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Die hier vorliegende Arbeit gehört zu eine der ersten im deutschsprachigen Raum durchgeführten Studien zu den Einstellungen von deutschen Kinderwunschpaaren im Umgang mit kryokonservierten Eizellen im Vorkernstadium und Embryonen sowie gegenüber der Legalisierung in Deutschland bisher unklar geregelter Verfahren. Insbesondere lag dabei der Fokus auf Einstellungen bezüglich der durch das EschG unklar geregelten Embryonenspende, der verbotenen routinemäßigen Kryokonser-vierung von Embryonen sowie dem weiteren Verbleib überzähliger Embryonen. Dabei wurden im Rahmen einer prospektiven Querschnittsstudie insgesamt 700 Kinderwunschpaare (in Behandlung im Fertility Center Berlin), die im Besitz krykon-servierter Eizellen im Vorkernstadium sind oder waren per standardisiertem Frage-bogen anonym befragt. Männer und Frauen wurden dabei getrennt voneinander befragt. Insgesamt sendeten 272 Patienten den Fragebogen korrekt ausgefüllt zu-rück. In der Mehrheit sprachen sich die befragten Kinderwunschpatienten für eine Legali-sierung der Embryonen- und Eizellspende aus. Außerdem sollte eine routinemäßige Kryokonservierung von Embryonen im Rahmen einer Kinderwunschbehandlung möglich sein. Die Paare würden dabei sog. überzählige Embryonen vorrangig für die eigene Kinderwunschbehandlung verwenden. Allerdings fand sich ebenso eine hohe Akzeptanz gegenüber einer Spende überzähliger Embryonen nach Beendigung des Kinderwunsches sowohl an andere Kinderwunschpaare als auch zu Forschungszwe-cken. Dabei machte es keinen signifikanten Unterschied, um welche Art der For-schung es sich dabei handeln würde (embryonale Stammzellforschung oder repro-duktionsmedizinische Forschung). Interessanterweise votierten jedoch mehr Patien-ten für eine Legalisierung der genannten Verfahren, persönlich dafür entscheiden, würden sich jedoch weniger Paare. Außerdem unterschieden die von uns befragten Patienten nach dem ethisch-moralischen Status gefragt nicht so rigoros wie das EschG zwischen Eizellen im Vorkernstadium und Embryonen. In der Mehrheit stell-ten diese frühen Formen menschlichen Lebens entweder Zellen mit hohem Schutz-anspruch dar oder beide hätten laut der Befragten sogar den Status eines Menschen mit vollem Schutzanspruch. Ob die Kinderwunschpaare dabei allerdings den Eizellen im Vorkernstadium oder Embryonen den höheren Schutzanspruch zugestehen, lässt sich anhand der Ergebnisse nicht zweifelsfrei belegen. Kryokonservierte Embryonen haben laut der Paare einen leicht höheren Schutzanspruch, in dem die Befragten diese eher als vollwertige Menschen gesehen haben. Insgesamt bleibt also festzuhalten, dass die Einstellungen der von uns befragten Kinderwunschpaare bezüglich früher Formen menschlichen Lebens nicht immer deckungsgleich sind mit denen des EschG. Die Paare sprechen sich mehrheitlich für eine Legalisierung verbotener Verfahren im Rahmen einer Kinderwunschbehandlung in Deutschland aus und unterscheiden in Bezug auf den moralischen Status nicht signifikant zwischen Eizellen im Vorkernstadium und Embryonen. Da diese Studie allerdings den Charakter einer Pilotstudie darstellt, konnten keine Einflussfaktoren ermittelt werden, die Daten stammen aus einem vorselektierten Kollektiv und müssen daher vorsichtig interpretiert werden. Nichtsdestotrotz können die Ergebnisse einen wertvollen Beitrag in der Diskussion um die Novellierung des EschG bzw. um die Notwendigkeit eines sog. „Fortpflanzungsmedizingesetzes“ leisten und damit zu einer Verbesserung der Ergebnisse, Effektivität und Sicherheit der Patienten im Rahmen der assistierten Reproduktion in Deutschland bieten.

