Made available in DSpace on 2015-04-01T14:16:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1615747 bytes, checksum: 2bbe77aa39b7f33d5f7b0781f235bb2d (MD5) Previous issue date: 2014-08-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / A new lectin was purified and characterized from marine sponge Aplysina fulva (AFL). The crude extract was obtained with Tris HCl 0.1 M pH 7.4 containing NaCl 0.15 M buffer. Haemagglutinating activity detection and soluble protein measurement were performed with the crude extract and after each purification step. Isolation of AFL was performed by affinity chromatography in Sepharose CL 4B column, and the retained peak was applied in a DEAE Sephacel ion exchange chromatography column. Analysis of DEAE Sephacel retained peak on polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) showed the presence of a single band with approximately 27.5 kDa. Under non-denaturating conditions it shows the presence of a single 57 kDa band. The novel lectin showed large amount of hydrophobic amino acids, high temperatures resistance and better hemagglutination activity in the range of neutral to alkaline pHs. AFL was able to inhibit the growth of strains of P. aeruginosa, C. albicans and C. tropicalis. The lectin did not show toxic effects on cells of breast cancer, but had agglutination effect on Leishmania brasiliensis promastigotes by recognizing galactose residues on its surface. / Uma nova lectina foi purificada e caracterizada a partir da esponja marinha Aplysina fulva (AFL). O extrato bruto foi produzido a partir da solubilização de proteínas em solução tampão Tris HCl 0,1 M pH 7,4 NaCl 0,15 M, sendo este utilizado na realização dos ensaios de atividade hemaglutinante e dosagem de proteínas pelo método de Bradford. O primeiro passo de purificação de AFL foi por meio de cromatografia de afinidade em coluna de Sepharose CL 4B. O pico não retido foi eluido com o mesmo tampão de extração e o pico retido foi eluido com tampão Glicina 0,1 M pH 2,6 NaCl 0,15 M. O mesmo foi dialisado, liofilizado e ressuspendido em Tris HCl 0,025 M pH 7,6 e submetido a cromatografia de troca iônica em DEAE Sephacel. A análise do pico retido da DEAE Sephacel por eletroforese nativa em gel de poliacrilamida (PAGE) mostrou a presença de uma única banda com aproximadamente 57 kDa, como também uma única banda com aproximadamente em 27,5 kDa em presença de SDS (PAGE-SDS). A nova lectina apresenta uma grande quantidade de aminoácidos hidrofóbicos, mostrando-se resistente a altas temperaturas e com melhor atividade hemaglutinante na faixa de pH neutro a alcalino. AFL foi capaz de inibir o crescimento de cepas de P. aeruginosa, C. albicans e C. tropicalis. A nova lectina não apresentou efeitos tóxicos para células de câncer de mama, entretanto mostrou-se hábil em aglutinar formas promastigotas de Leishmania brasiliensis através do reconhecimento de galactose em sua superfície.

