Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6416.pdf: 7607633 bytes, checksum: e01f0f58b2ee5032346c3d9eae67f4ac (MD5) Previous issue date: 2014-09-05 / Financiadora de Estudos e Projetos / Cystatins are reversible inhibitors of cysteine peptidases. The cystatins found in plants are called phytocystatins, and represent an independent subfamily of the cystatins superfamily. Some studies have reported significant pleiotropic effects for recombinant cystatins expressed in transgenic plants, notably including tolerance phenotypes against attack of herbivorous arthropods and pathogens, and against abiotic and biotic stresses. Besides, the recombinant sugarcane cystatin, CaneCPI-4, showed potential to inhibit development of melanoma cells. Thus, the study and knowledge about phytocystatins, become interesting from agricultural and medicinal point of view. The sugarcane genome project (SUCEST) allowed the identification of about 25 putative cystatins in this plant, which were gathered in 4 groups, by phylogenetic analysis. In this study, we propose a new classification for the putative cystatins found in the SUCEST database. Furthermore, we describe the heterologous expression, purification and characterization of two novel sugarcane cystatins, CaneCPI-5 and CaneCPI-6, which showed different inhibitory activities against human cathepsin B. While protein CaneCPI-6 was not able to inhibit this enzyme efficiently (Ki = 1,83 μM), the protein CaneCPI-5 showed a good inhibitory capacity against the same enzyme (Ki = 6,87 nM). The CaneCPI-5 cystatin was also analyzed against recombinant cathepsin L from the beetle Sphenophorus levis (rSl-CathL), and showed a good inhibitory capacity against this enzyme (Ki = 0,059 nM). Finally, both of proteins, CaneCPI-5 and CaneCPI-6, proved to be thermostable when kept at 100°C for 30 minutes. / Cistatinas são inibidores reversíveis de cisteíno-peptidases. As cistatinas encontradas em plantas são denominadas fitocistatinas, e constituem uma subfamília independente da superfamília das cistatinas. Alguns estudos têm relatado importantes efeitos pleiotrópicos para cistatinas recombinantes expressas em plantas transgênicas, incluindo principalmente, fenótipos com tolerância ao ataque de artrópodes herbívoros e patógenos, e contra estresses bióticos e abióticos. Ademais, a cistatina recombinante de cana-de-açúcar, CaneCPI-4, apresentou potencial para inibir o desenvolvimento de células de melanoma. Dessa maneira, o estudo e conhecimento sobre as fitocistatinas, tornam-se interessantes do ponto de vista agrícola e na saúde. O projeto genoma da cana-de-açúcar (SUCEST) possibilitou a identificação de 25 possíveis cistatinas nesta planta, que foram reunidas em 4 grupos, por meio de análises filogenéticas. Nesse trabalho propomos uma reanálise das prováveis cistatinas encontradas no banco de dados do SUCEST. Além disso, descrevemos a expressão heteróloga, purificação e caracterização de duas novas cistatinas de cana-de-açúcar, CaneCPI-5 e CaneCPI-6, as quais apresentaram diferenças na ação inibitória contra a catepsina B humana. Enquanto a proteína CaneCPI-6 não foi capaz de inibir esta enzima de forma eficiente (Ki = 1,83 μM), a proteína CaneCPI-5 apresentou um bom poder inibitório contra a mesma enzima (Ki = 6,87 nM). A cistatina CaneCPI-5 foi analisada também contra a catepsina L recombinante do inseto Sphenophorus levis (rSl-CathL), e apresentou alto poder inibitório contra essa enzima (Ki = 0,059 nM). Por fim, ambas as proteínas, CaneCPI-5 e CaneCPI-6, mostraram-se termoestáveis quando mantidas à 100°C durante 30 minutos.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:36:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 655720 bytes, checksum: 45203cde01cfaaa9a0bd784688103fd6 (MD5) Previous issue date: 2009-02-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The goals of this work were to determine the time in which occurs the vascular occlusion and the contribution of the peroxidase (POD) and polyphenoloxidase (PPO) in this process; partially purify and characterize these enzymes and verify the effect of the use of enzymatic inhibitors combined or not with sucrose in the pulsing solution on the postharvest life of the bird-of-paradise. To determine the time of occlusion, the stalks were dry stored for different periods of time (0, 8, 16, 24, 32, 40 and 48 hours), and after being placed in water. The variation of fresh mass and the relative water content (RWC) of the sepals were evaluated within the first 24 hours, and the POD and PPO activity were determined after 100 hours. Harvested flowers were immediately placed in water and had their fresh mass variation, and POD and PPO activity daily evaluated up to 8th day, when the first floret was complete wilted. Flowers maintained for 16 hours under dry storage recuperated the initial fresh mass index and RWC after being placed in water, suggesting that the vascular occlusion occured after 16 hours of dry storage. The POD activity was higher in control stalks and the PPO was higher in stalks which suffered moderated water stress (16, 24, 32 and 40 hours). Throughout the vase life, the POD activity reached the highest level in the 8th day of vase life, and the PPO was kept constant. The POD activity was higher than the PPO in all the analyses, suggesting