Infektionen im Bereich der Aorta stellen heute noch eine der gravierendsten Komplikationen der rekonstruktiven Gefäßchirurgie dar. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Effektivität von kryokonservierten Aortenallografts bei der in situ-Behandlung einer manifesten Infektion im Bereich der Aorta tierexperimentell zu evaluieren. Dessweiteren sollte die Rolle der im Rahmen der Kryokonservierung zum Zwecke der Dekontamination eingesetzten Antibiotika untersucht werden. Zu diesem Zwecke erfolgte im in-vitro Experiment die Untersuchung der Antibiotikakonzentration im Gewebe sowie die der Freisetzungskinetik. Am Modell einer durch Staphylococcus epidermidis RP-62 verursachten Protheseninfektion der infrarenalen Bauchaorta des Hundes konnte eine intrinsische Infektionsresistenz der kryokonservierten Aortenallografts nachgewiesen werden. Jedoch scheint die Antibiotikabehandlung der Allografts für die Optimierung des therapeutischen Effektes essentiell zu sein. Die Ergebnisse der in vivo-Experimente werden durch die in vitro-Untersuchungen, ebenso wie durch die Analyse der eigenen klinischen Ergebnisse und der in der Literatur publizierten Daten belegt. Die vorliegende Arbeit kommt zu dem Schluß, daß die Verwendung von kryokonservierten Allografts das Therapiekonzept der Wahl zur Behandlung von Infektionen im Bereich der Aorta darstellt. / Infections of the aorta remain one of the most dreaded complications in reconstructive vascular surgery. The purposes of this study were to evaluate the efficacy of a cryopreserved aortic allograft to treat an established vascular graft infection by the surgical in situ replacement of the infected segment in an animal model, and to investigate the role of antibiotics to decontaminate the allograft during the cryopreservation process. Furthermore, the tissue concentrations of the antibiotic and the kinetics of desorption were investigated in in vitro experiments. A model of prosthetic graft infection by Staphylococcus epidermidis RP-62 (inserted in the infrarenal aorta) in dogs was developed. By in situ replacement of the infected prosthetic graft with a cryopreserved aortic allograft, this study demonstrated an intrinsic resistance to infection of cryopreserved aortic allografts. However, antibiotic loading of the cryopreserved aortic allografts appeared to be essential to obtain optimal therapeutic effects. The results of these in vivo experiments were supported by the findings of our in vitro studies, as well by analysis of our own clinical results and by clinical data published in the medical literature. We conclude that in situ replacement with a cryopreserved allograft is currently the therapy of choice for an aortic infection.

Optimale Konservierungsmethoden sind erforderlich, um die bedarfsgerechte Verfügbarkeit kardiovaskulärer Transplantate für den Ersatz geschädigter Gewebe (Herzklappen oder Gefäße) zu garantieren. Die konventionelle Kryokonservierung (engl.: Conventional Frozen Cryopreservation, CFC) ist derzeit der Standard zur Konservierung kardiovaskulärer Allografts. Jedoch limitieren Immunreaktionen deren Langzeitfunktionalität. Die Alternative der eisfreien Kryokonservierung (engl.: Ice-free Cryopreservation, IFC) wurde kürzlich entwickelt. In der Arbeit wurde die Reaktion des humanen Immunsystems auf allogene kardiovaskuläre Gewebe nach Anwendung unterschiedlicher Konservierungsmethoden umfänglich charakterisiert. Zusätzlich wurde Glutaraldehyd (GA)-fixiertes Gewebe untersucht, um die Ergebnisse in den Gesamtkontext der Gewebekonservierung einzuordnen. Die Analyse des konservierten humanen Aortengewebes, welches als Modellmaterial diente, ergab, dass die Gewebestruktur nach IFC erhalten blieb, jedoch die metabolische Aktivität sowie Apoptose und Nekrose des Gewebes durch IFC reduziert wurde. Dies spiegelte sich auch in der verminderten Freisetzung von Zytokinen aus IFC-Gewebe wider. Funktionelle In-vitro-Tests zeigten deutlich, dass Immunzellen verstärkt in Richtung der löslichen Faktoren aus CFC- und GA-fixiertem Gewebe, jedoch nicht aus IFC-Gewebe migrieren. In Kokulturen der Makrophagen auf dem Aortengewebe konnte ausschließlich bei Makrophagen, welche auf GA-fixiertem Gewebe kultiviert wurden, eine Polarisation zum M1-Phänotyp festgestellt werden. Weiterhin zeigte sich, dass lediglich Faktoren des CFC-Gewebes in der Lage waren, die Aktivierung und Proliferation von T-Zellen zu verstärken. Insgesamt belegen diese Daten detailliert, dass IFC die Eigenschaften des Gewebes selektiv moduliert und dadurch eine verringerte Aktivierung des Immunsystems stattfindet. Die Ergebnisse verdeutlichen, dass IFC eine aussichtsreiche Strategie zur verbesserten Konservierung darstellt. / Optimal preservation methods are needed, to ensure constant availability of biological matrices for the replacement of damaged cardiovascular structures (heart valves or vessels). Conventional frozen cryopreservation (CFC) is currently the gold standard for cardiovascular allograft preservation. However, inflammation and structural deterioration limit transplant durability. The recently developed method of Ice-free cryopreservation (IFC) might be a superior method. The aim of this study was to characterize the reaction of the human immune system to allogeneic cardiovascular tissues after different cryopreservation methods. Regarding some aspects, the cryopreservation was compared to glutaraldehyde (GA) fixation, which is another common tissue preservation method. Human aortic tissue served as a proof-of-principle material for heart valves and vascular allografts. First, the histological and metabolic features of the differently preserved aortic tissues were analyzed. Tissues preserved by IFC exhibited typical architecture but significantly lower metabolic activity and the absence of necrotic or apoptotic cells. The reduced release of cytokines from IFC-tissue reflected these latter observations. In functional in-vitro-assays it was shown that migration of immune cells was significantly enhanced by soluble factors from CFC and GA-fixed tissue, but not by factors from IFC-tissue. In co-cultures of macrophages on aortic tissue, none of the preserved tissue induced activation. Exclusively GA-fixed tissue triggered the polarization of macrophages towards a M1-phenotype. Moreover, cues from only CFC-tissue but not IFC-tissue amplified T cell activation and proliferation. In conclusion, IFC selectively modulates the characteristics of tissues resulting in an attenuated activation of the human immune system. Therefore, IFC treatment is a promising strategy for improved tissue preservation and storage of cardiovascular allografts for clinical use.