Made available in DSpace on 2015-04-17T15:03:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 994952 bytes, checksum: f1d57a98a19b3db322c2f3b8a88b8c8c (MD5) Previous issue date: 2010-12-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Non-conventional leafy vegetables can be used as food in adequate quantities as an alternative source of nutrients. However, before its consumption, should take into account their nutritional composition, which depends on its bioavailability and the absence of cytotoxicity and anti-nutritional factors. In this study, leaves of carrot were analyzed to determine the proximate composition, antinutritional factors and haemolytic activity, antibacterial and antifungal. Chemical composition and content of antinutritional factors (lectins, tannins and saponins) were determined in fresh leaves, bleached, boiled and lyophilized. For extraction of proteins, we used six solutions under stirring for 3 hours at 25°C, and the crude extract. Hemagglutination assay was determined by double serial dilution of the extract in test tubes containing saline and erythrocytes at 3% of human blood A and B, and rabbit. We investigated the specificity of the lectin by sugars using inhibition with many simple carbohydrates. Soluble proteins was performed by Bradford method. The inactivation of the lectin was tested with the crude extract with a pH variation (2.08 to 13.08) and temperature (40 to 100º C). Protein extract was precipitated with ammonium sulfate at 80% saturation, obtaining the active fraction (0-80). This was subjected to affinity chromatography (stromapolyacrylamide) and used to check the resistance of the lectin against chelating agents, denaturants, reducing agents, oxidants and proteolytic enzymes (trypsin, papain and bromelain). After treatment of the lectin with these agents, there was testing hemagglutination activity (HA). Tannins were determined using tannic acid as standard and the hemolytic activity of saponin for the search. Tests were carried out for antibacterial, antifungal and haemolytic with the protein fraction. The HA was best seen when using 0.15 M NaCl. Among the erythrocytes tested lectin preferentially agglutinated rabbit treated and not treated with proteolytic enzymes (154.26 HU/mgP), with specificity for the carbohydrate lactose, galactose and arabinose. It was found that the lectin is inactivated at temperatures from 100ºC and at acid pH 2.08. Lectin sample was resistant to proteolytic enzymes, reducing agent, oxidizing and denaturing for 30 minutes. However, the total loss of HA occurred with the administration of chelating agent on the day and overnight after denaturing. Ions in the presence of isolated HA was maintained. Chromatography showed a peak that had HA and protein profile of fractions and the active peaks and no assets were subjected to electrophoresis on polyacrylamide gel in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS), indicating a partial purification. Total tannin contents ranged from 0,16% to 0,60% cooked leaf to fresh leaf. Research saponin was negative in the sample. The protein fraction showed no inhibitory effect on the growth of dermatophyte fungi, however, showed activity against Staphylococcus aureus and Escherichia coli with a minimum inhibitory concentration of 1,9 μg/mL of protein. Samples tested did not cause hemolytic effect against human erythrocytes A and B. We conclude from this study that the carrot leaves have nutritional properties that enable it to use. It also has anti-nutritional factors that are inactivated by heat. / Os vegetais folhosos não convencionais podem ser utilizados na alimentação humana em quantidades adequadas como fonte alternativa de nutrientes. Entretanto, antes de seu consumo, deve-se levar em conta sua composição nutricional, que depende de sua biodisponibilidade e ausência de citotoxicidade e fatores antinutricionais. Neste estudo, folhas de cenoura foram analisadas para se determinar a composição centesimal, fatores antinutricionais e atividade hemolítica, antibacteriana e antifúngica. A composição centesimal e o teor de fatores antinutricionais (lectinas, taninos e saponinas) foram determinados na folha fresca, branqueada, cozida e liofilizada. Para a extração das proteínas, foram utilizadas seis soluções sob agitação constante durante 3 horas à temperatura de 25ºC, obtendo-se o extrato bruto. O ensaio de hemaglutinação foi determinado por meio de diluição duplo-seriada do extrato em tubos de ensaio contendo