Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Lectinas sÃo proteÃnas que tem a capacidade de se ligar especificamente e reversivelmente a carboidratos e glicoconjugados, sem alterar a estrutura do ligante. Elas sÃo encontradas em organismos tais como vÃrus, bactÃrias, plantas e animais, e tem sido demonstrado que possuem atividades biolÃgicas importantes. Clitoria fairchildiana R. A. Howard à uma espÃcie pertencente à famÃlia Fabaceae, nativa da AmÃrica do Sul. O objetivo deste estudo foi isolar e caracterizar uma lectina presente em sementes de Clitoria fairchildiana, avaliar o potencial fitoterÃpico e farmacolÃgico (antinociceptivo, prà e antiinflamatÃrio, hemolÃtico, antibacteriano e antifÃngico) desta lectina. Os resultados indicaram a presenÃa de uma lectina (CFAL) na fraÃÃo proteica glutelina Ãcida, que aglutina eritrÃcitos de coelho nativos, a qual nÃo foi inibida por monossacarÃdeos e glicoproteÃnas testadas, foi purificada por cromatografia em coluna de troca-iÃnica, DEAE-Sephacel. AnÃlise da lectina em SDS-PAGE indicou duas bandas com massa molecular de aproximadamente 100 e 116 kDa. As anÃlises em DLS apresentam uma amostra monomodal com raio hidrodinÃmico (RH) de 4,5 nm, indicando uma conformaÃÃo dependente de alta concentraÃÃo salina. A CFAL à uma glicoproteÃna PAS (+) capaz de ser inativada pelo tratamento com metaperiodato de sÃdio, porÃm resistente ao efeito de β-mercaptoetanol e urÃia. Esta lectina nÃo apresentou citotoxicidade significativa nÃo alterou a fragilidade osmÃtica, bem como nÃo apresentou efeitos oxidante/antioxidante significativos frente a hemÃcias humanas. A lectina apresentou atividade antiinflamatÃria em modelo de edema da pata induzido por carragenina, com diminuiÃÃo de 71% do edema. Efeitos antinociceptivos dose dependentes foram observados para CFAL no teste de contorÃÃes abdominais induzida por Ãcido acÃtico, com reduÃÃo do nÃmero de contorÃÃes em atà 72%. A lectina de C. fairchildiana foi capaz de reduzir o crescimento de Bacillus subtilis e nÃo afetou o crescimento dos fungos testados. Concluiu-se que a lectina purificada e caracterizada a partir das sementes de Clitoria fairchildiana à uma glicoproteÃna desprovida de pontes dissulfeto com atividade antiinflamatÃria e antinociceptiva e nÃo à citotÃxica para eritrÃcitos humanos. / Lectins are proteins that have the ability to bind specifically and reversibly to carbohydrates and glycoconjugates, without changing the structure of binder. They are found in organisms such as virus, bacterias, plants and humans, and has been shown to possess important biological activities. Clitoria fairchildiana R. A. Howard is a species belonging to the Fabaceae family, native to South America. The purpose of this study was to isolate and to characterize a lectin present in seeds of Clitoria fairchildiana, evaluate the herbal and pharmacological potential (antinociceptive, pro-and antiinflammatory, hemolytic, antibacterial and antifungal) of this lectin. The results indicated the presence of a lectin (CFAL) on protein fraction acid glutelin, CFAL binds native rabbit erythrocytes, was not inhibited by monosaccharides and glycoproteins tested and was purified by ion exchange chromatography, DEAE-Sephacel. Analysis of the lectin in SDS-PAGE showed two bands with molecular mass approximately 100 and 116 kDa. In DLS analyzes have a monomodal sample with hydrodynamic radius (RH) of 4.5 nm, showing a conformation high salt concentration dependent. The CFAL is a glycoprotein PAS (+) capable of being inactivated by treatment with sodium metaperiodate, but resistant to the effect of β-mercaptoethanol and urea. This lectin did not show significant cytotoxicity, did not change the osmotic fragility and not showed oxidant/antioxidant significant effects, compared to human erythrocytes. The lectin showed anti-inflammatory activity in models of paw edema induced by carrageenan, decreasing 71% of edema. Dose dependent antinociceptive effects were observed for CFAL on abdominal writhing test induced by acetic acid, reducing the number of writhes in up to 72%. The C. fairchildiana lectin was able to reduce the growth of Bacillus subtilis and did not affect growth of the fungi tested. It was concluded that the lectin purified and characterized from the seeds of Clitoria fairchildiana is a glycoprotein lacks disulfide bonds with antinociceptive and antiinflammatory activity, and is not cytotoxic to human erythrocytes.