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Um die Erhaltung und Nutzung der beiden gefährdeten, hochwertigen Baumarten Pyrus pyraster und Sorbus torminalis zu fördern, wurden Methoden der in vitro Kultur und der Kryokonservierung evaluiert und optimiert. Kryokonservierung von Sorbus torminalis wird erstmalig beschrieben. Als Explantatquellen dienten Winterknospen, überwiegend von selektierten Bäumen aus Nachkommenschaftsprüfungen. Von den geprüften Faktoren Nährmedienzusammensetzung, Kulturgefäß, Schneidetechnik, Temperatur, Pikiertermin und physiologischer Zustand der Explantate erwies sich letzterer als entscheidend. Die Reiser mit den Winterknospen wurden in zwei aufeinander folgenden Jahren im November, Dezember, Januar, Februar und März geerntet und sowohl direkt als auch nach 2-monatiger Lagerung bei +5°C bearbeitet. Bei Pyrus führte Ernte im März zu den besten Ergebnissen der in vitro Kultur. Die besten Ergebnisse der Kryokonservierung wurden von Ernten im November bis Januar erzielt. Bei Sorbus differierten die Ergebnisse der in vitro Kultur zwischen den Jahren so stark, dass keine Aussage möglich war. Bei der Kryokonservierung waren die Erntetermine Dezember und Januar erfolgreich. Zur Kryokonservierung von in vitro Material wurden die Alginat-Einkapselung und die Droplet-Technik geprüft. Mit Pyrus wurden mit der Droplet-Technik Vitalitätsraten zwischen 7 und 13% erzielt, wenn eine bisher unveröffentlichte Kombination von Vorbehandlungen und PVS2-Vitrifizierung eingesetzt wurden. Die Kryokonservierung wirkte sich im Vergleich weder positiv noch negativ auf Wachstum und Entwicklung aus. Die Diskrepanz zwischen der Nutzung der tiefen Dormanz der Knospen und des damit verbundenen natürlichen Frostschutzes für die Kryokonservierung einerseits und der Vermeidung von tiefer Dormanz bei Etablierung von in vitro Kulturen wegen der damit verbundenen Wachstumshemmung andererseits wird diskutiert. / To facilitate conservation and utilization of the endangered valuable tree species Pyrus pyraster and Sorbus torminalis methods of in vitro culture and cryopreservation were evaluated and optimized. Cryopreservation of Sorbus torminalis is described for the first time. The explant sources were dormant winter buds, mainly from selected trees from progeny trials. The evaluation of media composition, culture vessel, cutting technique, date of pricking and physiological state proved the latter to be crucial. Twigs with winter buds were harvested in two subsequent years in November, December, January, February and March and were processed immediately and after two months of storage at +5°C. With Pyrus, the best results in in vitro culture were obtained after harvest in March while for cryopreservation harvest in November to January proved to be best. With Sorbus, the results in in vitro culture differed between the years and no conclusion could be drawn. Cryopreservation was successful after harvest in December and January. Encapsulation in alginate and the droplet-technique were evaluated for the cryopreservation of in vitro material. Vitality rates of 7 to 13% were achieved with Pyrus using the droplet-technique with a combination of pre-treatments and PVS2-vitrification not published so far. In comparison, cryopreservation was of neither positive nor negative influence on growth and development. The discrepancy between deep dormancy of buds being useful for cryopreservation because of its natural frost protection and the need to avoid it because it impedes in vitro culture is discussed.

