, o extrato contendo as proteínas e o pó de dentina parcialmente desmineralizado foram incubados em uma das respectivas soluções: solução 2 mM de APMA (acetato de 4-aminofenilmercúrio / grupo controle) ou em uma das soluções tampão (fosfato de potássio 0.1 M) com diferentes pHs (2.5, 4.5, 5.0, 6.0 e 7.0). Após a incubação, as proteínas foram separadas por eletroforese, em um gel de poliacrilamida copolimerizado com gelatina, para a avaliação da atividade gelatinolítica das MMPs, por zimografia. Esta análise foi realizada em triplicada e os zimogramas obtidos ao final foram avaliados por densitometria. A quantificação das bandas observadas nos zimogramas foi realizada pelo programa de imagens ImageJ e os dados avaliados de maneira descritiva e qualitativa. Para a avaliação do conteúdo de colágeno solubilizado, o pó de dentina parcialmente desmineralizado e incubado nos respectivos pHs (n = 8) foi mantido em um tampão de incubação durante 24h, e o conteúdo de hidroxiprolina (HYP) liberado neste meio foi mensurado em espectrofotômetro. Os dados obtidos foram avaliados estatisticamente por ANOVA 1 fator, seguido do teste de Tukey, com 5% de significância. A análise por zimografia mostrou bandas evidentes correspondente a MMP-2 na sua forma ativa (66kDa) e bandas menos expressivas relacionadas a sua forma latente (72kDa), tanto para a dentina coronária quanto para a radicular, em todos os grupos experimentais. Não foram identificadas bandas correspondentes a MMP-9, para nenhum dos substratos avaliados. As soluções com os menores pHs (2.5, 4.5 e 5.0) resultaram na maior atividade funcional da MMP-2, em comparação as soluções com os maiores pHs (6.0 e 7.0), em ambos os substratos. Para a análise de HYP, os grupos pH 2.5 e pH 4.5 mostraram valores de absorbância abaixo do limite de detecção do aparelho. Para os demais grupos experimentais, tanto para a dentina coronária quanto para a radicular, foram encontradas diferenças estatisticamente significantes entre eles (p < 0,05). O conteúdo de HYP liberada foi maior para o pH 7.0, comparado aos demais grupos (p < 0,05), exceto para o pH 6.0. Não foi encontrada diferença estatisticamente significante entre os grupos pH 6.0, pH 5.0 e controle (p > 0,05). Conclui-se que a atividade funcional da MMP-2 é dependente do pH. Os menores pHs promoveram um aumento na ativação da MMP-2 da dentina coronária e radicular humana. Nota-se em pHs próximos ao neutro, uma maior degradação da matriz orgânica dentinária desmineralizada por essas enzimas endógenas. / Matrix metalloproteinases (MMPs) are a family of endopeptidades calcium and zinc dependent that participate in the degradation of pratically all components of the extracellular matrix. With the assumption that these enzymes may be related to the progression of dental erosion and acidic agents that cause erosion can influence the activation of MMPs, the aim of this in vitro study was to evaluate the pH-influence on the functional activity of MMP-2 and -9 present in human coronal and root dentin. The powder of root and coronal dentine, from freshly extracted third molars was separately obtained and subjected to protein extraction protocol, with 1% phosphoric acid. After, the extract containing proteins and the partially demineralized powder were incubated in one of the following solutions: 2 mM APMA (4-aminophenylmercuric acetate / control) or one of the buffer solutions (0.1 M potassium phosphate) with different pHs (2.5, 4.5, 5.0, 6.0 and 7.0). After incubation, the proteins were separated by electrophoresis in a polyacrylamide gel copolymerized with gelatin, to evaluate the gelatinolytic activity of MMPs by means of zymography. This analysis was performed in triplicate and the zymograms obtained were evaluated by densitometry. Quantification of the bands observed in zymograms was performed by ImageJ software and the data were evaluated descriptively and qualitatively. To assess the solubilized dentin collagen, the partially demineralized dentin powder treated with different pHs (n=8) was incubated in an artificial saliva for 24 h, and the amount of hydroxyproline (HYP) released in media was measured by spectrophotometer. Data were statistically analyzed by ANOVA one factor, followed by the Tukey\'s test, with 5% significance. Zymography showed evident bands corresponding to active MMP-2 (66kDa) and less expressed bands related to its latent form (72kDa), for both coronal and root dentin, in all experimental groups. No bands corresponding to MMP-9 were identified, for both substrates. The lowest pH solutions (2.5, 4.5 and 5.0) yielded the higher functional activity than did the highest pH solutions (6.0 and 7.0), for both substrates. For HYP analysis, the groups pH 2.5 and pH 4.5 showed absorbance values below the detection limit of the equipment. For the other groups, for both coronal and root dentin, statistically significant diferences were found between them (p<0.05). The amount of HYP was higher for pH 7.0 than all other groups (p<0.05), except for pH 6.0. No statistical difference was found between pH 6.0, pH 5.0 and control (p>0.05). It can be concluded that the functional activity of MMP-2 is pH-dependent. Low pH solutions are able to increase the activation of human coronal and root MMP-2. It is noted in pHs close to neutral, a higher degradation of demineralized dentin organic matrix by these endogenous enzymes.