FundaÃÃo de Amparo à Pesquisa do Estado do Cearà / This work evaluated the biotechnological potential of lectins in the induction of apoptosis of neoplastic cells; the effect on wound healing in a murine model (in vivo) and established the level of toxicity on Artemia sp. Lectins are proteins or glycoproteins ubiquitously distributed in nature, being found from bacteria to humans. Since carbohydrates can act as mediators of biological information, the interaction with lectins can trigger some biologically important effect. To verify the role of lectins in the induction of apoptosis, A549 cells (lung carcinoma) were grown for 1 hour with lectins isolated from seeds of Canavalia ensiformis (ConA), C. brasiliensis (ConBr), C. boliviana (ConBol), C. grandiflora (Cgran) and C. gladiata (CGL) labeled with FITC. In addition, the relative gene expression of p53, Bax, Bcl-2 and caspase 9 was also evaluated when the cells were cultured with ConA, ConBr and ConBol. The data showed that all lectins interacted with A549 cells. Nevertheless, p53 and Bax had no significant change. Unlike, the expression of BCL-2 was down-regulated while caspase 9 was up-regulated by treatment with lectins. Concerning the pro-healing potential, the lectin isolated from the red alga Bryothamnion seafortii (BS) was tested by topical treatment of skin lesions. The data showed that BS improved the quality of healing, probably through the induction of fibroblast proliferation. Finally, the lethality test of Artemia sp. was carried out to determine the toxicity of some Diocleinae lectins. ConBr is the most toxic lectin against Artemia, while ConA is the least toxic, and ConBol, ConM, ConGr and CGL exhibit intermediate levels of toxicity. / Este trabalho avaliou o potencial biotecnolÃgico de lectinas na induÃÃo da apoptose de cÃlulas neoplÃsicas, o efeito sobre a cicatrizaÃÃo de feridas em modelo murino (in vivo) e estabeleceu o nÃvel de toxicidade sobre Artemia sp. Lectinas sÃo proteÃnas ou glicoproteÃnas distribuÃdas ubiquamente na natureza, sendo encontradas desde bactÃrias atà seres humanos. Tais proteÃnas possuem a capacidade de ligar-se seletivamente a carboidratos. Considerando que carboidratos possam atuar como mediadores da informaÃÃo biolÃgica, a sua interaÃÃo com lectinas pode desencadear algum efeito biolÃgico importante. Para verificar o papel das lectinas sobre a induÃÃo da apoptose, cÃlulas A549 (carcinoma de pulmÃo) foram cultivadas durante 1 hora juntamente com lectinas isoladas das sementes de Canavalia ensiformis (ConA), C. brasiliensis (ConBr), C. boliviana (ConBol), C. grandiflora (Cgran) e C. gladiata (CGL) marcadas com FITC. Em adiÃÃo, a expressÃo gÃnica relativa de p53, Bax, BCL-2 e caspase 9 foi tambÃm avaliada quando as cÃlulas foram cultivadas com ConA, ConBr e ConBol. Os dados mostraram que todas as lectinas intergiram com as cÃlulas A549. NÃo obstante, p53 e Bax nÃo tiveram nenhuma alteraÃÃo significativa. PorÃm, BCL-2 teve sua expressÃo diminuÃda enquanto a da caspase 9 foi aumentada pelo tratamento com as lectinas. Com relaÃÃo ao potencial pro-cicatrizante, a lectina isolada da alga vermelha Bryothamnion seafortii (BS) foi testada atravÃs do tratamento tÃpico de lesÃes cutÃneas. Os dados mostraram que BS melhora a qualidade da cicatrizaÃÃo, muito possivelmente atravÃs da induÃÃo da proliferaÃÃo de fibroblastos. Por fim, o teste de letalidade sobre Artemia sp. foi utilizado para verificar a toxicidade de algumas lectinas da subtribo Diocleinae. Os resultados mostraran que ConBr e ConA sÃo as lectinas mais tÃxica e menos tÃxica, respectivamente. ConBol, ConM, Cgran e CGL exibiram nÃveis intermediÃrios de toxicidade.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Os genes sintÃticos das lectinas das algas marinhas vermelhas Hypnea musciformis (HML) e Bryothamnion triquetrum (BTL) foram clonados em diferentes vetores e transformados em diferentes cÃlulas bacterianas de expressÃo. As lectinas recombinantes foram obtidas a partir da fraÃÃo solÃvel das culturas bacterianas de Escherichia coli Rosetta-gami 2 (DE3) para rHML e BL21 (DE3) para rBTL. Os testes de hemaglutinaÃÃo mostraram que rHML e rBTL sÃo capazes de aglutinar eritrÃcitos de coelho tratados com diferentes enzimas proteolÃticas. As propriedades hemaglutinantes de rHML e de rBTL confirmam o enovelamento correto e o estado funcional das proteÃnas. A caracterizaÃÃo da especificidade de ligaÃÃo a carboidratos da HML, BTL e da rBTL por glycan array mostrou uma especificidade restrita por oligossacarÃdeos complexos contendo o nÃcleo de fucosilaÃÃo (α1-6), com uma preferÃncia particular por N-glicanos nÃo bisectados, bi e tri-antenados de cadeia curta. A presenÃa de Ãcido siÃlico na extreminada nÃo-redutora dos glicanos favorece o reconhecimento. Essa foi a primeira caracterizaÃÃo de lectinas de algas vermelhas por glycan array. Experimentos de STD-RMN com a BTL mostraram uma interaÃÃo com um octassacarÃdeo contendo o nÃcleo de fucosilaÃÃo (α1-6). A atividade tÃxica das lectinas selvagens e recombinantes foi avaliada contra Artemia sp. e contra cÃlulas de adenocarcinoma de pulmÃo (A549). Nos ensaios de citotoxicidade, HML, rHML, BTL e rBTL nÃo mostraram nenhuma toxicidade contra Artemia sp. e somente HML e rHML mostraram uma baixa toxicidade contra cÃlulas de adenocarcinoma de pulmÃo (A549). O primeiro cristal de rBTL foi obtido a um nÃvel de microescala com a ajuda de um robÃt de cristalizaÃÃo e difratou a 15 Ã de resoluÃÃo. / Synthetic genes from the red marine algae Hypnea musciformis (HML) and Bryothamnion triquetrum (rBTL) were cloned into differents vectors and transformed into several bacterial expression strains. The recombinant lectins were obtained from the soluble fraction of bacterial cultures using Escherichia coli Rosetta-gami 2 (DE3) strain for rHML and E. coli BL21 (DE3) strain for rBTL. Haemagglutination tests showed that rHML and rBTL are able to agglutinate rabbit erythrocytes with strong haemagglutination activity only after treatment with papain and trysine indicating that their ligands are not directly accessible at the cell surface. The haemagglutinating properties of rHML and rBTL confirm the correct folding and functional state of the proteins. A study of the specificity of these lectins by glycan array was conducted. HML, BTL and rBTL showed a restricted specificity for complex N-glycans with core (α1-6) fucose. A more detailed analysis of the specificity of these lectins showed a preference for non bisecting N-glycans, bi- and tri-antennary branching sugars with short chains. Addition of Sialic acid at the non-reducing end of N-glycans favors their recognition by the lectins. This is the first characterization of lectins from red algae by glycan array. An interaction between BTL and a core (α1-6) fucosylated octasaccharides was also observed by STD-NMR. The toxic activity of wild and recombinant lectins were evaluated against Artemia sp. and the human lung adenocarcinoma cell line (A549). In cytotoxicity assays, HML, rHML, BTL and rBTL showed no toxicity against Artemia sp. Only HML and rHML showed a low cytotoxic activity against cell line (A549). The first crystal of rBTL was obtained in micro-scale level using a robot and diffracted at 15 Ã.

