FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Lectinas sÃo proteÃnas que pertencem a um grupo heterogÃneo de molÃculas com capacidade de ligaÃÃo especÃfica e reversÃvel a carboidratos. Desde sua descoberta, as lectinas se tornaram importantes ferramentas para a investigaÃÃo de fenÃmenos como a adesÃo, a migraÃÃo e a proliferaÃÃo celular, em condiÃÃes normais e patolÃgicas. Durante o processo de diferenciaÃÃo, cÃlulas tumorais apresentam vÃrios graus de modificaÃÃo na expressÃo de glicoproteÃnas de membrana. Neste aspecto, a investigaÃÃo da estrutura da membrana tumoral pode ser compreendida como um mÃtodo sensÃvel e especÃfico de diagnÃstico. Portanto, o reconhecimento de marcadores capazes de identificar e quantificar estas caracterÃsticas, pode ser usado como ferramenta de diagnÃstico. Neste trabalho propomos um modelo experimental para detectar marcadores de membrana de tumores primÃrios do Sistema Nervoso Central usando lectinas vegetais (Con A e Con Br) acopladas à cromÃforos. Amostras de tumores foram obtidas de pacientes que tinham diagnÃstico clÃnico e radiolÃgico de tumores do Sistema Nervoso Central, apÃs cirurgias realizadas no ServiÃo de Neurologia da Santa Casa de MisericÃrdia de Sobral. As amostras foram processadas e investigadas com tÃcnicas imunohistoquÃmicas, usando lectinas vegetais acopladas à fluoresceÃna, e microscopia de fluorescÃncia. Os resultados mostraram que meningiomas e gliomas apresentaram um padrÃo diferente de interaÃÃo com Con Br-FITC e Con A-FITC quando comparados ao controle (BSA/FITC). Estes dados sugerem que as lectinas vegetais estudadas podem ser ferramentas Ãteis na identificaÃÃo de marcadores de membrana em tumores primÃrios do Sistema Nervoso Central. / Lectins are proteins that belong to a heterogeneous group of molecules capable of binding specifically and reversibly to carbohydrates. Since its discovery, lectins have become important tools for investigating phenomena such as adhesion, migration and cell proliferation in normal and pathological conditions. In the process of differentiation, tumor cells display different degrees of modification in the expression of membrane glycoproteins. In this respect, the investigation of membrane structure tumor can be understood as a sensitive and specific method of diagnosis. Therefore, the recognition of markers capable of identifying and quantifying these characteristics can be used as diagnostic tool. In this paper we propose an experimental model to detect markers of the membrane of primary tumors of the central nervous system using plant lectins (Con A and Con Br) attached to the chromophores. Tumor samples were obtained from patients who had clinical and radiological diagnosis of tumors of the central nervous system after surgeries performed at the Department of Neurology, Santa Casa de Misericordia de Sobral. The samples were processed and investigated with immunohistochemical techniques, using plant lectins coupled to fluorescein, and fluorescence microscopy. The results showed that meningiomas and gliomas showed a different pattern for interaction with Con Br-FITC and Con A-FITC compared to control (BSA / FITC). These data suggest that the studied plant lectins can be useful tools in identifying membrane markers in primary tumors of the central nervous system.

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / Dental Caries is an infectious disease naturally multi-factorial that begins in the childhood, able to spread its intensity and prevalence according to the mouth ambient conditions of each host. The risk of the patients to develop, in some time of their lives, carious lesions can be measured through a complex analysis using health determinant factors and other specific factors of the health-disease process. Since the dental caries forward diagnostic as well as the review of the auxiliary determinant factors of the dental caries danger evaluation, the treatment becomes simpler, less invasive and costing lower. It has been quite broad-casted lately the use of lectins to diagnose and to prevent some diseases. When dealing with dental caries disease, through many years this strategy has been explored still inceptively. Looking through this perspective, the goal of this trial was to investigate the biotechnological potential of the red marine alga Hypnea musciformis (HML) applied to Dentistry. It is about an explanatory-experimental study of quantitative approach through the health questionnaire and data statistics analysis. The research makes reference to some comparative analysis of salivary tests and the cariogenic activity in twelve year-old students and it searches to evaluate the biotechnological potentialities of the lectin from the red marine alga Hypnea musciformis (HML) in the diagnose and prevention of the dental caries. The concentration area of this trial was the macromolecules/ lectin biotechnological application. In the present trial were compared obtained results through the application of the conventional clinical exams to dental caries and salivary tests of dental caries activity pointed by the CARIOGRAM program in association with lab analysis using specific lectins. From this trial, it has been concluded that, about lectins as a biotechnological potential to prevention and diagnose of the dental caries, it has been noticed that there is recognition of resident glycoconjugate on pacifier saliva of high and low risk observed in immunofluorescence pattern. The results showed that the tested lectin has the capacity to intervene on the bacterial growth in a negative way, it is being distinguished statistically (p<0,01) in relation to control group of saline and BSA. However, inhibition studies of the