Submitted by Andrea Maselli (deamaselli@yahoo.com.br) on 2018-01-19T20:23:34Z No. of bitstreams: 2 Tese PDF Impressão.pdf: 1825558 bytes, checksum: 52a8a536c671378887d7f638e8244a82 (MD5) Tese PDF Impressão.pdf: 1825558 bytes, checksum: 52a8a536c671378887d7f638e8244a82 (MD5) / Approved for entry into archive by Silvana Alvarez null (silvana@ict.unesp.br) on 2018-01-23T19:31:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 maselli_a_me_sjc.pdf: 1719458 bytes, checksum: 9bbc488c5915b3ba270ef7fd508729ab (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-23T19:31:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 maselli_a_me_sjc.pdf: 1719458 bytes, checksum: 9bbc488c5915b3ba270ef7fd508729ab (MD5) Previous issue date: 2017-12-17 / A mensuração da degradação de colágeno radicular é um importante parâmetro para avaliar a progressão de cáries na dentina ou a eficácia de métodos terapêuticos na prevenção de lesões não cariosas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a degradação do colágeno da dentina radicular frente a métodos de prevenção de cárie, utilizando o teste da Hidroxiprolina e a microradiografia. Foram obtidos 40 blocos de dentina radicular com aproximadamente 1,5 mm de profundidade x 6 mm de diâmetro, a partir de incisivos bovinos, os quais foram submetidos ao processo de desmineralização artificial em tampão acetato (pH=5), a fim de induzir a formação de uma lesão cariosa. Em seguida as amostras foram submetidas aos tratamentos preventivos de cárie radicular: 1) Clorexidina 0,12% 1 min, 2) Flúor neutro 2% 1 min, 3) Nd: YAG Laser- 60 mJ 10 s e 4) Água Deionizada (controle) 1 min. Após os tratamentos as amostras foram expostas à degradação pela enzima colagenase (Tipo VII, Produto No. C0773, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) por um período de 5 dias. Ao final do desafio da colagenase, a solução contendo a enzima foi coletada para ser submetida ao teste da hidroxiprolina, para a mensuração da quantidade de colágeno degradado por meio de colorimetria em espectrofotômetro. Em seguida as mesmas amostras foram submetidas à mais 2 dias de desmineralização. Em complemento ao ensaio da hidroxiprolina as amostras foram expostas à microradiografia transversal para visualização e medição da área degradada. Uma análise descritiva dos dados obtidos foi realizada de modo a determinar o teste estatístico a ser aplicado. A análise de variância (ANOVA) para a HYP revelou que não houve diferença estatisticamente significativa entre os tratamentos empregados (p>0,05). Os dados obtidos na microradiografia foram submetidos ao teste de Kruskal Wallis e teste de comparações múltiplas, Dunn. Os dados de reptetição, comparações entre a desmineralização inicial (5 dias) e a segunda desmineralização (2 dias), foi realizado individulamente em cada grupo por teste T de medidas repetidas ou Wilcoxon. Houve diferença significativa entre os grupos (p<0,0001). Dos tratamentos empregados, a clorexidina e o flúor foram eficazes na prevenção da progressão da cárie radicular. / Quantification of collagen degradation is an important parameter to evaluate dentin caries progression of caries prevention aid. The aim of this study was to evaluate root collagen degradation against preventive methods by using the hydroxyproline assay and microradiography technique. Forty root dentin blocks were obtained with 1,5x6 mm (depth x diameter) from bovine incisors, which were submitted to artificial demineralization process by acetate buffer (PH=5), in order to induce a carious lesion. Then, the samples were submitted to preventive therapeutic treatment of root caries: 1) Chlorhexidine 0,12% 1 min, 2) Fluoride 2% 1 min, 3) Nd:YAG Laser - 60 mJ 10s, 4) Deionized Water (control) 1 min. After that, the samples were exposed to degradation by the collagenase enzyme (Type VII, Product No. C0773, Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA) for 5 days. Following the collagenase challenge, the enzyme solution was collected for assaying hydroxyproline released from collgen matrix, where it is possilble to measure the amount of degraded collagen by colorimetry in a spectrophotometer. Soon after, the same samples were submitted to a further 2 days of demineralization process. In addition to the hydroxyproline assay the samples were exposed to the transverse microradiography for a visualization of the degraded