A lectina da alga marinha vermelha Amansia multifida, foi investigada com respeito à sua especificidade e afinidade por estruturas de carboidratos complexos. A cinÃtica da interaÃÃo em tempo real da lectina solÃvel com vÃrias glicoproteÃnas imobilizadas, e a inibiÃÃo destas interaÃÃes por oligomanosÃdeos, foram analisadas atravÃs da tecnologia de ressonÃncia plasmÃnica de superfÃcie. A lectina exibiu uma certa preferÃncia pelo monossacarÃdeo manose e a sua interaÃÃo por di-tri e pentamanosÃdeos foi mais expressiva. A lectina de A. multifida interagiu com glicopeptÃdeos Man5 a Man8â asparagina, e a alta afinidade da lectina pelas referidas estruturas, foi evidenciada quando da anÃlise da interaÃÃo com glicoproteÃnas tais como: lactotransferrina bovina e ribonuclease b. De acordo com os resultados obtidos com a coluna de Sepharose6B com lectina de A. multifida imobilizada, o baixo reconhecimento sobre a aglutinina de soja, confirma o nÃo reconhecimento sobre a estrutura Man 9, e descarta a capacidade de associaÃÃo da lectina com uma estrutura que exiba trÃs resÃduos de manose ligados em -1,2 na extremidade do glicano. Estudos farmacolÃgicos envolvendo a lectina de A. multifida complementaram este trabalho, quando foram testadas as atividades analgÃsica e antiinflamatÃria em camundongos. Os resultados indicaram que essa proteÃna produziu um efeito analgÃsico nos trÃs tipos de modelo de dor utilizados. Nos testes das contorÃÃes abdominais e de formalina, um efeito dose dependente foi evidenciado. A administraÃÃo por via intraperitoneal e por via oral, apresentou resultados que mostraram ser a primeira via de tratamento a mais efetiva. Com o objetivo de comparar a aÃÃo analgÃsica da lectina de A. multifida com um narcÃtico analgÃsico de aÃÃo central, morfina, foi realizado o teste da placa quente utilizando um tratamento prÃvio com naloxona, um antagonista opiÃide. A lectina de A. multifida, mostrou reduÃÃo no seu efeito antinociceptivo na presenÃa de naloxona, sugerindo portanto, que sua atividade envolve a ativaÃÃo de receptores opiÃides à semelhanÃa da morfina. Um efeito antinociceptivo a nÃvel central, tambÃm foi observado quando a lectina aumentou a duraÃÃo do tempo de sono induzido por barbitÃrico. A aÃÃo antiinflamatÃria da lectina de A. multifida foi comprovada no teste de edema de pata utilizando carragenina e dextrano. A participaÃÃo de lectina nos efeitos analgÃsicos observados, foi avaliada com utilizaÃÃo prÃvia de D-manose e avidina, das quais D-manose suprimiu a nocicepÃÃo satisfatoriamente. A lectina de A. multifida mostrou possuir propriedades analgÃsicas de origem perifÃrica e central, sendo esses efeitos mais evidenciados na dor de origem inflamatÃria. / This study aimed to investigate the specificity for simple sugars or glycoproteins of the lectin from the red seaweed Amansia multifida. The interaction kinetics in real time of the soluble lectin with several immobilized glycoproteins and the inhibition of these interactions by oligomanosides were analyzed through surface plasmon resonance technology. The lectin showed somehow preference to the monosaccharide mannose and its interaction with di-tri and pentamanosides was more expressive. The lectin of A. multifida interacted with glycopeptides Man5 to Man8â asparagine, and the high affinity of the lectin for these structures was shown by analyzing the interaction with glycoproteins such as ribonuclease b and bovine lactotransferrin. The results obtained with Sepharose6B column containing immobilized A. multifida and the low recognition of soybean agglutinin corroborate the non-recognition of Man 9, and discard the capacity of association with a structure showing three residues of mannose linked in a-1,2 at the glycan extremity. The results of the pharmacological studies with three models of pain showed that A. multifida lectin caused analgesia. In the abdominal contorsion and formalin tests a dose-dependent effect was observed. The IP route was more effective than the oral route. In order to compare the analgesic action of A. multifida lectin with that of morfine, a narcotic with central action, the hot plate test was conducted after pre-treatment with the opioid antagonist naloxane. The antinociceptive effect of the lectin was reduced at the presence of naloxane, which suggests that its action involves activation of opioid receptors as occurs with morfine. An antinociceptive effect at central level was also observed when the lectin increased the duration of barbituric-induced sleep. The lectin showed anti-inflammatory action by the paw edema test with carrageenan and dextran. The involvement of the lectin in the observed antinociceptive effects was assessed by pre-treatment with D-mannose and avidin. The antinociceptive effect was suppressed by D-mannose. A. multifida lectin was shown to have antinociceptive properties of both central and peripheral origin, being these effects more evident for pain of inflammatory origin

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Atualmente à crescente o nÃmero de estudos com base na alteraÃÃo de perfis glicoproteÃmicos em diversas doenÃas, principalmente na busca de biomarcadores sÃricos para o cÃncer. A identificaÃÃo e quantificaÃÃo direta, de glicoproteÃnas sorolÃgicas pouco abundantes, sÃo difÃceis, pois proteÃnas muito abundantes no sangue podem dificultar a identificaÃÃo. Assim, ferramentas de fracionamento sÃo necessÃrias para isolar, eficientemente, glicoformas proteicas aberrantes no proteoma sanguÃneo. Tendo em vista a interaÃÃo especÃfica e reversÃvel de lectinas com glicoconjugados, o uso de lectinas imobilizadas em matriz cromatogrÃfica tem sido frequente, visando fracionar misturas complexas, envolvendo glicoproteÃnas, para posterior anÃlise por espectrometria de massas. Mediante este contexto, o objetivo do presente trabalho foi investigar o uso da lectina glucose/ manose ligante de sementes de Dioclea altÃssima (DaL) imobilizada em matriz cromatogrÃfica Sepharose 4B (DaL-Sepharose), no fracionamento de glicoproteÃnas sÃricas e na pesquisa de potenciais biomarcadores para o cÃncer de prÃstata (CaP). As glicoproteÃnas da fraÃÃo retida, obtidas pela cromatografia do soro sanguÃneo na matriz de DaL-Sepharose, foram identificadas e quantificadas, por espectrometria de massas, e assim, foi obtido o perfil proteico para os trÃs grupos estudados: controle, hiperplasia prostÃtica benigna e CaP. A identificaÃÃo das proteÃnas diferentemente expressas entre os grupos revelou 132 glicoproteÃnas, destas, 29 foram unicamente identificadas no grupo com