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Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung von Mikroalgen-Kulturstämmen unterhalb des Artniveaus. Für Service-Kulturensammlungen sind diese Untersuchungen wichtig, um die genetische Diversität der vorhandenen bzw. neu aufzunehmender Kulturen zu erfassen, Stämme eindeutig zu identifizieren oder auch Kontaminationen auszuschließen. Zu diesem Zweck wurden häufig in der Forschung genutzte Stämme von Mikroalgen mithilfe von genetischen Fingerabdrücken, die mit der AFLP (amplified fragment length polymorphism) Technik generiert wurden, untersucht. Mittels AFLP was es möglich, verschiedene Stämme derselben Art (Chlorella vulgaris) zu unterscheiden und für jedes Isolat einen charakteristischen genetischen Fingerabdruck zu erhalten. Da diese genomischen Variationen innerhalb derselben Art auch mit Unterschieden in physiologischen/biochemischen Eigenschaften korreliert sein können, ist es wichtig genau festzuhalten, welches Isolat für einen Versuch oder eine biotechnologische Anwendung verwendet wurde. Mit der AFLP-Technik war es ferner möglich, phänotypisch unterschiedliche Mutanten von Parachlorella kessleri und den entsprechenden Wildtyp zu unterscheiden. Normalerweise ist es mit AFLP nicht möglich, Algenkulturen zu untersuchen, die mit anderen Organismen kontaminiert sind. Das Problem hierbei ist, dass bei den generierten Fragmenten nicht unterschieden werden kann, ob sie von der Alge stammen oder von der Kontamination. Es konnte hier jedoch gezeigt werden, dass kontaminierte Kulturen trotzdem mit AFLP untersucht werden können. Hierzu war es nötig, Kulturen mit unterschiedlichem Verhältnis von Algen- und Bakterienzellen zu untersuchen. Außerdem konnte gezeigt werden, dass Infektionen von Algenkulturen mit Viren, die meistens schwer nachzuweisen sind, mittels AFLP festgestellt werden können. Kryokonservierung ist mittlerweile die Methode der Wahl zur Langzeitaufbewahrung von Mikroalgen. Es wird davon ausgegangen, dass diese Aufbewahrungsmethode genetisch stabile Kulturen über Jahrzehnte hinweg garantieren kann. Jedoch wurde bis heute die genetische Stabilität von kryokonservierten Algen noch nicht überprüft und deshalb in der vorliegenden Arbeit mithilfe der AFLP-Technik untersucht.

Die Bedeutung geeigneter in vitro Modelle gewinnt im Hinblick auf die Reduktion von Tierversuchen getreu des 3R-Prinzips immer mehr an Bedeutung. Für viele Fragestellungen in Bezug auf den Lebermetabolismus bei Nutztieren bieten primäre bovine und porcine Hepatozyten ein vielversprechendes in vitro Modell. Die Verfügbarkeit von primären Hepatozyten ist aber, aufgrund ihrer besonderen Sensibilität, äußerst begrenzt. Die Kryokonservierung von primären Hepatozyten stellt eine Strategie dar die Verfügbarkeit dieser Zellen maßgeblich zu verbessern. Eine weitere Möglichkeit Hepatozyten haltbar zu machen, ist die Proliferationsinduktion und somit die Immortalisierung der Leberzellen. Ziel dieser Arbeit war es, erstmals ein Kryokonservierungsprotokoll für primäre bovine Hepatozyten zu etablieren. Darüber hinaus sollte überprüft werden ob die Proliferationsaktivität von primären bovinen und porcinen Hepatozyten durch eine Behandlung mit Wachstumsfaktoren oder die Integration von humaner Telomerase reverse Transkriptase (hTERT) mittels Lipofectamine®-Transfektion induziert werden kann. Primäre Hepatozyten vom Rind und vom Schwein wurden von lebergesunden Spendertieren vergleichend mit einer zweischrittigen Kollagenaseperfusion gewonnen. Für die Etablierung des Kryokonservierungsprotokolls wurde zunächst die geeignete DMSO-Endkonzentration von 10 % ermittelt (n=3). Anschließend erfolgte die Kryokonservierung der Hepatozyten mit einer DMSO-Endkonzentration von 10 % und einer Konzentration von 20 % Fetalem Bovinem Serum vergleichend in William’s E Medium (WE) bzw. University of Wisconsin Medium (UW) mit und ohne Zusatz von 0,2 M Trehalose (T). Gleichzeitig wurde der Effekt einer computergesteuerten Einfriertechnik in