solução salina e eritrócitos a 3% de sangue humano A, B e O e de coelho. Foi investigada a especificidade da lectina por açúcares utilizando inibição com diversos carboidratos simples. O teor de proteínas solúveis foi realizado pelo método de Bradford. A inativação da lectina foi testada com o extrato bruto com uma variação de pH (2,08 a 13,08) e temperatura (40 a 100ºC). O extrato protéico foi precipitado com sulfato de amônio a 80% de saturação, obtendo a fração ativa (0-80). Esta foi submetida à cromatografia de afinidade (estroma-poliacrilamida) e utilizada na verificação da resistência da lectina frente a agentes quelantes, desnaturantes, redutores, oxidantes e enzimas proteolíticas (tripsina, papaína e bromelaína). Após tratamento da lectina com estes agentes, realizou-se teste de atividade hemaglutinante (AH). Os taninos totais foram determinados usando o ácido tânico como padrão e a atividade hemolítica para a procura de saponina. Realizaram-se testes de atividade antibacteriana, antifúngica e hemolítica com a fração protéica. A AH foi melhor verificada quando se utilizou NaCl 0,15 M. Dentre os eritrócitos testados a lectina aglutinou preferencialmente os de coelho tratado e não tratado com enzimas proteolíticas (154,26 UH/mgP), apresentando especificidade pelos carboidratos lactose, galactose e arabinose. Verificou-se que a lectina é inativada em temperaturas, a partir de 100ºC e em pH ácido 2,08. A amostra lectínica se mostrou resistente a ação de enzimas proteolíticas, agente redutor, oxidante e desnaturante por 30 minutos. Porém, a perda total da AH ocorreu com a administração do quelante no dia e do agente desnaturante após overnight. Na presença de íons isolados a AH foi mantida. A cromatografia mostrou um pico que apresentou AH e o perfil protéico das frações e dos picos ativos e não ativos foram submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida em presença de dodecil sulfato de sódio (SDS) indicando uma purificação parcial. Os teores de taninos totais variaram de 0,16% para folha cozida a 0,60% para a folha fresca. A pesquisa de saponina foi negativa na amostra analisada. A fração protéica não apresentou efeito inibitório sobre o crescimento de fungos dermatófitos, todavia, apresentou atividade contra Staphylococcus aureus e Escherichia coli com uma concentração inibitória mínima de 1,9 μg/mL de proteína. As amostras testadas não causaram efeito hemolítico frente a eritrócitos humanos A e B. Conclui-se a partir do presente estudo, que as folhas de cenoura possuem propriedades nutricionais que a habilitam para consumo. Possui ainda fatores antinutricionais que são inativados pelo calor.

Lectinas são proteínas que possuem pelo menos um domínio não catalítico que se liga reversível e especificamente a um monossacarídeo ou oligossacarídeo. A capacidade de ligação a diferentes tipos de açúcares torna essas moléculas ferramentas úteis no estudo de diversos processos celulares específicos. Embora as lectinas de plantas sejam amplamente estudadas, aquelas referentes à família Apocynaceae ainda são pouco exploradas. Resultados prévios obtidos pelo nosso grupo de pesquisa mostraram que extratos brutos de súber do caule da apocinácea Tabernaemontana hystrix Steud apresenta atividade hemaglutinante. Além de aglutinar eritrócitos do sistema ABO, a putativa aglutinina foi capaz de estimular a síntese de RNAm de IL-6 e TGF- beta em células esplênicas de camundongos. À vista disso, no presente projeto tivemos como objetivo identificar, caracterizar bioquimicamente e avaliar o possível potencial imunoestimulador da aglutinina de T. hystrix. Os extratos de T. hystrix obtidos por meio da farinha de raspas do súber apresentaram atividade hemaglutinante, o que não foi observado no extrato do caule destituído de súber e no extraído das folhas. Para comprovar que se tratava da atividade observada anteriormente, obtivemos a inibição da hemaglutinação com a glicoproteína fetuína, mas não houve inibição por monossacarídeos. Foi determinado um protocolo de isolamento da hemaglutinina com precipitação do extrato do súber com sulfato de amônio, cuja atividade foi recuperada no material precipitado na faixa de 30 a 60% de saturação, seguido de cromatografias sequenciais por (1) interação hidrofóbica (HiTrap Octyl), (2) troca catiônica (HiTrap SP), (3) fase reversa (EC Nucleosil C18) e (4) afinidade (Blue Sepharose). Nessas colunas a atividade foi recuperada do (1) material não retido e dos eluatos (2 e 4) com 1M e 0,5M de