cÃncer de prÃstata ou apresentaram uma razÃo de ln maior que 1,2, quando comparado à quantificaÃÃo no grupo controle. ApÃs uma anÃlise considerando a confiabilidade da identificaÃÃo, estimada pelo escore, e as evidencias na literatura que justifiquem um possÃvel envolvimento da proteÃna no cÃncer de prÃstata, destacaram-se: alfa-1-glicoproteÃna Ãcida, trombospondin-5, complemento C4 A, heptaglobina, pregnancy zone protein, isoforma 3 de alfa-1-antitripsina, alfa-2-glicoproteÃna rica em leucina e Zinc finger protein. A anÃlise do soro sanguÃneo fracionado pela matriz DaL-Sepharose, com prÃvia depleÃÃo de Albumina sÃrica humana e IgG, permitiu a identificaÃÃo de alfa-1-antitripsina e a proteÃna IGK âÃnicasâ no grupo com CaP e a pregnancy zone protein e a proteÃna like alfa 1 mieloma up reguladas no CaP quando comparadas ao grupo controle. A identificaÃÃo destas glicoproteÃnas gera novas perspectivas e servem de indicativo para nortear a pesquisa e desenvolvimento de mÃtodos de validaÃÃo destes resultados para usos clÃnicos. / Nowadays there are an increase number of studies based on the change of glycoproteomics profiles in several diseases, especially in the search for serum biomarkers for cancer. The direct identification and quantification of serum glycoprotein of low abundance are difficult, because proteins very abundance in the blood can difficult the identification. Thus, fractionation tools are necessary to isolate efficiently changed protein glycoforms on the blood proteome. Given the specific and reversible interaction of lectins to glycoconjugates, the use of immobilized lectins on chromatographic matrix has been frequent in order to fractionate complex mixtures, involving glycoprotein for analysis for mass spectrometry. In this context, the goal of this work was to investigate the use of binding glucose/ mannose lectin from Dioclea altÃssima seed (DaL) immobilized on Sepharose chromatography matrix 4B (DaL-Sepharose), on the fractionation of serum glycoproteins and research of potential biomarkers for prostate cancer (PC). Glycoproteins from the retained fraction obtained by chromatography of blood serum on DaL-Sepharose matrix were identified and quantified by mass spectrometry and it was obtained the protein profile to the three groups: control, benign prostatic hyperplasia and PC. The identification of differentially expressed proteins between the groups showed 132 glycoproteins, in which 29 were only identified on the group with prostate cancer or showed one reason of ln greater than 1.2 when compared to quantification on control group. After an analysis, considering the confiability of the identification, estimated by score, and the evidences on the literature that justified a possible involvement of the protein on prostate cancer, stood out: alpha-1-acid glycoprotein, thrombospondin-5 complement C4 A, haptoglobin, pregnancy zone protein, isoform 3 of alpha 1-antitrypsin, alpha-2 glycoprotein rich in leucine and Zinc finger protein. The analysis of fractionated bood serum by DaL-Sepharose matrix with prior depletion of Human Serum Albumin and IgG allowed the identification of alpha 1-antitrypsin and the IGK protein âonlyâ on the group with CaP and the pregnancy zone protein and protein like alfa-1 mieloma up regulated on CaP when compared to the control group. The identification of these glycoproteins generates new perspectives and suit as indicative for guiding research and validation methods development of these results for clinical uses.

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A grande diversidade biolÃgica das algas marinhas e sua ocorrÃncia em praticamente todos os ambientes do planeta demonstram a importÃncia desses seres para os ecossistemas. Um deles à a extraÃÃo de biomolÃculas potencialmente ativa como as lectinas, que sÃo proteÃnas que tÃm sido alvo de pesquisas no mundo inteiro. Isso se deve à sua impressionante capacidade de ligar-se especificamente a carboidratos ou a substÃncias que os contÃm, propiciando um imenso campo de aplicaÃÃo biolÃgica. O objetivo deste trabalho foi produzir a lectina da alga marinha vermelha Bryothamnion triquetrum (Lec), avaliar sua estrutura secundÃria a partir de tÃcnicas espectroscÃpicas e investigar as suas propriedades anti-inflamatÃrias em camundongos. Primeiramente a lectina foi purificada por precipitaÃÃo com sulfato de amÃnio (0-60) e cromatografia de troca â iÃnica, sendo recolhido o primeiro pico (PI). Este pico foi selecionado atravÃs da atividade de hemaglutinaÃÃo obtendo assim a lectina pura a partir de Bryothamnion triquetrum, verificada por SDS-PAGE. A lectina foi analisada quanto a sua estrutura secundÃria por tÃcnicas espectroscÃpicas de dicroÃsmo circular, frente a extremos de pH (4,0 â 11,0) e comparada ao espectro da sua estrutura nativa, e fluorescÃncia frente a diferentes temperaturas que variaram de 25 a 75 em intervalo de 10Â. Na avaliaÃÃo das atividades biolÃgicas, grupos de animais foram submetidos ao prÃ-tratamento com a Lectina (1,5 e10mg/kg; i.p.) e indometacina (10mg/kg), 30 min antes do estÃmulo inflamatÃrio. A atividade anti-inflamatÃria em camundongos foi avaliada atravÃs dos ensaios de peritonite induzida por carragenina - Cg (500 μg/cav) e de edema de pata induzidos por Cg (500 μg/pata); dextrano (500 μg/pata). Extremos do pH (4,0 e 11,0) nÃo alterou a estrutura secundÃria da proteÃna. Os dados de fluorescÃncia (280nm e 295nm), mostraram tambÃm uma estabilidade, alÃm da presenÃa de aminoÃcidos aromÃticos na sua estrutura. A Lectina inibiu a migraÃÃo celular na peritonite induzida por Cg e os edemas de pata induzidos por Cg e dextrano. Deste modo, conclui-se que a Lectina obtida do PI da DEAE de Bryothamnion triquetrum apresentou estrutura estÃvel em relaÃÃo a variaÃÃo de pH e temperatura. Em relaÃÃo Ãs propriedades biolÃgicas testadas, a Lectina apresentou efeitos anti-inflamatÃrios nos modelos empregados, podendo ser considerada uma molÃcula com potencial para estudos mais aprofundados de inflamaÃÃo. / The great biodiversity of seaweeds and their occurrence in almost all environments on the planet demonstrate the importance of such beings to ecosystems. One example is the extraction of potentially active biomolecules such as lectins, which are proteins that have been subject of research worldwide. This is due to its impressive ability to bind specifically to carbohydrates or substances containing them, providing an immense field of biological application. This work purpose was to produce lectin from the red seaweed Bryothamnion triquetrum (Lec), evaluate its