a higher influence of the POD in the xylematic occlusion of this specie. In the process of enzymatic characterization, the ideal pH and the optimum temperature for both enzymes were determined, as well as the optimum substrate for the PPO. The stability in different pHs, thermal stability and the effect of different inhibitors were also observed. The highest activity of POD was found in pH 5.0 and 60ºC, and the prexi incubation for 120 minutes in pH 2.5 and 25ºC lead to the inhibition of 93.1% of the initial activity, 120 minutes in 70ºC to 98.7% of inhibition and 80ºC for 10 minutes or 90ºC for 1 minute lead to complete inactivation. A complete inhibition of this enzyme was also achieved in the presence of different inhibitors, like ascorbic acid, L-cysteine, sodium metabissulfite, sodium azide, β-mercaptoethanol and DTT. The PPO presented the highest activity with 4-methylcatecol as substrate, in pH 6.0 and 40ºC. Complete inactivation of this enzyme was obtaining by incubating for 10 minutes at 80ºC or using 1 mM of DTT, L-cisteyne, sodium metabissulfite and β-mercaptoethanol. Finally, different pulsing solutions containing enzymatic inhibitors, combined or not with sucrose 40% were applied for 24 hours. The fresh mass variation, RWC and number of open florets were daily determined, and the longevity was determined until the wilting of the last opened floret. From the inhibitors applied alone, the sodium azide was able to provide the highest values of fresh mass, longest longevity and highest number of open florets. Combined with sucrose, the ascorbic acid and the sodium azide were able to provide the best results, with the highest number of open florets and longer longevity. The occlusion of xylematic vessels of this specie is related to the POD and PPO activity and the use of pulsing solutions containing enzymatic inhibitors is a viable technique to extend the vase life of bird-of-paradise of flowers. / Os objetivos deste trabalho foram: determinar o momento de ocorrência do bloqueio vascular e a contribuição da peroxidase (POD) e polifenoloxidase (PPO) neste processo; purificar parcialmente e caracterizar essas enzimas; e verificar o efeito da utilização de inibidores enzimáticos combinados ou não com sacarose na solução de pulsing sobre a vida pós-colheita de ave-do-paraíso. Para determinar o tempo para a oclusão, hastes florais foram armazenadas a seco por diferentes períodos (0, 8, 16, 24, 32, 40 e 48 horas), e após foram colocadas na água. A variação de massa fresca e o teor relativo de água (TRA) das sépalas foram avaliados nas primeiras 24 horas, e a atividade da POD e PPO foram determinadas após 100 horas. Flores colhidas e colocadas imediatamente na água, tiveram sua variação de massa fresca, e atividade da POD e PPO avaliadas diariamente até o 8º dia, quando o 1º florete estava completamente seco. Flores mantidas por até 16 horas em armazenamento a seco, recuperaram os valores de massa fresca e TRA iniciais após serem mantidas em água, sugerindo que o bloqueio vascular esteja ocorrendo após essas 16 horas. A atividade da POD foi maior em hastes controle e a da PPO em hastes que sofreram estresse hídrico moderado (16, 24, 32 e 40 horas). Ao longo da vida de vaso, a atividade da POD alcançou maiores níveis após o 8º dia da vida de vaso, e a da PPO manteve-se constante. A atividade da POD foi superior a da PPO em todas as análises, sugerindo uma maior influência da POD no bloqueio xilemático desta espécie. No processo de caracterização enzimática, o pH ideal e a temperatura ótima para ambas as enzimas foi determinado, bem como o substrato ótimo para a PPO. A estabilidade a diferentes pHs, estabilidade térmica e o efeito de diferentes inibidores também foram acompanhados. Maior atividade da POD foi encontrada em pH 5,0 e 60ºC, e a pré-incubação por 120 minutos em pH 2,5 a 25ºC levou a inibição de 93,13% da atividade inicial, 120 minutos a 70ºC a 98,69% de inibição, e a 80ºC por 10 minutos ou 90ºC por 1 minuto levou a inativação completa. Uma completa inibição desta enzima também foi encontrada na presença de diferentes inibidores, como ácido ascórbico, L-císteina, metabissulfito de sódio, sódio azida, β-mercaptoetanol e DTT. A PPO apresentou maior atividade com 4-metil-catecol como substrato, em pH 6,0 e 40ºC. Inativação completa desta enzima foi obtida com pré-incubação por 10 minutos a 80ºC ou usando 1 mM de DTT, L-cisteína, metabissulfito de sódio e β-mercaptoetanol. Finalmente, diferentes soluções de pulsing contendo inibidores enzimáticos, combinados ou não com sacarose 40% foram aplicadas por 24 horas. A variação de massa fresca, TRA e o número de floretes abertos foram determinados diariamente, e a longevidade foi acompanhada até o murchamentodo último florete aberto. A partir dos inibidores aplicados sozinhos, o sódio azida foi que proporcionou maiores valores de massa fresca, maior longevidade e maior número de floretes abertos. Combinados com sacarose, o ácido ascórbico e o sódio azida foram capaz de proporcionar os melhores resultados, com maior número de floretes abertos e maior longevidade. O bloqueio dos vasos xilemáticos desta espécie está relacionado à atividade da POD e PPO e o uso de soluções de pulsing contendo inibidores enzimáticos é uma técnica eficiente em prolongar a vida de vaso de flores de ave-doparaíso.