microbial biofilms using the HML are being programmed to evaluate the using possibility of these protein as biotech input to be used for dental caries prevention. It could be said also that the obtained results by the use of HML in the antimicrobial activity were promising, showing that this lectin has presented antimicrobial activity even on very small amounts. As to the use of these protein in the biofilm formation and developing there was no characteristic pattern. / A cÃrie à uma doenÃa infecciosa de natureza multifatorial que se inicia na infÃncia, podendo aumentar de intensidade e prevalÃncia de acordo com as condiÃÃes do ambiente bucal de cada hospedeiro. O risco do paciente em desenvolver, em algum perÃodo de seu ciclo de vida, lesÃes cariosas pode ser medido atravÃs de uma anÃlise complexa que utiliza os fatores determinantes da saÃde e outros fatores especÃficos do processo saÃde-doenÃa. A partir do diagnÃstico precoce da doenÃa cÃrie, assim como anÃlise dos fatores determinantes auxiliares da avaliaÃÃo do risco de cÃrie, o tratamento torna-se mais simples, menos invasivo e de menor custo. Tem sido bastante difundida ultimamente a utilizaÃÃo de lectinas para diagnÃstico e prevenÃÃo de algumas doenÃas. Em se tratando da doenÃa cÃrie, ao longo de muitos anos, essa estratÃgia tem sido explorada ainda de forma incipiente. Nesta perspectiva, o objetivo deste trabalho foi investigar as potencialidades biotecnolÃgicas da lectina de alga marinha da espÃcie de Hypnea musciformis (HML) aplicadas à odontologia. Trata-se de um estudo explicativo-experimental de abordagem quantitativa atravÃs de questionÃrio de saÃde e anÃlises estatÃsticas de dados. A pesquisa faz referÃncia à uma anÃlise comparativa de testes salivares e atividade cariogÃnica em escolares de 12 anos de idade e a busca avaliar as potencialidades biotecnolÃgicas da lectina de alga marinha da espÃcie de Hypnea musciformis (HML) no diagnÃstico e prevenÃÃo de cÃrie dentÃria. A Ãrea de concentraÃÃo deste estudo MacromolÃtulas / AplicaÃÃo BiotecnolÃgica de Lectinas. No presente estudo, foram comparados os resultados obtidos atravÃs da aplicaÃÃo de exame clÃnico convencional para cÃrie e testes salivares de atividade cariogÃnica apontados pelo programa CARIOGRAM em associaÃÃo com anÃlises laboratoriais com a utilizaÃÃo de lectinas especÃficas. A partir deste estudo, concluiu-se que, em se tratando do uso de lectinas como potencial biotecnolÃgico para a prevenÃÃo e diagnÃstico de cÃrie dentÃria, percebeu-se que hà reconhecimento de glicoconjugados presentes na saliva de pacientes de alto e baixo risco observados em padrÃo de fluorescÃncia. Os resultados demonstram que a lectina testada tem a capacidade de interferir no crescimento bacteriano de forma negativa, sendo estatisticamente significante (p<0,01) em relaÃÃo aos grupos controle de salina e BSA. Entretanto estudos de inibiÃÃo da formaÃÃo de biofilmes microbianos utilizando a HML estÃo sendo programados, para assim avaliar a possibilidade de utilizaÃÃo dessas proteÃnas como insumos biotecnolÃgicos a ser utilizados para prevenÃÃo da cÃrie dentÃria. Pode-se ainda afirmar que os resultados obtidos pelo uso de HML na atividade antibacteriana foram promissores, mostrando que esta lectina apresentou atividade antibacteriana mesmo em quantidades muito pequenas. Quanto ao uso destas proteÃnas na formaÃÃo e desenvolvimento de biofilmes, nÃo houve padrÃo caracterÃstico.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Os biofilmes sÃo uma forma mais resistente de vida microbiana comparada à forma planctÃnica, em vida livre. Essa resistÃncia està diretamente relacionada Ãs caracterÃsticas naturais de sobrevivÃncia das cÃlulas microbianas vivendo nesse tipo de comunidade. A doenÃa cÃrie capaz de acometer os tecidos dentais està diretamente relacionada com a formaÃÃo de comunidades microbianas e ainda apresenta grande impacto social e econÃmico sobre a sociedade atual. O presente trabalho teve como objetivo investigar a potencialidade de compostos vegetais como insumos biotecnolÃgicos a serem aplicados na prevenÃÃo e tratamento da cÃrie dental. Para tanto, foram realizadas metodologias de verificaÃÃo da atividade antimicrobiana e antibiofilme de lectinas vegetais do gÃnero Canavalia e Ãleos essenciais de Croton zehntneri assim como de seus componentes majoritÃrios frente a bactÃrias envolvidas na cÃrie. AlÃm disso, foi verificada a possÃvel aÃÃo simultÃnea de lectinas e diterpeno casbano (DC) sobre a expressÃo de genes de virulÃncia relacionados à formaÃÃo de biofilmes de Streptococcus mutans. Dentro dos limites das metodologias realizadas no presente trabalho pode-se concluir que: lectinas vegetais do gÃnero Canavalia podem interferir no fator micro-organismos relacionado à cÃrie dental; Ãleos essenciais e seus componentes majoritÃrios apresentaram atividade antimicrobiana significativa sobre S. mutans e ainda que as soluÃÃes da lectina ConM e ConM/DC atuando simultaneamente foram capazes de alterar a expressÃo de genes relacionados a formaÃÃo de biofilmes por S. mutans, podendo vir a ser usado em estudos prÃ-clÃnicos no intuito de instituir novas alternativas de prevenÃÃo e terapÃutica para doenÃa cÃrie. / Biofilms are more resistant form of microbial life compared to planktonic form, in the wild. This resistance is related to the natural characteristics of survival of microbial cells living in this type of community. The caries that can affect the dental tissues is directly related to the formation of microbial communities and still has great social and economic impact on society. This study aimed to investigate the potential of plant compounds as biotechnological inputs to be applied in prevention and treatment of dental