area. Soon after the colorimetric test the same samples were submitted to further two days of demineralization. A descriptive analysis of the data will be performed to determine the statistical test to be applied. ANOVA test revealed that there was no difference between the treatments (p>0,05). The microradiography data were submitted to the Kruskal Wallis test and multiple comparison test, Dunn. The repetition data, comparisons between the initial (5 days) and the second (2 days) demineralization, were performed individually in each group by repeated measures T-test or Wilcoxon (p<0,0001). Among the proposed treatments, chlorhexidine and fluoride were effective in preventing root caries progression.

Orientador: Sergio Eduardo de Paiva Gonçalves / Co-orientadora: Ana Carolina Magalhães / Banca: Alessandra Buhler Borges / Banca: Graziela Ribeiro / Resumo: A mensuração da degradação de colágeno radicular é um importante parâmetro para avaliar a progressão de cáries na dentina ou a eficácia de métodos terapêuticos na prevenção de lesões não cariosas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a degradação do colágeno da dentina radicular frente a métodos de prevenção de cárie, utilizando o teste da Hidroxiprolina e a microradiografia. Foram obtidos 40 blocos de dentina radicular com aproximadamente 1,5 mm de profundidade x 6 mm de diâmetro, a partir de incisivos bovinos, os quais foram submetidos ao processo de desmineralização artificial em tampão acetato (pH=5), a fim de induzir a formação de uma lesão cariosa. Em seguida as amostras foram submetidas aos tratamentos preventivos de cárie radicular: 1) Clorexidina 0,12% 1 min, 2) Flúor neutro 2% 1 min, 3) Nd: YAG Laser- 60 mJ 10 s e 4) Água Deionizada (controle) 1 min. Após os tratamentos as amostras foram expostas à degradação pela enzima colagenase (Tipo VII, Produto No. C0773, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) por um período de 5 dias. Ao final do desafio da colagenase, a solução contendo a enzima foi coletada para ser submetida ao teste da hidroxiprolina, para a mensuração da quantidade de colágeno degradado por meio de colorimetria em espectrofotômetro. Em seguida as mesmas amostras foram submetidas à mais 2 dias de desmineralização. Em complemento ao ensaio da hidroxiprolina as amostras foram expostas à microradiografia transversal para visualização e medição da área degradada... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Quantification of collagen degradation is an important parameter to evaluate dentin caries progression of caries prevention aid. The aim of this study was to evaluate root collagen degradation against preventive methods by using the hydroxyproline assay and microradiography technique. Forty root dentin blocks were obtained with 1,5x6 mm (depth x diameter) from bovine incisors, which were submitted to artificial demineralization process by acetate buffer (PH=5), in order to induce a carious lesion. Then, the samples were submitted to preventive therapeutic treatment of root caries: 1) Chlorhexidine 0,12% 1 min, 2) Fluoride 2% 1 min, 3) Nd:YAG Laser - 60 mJ 10s, 4) Deionized Water (control) 1 min. After that, the samples were exposed to degradation by the collagenase enzyme (Type VII, Product No. C0773, Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA) for 5 days. Following the collagenase challenge, the enzyme solution was collected for assaying hydroxyproline released from collgen matrix, where it is possilble to measure the amount of degraded collagen by colorimetry in a spectrophotometer. Soon after, the same samples were submitted to a further 2 days of demineralization process. In addition to the hydroxyproline assay the samples were exposed to the transverse microradiography for a visualization of the degraded area. Soon after the colorimetric test the same samples were submitted to further two days of demineralization. A descriptive analysis of the data will be performed to determine... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:43Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-04-20Bitstream added on 2014-06-13T20:30:37Z : No. of bitstreams: 1 teixeira_lg_me_jabo.pdf: 1248709 bytes, checksum: abf07304609e643fddd58d8b10e9193e (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Avaliou-se por meio de análises clínico-laboratoriais e morfológicas, a evolução cicatricial de dois segmentos distintos do cólon descendente. Os equinos foram alocados em um único grupo e submetidos a três fases experimentais: obstrução experimental (F I), seguida de 13 dias pós-operatórios; anastomose término-terminal (F II) e videolaparoscopia (F III), ambas seguidas, cada uma, de seis dias pós-operatórios. O segmento distendido (SD) foi submetido a 240 minutos de distensão intraluminal, com pressão de 40 mmHg. O segmento controle (SC) não sofreu distensão. Colheram-se amostras do cólon descendente antes da obstrução (M0), após a desobstrução (M1) e durante a anastomose (M2). Realizou-se exame clínico antes de cada cirurgia (M0a, M0b e M0) e nos dias pós-operatórios (M12a-M312a, M24b-M120b e M24-M120). A colheita de sangue foi realizada antes de cada cirurgia (M0a, M0b e M0), durante a obstrução (M2a-M4a) e nos respectivos momentos pós-operatórios (M6a-M240a, M24b- M120b e M24-M120). Dois animais foram a óbito, sendo um durante F I e outro na F II. Verificou-se que a as alterações morfológicas e morfométricas intestinais foram mais evidentes na camada serosa no M2, no SD e SC, com muita semelhança entre os dois segmentos. Não houve diferença (p>0,5) na quantidade de colágeno determinada histologicamente e dosagem espectrofotométrica de hidroxiprolina. Durante a F II e F III, três e dois equinos, respectivamente, apresentaram aderências intestinais. Foram observadas diferenças (p>0,5) nos parâmetros clínicos e hematológicos apenas durante F I e F II. Concluiu-se que os equinos submetidos à obstrução experimental apresentaram pior prognóstico em relação à enteroanastomose... / The healing progression of two distinct segments of equine descending colon was evaluated by clinical, laboratorial and morphological analysis. Horses were allocated in only one group and submitted to three following experimental stages: experimental obstruction (F I) followed by thirteen days of postoperative care; end-toend anastomosis (F II) and the videolaparoscopy (F III), both last stages followed by six days of postoperative care. The distended segment (DS) underwent 40 mmHg intraluminal distension pressure for 240 minutes long. The control segment (CS) didn’t suffer any distension. Samples of the tissue of the descending colon was obtained before the obstruction (M0), after the desobstruction (M1) and during the anastomosis (M2). Clinical exam was done before each surgery (M0a, M0b and M0) and during the postoperative care days (M12a-M312a, M24b-M120b e M24-M120). Two animals died, one during F I and the other during F II. The intestinal morphological and morphometric changes were observed markedly on the serous layer on the M2 stage, on the DS and the CS, and it had similarity among the two segments. There was no difference (p>0,5) in the amount of collagen determined by histology and hydroxyproline spectrophotometric analysis. During F II and F III, three and two horses respectively, presented intestinal adhesions. Differences (p<0,5) in some of the clinical and hematological parameters were only observed during F I and F II. In conclusion, the horses that underwent experimental obstruction presented poor prognosis compared to the enteroanastomosis. The serialized clinical exams and the laboratory analyses provided good monitoring of the physiological immune responses during and after the intestinal obstruction or the anastomosis

Orientador: José Corrêa de Lacerda Neto / Banca: Rosemeri de Oliveira Vasconcelos / Banca: Rafael Resende Faleiros / Resumo: Avaliou-se por meio de análises clínico-laboratoriais e morfológicas, a evolução cicatricial de dois segmentos distintos do cólon descendente. Os equinos foram alocados em um único grupo e submetidos a três fases experimentais: obstrução experimental (F I), seguida de 13 dias pós-operatórios; anastomose término-terminal (F II) e videolaparoscopia (F III), ambas seguidas, cada uma, de seis dias pós-operatórios. O segmento distendido (SD) foi submetido a 240 minutos de distensão intraluminal, com pressão de 40 mmHg. O segmento controle (SC) não sofreu distensão. Colheram-se amostras do cólon descendente antes da obstrução (M0), após a desobstrução (M1) e durante a anastomose (M2). Realizou-se exame clínico antes de cada cirurgia (M0a, M0b e M0) e nos dias pós-operatórios (M12a-M312a, M24b-M120b e M24-M120). A colheita de sangue foi realizada antes de cada cirurgia (M0a, M0b e