Realizamos uma caracterização estrutural e eletrônica dos inibidores enzimáticos E-64 e CA030 utilizando técnicas de química quântica. Otimizações de geometria são realizadas em nível ab initio com os métodos Hartree-Fock e Teoria do Funcional da Densidade e estas estruturas são então comparadas com os resultados cristalográficos obtidos do Protein Data Bank. O cálculo do espectro de vibração infravermelho foi realizado para assegurar que as estruturas eram pontos de mínimo. Nós também fizemos a atribuição das freqüências vibracionais aos grupos funcionais das moléculas. A caracterização eletrônica é obtida com o cálculo do espectro de absorção ultravioleta-visível. Efeitos de solvente são contabilizados através da teoria de Campo de Reação Auto-Consistente. Uma análise detalhada das excitações do espectro calculado do E-64 e do CA030 é realizada e nós estudamos particularmente as transições características em torno de 200 nm. Tanto para o E-64 como para o CA030 nós identificamos o cromóforo responsável pela transição característica dos inibidores. Adicionalmente, nós levamos em consideração a influência da interação do CA030 com a catepsina B através do cálculo do espectro ultravioleta-visível do inibidor com o aminoácido cisteína. / We have made a structural and electronic characterization of the enzyme inhibitors E-64 and CA030 using quantum chemistry techniques. Geometry optimizations are performed in the ab initio level with the Hartree-Fock and Density Functional Theory methods and these structures are then compared with crystallographic results obtained from the Protein Data Bank. The infrared vibration spectrum calculation has been carried out to assure that the theoretical structures are true minima. We also have made an assignment of the vibrational frequencies to the functional groups of the molecules. The electronic characterization is performed with the calculation of the ultraviolet-visible absorption spectrum. Solvent effects are taken into account the Self Consistent Reaction Field theory. A detailed analysis of the calculated spectra of E-64 and CA030 excitations is given and we have particularly studied the characteristic transitions around 200 nm. For both the E-64 and the CA030 we have identified the chromophore responsible for the characteristic transition of the inhibitors. In addition, we have considered the influence of the interaction of the CA030 with the enzyme cathepsin B by calculating the ultraviolet-visible spectrum of the inhibitor with the cysteine amino acid.

A tuberculose (TB) é uma das maiores causas de morte por infecção no mundo, sendo que, em 2015, registraram-se 10,4 milhões de novos casos. O agente etiológico da doença, o Mycobacterium tuberculosis (Mtb), apresenta altos níveis de resistência frente aos quimioterápicos disponíveis para o tratamento da TB. Além disso, a terapia atual da doença explora poucos alvos essenciais ao Mtb. Neste sentido, explorar novos alvos, essenciais ao crescimento e sobrevivência da micobactéria é de grande interesse e poderia gerar fármacos mais efetivos, eficazes contra cepas resistentes e a forma latente da TB. Para este fim, o presente trabalho propôs o desenvolvimento de inibidores da enzima fosfopanteteína adenililtransferase (PPAT), a qual possui caráter regulatório na via de biossíntese da Coenzima A (CoA) da micobactéria. Inicialmente, propuseram-se 50 estruturas de potenciais inibidores da PPAT de M. tuberculosis (MtPPAT), baseando-se na estrutura de seu substrato, a fosfopanteteína, e na estrutura do sítio ativo da enzima. Em seguida, propuseram-se outros 28 ligantes. A fim de se prever as potenciais complementaridades entre os 78 inibidores propostos e o sítio ativo da MtPPAT, empregou-se a estratégia de docking. Posteriormente, realizaram-se cálculos semi-empíricos, com os complexos dos ligantes que se mostraram mais interessantes nas simulações de docking, a fim de se obter informações sobre a entalpia de interação dos ligantes com o sítio ativo da MtPPAT. A partir dos resultados obtidos nos estudos computacionais, selecionaram-se os inibidores que se mostraram mais promissores. A síntese destes ligantes e a de seus fragmentos foi realizada. Avaliaram-se a atividade microbiológica in vitro, bem como a citotoxicidade dos ligantes sintetizados. Alguns dos compostos sintetizados apresentaram atividade frente às cepas sensíveis e resistentes do Mtb na casa de micromolar. Todos os compostos ativos não foram considerados citotóxicos. A fim de validar o planejamento e o alvo dos possíveis inibidores, verificando a atividade inibitória desses frente à enzima MtPPAT, realizou-se a produção e purificação da enzima. Por fim, realizaram-se ensaios de inibição enzimática frente à MtPPAT, os quais permitiram a identificação dos primeiros inibidores da enzima já descritos, com atividade na casa de micromolar, validando-se o alvo em questão. / Tuberculosis is one of the major causes of death by infection worldwide. In 2015, 10.4 thousand new cases of the disease were registered. The tuberculosis\' causing agent Mycobacterium tuberculosis presents high levels of resistance for the available chemotherapy. Thereof, exploit new M. tuberculosis targets is of utmost importance to overcome drug resistant tuberculosis. In this sense, the enzyme phosphopantetheine adenylyltransferase (PPAT) generates scientific interest since it displays a regulatory role in the M. tuberculosis coenzyme A (CoA) biosynthesis. Therefore, the purpose of the present study was the development of M. tuberculosis PPAT (MtPPAT) inhibitors. Initially, 50 potentially MtPPAT inhibitors were designed based on MtPPAT\'s substrate and the enzyme\'s active site. After preliminary results, more 28 compounds were designed. Docking simulations were performed with the 78 compounds synthesized, leading to the prediction of the interaction between the proposed inhibitors and MtPPAT active site. Latelly, semi-empirical calculations were performed with the most promising compounds. These calculations were carried out to obtain information about the enthalpy interactions between compounds and MtPPAT active site. Computational studies led to the selection of the most promising inhibitors. Those compounds and some of their fragments were synthesized, purified, and characterized. The synthesized compounds had their in vitro microbiological activity and cytotoxicity evaluated. Some of the synthesized compounds showed activity against the Mtb sensitive and resistant strains in micromolar range. Besides that, the active compounds were not considered cytotoxic. To validate the potential inhibitors\' design and evaluate their capacity to inhibit MtPPAT, the enzyme was produced and purified. MtPPAT inhibitory assays were performed, leading to the first inhibitors of the enzyme, with activity in micromolar range, validating the target.