caries. To this end, methods were performed to verify the antimicrobial and antibiofilme activity of plant lectins of the genus Canavalia and essential oils of Croton zehntneri as well as its major components against bacteria involved in caries. Furthermore, was verified the possible simultaneous action of lectins and casban diterpene (DC) on the expression of virulence genes related to biofilm formation of Streptococcus mutans. Within the methodology undertaken in this work can be concluded that: lectins of the genus Canavalia can interfere with the factor micro-organisms related to dental caries; essential oils and their major components showed significant antimicrobial activity against S. mutans and that solutions of ConM lectin and ConM/DC acting simultaneously were able to alter the expression of genes related to biofilm formation by S. mutans, and may be used in preclinical studies in order to develop new alternatives for prevention and therapy for caries.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Lectinas podem ser definidas como proteÃnas de origem nÃo imune que possuem pelo menos um domÃnio nÃo catalÃtico que se liga reversivelmente de maneira especÃfica a mono ou oligossacarÃdeos. Dentre as lectinas de origem vegetal, as lectinas de leguminosas sÃo as mais estudas, em especial as lectinas pertencentes subtribo Diocleinae. As lectinas da subtribo Diocleinae apresentam um alto grau de similaridade em sua seqÃÃncia primÃria e estrutura tridimensional, mas apresentam diferentes intensidades em suas atividades biolÃgicas em que sÃo aplicadas, como a induÃÃo da produÃÃo de Ãxido nÃtrico. A estrutura da recÃm cristalizada lectina de Canavalia brasiliensis (ConBr) objetiva esclarecer como essas variaÃÃes ocorrem baseado na geometria dos resÃduos que compÃe o domÃnio de reconhecimento à carboidrato (DRC). A lectina de Canavalia brasiliensis foi purificada e cristalizada pelo mÃtodo de difusÃo de vapor a 293 K. Cristais adequados foram obtidos na condiÃÃo contendo 200 mM de cloreto de sÃdio, 100 mM de hepes pH 8.5 e 1.8 M e sulfato de amÃnio. O cristais apresentam um grupo espacial ortorrÃmbico I222, a cela unitÃria tem dimensÃes de a=68.3 Ã, b=73.0 Ã, c=99.5 à e Ãngulos de &#945; = &#946; = &#947; = 90Â, sendo observado um monÃmero na unidade assimÃtrica e um conteÃdo de 49.5 % de solvente. O refinamento satisfatÃrio apresentou um âRfactorâ e âRfreeâ de respectivamente 20.4% e 25.3%. Foram determinados parÃmetros no potencial de atividade biolÃgica registrada na literatura, onde a lectina de Canavalia maritima (ConM) tem alto potencial de induÃÃo a produÃÃo de Ãxido nÃtrico comparado com a lectina de Canavalia ensiformis (ConA) que tem um baixo potencial de induÃÃo. DiferenÃas significativas foram encontradas entre coordenadas dos resÃduos que compÃe o DRC de lectinas da subtribo Diocleinae, e comparando esses dados com os potenciais de atividade biolÃgica foi estipulado um padrÃo distinto de distancias para lectinas com alto e baixo potencial de induÃÃo. A lectina de Canavalia brasiliensis (ConBr) apresenta um padrÃo de distancias de uma Ãtima indutora de Ãxido nÃtrico como ConM, porÃm apresenta uma atividade inferior que ConA. As distancias da DRC explicam a diferenÃa na atividade, mas a ConBr se mostra um caso excepcional, onde uma avaliaÃÃo do volume do sÃtio mostra um sÃtio extremamente reduzido, o que explica sua discrepÃncia na atividade biolÃgica. / Lectins may be defined as proteins of nonimmune origin that have at least one non-catalytic domain that reversibly binds specifically to mono or oligosaccharides. Among plant lectins, legume lectins are the most studied, in particular those lectins belonging to subtribe Diocleinae. The lectins from subtribe Diocleinae show a high degree of similarity in their primary sequence and three-dimensional structure but have different intensities in their biological activities in which they are applied, such as induction of nitric oxide production. The structure of the newly crystallized lectin from Canavalia brasiliensis (ConBr) aims to clarify how these variations are based on the geometry of the residues that comprise the carbohydrate recognition domain (CRD). The lectin from Canavalia brasiliensis was purified and crystallized by vapor diffusion method at 293 K. Suitable crystals were obtained under the condition containing 200 mM sodium chloride, 100 mM HEPES pH 8.5 and 1.8 M ammonium sulfate. The crystals have a space group orthorhombic I222, the unit cell has dimensions a = 68.3 Ã, b = 73.0 Ã, c = 99.5 à and angles &#945; = &#946; = &#947; = 90  been observed a monomer in the asymmetric unit with a content of 49.5% solvent. The refinement showed a satisfactory "Rfactor" and "Rfree" of respectively 20.4% and 25.3%. Parameters were determined in the potential of biological activity reported in literature, where the lectin from Canavalia maritima (ConM) has high potential for inducing nitric oxide production compared with the lectin from Canavalia ensiformis (ConA), which has a low potential for induction. Significant differences were found between coordinates of the residues that comprise the CRD of lectins from the subtribe Diocleinae, and comparing these data with potential biological activity was provided a distinct pattern of distances to lectins with high and low potential for induction. The lectin from Canavalia brasiliensis (ConBr) shows a pattern of distances for a great inducer of nitric oxide as ConM, but shows a lower activity than ConA. The distances of CRD explain the difference in activity, but ConBr shown an exceptional case where an assessment of the volume of the site shows a very small site, which explains their discrepancy in biological activity.