M0), durante a obstrução (M2a-M4a) e nos respectivos momentos pós-operatórios (M6a-M240a, M24b- M120b e M24-M120). Dois animais foram a óbito, sendo um durante F I e outro na F II. Verificou-se que a as alterações morfológicas e morfométricas intestinais foram mais evidentes na camada serosa no M2, no SD e SC, com muita semelhança entre os dois segmentos. Não houve diferença (p>0,5) na quantidade de colágeno determinada histologicamente e dosagem espectrofotométrica de hidroxiprolina. Durante a F II e F III, três e dois equinos, respectivamente, apresentaram aderências intestinais. Foram observadas diferenças (p>0,5) nos parâmetros clínicos e hematológicos apenas durante F I e F II. Concluiu-se que os equinos submetidos à obstrução experimental apresentaram pior prognóstico em relação à enteroanastomose ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The healing progression of two distinct segments of equine descending colon was evaluated by clinical, laboratorial and morphological analysis. Horses were allocated in only one group and submitted to three following experimental stages: experimental obstruction (F I) followed by thirteen days of postoperative care; end-toend anastomosis (F II) and the videolaparoscopy (F III), both last stages followed by six days of postoperative care. The distended segment (DS) underwent 40 mmHg intraluminal distension pressure for 240 minutes long. The control segment (CS) didn't suffer any distension. Samples of the tissue of the descending colon was obtained before the obstruction (M0), after the desobstruction (M1) and during the anastomosis (M2). Clinical exam was done before each surgery (M0a, M0b and M0) and during the postoperative care days (M12a-M312a, M24b-M120b e M24-M120). Two animals died, one during F I and the other during F II. The intestinal morphological and morphometric changes were observed markedly on the serous layer on the M2 stage, on the DS and the CS, and it had similarity among the two segments. There was no difference (p>0,5) in the amount of collagen determined by histology and hydroxyproline spectrophotometric analysis. During F II and F III, three and two horses respectively, presented intestinal adhesions. Differences (p<0,5) in some of the clinical and hematological parameters were only observed during F I and F II. In conclusion, the horses that underwent experimental obstruction presented poor prognosis compared to the enteroanastomosis. The serialized clinical exams and the laboratory analyses provided good monitoring of the physiological immune responses during and after the intestinal obstruction or the anastomosis / Mestre

As metaloproteinases da matriz (MMPs) são uma família de endopeptidades cálcio e zinco dependentes que participam da degradação de praticamente todos os componentes da matriz extracelular. Com o pressuposto de que estas enzimas podem estar relacionadas à progressão da erosão dental e que os agentes ácidos causadores da erosão podem influenciar na ativação das MMPs, o objetivo desse estudo in vitro foi avaliar a influência do pH sobre a atividade funcional das MMP-2 e -9 presentes na dentina coronária e radicular humana. O pó das dentinas coronária e radicular, provenientes de terceiros molares inclusos recém extraídos foi obtido separadamente e submetido ao protocolo de extração das proteínas, com ácido fosfórico a 1%. Após, o extrato contendo as proteínas e o pó de dentina parcialmente desmineralizado foram incubados em uma das respectivas soluções: solução 2 mM de APMA (acetato de 4-aminofenilmercúrio / grupo controle) ou em uma das soluções tampão (fosfato de potássio 0.1 M) com diferentes pHs (2.5, 4.5, 5.0, 6.0 e 7.0). Após a incubação, as proteínas foram separadas por eletroforese, em um gel de poliacrilamida copolimerizado com gelatina, para a avaliação da atividade gelatinolítica das MMPs, por zimografia. Esta análise foi realizada em triplicada e os zimogramas obtidos ao final foram avaliados por densitometria. A quantificação das bandas observadas nos zimogramas foi realizada pelo programa de imagens ImageJ e os dados avaliados de maneira descritiva e qualitativa. Para a avaliação do conteúdo de colágeno solubilizado, o pó de dentina parcialmente desmineralizado e incubado nos respectivos pHs (n = 8) foi mantido em um tampão de incubação durante 24h, e o conteúdo de hidroxiprolina (HYP) liberado neste meio