A longevidade da interação estabelecida entre a união do material restaurador e substrato tem sido o foco principal da Odontologia Adesiva. Se por um lado, a dentina é alterada por desafios como a erosão e a cárie dentária, por outro lado, tecnologias que atendam às condições distintas do substrato e que possibilitem união química tem sido desenvolvidas. O objetivo desde trabalho foi avaliar o desempenho de um sistema adesivo restaurador universal (modo convencional) na resistência de união (RU) à dentina em diferentes condições (artificialmente erodida ou cariada) e pré-tratadas com inibidores proteolíticos. Noventa molares hígidos foram selecionados e preparados, obtendo-se superfícies planas que foram tratadas com lixa 600 por 1 minuto. Os espécimes foram aleatoriamente divididos em três grupos iniciais, de acordo com o substrato: N- sem simulação de desafio ácido (mantidos em saliva artificial); ERO- simulação de erosão (3x5min/5dias com suco de laranja) e CA- simulação de cárie artificial (6h desmineralizante+ 18hremineralizante/ 5 dias + 48 remineralizante). Em seguida, cada um desses grupos foi redividido em três subgrupos, de acordo com o pré-tratamento da dentina: Atratado com água; CHX- tratado com clorexidina a 2%e E-64- tratado com o inibidor E-64 a 5 &#x3BC;M. No total, formaram-se, 9 grupos (n=10): N-A, N-CHX, N-E-64, ERO-A, ERO-CHX, ERO-E-64, CA-A, CA-CHX, CA-E-64. Todos os espécimes foram restaurados com adesivo Adper Single Bond Universal® e com resina composta Filtek Z250. Os dentes foram cortados para a obtenção dos palitos (área de 0,64mm2 aproximadamente), que foram submetidos ao ensaio de microtração em máquina de teste a 0,5mm/min em 7 dias e 6 meses. O modo de fratura foi classificado de acordo com a análise das interfaces com microscopia ótica 40X. Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade e analisados por ANOVA a três critérios e teste de Tukey (p<0,05). Os resultados demonstraram que houve interação entre o substrato x tratamento (p=0,0011) e substrato x tempo (p=0,0003). A dentina alterada por erosão e cárie artificialmente contribuíram negativamente na RU do sistema adesivo. O uso de clorexidina afetou negativamente a RU em todas as condições testadas. O E-64 mostrou-se efetiva em manter a estabilidade da união aos 6 meses para os substratos alterados. O sistema adesivo universal apresenta-se promissor para ser utilizado na dentina alterada, mantendo a resistência de união ao longo do tempo. O uso de E-64 não comprometeu a união à dentina, ao contrário do impacto no uso da solução de clorexidina. / The longevity of the interaction established between restorative material and substrate has been the main focus of Adhesive Dentistry. Dentin is altered through challenges as dental erosion and caries and, on the other hand, technologies that attend for particular conditions of the substrate and favors for the chemical bonding has been developed. The aim of this study was to evaluate the performance of a universal adhesive system (etch-and-rinse mode) on bonding strength (BS) to dentin in different conditions (artificial caries or erosion) and pretreated with proteolytic inhibitors. Ninety molars were selected and prepared, obtaining flat surfaces treated with 600 sandspaper for 1 minute. The specimens were randomly divided into three groups according to the substrate: N- with no challenges (stored in artificial saliva), ERO-artificial erosion simulation (3x5min/5days with orange juice) and CA- artificial caries simulation (6h demineralizing+ 18h-remineralizing/ 5 days + 48 remineralizing). Then, each of these groups was redivided into three subgroups according to the pretreatment of dentin: A- treated with water; CHX-treated with 2% chlorhexidine and E-64- treated with 5 &#x3BC;M E-64 inhibitor. Therefore, they constituted 9 groups (n = 10): N-A, N-CHX, N-E-64, ERO-A, ERO-CHX, ERO-E-64, CA-A, CACHX, CA-E-64. All specimens were restored with Adper Single Bond ® Universal and composite resin Filtek Z250. The teeth were cut to obtain sticks (area of approximately 0.64 mm2), which were subjected to the microtensile bond test in the testing machine at 0.5 mm/min after 7 days and 6 months. The failure mode was classified according to the analysis of interfaces by optical microscopy 40X. Data was tested to verify normal distribution and homogeneity to be analyzed with three-way ANOVA and Tukey tests (p <0.05). Data revealed interaction between substrate x treatment (p=0.0011) and between substrate x time (p=0.0003). Dentin affected by artificial erosion and caries negatively contributed to the BS. The use of chlorhexidine negatively affected the RU for all tested conditions. E-64 showed to be effective to maintain the bonding stability to affected dentin for 6 months. The universal bonding system seems to be promissory to be employed to affected dentin, maintaining the BS overtime. The use of E-64 did not affect the bonding to dentin, controversial to the use of chlorhexidine.