einem Controlled-Rate-Freezer gegenüber einer manuellen Einfriertechnik mit Hilfe eines Gefrierbehälters evaluiert (n=6). Nach dem Auftauen wurde die Recovery (R, Zellzahl lebend aufgetauter Zellen im Vergleich zur Zahl der lebend eingefrorenen Zellen) und die Viabilität (V) der Hepatozyten mittels Trypanblaufärbung bestimmt, sowie die Kultivierbarkeit der Hepatozyten nach der Kryokonservierung untersucht. Für die Studien zur Proliferationsinduktion primärer boviner und porciner Hepatozyten, wurde im ersten Schritt ein geeignetes Transfektionsreagenz ermittelt, welches keine oder nur geringe zytotoxische Auswirkungen auf die Hepatozyten hat. Hierfür wurden die Hepatozyten in einer Monolayerkultur kultiviert und vergleichend mit Lipofectamine® 3000 und Lipofectamine® 2000 Reagenz behandelt (n=3). Anschließend erfolgte, mit Hilfe des Lipofectamine® 2000 Reagenz, eine Ko-Transfektion des eukaryotischen Plasmidvektors pCL-neo-hEST2 (hERT) sowie des fluoreszierenden eukaryotischen Plasmidvektors pmaxGFP™ in primäre bovine und porcine Hepatozyten. Die Überprüfung von Transfektionserfolg und -effizienz erfolgte mittels Fluoreszenzmikroskopie an Tag 2 nach Ko-Transfektion (n=6). Darüber hinaus wurde überprüft, ob eine Behandlung mit den Wachstumsfaktoren „bovine hepatocyte growth factor“ (bHGF) und „bovine epithelial growth factor“ (bEGF) bei kultivierten primären bovinen Hepatozyten zu einer effektiven Stimulation ihrer Proliferationsaktivität führt. Die Bestimmung der Signifikanzniveaus (P-Wert) erfolgte mittels One-way ANOVA Analyse mit Turkey-Test als Post-Hoc-Test, sowie der Two-Way ANOVA Analyse mit Šidák-Test als Post-Hoc-Test für Mehrfachvergleiche. Als statistisch signifikant wurde ein Signifikanzniveau von P ≤ 0,05 gewertet. Es konnte gezeigt werden, dass die computergesteuerte Einfriertechnik für die Kryokonservierung von primären bovinen und porcinen Hepatozyten einer manuellen Einfriertechnik deutlich überlegen ist (P < 0.0001). Im Hinblick auf die Wahl des Einfriermediums konnten für bovine Hepatozyten mit WE + T (V: 65,1 ± 8,3 %; R: 36,5 ± 6,0 %) und UW (V: 66,0 ± 11,2 %; R: 34,0 ± 8,9 %) und für porcine Hepatozyten mit UW (V: 76,8 ± 2,7 %; R: 69,7 ± 26,2 %) und UW + T (V: 64,4 ± 7,3 %; R: 67,6 ± 26,1 %) die besten Ergebnisse erzielt werden. Im Gegensatz zu kryokonservierten porcinen Hepatozyten, konnten bovine Hepatozyten ihre Kultivierbarkeit nach der Kryokonservierung nicht beibehalten. Für die Studien zur Proliferationsinduktion primärer boviner und porciner Hepatozyten, konnte gezeigt werden, dass das Transfektionsreagenz Lipofectamine® 3000 für die Transfektion primärer boviner und porciner Hepatozyten aufgrund zytotoxischer Eigenschaften nicht geeignet ist. Im Gegensatz dazu konnte mit Hilfe des Lipofectamine® 2000 Reagenz ein erfolgreiches Transfektionsprotokoll für primäre bovine und porcine Hepatozyten etabliert werden. Eine Induktion der Proliferationsaktivität durch die Integration von hTERT konnte allerdings nicht beobachtet werden. Ebenso konnte gezeigt werden, dass eine Behandlung mit den Wachstumsfaktoren bHGF und bEGF allenfalls zu einer geringgradigen Steigerung der Proliferationsaktivität primärer boviner Hepatozyten in einer Kollagen-Monolayer-Kultur führt. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass das Kryokonservierungsprotokoll für primäre bovine Hepatozyten weiter angepasst werden muss, um diese nach dem Tiefgefrieren brauchbar zu machen. Darüber hinaus sollte im Prozess der Etablierung einer Hepatozyten-Zelllinie aus primären bovinen bzw. porcinen Hepatozyten die Transfektion viraler Onkogene durchgeführt werden.