secondary structure using spectroscopic techniques, and investigate their anti-inflammatory properties in mice. Initially, the lectin was purified by precipitation with ammonium sulfate (0-60) and ion exchange chromatography, and obtained the first peak (PI). This peak was selected by hemagglutination activity thus obtaining pure lectin from Bryothamnion triquetrum, verified by SDS-PAGE. The secondary structure of lectin was analyzed by circular dichroism spectroscopic techniques, against to pH extremes (4.0 to 11.0), and compared to the spectrum of its native structure, and fluorescence against different temperatures, ranging from 25 to 75Â, each 10 interval. In biological activities assessment, groups of animals were subjected to pretreatment with the lectin (1.5 and 10mg/kg, ip) and indomethacin (10mg/kg) 30 min before the inflammatory stimulus. The anti-inflammatory activity in mice was evaluated through the assays of peritonitis induced by carrageenan - Cg (500 μg / cav) and paw edema induced by Cg (500 μg / paw), and dextran (500 μg / paw). Extremes of pH (4.0 and 11.0) did not alter the protein secondary structure. Fluorescence data (280nm and 295nm) also showed stability, and aromatic amino acids presence in their structure. Lectin inhibited cell migration in the induced peritonitis by Cg and induced paw edema by Cg and dextran. Thus, it is concluded that the lectin obtained from the Bryothamnion triquetrum DEAE PI shows stable structure related to pH and temperature variation. Regarding biological properties tested, the lectin showed anti-inflammatory effects in models used, and it can be considered a molecule with potential for further studies of inflammation.

O fungo termodimórfico Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis) é o agente causador da paracoccidioidomicose (PCM), doença endêmica na América Latina. A partir do reconhecimento de componentes fúngicos, macrófagos são ativados e adquirem propriedades que favorecem a eliminação do patógeno. Essas células produzem citocinas responsáveis pelo direcionamento da resposta adaptativa, sendo que o perfil Th1 é associado a proteção. Lectinas são proteínas que se ligam seletiva e reversivelmente a açúcares. Sua interação com glicanas da superfície de células da imunidade pode resultar em ativação e produção de citocinas, o que pode culminar em imunomodulação de efeito anti-infectivo. Nosso grupo trabalha com uma lectina de P. brasiliensis, denominada de Paracoccina (PCN) que se liga a N-acetilglicosamina. Assim, no presente trabalho objetivamos a produção de paracoccina recombinante (rPCN) expressa em Pichia pastoris e análise do papel ativador da rPCN em macrófagos. Demonstramos que esse organismo transformado secreta rPCN para o meio de cultura, com baixa contaminação de proteínas endógenas, o que possibilita o isolamento da proteína recombinante através de etapa cromatográfica única. Verificamos que a preparação obtida reproduz características da proteína nativa obtida de leveduras de P. brasiliensis e tem massa molecular aparente de 27 kDa. Demonstramos que rPCN estimula macrófagos murinos a produzirem citocinas pró-inflamatórias (IL-6, IL-12p40 e TNF-) e óxido nítrico (NO). Macrófagos estimulados com rPCN polarizam-se em direção ao perfil M1, como indicado pela maior expressão relativa de mRNA para iNOS2, SOCS3 e STAT1. Verificamos que TLR2 e TLR4 medeiam a ativação de macrófagos por rPCN, uma vez que a ausência de cada um desses receptores, com destaque para TLR4, afeta a produção de mediadores inflamatórios estimulada pelo componente fúngico. TLR4 é também responsável pela polarização de macrófagos em direção ao perfil M1, pois na ausência desse receptor não se detecta mensagem para iNOS2. Concluímos que o método de produção de rPCN via P. pastoris é eficiente e que a preparação obtida ativa macrófagos, levando-os a produzirem mediadores pró-inflamatórios e se polarizarem em direção ao perfil M1. Esses processos são essencialmente mediados por TLR4. Postula-se que paracoccina seja um agonista de TLR4 capaz de desencadear respostas que, sabidamente, conferem proteção contra a infecção por P. brasiliensis. / The dimorphic fungus Paracoccidioiddes brasiliensis (P. brasiliensis) is the causative agent of paracoccidioidomycosis (PCM), an endemic disease in Latin America. From the recognition of fungal components, macrophages are activated and acquire properties that favor the elimination of the pathogen. These cells produce cytokines that are responsible for directing the adaptive response, wherein Th1 immunity is protective. Lectins are proteins that bind selectively and reversibly to sugars. Their interaction with glycans in the surface of immune cell can result in activation and cytokine production, which may result in immunomodulatory anti-infective effect. Our group has been working with a lectin from P. brasiliensis called paracoccin (PCN) which binds to N-acetylglucosamine. In the present work we aimed to produce recombinant paracoccin (rPCN) expressed in Pichia pastoris and analysis of the role of rPCN in macrophages activation. We have demonstrated that this transformed organism secret rPCN to the culture medium and presents low contamination with endogenous proteins, which allows the isolation of recombinant protein by a single chromatography step. We found that the obtained preparation reproduces characteristics of the native protein from P. brasiliensis yeast and has apparent molecular mass of 27 kDa. We demonstrated that rPCN stimulates murine macrophages to produce pro-inflammatory cytokines (IL-6, IL-12 p40, and TNF-) and nitric oxide (NO). Macrophages stimulated with rPCN polarize toward the M1 profile, as indicated by increased relative expression of iNOS2, SOCS3, and STAT1. We found that TLR2 and TLR4 mediate macrophage activation by rPCN, since the absence of each of these receptors, especially TLR4, affects the production of inflammatory mediators stimulated by the fungal component. TLR4 is also responsible for macrophage polarization toward the M1 profile, because in the absence of this receptor, the message to iNOS2 is not detected. We conclude that the method used to rPCN production, by P. pastoris, is efficient and that the obtained preparation is able to active macrophage, inducing them to produce pro-inflammatory mediators and polarize into the M1 profile. These processes are primarily mediated by TLR4. It is postulated that Paracoccin corresponds to a TLR4 agonist, able to trigger responses that are known to provide protection against infection with P. brasiliensis.