A cruzaína é a principal cisteíno protease encontrada no parasito Trypanosoma cruzi, o agente etiológico da Doença de Chagas. A enzima é essencial para o desenvolvimento e sobrevivência do parasito dentro do hospedeiro e possui uma excelente validação pré-clínica como alvo susceptível à ação de fármacos. Várias classes de inibidores peptídicos reversíveis e irreversíveis, baseados no estado de transição, inibem efetivamente a cruzaína. No entanto, a maioria destes inibidores ainda não apresenta perfis farmacodinâmicos/farmacocinéticos adequados e/ou estão relacionados com potenciais efeitos fora do alvo (do inglês, off-target). Com o objetivo de encontrar inibidores mais eficientes e seletivos, foi aplicado uma abordagem de planejamento de ligantes baseada em hipótese, combinando quiminformática, síntese orgânica, ensaios bioquímicos e determinação do modo de interação para validar os compostos planejados como inibidores de cruzaína. Neste trabalho, é mostrado um conjunto de dipeptidil-nitrilas que foram sintetizadas e avaliadas com base nestes métodos para investigar as interações nos subsítios S1, S2 e S3 de cruzaína. Nossos resultados demonstram o sucesso da abordagem aplicada que resultou na identificação de vários inibidores da cruzaína em concentrações que chegam a sub-micromolar. Alguns dos compostos dessa classe de dipeptidil-nitrilas também são agentes tripanossomicidas por apresentar concentrações efetivas com formas infectivas do T. cruzi em baixo micromolar. / Cruzain is the major cysteine protease found in the parasite Trypanosoma cruzi, the etiologic agent of Chagas disease. The enzyme is essential for the development and survival of the parasite within host cells, having excellent pre-clinical validation evidence as a druggable target. Several classes of peptide inhibitors including transition state-based reversible and irreversible ones effectively inhibit cruzain. However, most of these inhibitors still have poor PK/PD profiles and are related with potential off target effects. In order to find more efficient and selective inhibitors, we have applied the hypothesis driven ligand design approach, combining cheminformatics, organic synthesis, biochemical assays and mode of binding determination to validate the designed compounds as cruzain inhibitors. Here, we show a set of dipeptidyl nitriles that were synthetized and evaluated based on these methods to probe interactions at S1, S2 and S3 pockets of cruzain binding site. Our results unveil the success of the applied approach that yielded in the identification of several cruzain inhibitors at sub-micromolar concentrations. Some of the compounds of this class of dipeptidyl nitriles are also trypanocidal agents with effective concentrations in the low micromolar range against infective forms of T. cruzi.