NaCl, respectivamente, e (3) 83% de acetonitrila. Esse protocolo produziu uma preparação homogênea contendo um peptídeo cuja análise eletrofóretica revelou massa molecular (MM) aproximada de 3kDa e concentração hemaglutinante mínima de 50g/mL. A fim de determinar se esse peptídeo formava estrutura quaternária (dímeros, tetrâmetros, etc.), característica da maioria das lectinas de plantas, submeteu-se a preparação a uma eletroforese em gel nativo (PAGE), não sendo observadas mudanças na MM do peptídeo e nem a presença de outras moléculas com MM maiores que pudessem estar associadas a ele, o que sugere que a aglutinina de T. hystrix (denominado aqui de Tabhys) é um peptídeo de MM aproximada de 3kDa. O fato da heveína, um dos peptídeos lectínicos com atividade antifúngica mais estudado, ter especificidade por quitina nos motivou a tentar o isolamento do peptídeo em coluna desse polissacarídeo. Observou-se atividade hemaglutinante e presença de peptídeo com MM de 3kDa no material eluído com Ácido acético a 0,1M da coluna de quitina. Curiosamente, nenhuma de nossas preparações foram capazes de inibir o crescimento do fungo Trichophyton rubrum. O peptídeo purificado foi testado quanto a sua capacidade em induzir a proliferação celular e a produção de citocinas em células esplênicas murinas. Os resultados dos ensaios de RT-PCR em tempo real e citometria de fluxo demonstraram que o a aglutinina de T. hystrix não foi capaz de estimular a proliferação de linfócitos, entretanto, induziu o aumento de mensagem para a citocina TGF-beta, cujo pico de produção ocorreu em célula estimuladas com 37ng/mL. Neste estudo, relatamos a presença de um peptídeo no extrato de T. hystrix com atividade hemaglutinante, o que é relativamente raro e novo. Devido a isso, este estudo pode proporcionar novas perspectivas e paradigmas nos estudos das lectinas a nível molecular e estrutural. / Lectins are proteins that have at least one non-catalytic domain that binds specifically and reversibly to a monosaccharide or oligosaccharide. This ability to bind to different types of sugars makes these molecules useful tools in the study of various specific cellular processes. Although the plant lectins are widely studied, those belong to Apocynaceae family are still little explored. Previous results obtained by our research group showed that bark crude extracts from Tabernaemontana hystrix Steud (Apocynaceae) had hemagglutination activity. Besides to agglutinate erythrocytes from ABO blood group system, the putative agglutinin induced the synthesis of IL-6 and TGF-beta mRNA in mouse spleen cells. Here we aim to identify, characterize biochemically and evaluate the possible immunostimulatory potential of T. hystrix agglutinin. The haemagglutination activity was obtained from crude extracts of bark flour, but not of flours of stems without bark and leaves. The activity of the bark extract was similar to that from the previous study, since the haemagglutination was inhibited by the glycoprotein fetuin, but not by monosaccharides. An isolation protocol was determined by using ammonium sulfate precipitation, with haemagglutination activity recovered in the range of 30-60% of saturation, and sequential chromatography procedures: (1) hydrophobic interaction (HiTrap Octyl), (2) cation-exchange (HiTrap SP), (3) reverse phase (EC Nucleosil) and (4) affinity (BlueSepharose) chromatography. From these columns the activity was recovered in the (1) unbound material, and eluates (2 and 4) with 1M and 0,5M of NaCl, respectively, and (3) 83% acetonitrile. On the basis of electrophoresis analysis, the protocol produced a preparation comprised of only band corresponding a peptide with molecular weight (MW) of about 3-kDa, with minimum haemagglutination concentration of 50g/ml. To determine if this molecule arrangement had a quaternary structure arrangement, a feature of most known lectins, we submitted the preparation to a native electrophoresis. Because there was neither change in migration pattern nor presence of molecules of higher molecular mass, we suggested that T. hystrix peptide (Tabhys) is a peptide with MW of about 3-kDa. Since hevein, which is a most studied lectin-like peptide with antifungal activity, binds specifically to chitin, we performed an affinity chromatography in the chitin column with bark extract. We observed haemagglutination activity and the presence of peptide with MW of 3-kDa in the material bound to column and eluted with 0,1M acetic acid. Curiously, this peptide was not able to inhibit the growth of the fungus Trichophyton rubrum. Thereafter, when the purified peptide was used to stimulate murine spleen cells, we detected the expression of TGF-beta message, with a peak production obtained in cell stimulated with 37 ng/mL of Tabhys. In the current study, we isolated a peptide from crude extract of T. hystrix bark with haemagglutination activity, providing new perspectives in molecular and structural researches of peptide lectins.