Submitted by Caroline Falcao (caroline.rfalcao@ufpe.br) on 2017-04-05T16:39:15Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2011-Tese-MoacyrRêgol.pdf: 2001004 bytes, checksum: 1fa7b5e19c232f34bd9c8735fac6c753 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-05T16:39:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2011-Tese-MoacyrRêgol.pdf: 2001004 bytes, checksum: 1fa7b5e19c232f34bd9c8735fac6c753 (MD5) Previous issue date: 2011-08-26 / Este trabalho objetivou analisar a expressão de Galectina=1(Gal=1), Galectina=3 (Gal=3) e ligantes de lectinas em ambientes hipóxicos e/ou privados de nutrientes em célula de câncer de mama e em biópsias tumorais. Para modelar o evento in vitro a linhagem celular de câncer de mama T47D foi submetida à hipóxia em câmara de hipóxia durante 24, 48 e 72h com ou sem privação de nutrientes. Os grupos controles (normóxia com ou sem nutrientes) foram mantidos em estufa de CO2. As biópsias tumorais de carcinoma ductal invasivo (CDI) foram divididas em dois grupos: um positivo e outro negativo para o marcador de hipóxia (CA IX) assim como as biópsias de carcinoma ductal in situ (CDIS) foram divididas em comedônicas/hipóxas e não=comedônicas/controle, para posterior comparação quanto aos parâmetros clínicos, histopatológicos e glicobiológicos. Os experimentos com T47D mostraram que a expressão de Gal=3 aumenta progressivamente quando submetida à hipóxia e privação de nutrientes durante 24, 48, 72h. As biopsias de CDI positivas para CA IX apresentaram uma marcação nuclear mais intensa que o grupo negativo e características tumorais mais agressivas como invasão linfonodal e ausência de Receptor de estrógeno. Gal=1 não foi expressa pelas células neoplásicas no modelo in vitro bem como nas biópsias, onde foi possível detectar positividade nas células do estroma associadas ao tumor. Quanto ao papel da Gal=3 na proteção a morte celular, utilizando=se citômetria de fluxo, observou=se que não houve correlação entre a inibição do domínio de reconhecimento a carboidratos da proteína e o aumento de morte celular. Entretanto, foi observada indução a morte para o anticorpo monoclonal M338, específico para o N=terminal de Gal=3, sendo esta marcação aumentada em até três vezes durante o aumento de morte celular em 48h e 72h de hipóxia e privação de nutrientes. A histoquímica com lectinas foi utilizada em amostras de CDIS com Con A, WGA e UEA=I e de CDI com L=PHA e SNA. Nos casos de CDIS as lectinas utilizadas reconheceram mais casos do grupo comedônico (hipóxico) que o não=comedônico. Ao passo que nas biópsias de CDI foi observado um aumento na sialilação assim como nas células T47D (in vitro) onde se pode avaliar que esta glicosilação não é de responsabilidade exclusiva de ST6GALNac. Nossos resultados indicam que ocorre uma glicosilação aberrante no ambiente hipóxico in vitro e in vivo associada a um fenótipo tumoral mais agressivo bem como sugere que Gal=3 participa da proteção contra morte celular e informativa para diagnóstico e prognóstico. / This study aimed to analyze the expression of Galectin=1, Galectin=3 and lectin ligands in hypoxic environments starved or not of nutrients in breast cancer cells and in tumour biopsies. In vitro experiments in T47D breast cancer cells were subjected to hypoxia in hypoxia chamber for 24, 48 and 72h with or without nutrients; control groups (in normoxia and nutrients supplied) were kept in CO2 incubator. Invasive ductal carcinoma (IDC) biopsies were divided into two groups: one positive and one negative for hypoxia marker Carbonic Anhydrase (CA IX); and Ductal Carcinoma in situ (DCIS) samples were divided in comedonecrosis/hypoxic or non=comedonecrosis/control groups, and then they were compared to clinical, histopathological and glycobiology aspects. Confocal microscopy, real=time PCR and western blotting showed that Galectin=3 expression was predominantly nuclear and increased progressively when subjected to hypoxia for 24, 48, 72h and nutrient starvation. CDI samples positive for hypoxia marker CA IX presented an intense nuclear staining in comparison to control group besides more aggressive tumour features as node positivines and absence of ER staining. Gal=1 was not expressed by neoplastic cells in cell model and biopsies, where it was possible to detect positivity in tumour=associated stroma. The evaluation of Gal=3 role in cell death protection using flow cytometry showed that there was no correlation between inhibition of Gal=3 carbohydrate recognition domain and the increase in cell death rate. However, it was observed that monoclonal antibody M338, specific to Gal=3 N=terminal, positivity increased with the increasing of dead cells after 48h and 72h under hypoxia and starvation. Lectin histochemistry for Gal=3 ligands or Gal=3=ligant complex preventing carbohydrates were investigated using Con A, WGA, PNA and UEA=I for DCIS and L=PHA, SNA and VVA for CDI. Results indicated that in CDIS the lectins used recognized more intensely the comedogenic/hypoxic group while in CDI samples were observed an increase in sialylation as well as in T47D cells indicating that ST6GALNac is not the only responsible for this event. Our results indicate that aberrant glycosylation occurs in hypoxic environments associated with a high aggressive tumour phenotype providing information of diagnostic and prognostic value. Results also suggest that Gal=3 participates in the protection of cell death by N=terminal and that sialylation in hypoxic environment is not mainly caused by N=glycosylation.