Nos últimos anos o tratamento da infecção crônica pelo HCV passou por importantes mudanças. Recentes avanços em biologia molecular proporcionaram o melhor conhecimento sobre a estrutura molecular do HCV e permitiram o desenvolvimento de moléculas que tem como alvo proteínas específicas integrantes do ciclo replicativo do vírus, denominados agentes antivirais de ação direta (DAAs). No Brasil, atualmente, os DAAs aprovados para o tratamento da Hepatite C são: Simeprevir (2ª geração de inibidor de protease), Daclatasvir (inibidor de NS5A) e o Sofosbuvir (inibidor análogo nucleotídeo de polimerase). A combinação dessas diferentes classes de DAAs permite maior eficácia no tratamento do HCV, reduz a duração do tratamento e o risco da emergência de resistência. Ao mesmo tempo em que o desenvolvimento de DAAs promete melhorar a chance de sucesso do tratamento dos pacientes crônicos infectados pelo HCV, a emergência de variantes associadas à resistência representa um grande desafio ao sucesso da terapia antiviral atualmente proposta e informações sobre a presença dessas mutações ainda são escassas. Este estudo tem como objetivo o mapeamento de variantes associadas à resistência (RAVs) primárias aos inibidores da polimerase (NS5B) do HCV em pacientes monoinfectados (HCV) e em pacientes coinfectados (HCV/HIV). Para tal, o rastreamento de substituições de aminoácidos foi realizado entre as posições 159 e 495 da proteína NS5B do HCV nas sequências de 244 pacientes infectados pelo HCV-1: 133 monoinfectados [1b (n=93); 1a (n=40)] e 111 coinfectados [1a (n=93); 1b (n=18)]. A ocorrência natural de RAVs nos resíduos S282, L320 e P495 não foi observada nas sequências analisadas neste estudo. As RAVs encontradas no grupo de monoinfectados foram: L159F (16,1% - 1b), C316N (16,3% - 1b) e A421V (21,4% - 1a; 3,2 - 1b) ; e no grupo de coinfectados foram: C316N (7,1% - 1b), V321A (1,6% - 1a), M414V (1,3% - 1a); A421V (23,7% - 1a; 6,3% - 1b), A421G (1,3% - 1a); Y448H (1,3% - 1a). Entre os pacientes monoinfectados, a região NS5B do HCV-1a apresentou menor número de variantes associadas à resistência (RAVs) quando comparada ao subtipo 1b, ao contrário do observado nos coinfectados. A variante C316N foi a única que ocorreu em combinação com outras variantes. Houve a ocorrência concomitante das variantes L159F e C316N em 8 pacientes monoinfectados pelo HCV-1b (8/56; 14,3%). Entre os coinfectados, foi observada a ocorrência concomitante das variantes C316N e A421V em apenas 1 paciente infectado pelo HCV-1b (1/14; 7,1%). A presença de RAVs foi detectada nas duas populações estudadas neste estudo. Contudo, outros estudos são necessários para que se possa avaliar o real impacto dessas mutacões na resposta ao tratamento / The treatment of chronic HCV infection has undergone important changes recently. Advances in molecular biology provided a better knowledge of the HCV molecular structure and allowed the development of molecules which target specific proteins that have important roles in the viral replicative cycle, known as direct action antiviral agents (DAAs). In Brazil, DAAs approved for treating hepatitis C are Simeprevir (2nd generation protease inhibitor), Daclatasvir (NS5A inhibitor) and sofosbuvir (nucleotide analogue NS5B polymerase inhibitor). The combination of these different DAAs classes leads to a greater efficacy in the treatment of HCV, reducing its duration and the risk of resistance associated variants (RAVs) emergence. DAAs increase the chance of successful treatment of HCV chronic infected patients. RAVs emergence represents a major challenge to the success of antiviral therapy. Nevertheless, data about the presence of these mutations are still scarce. The aim of this study was to verify the presence of primary RAVs associated to HCV polymerase inhibitors primary resistance in monoinfected (HCV) and coinfected (HCV / HIV) patients. For this purpose, amino acid substitutions identification was conducted between positions 159 and 495 of the HCV NS5B protein in the sequences of 244 patients with HCV-1: 133 monoinfected [1a (n=40); 1b (n=93)] and 111 coinfected [1a (n=93); 1b (n=18)]. Naturally occurring RAV in S282, L320 and P495 residues were not observed among the sequences analyzed in this study. RAVs found in monoinfected patients were L159F (16.1% - 1b), C316N (16.3% - 1b) and A421V (21.4% - 1a; 3.2% - 1b); while in co-infected group, the following RAVs were identified: C316N (7.1% - 1b), V321A (1.6% - 1a), M414V (1.3% - 1a); A421V (23.7% - 1a; 6.3% - 1b), A421G (1.3% - 1a); Y448H (1.3% - 1a). Among monoinfected patients, HCV-1a NS5B region showed fewer RAVs when compared to HCV-1b, conversely to what was observed in HIV coinfected patients. Variant C316N occurred in combination with other ones: there was the simultaneous occurrence of L159F and C316N variants 8/56 (14.3%) 8 HCV-1b monoinfected patients Among the coinfected patients, it was observed concomitant occurrence of C316N and A421V variant in only 1/14 (7.1%) HCV-1b infected patient. RAVs were detected in both HCV and HCV/HIV infected populations in this study. Further studies are required to assess the real impact of these changes in response to treatment