A heterogeneidade intratumoral é um fenômeno extremamente importante para entender a progressão tumoral e a resposta à intervenção terapêutica. A galectina-3 pertence à família das lectinas, possuem a função de reconhecimento e ligação à ?-galactosídeos ramificados de glicolipídeos e glicoproteínas, e está envolvida em processos fisiológicos e patológicos como o câncer. Nesse trabalho, a heterogeneidade intratumoral em relação à expressão de galectina-3 foi observada em amostras de diferentes lesões melanocíticas de pacientes. Além disso, o inóculo de células de melanoma murino negativas para galectina-3 em animais gal3-/- gerou tumores constituídos por uma fração de células tumorais que passaram a expressar de novo galectina-3, sugerindo que pressões do microambiente tumoral modulam a expressão dessa lectina em melanomas. A acidose extracelular atuou como regulador negativo de galectina-3 in vitro, diminuindo a expressão dessa lectina tanto em células de melanoma murino e humano quanto em melanócito murino. Entretanto, a hipóxia, seja pela exposição aguda ou intermitente, não alterou a expressão in vitro de galectina-3 em células de melanoma humano. Por fim, tumores originados pelo inóculo de células tumorais positivas e negativas para galectina-3 (mimetizando tumores heterogêneos) obtiveram a maior taxa de crescimento tumoral comparados aos tumores constituídos por uma única população de células, seja positiva ou negativa para galectina-3. Portanto, foram apresentadas evidências de que a heterogeneidade intratumoral em relação à galectina-3 parece estar envolvida com o sucesso evolutivo do melanoma e que a acidose é indicada como uma das pressões microambientais que contribuem para o estabelecimento e manutenção da fração de células tumorais negativas para galectina-3 dentro da massa tumoral / The intratumoral heterogeneity observed in human tumors is extremely important to understand tumor progression and its therapeutic response. Galectin-3 belongs to animal lectin family and it is a ?-galactosidase binding protein which is involved in physiological and pathological processes, including cancer. In this work, an intratumor heterogeneous galectin-3 expression was observed in tissue sessions containing different human melanocytic lesions. Moreover, negative galectin-3 murine cells injected into gal3-/- mice were able to generate tumors composed of a positive galectin-3 cell fraction, suggesting that selective forces in tumor microenvironment modulate galectin-3 expression in melanoma. Extracellular acidosis acts as a negative regulator to galectin-3 in vitro, decreasing its expression in murine and human melanoma cells and even in murine melanocytes. However, intermittent or acute hypoxia exposure did not alter galectin-3 expression in human melanoma cells in vitro. In addition, tumors originated from a mixture of positive and negative galectin-3 cells (mimicking heterogeneous tumors) showed higher growth rate compared to those derived from only galectin-3 positive or negative cells. Therefore, we showed evidences that galectin-3 intratumoral heterogeneity seems to be involved with the evolutionary success of melanoma and that acidosis may be the microenvironmental pressure responsible for the establishment and maintenance of galectin-3 negative cell fraction into the tumor bulk

Orientadores: Maria Ligia Rodrigues Macedo, Tomomasa Yano / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T00:07:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ventura_ClaudioAngelo_D.pdf: 5407567 bytes, checksum: 8408eb98403ba9f693c16020c7c85169 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Lectinas constituem uma classe de proteínas ou glicoproteínas que são capazes de ligar-se, reversivelmente e seletivamente, a carboidratos sem causar transformação química. Estudos têm mostrado que a ligação de lectinas a carboidratos de superficie celular de células normais e malignas leva a vários efeitos biológicos tais como proliferação celular e apoptose. Neste trabalho, nós investigamos os efeitos citotóxicos induzidos por TEL (uma lectina, isolada de sementes de Talisia esculenta, a qual preferencialmente liga-se a resíduos de manose) sobre linhagens de células tumorais e não-tumorais. Células Vero (rim de macaco verde afiicano) e Rela (carcinoma cervical humano) tratadas com TEL exibiram perda da integridade da membrana plasmática, retração celular, condensação da cromatina, fragmentação nuclear e formação de corpos apoptóticos. Além disso, células Vero e Rela tratadas com TEL também revelaram uma drástica