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Anwendungsgebiete primärer Hepatozyten 3 2.2 Kryokonservierung 4 2.2.1 Geschichte 4 2.2.2 Grundlagen des Tiefgefrierens 5 2.2.3 Kryoprotektiva 8 2.2.3.1 Penetrierende Kryoprotektiva 8 2.2.3.2 Nicht penetrierende Kryoprotektiva 11 2.2.4 Einfriermedium 13 2.2.5 Kühlungsrate 14 2.2.6 Lagerung kryokonservierter Zellen 15 2.2.7 Auftauen 15 2.2.8 Kryokonservierung primärer Hepatozyten 17 2.3 Immortalisierung primärer Hepatozyten 19 2.3.1 Grundlagen der Immortalisierung 19 2.3.1.1 Zellzyklus Regulation 20 2.3.1.2 Kontrollpunkte und Kontrollmechanismen im Zellzyklus 23 2.3.2 Immortalisierungs-Strategien für primäre Hepatozyten 24 2.3.3 Gentransfer 26 3 Tiere, Material und Methoden 28 3.1 Material 28 3.2 Spendertiere 28 3.3 Methoden 30 3.3.1 Leberentnahme Rind 30 3.3.2 Leberentnahme Schwein 30 3.3.3 Leberzellisolation 31 3.3.4 Bestimmung von Zellzahl, Viabilität und Morphologie primärer Hepatozyten 35 3.3.5 Vorbereitung der Zellkulturplatten 36 3.3.6 Kultivierung primärer boviner und porziner Hepatozyten 37 3.3.7 Kryokonservierung 38 3.3.7.1 Vorversuch 38 3.3.7.2 Hauptversuch 40 3.3.8 Transfektion 44 3.3.8.1 Vorversuch 44 3.3.8.2 Hauptversuch 47 3.3.9 Proliferationsinduktion primärer boviner Hepatozyten mit Wachstumsfaktoren 50 3.4 Auswertung 51 3.4.1 Beurteilung der Qualität der aufgetauten Hepatozyten 51 3.4.2 Statistik 52 4 Ergebnisse 53 4.1 Beurteilung der Viabilität und Qualität der isolierten primären Hepatozyten 53 4.2 Kryokonservierung 55 4.2.1 Vorversuch 55 4.2.2 Hauptversuch 57 4.3 Transfektion 63 4.3.1 Vorversuch 63 4.3.2 Hauptversuch 67 4.4 Proliferationsinduktion primärer boviner Hepatozyten mit Wachstumsfaktoren 73 5 Diskussion 77 5.1 Ausgangsmaterial 77 5.2 Kryokonservierung 79 5.2.1 DMSO-Konzentration 79 5.2.2 Einfluss des Einfriermediums und des Zusatzes von Trehalose auf die Viabilität und Recovery kryokonservierter primärer boviner und porziner Hepatozyten 81 5.2.3 Einfluss der Einfriertechnik auf die Qualität kryokonservierter primärer boviner und porziner Hepatozyten 82 5.2.4 Einfluss der Langzeitlagerung bei -80 °C bzw. -150 °C auf die Qualität kryokonservierter primärer boviner und porziner Hepatozyten 83 5.2.5 Kultivierung kryokonservierter Hepatozyten 84 5.2.6 Vergleich primärer boviner und porziner Hepatozyten 88 5.3 Transfektion 90 5.3.1 Wahl des geeigneten Lipofectamine®-Reagenz und der geeigneten Einwirkdauer 90 5.3.2 Auswirkungen der Integration von hTERT in primäre bovine und porzine Hepatozyten 91 5.4 Proliferationsinduktion primärer boviner Hepatozyten mit Wachstumsfaktoren 93 6 Ausblick 94 7 Zusammenfassung 96 8 Summary 98 9 Literaturverzeichnis 100 10 Anhang 119 10.1 Geräte 119 10.2 Chemikalien 120 10.3 Plasmide 123 10.4 Gas 123 10.5 Verbrauchsmaterialien 123 10.6 Original Temperatur-Kurven 126 11 Danksagung 129 / The importance of suitable in vitro models is gaining more and more importance with regard to the reduction of animal experiments true to the 3Rs principle. Primary bovine and porcine hepatocytes offer a promising in vitro model to study liver metabolism in farm animals. However, the availability of primary hepatocytes is extremely limited due to their particular sensitivity. Cryopreservation of primary hepatocytes illustrates one strategy to increase their availability. Another approach to preserve hepatocytes in vitro is to induce cell-proliferation resulting in an immortalized hepatocyte cell line. This study aimed to establish for the first time a cryopreservation protocol for primary bovine hepatocytes. Furthermore, it should be verified whether proliferation activity can be induced by treatment with growth factors or integration of human telomerase reverse transcriptase (hTERT) via Lipofectamine® transfection. Primary bovine and porcine hepatocytes of liver healthy animals were obtained comparatively using a two-step collagenase-perfusion technique. For the establishment of the cryopreservation protocol, the appropriate final DMSO concentration of 10 % was first determined (n=3). Subsequently, cryopreservation of hepatocytes was performed comparatively in William's E medium (WE) and University of Wisconsin medium (UW) respectively, with and without the addition of 0.2 M trehalose (T) with a final DMSO concentration of 10% and a concentration of 20% fetal bovine serum. At the same time, the effect of a computer-controlled freezing technique