Parkinson`s Disease is the second most common motor disorder and is also considered a progressive multisystemic disease associated to several nom motor symptoms (NMS), such as depression, with a prevalence of about 50% among PD patients. Selective serotonin reuptake inhibitors (SSIR) are the main treatment for this NMS, although researches with acutely induced parkinsonism has related fluoxetine to increased motor impairment. The aim of the present research is to evaluate the effect of the fluoxetine hydrochloride on a model of parkinsonism induced by low doses of reserpine. Sixty-four male 7-9-month-old Wistar rats were used, and were obtained from vivarium of the Department of Physiology – Federal University of Sergipe. Animals were divided into four groups: fluoxetine vehicle + reserpine vehicle (CTR); fluoxetine 10 mg/kg + reserpine vehicle (F); fluoxetine 10 mg/kg + reserpine 0,1 mg/kg (F + R); and fluoxetine vehicle + reserpine 0,1 mg/kg (R). During the treatment, the animals were submitted to open field test, catalepsy test and tremoulous jaw movement evaluation. It was shown that animals treated with fluoxetine and reserpine spent more time at the catalepsy test, decreased distance travelled, lower number of rearing at the open field test, increased tremulous jaw movements and increased weight loss. The treatment only with fluoxetine caused immunohistochemistry changes, such as decrease of TH expression in the dorsal striatum and increased staining of the dorsal raphe nucleus, with no correlation with MS for this group. The F + R group showed different immunohistochemistry results for both acute and continued administrations. / A Doença de Parkinson (DP) é a segunda desordem motora mais comum e também é considerada uma doença progressiva multissistêmica ligada a vários sintomas não motores (SNM), como a depressão, que acomete cerca de 50% dos pacientes. Os inibidores seletivos da recaptação de serotonina (ISRS) são considerados os principais medicamentos para o tratamento desse SNM, embora pesquisas que utilizaram indução aguda de parkinsonismo tenham relacionado a fluoxetina ao agravamento dos sintomas motores. Diante disso, este estudo objetivou avaliar o efeito da administração de cloridrato de fluoxetina em um modelo de parkinsonismo induzido por baixas doses de reserpina. Foram utilizados 64 ratos Wistar, machos, com idade de 7 a 9 meses, provenientes do Biotério Setorial do Departamento de Fisiologia da Universidade Federal de Sergipe. Os animais foram divididos aleatoriamente em quatro grupos: veículo fluoxetina + veículo reserpina (CTR); fluoxetina 10 mg/kg + veículo reserpina (F); fluoxetina 10 mg/kg + reserpina 0,1 mg/kg (F + R); e veículo fluoxetina + reserpina 0,1 mg/kg (R). Durante o tratamento, os animais foram submetidos aos testes de campo aberto, catalepsia e avaliação dos movimentos orofaciais. Foi observado aumento da latência na barra, diminuição da distância total percorrida em campo aberto, diminuição do número de rearing, aumento dos movimentos involuntários de mandíbula e maior alteração de peso corporal dos animais do grupo F + R. O tratamento apenas com fluoxetina provocou alterações imunohistoquímicas, como a diminuição da expressão de TH no estriado dorsal e aumento da marcação para 5-HT no núcleo dorsal da rafe, sem correlação com nenhum sintoma motor para esse grupo. O grupo F + R apresentou resultados de imunorreatividade distintos para as administrações breve e continuada. / São Cristóvão, SE

Nos últimos anos o tratamento da infecção crônica pelo HCV passou por importantes mudanças. Recentes avanços em biologia molecular proporcionaram o melhor conhecimento sobre a estrutura molecular do HCV e permitiram o desenvolvimento de moléculas que tem como alvo proteínas específicas integrantes do ciclo replicativo do vírus, denominados agentes antivirais de ação direta (DAAs). No Brasil, atualmente, os DAAs aprovados para o tratamento da Hepatite C são: Simeprevir (2ª geração de inibidor de protease), Daclatasvir (inibidor de NS5A) e o Sofosbuvir (inibidor análogo nucleotídeo de polimerase). A combinação dessas diferentes classes de DAAs permite maior eficácia no tratamento do HCV, reduz a duração do tratamento e o risco da emergência de resistência. Ao mesmo tempo em que o desenvolvimento de DAAs promete melhorar a chance de sucesso do tratamento dos pacientes crônicos infectados pelo HCV, a emergência de variantes associadas à resistência representa um grande desafio ao sucesso da terapia antiviral atualmente proposta e informações sobre a presença dessas mutações ainda são escassas. Este estudo tem como objetivo o mapeamento de variantes associadas à resistência (RAVs) primárias aos inibidores da polimerase (NS5B) do HCV em pacientes monoinfectados (HCV) e em pacientes coinfectados (HCV/HIV). Para tal, o rastreamento de substituições de aminoácidos foi realizado entre as posições 159 e 495 da proteína NS5B do HCV nas sequências de 244 pacientes infectados pelo HCV-1: 133 monoinfectados [1b (n=93); 1a (n=40)] e 111 coinfectados [1a (n=93); 1b (n=18)]. A ocorrência natural de RAVs nos resíduos S282, L320 e P495 não foi observada nas sequências analisadas neste estudo. As RAVs encontradas no grupo de monoinfectados foram: L159F (16,1% - 1b), C316N (16,3% - 1b) e A421V (21,4% - 1a; 3,2 - 1b) ; e no grupo de coinfectados foram: C316N (7,1% - 1b), V321A (1,6% - 1a), M414V (1,3% - 1a); A421V (23,7% - 1a; 6,3% - 1b), A421G (1,3% - 1a); Y448H (1,3% - 1a). Entre os pacientes monoinfectados, a região NS5B do HCV-1a apresentou menor número de variantes associadas à resistência (RAVs) quando comparada ao subtipo 1b, ao contrário do observado nos coinfectados. A variante C316N foi a única que ocorreu em combinação com outras variantes. Houve a ocorrência concomitante das variantes L159F e C316N em 8 pacientes monoinfectados pelo HCV-1b (8/56; 14,3%). Entre os coinfectados, foi observada a ocorrência concomitante das variantes C316N e A421V em apenas 1 paciente infectado pelo HCV-1b (1/14; 