foi mensurado em espectrofotômetro. Os dados obtidos foram avaliados estatisticamente por ANOVA 1 fator, seguido do teste de Tukey, com 5% de significância. A análise por zimografia mostrou bandas evidentes correspondente a MMP-2 na sua forma ativa (66kDa) e bandas menos expressivas relacionadas a sua forma latente (72kDa), tanto para a dentina coronária quanto para a radicular, em todos os grupos experimentais. Não foram identificadas bandas correspondentes a MMP-9, para nenhum dos substratos avaliados. As soluções com os menores pHs (2.5, 4.5 e 5.0) resultaram na maior atividade funcional da MMP-2, em comparação as soluções com os maiores pHs (6.0 e 7.0), em ambos os substratos. Para a análise de HYP, os grupos pH 2.5 e pH 4.5 mostraram valores de absorbância abaixo do limite de detecção do aparelho. Para os demais grupos experimentais, tanto para a dentina coronária quanto para a radicular, foram encontradas diferenças estatisticamente significantes entre eles (p < 0,05). O conteúdo de HYP liberada foi maior para o pH 7.0, comparado aos demais grupos (p < 0,05), exceto para o pH 6.0. Não foi encontrada diferença estatisticamente significante entre os grupos pH 6.0, pH 5.0 e controle (p > 0,05). Conclui-se que a atividade funcional da MMP-2 é dependente do pH. Os menores pHs promoveram um aumento na ativação da MMP-2 da dentina coronária e radicular humana. Nota-se em pHs próximos ao neutro, uma maior degradação da matriz orgânica dentinária desmineralizada por essas enzimas endógenas. / Matrix metalloproteinases (MMPs) are a family of endopeptidades calcium and zinc dependent that participate in the degradation of pratically all components of the extracellular matrix. With the assumption that these enzymes may be related to the progression of dental erosion and acidic agents that cause erosion can influence the activation of MMPs, the aim of this in vitro study was to evaluate the pH-influence on the functional activity of MMP-2 and -9 present in human coronal and root dentin. The powder of root and coronal dentine, from freshly extracted third molars was separately obtained and subjected to protein extraction protocol, with 1% phosphoric acid. After, the extract containing proteins and the partially demineralized powder were incubated in one of the following solutions: 2 mM APMA (4-aminophenylmercuric acetate / control) or one of the buffer solutions (0.1 M potassium phosphate) with different pHs (2.5, 4.5, 5.0, 6.0 and 7.0). After incubation, the proteins were separated by electrophoresis in a polyacrylamide gel copolymerized with gelatin, to evaluate the gelatinolytic activity of MMPs by means of zymography. This analysis was performed in triplicate and the zymograms obtained were evaluated by densitometry. Quantification of the bands observed in zymograms was performed by ImageJ software and the data were evaluated descriptively and qualitatively. To assess the solubilized dentin collagen, the partially demineralized dentin powder treated with different pHs (n=8) was incubated in an artificial saliva for 24 h, and the amount of hydroxyproline (HYP) released in media was measured by spectrophotometer. Data were statistically analyzed by ANOVA one factor, followed by the Tukey\'s test, with 5% significance. Zymography showed evident bands corresponding to active MMP-2 (66kDa) and less expressed bands related to its latent form (72kDa), for both coronal and root dentin, in all experimental groups. No bands corresponding to MMP-9 were identified, for both substrates. The lowest pH solutions (2.5, 4.5 and 5.0) yielded the higher functional activity than did the highest pH solutions (6.0 and 7.0), for both substrates. For HYP analysis, the groups pH 2.5 and pH 4.5 showed absorbance values below the detection limit of the equipment. For the other groups, for both coronal and root dentin, statistically significant diferences were found between them (p<0.05). The amount of HYP was higher for pH 7.0 than all other groups (p<0.05), except for pH 6.0. No statistical difference was found between pH 6.0, pH 5.0 and control (p>0.05). It can be concluded that the functional activity of MMP-2 is pH-dependent. Low pH solutions are able to increase the activation of human coronal and root MMP-2. It is noted in pHs close to neutral, a higher degradation of demineralized dentin organic matrix by these endogenous enzymes.