desorganização do citoesqueleto de actina. A Fragmentação intemuc1eossomal do DNA foi detectada pelo método de TUNEL e eletroforese em gel de agarose. Os efeitos citotóxicos induzidos por TEL foram progressivos e mostraram que as alterações morfológicas e os danos ao DNA ocorreram após a perda da integridade da membrana. Adicionalmente, TEL inibiu significantemente a proliferação das células Rela de maneira dependente da concentração. Nós também mostramos através de microscopia de tluorescência que TEL é intemalizada nas células Vero dentro de pequenas vesículas que depois se acumulam da região perinuclear; nas células Rela, a intemalização não foi observada. Foi estabelecido que a atividade das caspases-3 e -9 aumentaram nas células Vero e Rela de uma maneira dependente do tempo. Em contraste com as células Vero, a atividade da caspase-3 precedeu a ativação da caspase9 nas células Rela. Os efeitos citotóxicos e a intemalização de TEL foram bloqueados pela mano se, sugerindo que a ligação de TEL ao carboidrato específico na superficie celular é um pré-requisito para esses processos. Os resultados mostraram que a morte celular induzida por TEL nas células Vero e Rela seguiu uma série de eventos que culminou em um modo apoptótico de morte celular. Finalmente, uma vez que as células Rela foram altamente sensíveis a citotoxicidade induzida pela lectina, TEL merece futuras investigações porque suas propriedades podem ser uma ferramenta útil na terapia contra câncer cervical humano / Abstract: Lectins constitute a class of proteins or glycoproteins which are capable of binding carbohydrates selectively and reversibly without causing their chemical transformation. Studies have shown that lectin binding to cell surface carbohydrates of normal and malignants cells triggers various biological effects such as cellular proliferation and apoptosis. In this work, we investigate the cytotoxic effects induced by TEL (a lectin, isolated from Talisia esculenta seeds, which binds preferentially to mannose residues), on tumoral and non-tumoral cell lines. TEL- treated Vero (African green monkey kidney) and Hela (human cervical carcinoma) cells exhibited loss of plasma membrane integrity, cellular retraction, chromatin condensation, nuclear fragmentation and formation of apoptotic bodies. Furthermore, TEL-treated Vero and Hela cells also revealed a drastic disorganization of the actin cytoeskeleton. Internucleossomal DNA fragmentation was detected by TUNEL method. and agarose gel electrophoresis. TEL-induced cytotoxic effects were progressive and showed that the morphological alterations and DNA damage occurred after the loss of membrane integrity. Additionally, TEL significantly inhibited the proliferation of Hela cells in a concentration- dependent manner. We also show through of fluorescence microspy that TEL is internalized in Vero cells into small visicles that further coalesce in the perinuclear region; in Hela cells, TEL internalization was not observed. It was established that caspase-3 and -9 activity increased in Vero and Hela cells after TEL treatment in a time- dependent manner. In contrast to Vero cells, caspase- 3 activity preceded the activation of caspase-9 in Hela cells. The cytotoxic effects and the internalization of TEL was blocked by manose, suggesting that the binding of TELto specific carbohydrate on the cell-surface is a prerequisite for these processes. The results showed that TEL- induced cell death in Vero and HeLa cells followed by down stream events leading to apoptotic mode of cell death. Finally, since Hela cells were highly sensitive to lectin-induced cytotoxicity, TEL merits further investigation due to its properties can be a useful tool in therapy against human cervical cancer / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Lectins are proteins or glycoproteins that recognize free or conjugated carbohydrates, reversibly binding to them. Lectins participate in several events of the immune system of plants and animals and assisting in the process of cell adhesion and recognition. Schinus terebinthifolius belongs to the family Anacardiaceae, which is resistant to various types of insect injury. This work aimed at the isolation and characterization of a new lectin from the shell of S. terebinthifolius (SteBL). The bark extract (20%, w/v) was prepared in 0.15 M NaCl solution for 16 h at 4°C. The extract was treated with ammonium sulfate in different concentrations (0-20%, 20-40%, 40-60% and 60-80%). The hemagglutinating activity (HA) of the fractions were evaluated with rabbit