Orientador: Marcos Hikari Toyama / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T11:46:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_SimoneCristinaBuzzo_M.pdf: 2132823 bytes, checksum: b98ccca4e06a6ca0155f84135393b9b5 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Lectinas são proteínas que se ligam de forma específica e reversível a carboidratos. Estão distribuídas pelos mais diversos organismos e apresentam atividades de interesse em pesquisas biológicas e médicas. Neste trabalho, duas isoformas de lectina da alga marinha vermelha Bryothamnion triquetrum foram purificadas por cromatografia de troca iônica seguida por uma de fase reversa. As frações foram nomeadas de BTLD1 e BTLD2 e ambas apresentaram massa molecular aparente em SDSPAGE de aproximadamente 9,0 kDa. A análise dos aminoácidos de ambas as lectinas revelaram moléculas de caráter básico e as regiões Nterminal das lectinas foram seqüenciadas e comparadas entre si e com lectinas de outras algas, apresentando grande similaridade com hypninA1, hypninA2 e BTL. Além disso, o dicroísmo circular revelou que a estrutura secundária das proteínas é predominantemente de arranjo aleatório. A lectina BTLD2, a isoforma mais abundante do extrato da alga, apresentou ação antibacteriana contra a bactéria grampositiva Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm), mas não foi eficiente contra a bactéria gramnegativa Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae (Xap). Também foram utilizados dois modelos de fosfolipases A2, uma isolada do veneno total de Crotalus durissus cascavella que é cataliticamente ativa do tipo Asp 49 (D49), e uma outra PLA2 cataliticamente não ativa do tipo Lys49 (K49), isolada do veneno de Bothrops jararacussu, para ensaios biológicos. A atividade farmacológica e biológica de ambas as PLA2s foi significativamente afetada pela coincubação das mesmas com BTLD2. A formação de heterodímeros de BTLD2 com a PLA2 de Crotalus durissus cascavella ou com a PLA2 de Bothrops jararacussu sugere a formação de um complexo estável em solução com uma massa molecular de aproximadamente 23,0 kDa. A BTLD2 também foi capaz de aumentar significativamente a atividade enzimática da PLA2 de C. d. ascavella em comparação com a PLA2 cataliticamente ativa isolada. As PLA2s de C. d. cascavella e B. jararacussu mostraram forte atividade antibacteriana contra bactérias Cmm e tiveram pouco efeito contra a bactéria Xap. Entretanto, o complexo BTLD2: PLA2 D49 ou K49 mostram um aumento da atividade antibacteriana, principalmente contra a bactéria Xap. As PLA2s induziram atividade edematogênica em pata de ratos e também foram capazes de induzir uma forte agregação plaquetária usando o sistema de plaquetas lavadas. Em ambos os sistemas, o complexo BTLD2: PLA2 mostrou uma atividade menor do que os respectivos controles. Concluindo, os resultados apresentados mostram que esta nova lectina isolada de alga vermelha possui uma evidente capacidade de interação com moléculas de PLA2, tanto cataliticamente ativas quanto inativas, com a formação de heterodímeros. Portanto, esta interação é capaz de modificar significativamente a estrutura terciária da PLA2, uma vez que o complexo mostrou atividade enzimática aumentada além de possivelmente alterar a estrutura de outras regiões moleculares da enzima. É importante verificar que a atividade farmacológica das PLA2s não tem uma correlação direta com a atividade catalítica das mesmas, envolvendo outras regiões que permitem a sua interação com receptores cuja região está distante do sítio catalítico da PLA2 / Abstract: Lectins are proteins that bind specifically and reversibly to carbohydrates. They are widely distributed among living organisms and show many activities of biological and medical interest. In this work, two isoforms of lectins isolated from the red marine alga Bryothamnion triquetrum were purified by ion exchange followed by reverse phase chromatographies. The fractions named BTLD1 and BTLD2 showed apparent molecular mass of approximately 9.0 kDa in SDSPAGE. Both lectins probably have a basic character, as indicated the amino acid analyses using the Compute pI/Mw tool at the ExPASy server. The Nterminal sequences were compared between both lectins and also to other lectins, showing similarity with hypninA1, hypninA2 and BTL. The circular dichroism indicated that the secondary structure of the proteins are predominantly random coiled. Additionaly, BTLD2 (the more abundant lectin isoform in the alga extract) showed antibacterial activity against the grampositive bacteria Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm) but was not effective against the gramnegative bacteria Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae (Xap). A possible modulation of phospholipase activity by BTLD2 was also studied using two phospholipases A2, one isolated from Crotalus durissus cascavella venom that is Asp49 (D49) catalytically active, and other PLA2 Lys49 (K49) catalytically non active from Bothrops jararacussu venom. The pharmacological and biological activities of PLA2s were significantly change by incubation with BTLD2. The heterodimer formation of BTLD2 with Crotalus durissus cascavella or Bothrops jararacussu PLA2s appears to be a stable complex in solution with a molecular mass of approximately 23 kDa. BTLD2 significantly increased the enzymatic activity of the PLA2 from C.d. cascavella compared to the PLA2 alone. Both PLA2s (catalytically active and nonactive) showed strong antibacterial activity against Cmm with little effect against Xap. However, the BTLD2: PLA2 D49 or K49 complexes showed increase in antibacterial activity, particularly against Xap. Moreover, both PLA2s induced edematogenic activity in rat paw and strong platelet aggregation in washed platelets system. Interestingly, addition of BTLD2 with consequent formation of the BTLD2: PLA2 complex decreased both PLA2induced edema and platelet aggregation. Taken toghether, these results show that this new lectin isolated from a red alga and named BTLD2 has the capacity to interact with catalytic or noncatalytic PLA2, forming heterodimers. Therefore, this interaction possibly modify the PLA2 tertiary structure; as the complex BTLD2: PLA2 increase the enzymatic activity of PLA2 (i.e., the phospholipase activity) but at the same time decrease pharmacological and biological PLA2 activities not related to catalysis (i.e., platelet aggregation and edema). This suggests that the PLA2 structure is possibly modified in other sites of the enzyme rather than in the catalytic site. It can be concluded that the PLA2s has several binding sites for different molecules comprising the catalytic site responsible for the phospholipase activity and at least one more pharmacological site responsible for the effects observed after interaction with BTLD2. Therefore, the pharmacological activity of PLA2s has no direct correlation with the catalytic activity, involving other binding sites that allow receptor interaction whose position might be far from the catalytic site of PLA2 / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