in a controlled-rate freezer versus a manual freezing technique using a freezing container was evaluated (n=6). Cell-recovery (R, cell number of live thawed cells compared to the number of live frozen cells), as well as cell-viability (V) of cryopreserved hepatocytes was determined by trypan blue staining, after thawing. In addition, it was examined if cryopreserved hepatocytes maintain plateable after thawing. For the studies on proliferation induction of primary bovine and porcine hepatocytes, the first step was to determine a suitable transfection reagent that has no or only minor cytotoxic effects on the hepatocytes. For this purpose, hepatocytes were cultured in a monolayer culture and comparatively treated with Lipofectamine® 3000 and Lipofectamine® 2000 reagent (n=3). Subsequently, the eukaryotic plasmid vector pCL-neo-hEST2 (hTERT) plus fluorescent eukaryotic plasmid vector pmaxGFP™ were transfected into primary bovine and porcine hepatocytes using Lipofectamine® 2000 reagent. Transfection success and efficiency was verified by fluorescence microscopy 2 days after co-transfection (n=6). Futhermore, it was examined whether treatment with bovine hepatocyte growth factor' (bHGF) and bovine epithelial growth factor (bEGF) leads to an effective stimulation of proliferation activity in cultured primary bovine hepatocytes Significance levels (P value) were determined by one-way ANOVA analysis with Turkey test as post hoc test, and two-way ANOVA analysis with Šidák-test as post hoc test for multiple comparisons. A significance level of P ≤ 0.05 was considered statistically significant. It was shown that a computer-controlled freezing technique is clearly superior to a manual freezing technique for the cryopreservation of primary bovine and porcine hepatocytes (P < 0.0001). With regard to the choice of the freezing medium, the best results were obtained for bovine hepatocytes with WE + T (V: 65.1 ± 8.3 %; R: 36.5 ± 6.0 %) and UW (V: 66.0 ± 11.2 %; R: 34.0 ± 8.9%) and for porcine hepatocytes with UW (V: 76.8 ± 2.7%; R: 69.7 ± 26.2%) and UW + T (V: 64.4 ± 7.3%; R: 67.6 ± 26.1%). In contrast to cryopreserved porcine hepatocytes, bovine hepatocytes could not maintain their cultivability after cryopreservation. For the studies on proliferation induction of primary bovine and porcine hepatocytes, it was shown that the transfection reagent Lipofectamine® 3000 is not suitable for transfection of primary bovine and porcine hepatocytes due to cytotoxic properties. In contrast, a successful transfection protocol for primary bovine and porcine hepatocytes could be established using Lipofectamine® 2000 reagent. However, induction of proliferation activity by integration of hTERT could not be observed. Similarly, treatment with the growth factors bHGF and bEGF was shown to result in at most a modest increase in the proliferation activity of primary bovine hepatocytes in a collagen monolayer culture. In conclusion, the cryopreservation protocol for primary bovine hepatocytes needs to be further adapted to make hepatocytes useful after deep freezing. Furthermore, transfection of viral oncogenes should be considered in the further process of establishing a hepatocyte cell line of primary bovine or porcine hepatocytes.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Anwendungsgebiete primärer Hepatozyten 3 2.2 Kryokonservierung 4 2.2.1 Geschichte 4 2.2.2 Grundlagen des Tiefgefrierens 5 2.2.3 Kryoprotektiva 8 2.2.3.1 Penetrierende Kryoprotektiva 8 2.2.3.2 Nicht penetrierende Kryoprotektiva 11 2.2.4 Einfriermedium 13 2.2.5 Kühlungsrate 14 2.2.6 Lagerung kryokonservierter Zellen 15 2.2.7 Auftauen 15 2.2.8 Kryokonservierung primärer Hepatozyten 17 2.3 Immortalisierung primärer Hepatozyten 19 2.3.1 Grundlagen der Immortalisierung 19 2.3.1.1 Zellzyklus Regulation 20 2.3.1.2 Kontrollpunkte und Kontrollmechanismen im Zellzyklus 23 2.3.2 Immortalisierungs-Strategien für primäre Hepatozyten 24 2.3.3 Gentransfer 26 3 Tiere, Material und Methoden 28 3.1 Material 28 