erythrocyte suspension 2.5% (m/v). Subsequently, the supernatant fraction – FS 40%, which presented the highest specific activity, was subjected to chitin matrix affinity chromatography, where about 125 μg of protein was applied on a chitin column equilibrated with 0.15 M NaCl. showed HA were eluted with 1.0 M acetic acid. The chromatographic profile of the chitin column showed an active protein peak (SHA: 65536) after elution with 1.0 M acetic acid (0.0625 mg protein). Then the partially isolated SteBL was characterized as the effect of temperature (30-100 ° C), pH (3-10), divalent cations (Ca2+, Mn2+ and Zn2+) on. The same preparation was also evaluated on polyacrylamide gel (10% w/v) under denaturing conditions in the presence and absence of 2-Mercaptoethanol. N-acetylglucosamine and lactose carbohydrates showed inhibition, expressing a reduction of about 75% and 99%. , SteBL HA was partially isolated and showed a thermal stability over a wide temperature range with a maximum activity at 50 ° C (SHA: 131.072) and pH 5 (SHA: 131.072) and ionindependent. In order to completely isolate SteBL, a new extract from the bark of the mastic was prepared in 50 mM Tris-HCl buffer pH 8.0 (20%, w/v), where it was filtered on activated charcoal and subjected to chitin matrix affinity chromatography followed by anion exchange chromatography (DEAE-Sepharose), where it was possible to isolate a peptide of about 24 kDa. / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / As lectinas são proteínas ou glicoproteínas que reconhecem carboidratos livres ou conjugados, ligando-se reversivelmente a eles. Lectinas possuem diversas funções e aplicações biotecnológicas tais como atividade antimicrobiana, inseticida, imunomoduladora, cicatrizante, antitumoral, dentre outras. Schinus terebinthifolius (Aroeira-da-praia) pertence à família Anacardiaceae, apresenta resistência contra vários tipos de lesões causadas por insetos. Esse trabalho teve como objetivo o isolamento e a caracterização de uma nova lectina da casca de S. terebinthifolius (SteBL). O extrato da casca (20%, p/v) foi preparado em solução de NaCl 0,15 M por 16 h a 4 ºC. O extrato foi tratado com sulfato de amônio em diferentes concentrações (0-20%, 20-40%, 40-60% e 60-80%). A atividade hemaglutinante (AH) das frações foram avaliadas com suspensão de eritrócitos de coelho 2,5% (m/v). Posteriormente, a fração sobrenadante - FS40%, que apresentou maior atividade específica, foi submetida a cromatografia de afinidade em matriz de quitina, onde foi aplicado cerca de 125 μg de proteína numa coluna de quitina equilibrada com NaCl 0,15 M. As amostras que apresentaram AH foram eluídas com ácido acético 1,0 M. O perfil cromatográfico da coluna de quitina mostrou um pico de proteína ativo (AHE: 65.536) após eluição com ácido acético 1,0 M (0,0625 mg de proteína). Em seguida a SteBL parcialmente isolada foi caracterizada quanto ao efeito da temperatura (30-100°C), pH (3-10), cátions divalentes (Ca2+, Mn2+ e Zn2+) na AH. Também a mesma preparação foi avaliada em gel de poliacrilamida (10% (p/v) em condições desnaturantes na presença e ausência de 2-Mercaptoetanol. Os carboidratos N-acetilglucosamina e lactose apresentaram inibição, expressando uma redução de cerca de 75 % e 99,97% respectivamente da HA da SteBL parcialmente isolada. A SteBL parcialmente purificada apresentou estabilidade térmica em uma ampla faixa de temperatura com uma atividade máxima a 50 ° C (AHE: 131.072) e pH 5 (AHE: 131.072) e íonindependente. Com a finalidade de isolar totalmente a SteBL, um novo extrato da casca da aroeira foi preparado em solução tampão Tris-HCl 50 Mm pH 8,0, onde o mesmo foi filtrado em carvão ativado e submetido a cromatografia por afinidade em matriz de quitina seguida por cromatografia de troca aniônica – DEAE-Sepharose, onde foi possível o isolamento de um peptídeo de cerca de 24 kDa.

Não consta resumo na publicação / Biological and immunological properties of phytohemagglutins from two brazilian varieties of beans (Phaseolus vulgaris) were studied. Through immunoprecipitation in agar gel, immuoenzymatic assays (ELISA) and eletrophoretic behavior after affinity chromatography purification it was shown that the lectins are similar. Both lectins when given to rats are toxic. They reduce growth and intestinal dissacharidase activity. They also able to smooth the \"microvillous\" of the enterocyte and to induce the appearance of autophagosomes in the enterocyte citoplasm. All this modification result in a reduced rate of carbohydrates absorption either in \"vitro\" or \"in vivo\".