FundaÃÃo de Amparo à Pesquisa do Estado do Cearà / CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / IntroduÃÃo: A transformaÃÃo neoplÃsica està associada a alteraÃÃes na composiÃÃo dos carboidratos celulares, que determinam caracterÃsticas especiais à cÃlula, tais como comportamento, crescimento, diferenciaÃÃo e adesividade. Lectinas sÃo proteÃnas que apresentam afinidade por carboidratos especÃficos e por isso tÃm sido usadas em muitas Ãreas de investigaÃÃo diagnÃstica e prognostica do cÃncer e das metÃstases. O Linfoma de Hodgkin (LH) à uma neoplasia heterogÃnea em relaÃÃo a aspectos clÃnicos, biolÃgicos e de resposta ao tratamento. Existe atualmente uma intensa procura de novos marcadores que possam ter valor prÃtico na previsÃo de comportamento e prognÃstico do LH. Este estudo investiga em casos de LH forma clÃssica (LHc) a expressÃo de glicoconjugados especÃficos para Artocarpus incisa L (frutalina), uma lectina vegetal aD-Galactose ligante, nas cÃlulas de Reed-Sternberg (RS) e suas variantes. Material e MÃtodos: O estudo foi feito em 54 blocos de parafina de linfonodos com diagnÃstico morfolÃgico e imunohistoquÃmico de LHc, 31 do tipo Esclerose Nodular (LHEN), 18 do tipo Celularidade Mista (LHCM), 3 do tipo Interfolicular (LHIN) e 2 do tipo Rico em LinfÃcitos (LHRL). Foram realizados cortes histolÃgicos na espessura de 3 micrÃmetros (mm), fixados em lÃminas silanizadas e processados pela tÃcnica da estrepto-avidinaâbiotinaâperoxidase (estrepto ABC) utilizando a frutalina biotilinada (Fb) como sonda. Como controles positivos, casos de carcinoma papilÃfero de tireÃide e, negativos, os cortes do estudo com a exclusÃo da Fb. Dados clÃnicos foram obtidos por revisÃo de prontuÃrios. Resultados: Foram detectados trÃs padrÃes de positividade: citoplasmÃtica (Fbc), membranar (Fbm) e golgiana (Fbg) (coloraÃÃo puntiforme paranuclear), que tambÃm foram classificadas segundo a intensidade: fraca (+) e forte (++/+++). A positividade global para Fb nas cÃlulas RS e suas variantes foi de 85,2% (46/54), freqÃÃncia igual a da positividade global da amostra para o CD15. O padrÃo de marcaÃÃo Fbg foi o mais freqÃente aparecendo em 91,3% (42/46) dos casos positivos (p=0,008). NÃo foi observada associaÃÃo estatisticamente significante entre a marcaÃÃo pela frutalina e os dados clÃnicos e de estadiamento; resposta inicial ao tratamento; subtipo histolÃgico e fenÃtipo do LHc. ConclusÃo: A Fb pode ser utilizada como marcador para cÃlulas RS e variantes. O seu uso, associado ao estudo morfolÃgico, pode ser Ãtil para o diagnÃstico de LHc. Com este nÃmero de casos ainda nÃo foram observadas correlaÃÃes do padrÃo de marcaÃÃo com apresentaÃÃo clÃnica ou fatores oncobiolÃgicos tidos como indicadores de prognÃstico do LHc. Palavras-chave: DoenÃa de Hodgkin, Frutalina, Lectina, HistoquÃmica. / Introduction: Neoplasic transformation is associated with alterations in the composition of cellular carbohydrates, which determine special cellular characteristics, such as behavior, growth, differentiation and adhesivity. Lectins are proteins which have affinity with specific carbohydrates, so they serve as tools in several fields of diagnostic and prognostic investigations on cancer and on metastases. Hodgkinâs Lymphoma (HL) is an heterogenous neoplasia in clinical, biological, and responsive aspects concerning treatment. There is currently an intense search for new markers which can have practical value in predicting HL behavior and prognosis. This study investigates, in cases of HL classical form (CHL) the expression of specific glyconjugates for Artocarpus incisa L (frutalin), a vegetable aD-galactose-binding lectin, in Reed-Sternberg cells (RS) and their variations. Materials and Methods: The study assessed 54 paraffin blocks containing lymphonodes with morphological and immunohistochemical diagnosis for CHL; 31 of the Nodular Esclerosis type (HLNE); 18 of the Mixed Cellularity type (HLMC); 3 of the Inter-folicular type (HLIN); and 2 of the Lymphocyte-rich type (HLLR). Then 3-mm histological cuts were made and fixed to sylated slides and processed through the strep-avidin-biotin-peroxidase technique (strep ABC), using the biotilinated frutalin (Fb) as probe. Cases of thyroidâs papillary carcinoma were considered positive controls; studyâs cutoffs excluding Bf were considered negative ones. Clinical data were obtained through records review. Results: Three positivity patterns have been detected: cytoplasmic (Fbc), membranous (Fbm) and golgian (Fbg) (paranuclear punctiform coloration), which were also classified according to intensity: weak (+) and strong (++/+++). Global positivity for Fb in RS cells was 85.2% (46/54), same frequency as global positivity of CD15 sample. The Fbg marking pattern was the most frequent one, present in 91.3% (42/46) of positive cases (p=0.008). No statistically significant association was observed between frutalin markers, and clinical and stadiament data; initial response to treatment; CHL histological and phenotype subtype. Conclusion: Fb can be used as marker for RS cells and their variations. This use, associated with the morphological study, can be an useful tool for CHL diagnosis. With this number of cases, no correlation between marking pattern and clinical presentation or oncobiological factors that could be considered a prognosis indicator for CHL has been observed so far.