A degradação da interface adesiva em dentina pode acometer tanto a porção resinosa como a porção orgânica da camada híbrida. Evidências indicam que a degradação da porção orgânica pode ocorrer em parte devido a atividade enzimática de proteases da própria dentina. As metaloproteinases da matriz (MMPs) constituem a primeira classe de enzimas relacionada com a degradação da matriz orgânica. É possível que as MMPs, possam ser reativadas durante o procedimento adesivo em conseqüência da queda do pH do meio. Objetivo: Esta investigação teve como objetivos avaliar a influência de soluções desmineralizadoras com diferentes concentrações de ácido fosfórico (AF1%, AF10% e AF37%) na atividade proteolítica da dentina humana sadia, na degradação do colágeno exposto pela desmineralização, além de identificar imunologicamente as metaloproteinases. Material e Métodos: Vinte dentes molares permanentes foram triturados para obtenção de um pó de dentina. Alíquotas de 1g do pó foram acondicionadas em tubos plásticos para que a desmineralização do substrato pudesse ser realizada de acordo com as três diferentes concentrações de ácido fosfórico testadas. Após a neutralização do ácido com NaOH, as amostras foram centrifugadas. O sobrenadante foi utilizado para mensuração espectrofotométrica do conteúdo de Cálcio (Ca) liberado pela desmineralização. O precipitado obtido foi incubado com tampão de extração de proteínas por 24h a 4°C sob agitação. Nova centrifugação foi realizada e o sobrenadante utilizado para avaliação da atividade da MMP-2 e MMP-9 por zimografia e para a identificação imunológica das metaloproteinases por western blot. O precipitado obtido pela centrifugação foi liofilizado e separado em alíquotas de 40mg (n=10) de pó de dentina para cada condição experimental. As alíquotas foram incubadas em saliva artificial por 24h a 37°C sob agitação e hidrolisadas em autoclave. Após incubação a 65°C por 40 min, as amostras foram avaliadas por espectrofotometria para que a mensuração da concentração do aminoácido hidroxiprolina (HYP) liberado pela degradação do colágeno exposto pudesse ser obtida. Fatias de 0.3 mm da dentina coronária de outro dente foram obtidas e desmineralizadas, de acordo com as diferentes concentrações de ácido fosfórico para avaliação da atividade enzimática através do método da zimografia in situ. Os resultados foram submetidos à análise de variância de um fator sem vinculação ou teste de Kruskal-Wallis para identificação das diferenças existentes entre os grupos experimentais. Para contraste das médias foi realizado o teste de Student-Newman-Keuls com nível de significância de 5% (=0,05). Resultados: A atividade enzimática de MMP-2 foi estatisticamente maior quando a dentina foi desmineralizada com AF 1% ou 10%. O uso do ácido fosfórico 37% diminuiu consideravelmente a atividade desta enzima, em relação ao AF10% (<0,05). Em nenhuma das amostras desmineralizadas com AF foi detectada a atividade enzimática da MMP-9. A identidade da MMP-2 foi confirmada pelo immunoblotting da enzima com anticorpo específico. A MMP-9 não foi expressa nos extratos analisados. A expressão de MMP-2 foi maior quando utilizado AF 1% ou 10% e menor quando foi utilizado o AF 37%. A utilização do AF 37% liberou valores de Ca, em g/mL, estatisticamente superiores aos valores determinados para os demais grupos (<0,05). A maior concentração de HYP, em g/mL, foi encontrada nos extratos desmineralizados com AF 10%. Em seguida, aparecem os valores encontrados com o uso do AF1%. Os menores valores da concentração de HYP aparecem no grupo em que foi utilizado o AF 37% (<0,05). A concentração de HYP em função do peso de dentina utilizado (40mg) também foi calculada. A maior concentração de HYP por mg de dentina foi obtida com AF 10%, seguida pelos extratos desmineralizados com AF1%. Os menores valores foram detectados com AF 37% (<0,05). O uso do AF10% demonstrou ser responsável pela maior taxa de degradação de colágeno exposto (20,13%). Em seguida, aparecem valores intermediários (11,34%) obtidos com AF1%. Por último, surgem os menores valores (0,68%) com AF37%. A análise das imagens obtidas após a realização da zimografia in situ demonstrou maior atividade enzimática quando a dentina foi desmineralizada com AF10%. Conclusão: O uso do AF37% para o condicionamento da dentina durante a realização do procedimento adesivo pode minimizar os efeitos degradantes das proteases endógenas sobre o colágeno. Em contrapartida, estudos realizados com pó de dentina desmineralizado com AF1% ou 10% podem estar sobreestimando a atividade das MMPs, em relação à prática clínica. / The dentin adhesive interface degradation can occur in resin and in organic portion of the hybrid layer. Evidence indicates that the degradation of organic matrix may partially occur due to the enzymatic activity of proteases own dentin. The matrix metalloproteinases (MMPs) have been described as the first class of enzymes associated with degradation of the organic matrix. It is possible that MMPs may be reactivated during the adhesive procedure as a result of the fall of pH. Purpose: The objectives of the present investigation are to evaluate the influence of different demineralizing phosphoric acid solutions (PA1%, PA10% and PA37%) on the proteolytic activity of human sound dentin, on the collagen degradation that was exposed after demineralization, as well as to identify the metaloproteases immunologically. Material and Methods: Dentin powder was obtained from twenty human molars. One gram aliquots were placed in polyestyrene tubes and the dentin demineralization was performed using the three different phosphoric acid concentrations tested in this study. After neutralization with NaOH, the samples were centrifuged. The supernatant was used for the spectrophotometrically quantification of calcium (Ca) released by the demineralization while the precipitate was re-suspended and incubated with a protein extraction buffer for 24h at 4ºC under agitation. The sample was centrifuged and the supernatant was used for the identification of MMP-2 and MMP-9 by western blot and for the evaluation of gelatinolytic activity by zymography. The pellet was lyophilized and 40 mg aliquots of the dentin powder (n=10) were incubated in artificial saliva for 24h at 37°C under agitation and hydrolysed in autoclave after incubation at 65°C for 40 min. The samples were analyzed spectrophotometrically to measure the hydroxyproline (HYP) released after collagen degradation. Slices of 0.3 mm of the dentine crown of the another tooth were obtained and demineralized in accordance with the concentrations of phosphoric acid used in this study for evaluating the enzymatic activity by the method of in situ zymography.The data were analyzed by ANOVA one-way or Kruskal-Wallis test for the identification of differences between the experimental groups. The means were analyzed by Student-Newmans-Keulss test (=0,05). Results: The MMP-2 enzymatic activity was statistically higher when the dentin was demineralized with 1% or 10% PA. The 37% phosphoric acid decreased the activity of such enzyme relative to PA 10% (<0,05). MMP-9 activity was not detected in any demineralization condition (1%, 10% or 37% PA). MMP-2 identification was confirmed by immunoblotting while MMP-9 was not observed in any condition. MMP-2 identification was higher when 1% or 10% PA were used while 37% PA showed lower MMP-2 identification. The use of 37% PA resulted in higher release of Ca, which was significantly higher when compared to other PA concentrations (<0,05). The highest HYP concentration was observed when 10% PA was used, followed by 1% PA. The lowest values were observed for 37% PA (<0,05). The HYP concentration according to the dentin weight used (40 mg) was also calculated. Highest concentrations of HYP per mg of dentin were observed for 10% and 1% PA, while 37% PA resulted in the lowest HYP concentration (<0,05). The use of 10% PA showed to be responsible for the highest exposed collagen degradation after demineralization (20,13%) when compared to 1% PA (11,34%) and 37% PA (0,68%). The analysis of images obtained after the realization of in situ zymography showed greater enzyme activity when the dentin was demineralized in PA10%. Conclusion: The use of 37% PA for dentin etching during the restorative procedure might minimize collagen degradation by host-derived proteases. On the other hand, studies that have been using 1% or 10% PA might have overestimated MMPs activity when compared to the clinical situation.