A lagarta da espécie Lonomia obliqua é medicamente importante, cujo veneno, presente nas espículas, causa uma síndrome hemorrágica caracterizada por equimoses, alterações da coagulação, dentre outros sintomas. Isto sugere a presença de peptídeos bioativos com potencial farmacêutico, devido à capacidade de modular o comportamento das células endoteliais. O objetivo deste estudo é analisar os potenciais efeitos do veneno de Lonomia obliqua na angiogênese. Uma linhagem celular endotelial (HUVEC) foi exposta a diferentes concentrações do extrato de espículas da Lonomia obliqua (Lonomia obliqua Bristle extract - LOBE) 5 μg/mL, 10 μg/mL, 20 μg/mL e 50 μg/mL. Empregando citometria de fluxo, observou-se que nenhuma das doses afetou o ciclo celular, viabilidade ou apoptose das células endoteliais após 24h de exposição. Os esferóides das células HUVEC foram plaqueados numa matriz 3D de colágeno e observou-se que LOBE (10 μg/mL, 20 μg/mL e 50 μg/mL) induz um aumento na migração celular, consistente com o processo de angiogênese. A análise da dinâmica da VE-caderina indica que a exposição imediata a LOBE (10 μg/mL) induz um desprendimento da junção célula-célula, o que corrobora com a hemorragia observada nas vítimas de envenenamento. Através de espectrometria de massa, observou-se que LOBE possui vários potenciais peptídeos bioativos. Grupos destes peptídeos foram isolados por fracionamento com metanol a partir do veneno bruto. Os peptídeos presentes, em cada uma das 10 frações, foram caracterizados por espectrometria de massa e foram analisados os efeitos de cada fração sobre a angiogênese. Os resultados sugerem que alguns dos efeitos do envenenamento por Lonomia obliqua são devidos à presença de peptídeos bioativos que modulam o comportamento das células endoteliais. / The caterpillar of the species Lonomia obliqua is medically important, whose venom present in the bristles leads to an hemorrhagic syndrome characterized by ecchymosis, coagulation disorders and others symptoms. This suggests the presence of bioactive peptides with pharmaceutical potencial due to the ability to modulate the behavior of endothelial cells. The aim of this study is to analyze the potential effects of Lonomia obliqua venom on angiogenesis. An endothelial cell line (HUVEC) was exposed to different concentrations (5 μg/mL, 10 μg/mL, 20 μg/mL and 50 μg/mL) of Lonomia obliqua bristle extract (LOBE). Using flow cytometry, it was observed that none of the doses affected endothelial cell cycle, cell viability or apoptosis after 24h of exposition. Spheroids of HUVEC cells were plated in a 3D-collagen matrix and it was observed that LOBE (10 μg/mL, 20 μg/mL and 50 μg/mL) induced an increase on cell migration consistent with the angiogenesis process. Analysis of VE-cadherin dynamics indicates that the immediate exposition to LOBE (10 μg/mL) induced a loosening of cell-cell junction, which corroborates with the hemorrhage observed in the victims. By mass spectroscopy, it was observed that LOBE possesses several potentially bioactive peptides. Groups of these peptides were isolated by a methanol-based fractioning of the crude venom. The peptides present in each of the 10 fractions were characterized by mass spectroscopy and it was analyzed the effects of each fraction on angiogenesis. The results suggest that some of the effects of Lonomia obliqua envenomation are due to the presence of bioactive peptides that modulate the behavior of endothelial cells.

Uma nova lectina extraída da semente de Artocarpus integrifólia, denominada KM+ foi recentemente descrita. KM+ e haptotática para neutrófilos, promove a aglutinação de hemácias dos grupos A, B, 0, estimula a proliferação de linfócitos do baço de camundongos e liga-se em &#945 D-manose, &#945 metil manosidio e &#945 D-glicose. Esta lectina é composta por quatro monômeros, com peso molecular de 13.150 daltons cada, unidos por interações não covalentes. KM+ contem 1,8% de carboidratos e apresentou quatro isoformas com pontos isoelétricos entre 4,2 e 5,2. Este trabalho teve como objetivos estudar modificações estruturais de KM+ em função de parâmetros como temperatura, força iônica, pH, agentes desnaturantes, ligação com D-manose, monitoradas por dicroísmo circular (CD) e fluorescência. CD também foi utilizado para estimar o conteúdo de estrutura secundaria de KM+, utilizando-se dois programas descritos na literatura: SSE (Secondary Structure Estimation), que utiliza o método dos mínimos quadrados para a estimativa da estrutura secundaria e obtenção dos espectros básicos, baseados nos dados cristalográficos de proteínas de .estrutura resolvida; CCA (Convex Constraint Analisys) que utiliza o algoritmo simplex e a partir dos espectros de CD das proteínas de referencia calcula os espectros das componentes básicas. Para a estimativa das frações de estrutura secundária o segundo método utiliza o programa Lincomb. Os espectros de CD foram registrados no intervalo de 185 a 260 nm. O conteúdo em estrutura secundária, estimado pelo programa SSE foi: 0% de &#945-hélice, 41% de folha &#946, 27% de volta &#946 e 32,3 de estrutura desordenada; pelo programa CCA foi: 1% de &#945-hélice, 35% de folha &#946 anti-paralela, 21% de volta &#946 e/ou folha &#946 paralela, 15% de contribuições de aromáticos e/ou ligações dissulfeto, 28% de estrutura desordenada. Os desvios médios quadráticos para os programas SSE e CCA foram 12% e 1%, respectivamente. Portanto a lectina KM+ é principalmente constituída por estruturas tipo folha &#946 e tipo desordenada. A curva calculada pelo programa CCA foi