7,1%). A presença de RAVs foi detectada nas duas populações estudadas neste estudo. Contudo, outros estudos são necessários para que se possa avaliar o real impacto dessas mutacões na resposta ao tratamento / The treatment of chronic HCV infection has undergone important changes recently. Advances in molecular biology provided a better knowledge of the HCV molecular structure and allowed the development of molecules which target specific proteins that have important roles in the viral replicative cycle, known as direct action antiviral agents (DAAs). In Brazil, DAAs approved for treating hepatitis C are Simeprevir (2nd generation protease inhibitor), Daclatasvir (NS5A inhibitor) and sofosbuvir (nucleotide analogue NS5B polymerase inhibitor). The combination of these different DAAs classes leads to a greater efficacy in the treatment of HCV, reducing its duration and the risk of resistance associated variants (RAVs) emergence. DAAs increase the chance of successful treatment of HCV chronic infected patients. RAVs emergence represents a major challenge to the success of antiviral therapy. Nevertheless, data about the presence of these mutations are still scarce. The aim of this study was to verify the presence of primary RAVs associated to HCV polymerase inhibitors primary resistance in monoinfected (HCV) and coinfected (HCV / HIV) patients. For this purpose, amino acid substitutions identification was conducted between positions 159 and 495 of the HCV NS5B protein in the sequences of 244 patients with HCV-1: 133 monoinfected [1a (n=40); 1b (n=93)] and 111 coinfected [1a (n=93); 1b (n=18)]. Naturally occurring RAV in S282, L320 and P495 residues were not observed among the sequences analyzed in this study. RAVs found in monoinfected patients were L159F (16.1% - 1b), C316N (16.3% - 1b) and A421V (21.4% - 1a; 3.2% - 1b); while in co-infected group, the following RAVs were identified: C316N (7.1% - 1b), V321A (1.6% - 1a), M414V (1.3% - 1a); A421V (23.7% - 1a; 6.3% - 1b), A421G (1.3% - 1a); Y448H (1.3% - 1a). Among monoinfected patients, HCV-1a NS5B region showed fewer RAVs when compared to HCV-1b, conversely to what was observed in HIV coinfected patients. Variant C316N occurred in combination with other ones: there was the simultaneous occurrence of L159F and C316N variants 8/56 (14.3%) 8 HCV-1b monoinfected patients Among the coinfected patients, it was observed concomitant occurrence of C316N and A421V variant in only 1/14 (7.1%) HCV-1b infected patient. RAVs were detected in both HCV and HCV/HIV infected populations in this study. Further studies are required to assess the real impact of these changes in response to treatment

A primeira parte desta tese aborda estudos sobre a reatividade de compostos de telúrio eletrofílicos, principalmente tetracloreto de telúrio e tricloretos aromáticos de telúrio. Novos aspectos da reatividade de TeCl4 frente a alcinos e algumas acetofenonas foram observados e, a partir da elucidação estrutural dos compostos obtidos, por cristalografia, uma racionalização mecanística foi proposta para cada caso. As proposições apresentadas encontraram respaldo com a detecção de intermediários transientes por estudos de espectrometria de massas com ionização por electron-spray (ESI-MS/MS). Além de novos aspectos da química do Telúrio, os compostos preparados encontraram aplicação como potentes e seletivos inibidores de cisteíno proteases. Com esta aplicação estabelecida, foram sintetizadas ambos os enantiômeros de uma telurana e a atividade inibitória destas frente a Catepsina B mostrou dependência da estereoquímica devido a dependência estereoquímica da interação entre a enzima e o inibidor. A segunda parte deste trabalho trata do desenvolvimento da reação de abertura de anel de aziridinas por reagentes organometálicos de cobre derivados de teluretos vinílicos e arílicos que resultaram em derivados de aminas homoalílicas ou homobenzílicas. Em seguida, a reatividade de aziridinas alílicas foi estudada frente a uma série de reagentes organometálicos de lítio, magnésio, cobre e zinco que mostraram influenciar a regio- e estereosseletividades das reações de abertura. / The first part of this thesis deals with the study of the reactivity of electrophilic tellurium compounds, mainly tellurium tetrachloride and aromatic tellurium trichlorides. New aspects of the reactivity of TeCl4 towards alkynes and some acetophenones were disclosed. A mechanistic rationale for each of the processes studied was possible by the determination of the stereochemistry for each product by monocrystal X-ray diffraction analysis. The proposition of the formation of cationic intermediates in the addition reaction of TeCl4 to alkynes was corroborated by the detection and characterization of transient intermediates by ESI-MS/MS experiments. Besides the new aspects of the Tellurium chemistry found, the prepared compounds showed a high and selective activity as inhibitors of cysteine proteases. A pair of enantiomers of a tellurane showed different activities against Human Catepsin B due to a stereochemical dependence in the enzyme/inhibitor interaction. The second part of the present work deals with the development of the ring opening reaction of aziridines by organometallic reagents of copper prepared from vinylic and arylic tellurides. These reactions led to homoallylic and homobenzylic amine derivatives. Finally, the reactivity of 2-alkenyl aziridines was studied towards a series of organometallic reagents of lithium, magnesium, copper and zinc which biased the regio- and stereoselectivities of the ring opening reactions.