3.2 Spendertiere 28 3.3 Methoden 30 3.3.1 Leberentnahme Rind 30 3.3.2 Leberentnahme Schwein 30 3.3.3 Leberzellisolation 31 3.3.4 Bestimmung von Zellzahl, Viabilität und Morphologie primärer Hepatozyten 35 3.3.5 Vorbereitung der Zellkulturplatten 36 3.3.6 Kultivierung primärer boviner und porziner Hepatozyten 37 3.3.7 Kryokonservierung 38 3.3.7.1 Vorversuch 38 3.3.7.2 Hauptversuch 40 3.3.8 Transfektion 44 3.3.8.1 Vorversuch 44 3.3.8.2 Hauptversuch 47 3.3.9 Proliferationsinduktion primärer boviner Hepatozyten mit Wachstumsfaktoren 50 3.4 Auswertung 51 3.4.1 Beurteilung der Qualität der aufgetauten Hepatozyten 51 3.4.2 Statistik 52 4 Ergebnisse 53 4.1 Beurteilung der Viabilität und Qualität der isolierten primären Hepatozyten 53 4.2 Kryokonservierung 55 4.2.1 Vorversuch 55 4.2.2 Hauptversuch 57 4.3 Transfektion 63 4.3.1 Vorversuch 63 4.3.2 Hauptversuch 67 4.4 Proliferationsinduktion primärer boviner Hepatozyten mit Wachstumsfaktoren 73 5 Diskussion 77 5.1 Ausgangsmaterial 77 5.2 Kryokonservierung 79 5.2.1 DMSO-Konzentration 79 5.2.2 Einfluss des Einfriermediums und des Zusatzes von Trehalose auf die Viabilität und Recovery kryokonservierter primärer boviner und porziner Hepatozyten 81 5.2.3 Einfluss der Einfriertechnik auf die Qualität kryokonservierter primärer boviner und porziner Hepatozyten 82 5.2.4 Einfluss der Langzeitlagerung bei -80 °C bzw. -150 °C auf die Qualität kryokonservierter primärer boviner und porziner Hepatozyten 83 5.2.5 Kultivierung kryokonservierter Hepatozyten 84 5.2.6 Vergleich primärer boviner und porziner Hepatozyten 88 5.3 Transfektion 90 5.3.1 Wahl des geeigneten Lipofectamine®-Reagenz und der geeigneten Einwirkdauer 90 5.3.2 Auswirkungen der Integration von hTERT in primäre bovine und porzine Hepatozyten 91 5.4 Proliferationsinduktion primärer boviner Hepatozyten mit Wachstumsfaktoren 93 6 Ausblick 94 7 Zusammenfassung 96 8 Summary 98 9 Literaturverzeichnis 100 10 Anhang 119 10.1 Geräte 119 10.2 Chemikalien 120 10.3 Plasmide 123 10.4 Gas 123 10.5 Verbrauchsmaterialien 123 10.6 Original Temperatur-Kurven 126 11 Danksagung 129

Als Kapazitation bezeichnet man den im weiblichen Reproduktionstrakt stattfindenden Reifungsschritt, der Spermien das volle Fertilisierungspotential verleiht. Die molekularbiologischen Grundlagen dieses für eine erfolgreiche natürliche oder auch artifizielle Befruchtung essenziellen Prozesses sind bis heute nur unvollständig verstanden. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden die mit der Kapazitation einhergehenden funktionellen und strukturellen spermalen Veränderungen untersucht. Die kapazitative Stimulation führte zu einer gesteigerten Motilität bis hin zur Hyperaktivierung, zu einer vermehrt induzierten Akrosomenreaktion und zu einer deutlich reduzierten Apoptoseaktivität. Anhand von Inhibitionsexperimenten wurde die Rolle der potentiellen Signaltransduktoren Caspase-1, Calpain und Calmodulin analysiert. Dabei wies die Calmodulinantagonisierung auf eine ausgeprägte Calciumabhängigkeit aller untersuchten kapazitationsassoziierten Prozesse hin. Die Hemmung von Caspase-1 und Calpain führte zu einer Beeinträchtigung der Motilität und der Akrosomenreaktion ohne das Ausmaß der Apoptoseinduktion zu beeinflussen. Die vorstehend genannten Erkenntnisse wurden zur Evaluation verschiedener Ejakulataufbereitungsprotokolle genutzt. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Kombination des modernen Verfahrens der immunomagnetische Zellseparation mit der etablierten Methode der Dichtegradientenzentrifugation dem einfachen Standard in Bezug auf die Anreicherung hochmotiler Spermien mit minimaler Apoptoseaktivität aus frischen wie auch aus kryokonservierten Ejakulaten deutlich überlegen war. Bedeutsam im Hinblick auf eine mögliche pratische Anwendung der immunomagnetischen Zellseparation erscheint der Befund, dass die durch das kombinierte Anreicherungsverfahren erhaltene Spermatozoensubpopulation im Hamsteroozytenpenetrationstest ein signifikant höheres Fertilisierungspotential zeigte.