mais bem estimada, pois tem o desvio médio quadrático 12 vezes menor que o do programa SSE. Este resultado, provavelmente ocorre devido aos seguintes fatores: (i) no programa CCA, o espectro da proteína a ser analisada e alinhado com os espectros das proteínas de referência, influenciando no calculo dos espectros básicos; (ii) maior número de proteínas com estrutura &#946 no grupo de referência do programa CCA. A estabilidade de KM+ em função da temperatura tem comportamento diferente em tampão sódio fosfato (PBS) daquele observado em água. Em PBS, quando a amostra esta a 70&#176C, a forma do espectro de CD mostrou-se consistente com um espectro de proteína desnaturada. Comumente, um espectro de proteína desnaturada caracteriza-se pela perda da estrutura secundaria predominante e aumento da estrutura desordenada. Em água, também a 70&#176C, na região da estrutura &#946 (216 nm) surge uma nova banda e na região da estrutura desordenada (195 nm) aparece uma banda com valores positivos mimetizando um espectro da estrutura &#945-hélice. Esta diferença de comportamento pode ser devida à força iônica. A desorganização promovida na molécula de KM+ por cloreto de guanidina foi típica de desnaturação. o máximo da emissão de fluorescência, da KM+ em PBS pH 7,2, foi a 328 nm, característico de resíduos de triptofano protegidos do solvente. Este máximo mudou para 340 nm em pH 10,5. Este resultado indica mudanças no ambiente químico do triptofano neste pH. O deslocamento para a região do vermelho indica, que em pH. os resíduos de triptofano estio em maior contato com o solvente. O número de sitios ligantes de D-manose J)a molécula de KM+, foi estimado pela supressão da fluorescência promovida pelo D-manose. Esta estimativa foi baseada na suposição de que todos os sítios ligantes de D-manose estivessem próximos aos resíduos de triptofano. A relação encontrada foi de 2 moles de D-manose/mol de KM+ / Recently a new lectin, KM+, isolated from Artocarpus integrifolia seeds was described. KM+ induces neutrophil migration, agglutination of human red blood cells, proliferation of mouse spleen cells and binding with monosacharides D-mannose, D-glicose and &#945-metil mannoside. This glycoprotein is composed of four monomers, assembled by non covalent bonds, has 500 aminoacids residues/mol, with a Molecular Weight of 52,000 Daltons and 1.8% of carbohydrates [27]. In this work structural changes of KM+ was studied as a function of temperature, pH, chemical denaturing agents as well as the binding with D-mannose. These changes were monitored by circular dichroism (CD) and fluorimetry. Circular Dichroism (CD) spectroscopy was used for the analysis of the secondary structure of KM+ in solution due do its capacity to indicate the presence and to estimate the proportion of &#945-helix, &#946-sheet, &#946-turn and unordered conformations. This measurent can be regarded as a function of the relative orientation of the chromophores responsible for their chiroptical activity. CD spectroscopy is also one of the methods of choice for monitorization of conformational changes in proteins as a function of solvents, pH, temperature, ionic strength and specific or non specific binding. Two programs which are in use for estimation of secondary structure: SSE, using the linear least squares method and CCA, using the simplex method, were evaluated in the present work. SSE uses a set of proteins with known X-ray data as the basis for evaluation while CCA uses only pure proteins experimental CD spectra. Fluorescence spectroscopy is very useful to monitore of protein conformational changes in solution due to the presence of intrinsic fluorophores. Fluorescence Measurements were performed at 25&#176C. Samples were excited at 280 nm and the emission was monitored in the range 290-450 nm. The maximum emission as a function of pH was at pH 7.0. The wavelength for maximum emission changed from 328 nm at pH 7.0 to 340 nm at pH 10.5. CD spectra were recorded over the range of 185 up to 260 nm. The Secondary structure content estimated by SSE program was: 0% &#945-helix, 41% &#946-sheet, 26% &#946-turn and 32% random with RMS of 12% and CCA program was: 1% &#945-helix, 35% antiparallel &#946-sheet, 21% &#946-turn and/or parallel B-sheet, 28% random, 15% aromatics contributions and dissulfide linkages with RMS of 1%. The fractions of secondary structure obtained when using CCA program were more consistent than those of SSE program. The simulation by CCA program was better probably due to its desconvolution of the spectral contribution of the common secondary structures using experimental CD curves of proteins. The stability of KM+, in PBS, as a function of temperature changes above 55&#176C but only at 70&#176C the shape of the CD spectrum is consistent with the loss of the native ordered secondary structure that should accompany protein unfolding. CD spectra of KM+ in water showed conformational changes as a function of temperature was not consistent with denaturated proteins. The unfolding of KM+ by GdnCl and SDS resulted in CD spectroscopic changes: consistent with the increased random structure and disappearance of beta sheet. Using the two denaturing agents together GdnCl and temperature, the denaturation was observed at lower decreased both GdnCl concentration and at lower temperature. The estimation of the number of binding sites for D-mannose was obtained through the fluorescence intensity decrease due to a quenching effect of D-mannose and showed that the stoichiometry of binding was 2 moles of D-mannoseimol of lectin