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_fernanda_nedel.pdf: 5232153 bytes, checksum: 94c9f4584571a1e142e44a8b165fc8dd (MD5) Previous issue date: 2012-09-17 / Cancer is a leading cause of death and its rates are expected to increase 50% by 2020. Although surgical resection and additional therapies (such as chemotherapy and radiotherapy) are able to cure well-confined, primary tumors, the same does not apply during metastasis due to the systemic involvement and its resistance to conventional therapies. Therefore, the current clinical challenge is to develop new drugs and treatment modalities that will significantly impact the cure rates. In this sense, the present study aimed to evaluate the anticancer effect and study the underlying cell death mechanisms of diaryl diselenides and its substituted structures - (4-ClC6H4Se)2, (3-CF3C6H4Se)2 e (4-MeOC6H4Se)2 - on the human colon adenocarcinoma cell line (HT-29). We verified that (3-CF3C6H4Se)2 and (4-MeOC6H4Se)2 induced cytotoxicity through apoptosis mechanisms in HT-29 cells, where pro-apoptotic genes were up-regulated (Bax, caspase-9, caspase-8, apoptosis-inducing factor (AIF) and endonuclease G (EndoG), and anti-apoptotic genes were down-regulated (Bcl-2 and survivin). In a second moment we evaluated the anticancer potential of Canavalia brasiliensis (ConBr), Canavalia boliviana (ConBol) and Canavalia ensiformis (ConA) lectins in HT-29 cells, which showed an effective capacity to reduce cell viability. Once the anticancer effect was confirmed, lectins were labeled with FITC and its interaction with the tumor cells was investigated. The FITC-ConA and FITC-ConBol demonstrated the potential to bind to HT-29 cells unlike FITC-ConBr. In order to investigate a new treatment modality, the interaction between the respective lectins with HT-29 was evaluated when associated with functionalized multi-walled carbon nanotubes (f-MWCNTs). When f-MWNT was incorporated to FITC-ConBol and FITC-ConA lectins there was an increase in fluorescence intensity. / O câncer é uma das principais causas de morte no mundo, onde os índices devem aumentar 50% até 2020. Embora a ressecção cirúrgica e terapias adicionais (como a quimioterapias e radioterapias) sejam capazes de curar tumores primários bem delimitados, o mesmo não se aplica a metástase devido ao seu envolvimento sistêmico e a resistência a terapias convencionais. Portanto, atualmente o desfio clínico é desenvolver novas drogas e modalidades de tratamentos que irão impactar significativamente as taxas de cura do câncer. Neste sentido, o presente trabalho objetivou avaliar o efeito antineoplásico e investigar a rota de apoptose induzido pelo disseleneto de diarila e seus derivados substituídos - (4-ClC6H4Se)2, (3-CF3C6H4Se)2 e (4-MeOC6H4Se)2 - em células de adenocarcinoma de colorretal humano (HT-29). Verificamos que os compostos (3-CF3C6H4Se)2 e (4-MeOC6H4Se)2 induziram um efeito citotoxidade por meio de apoptose, onde os genes pró-apoptoticos (Bax, caspase-9, caspase-8, fator indutor de apoptose (AIF) e endonuclease G (EndoG)) foram altamente expressos e os genes anti-apoptótico (Bcl-2 e survivin) mostraram uma redução na sua expressão. Em um segundo momento avaliamos o potencial antineoplásico das lectinas Canavalia brasiliensis (ConBr), Canavalia boliviana (ConBol) e Canavalia ensiformis (ConA) em células HT-29, as quais se mostraram efetivas em reduzir a viabilidade celular. Uma vez confirmado o efeito antineoplásico, as lectinas forma marcadas com FITC e a sua interação com as células tumorais foi investigado. As lectinas FITC-ConA e FITC-ConBol demonstraram potencial de se ligar as células HT-29 ao contrário da FITC-ConBr. A fim de investigar uma nova modalidade de tratamento foi avaliada a interação entre as respectivas lectinas com as células HT-29 quando associadas à nanotubos de carbonos funcionalizados de paredes múltiplas (f-MWCNTs). Quando os f-MWCNTs foram incorporados as lectinas FITC-ConA e FITC-ConBol houve um aumentaram na intensidade de fluorescência.

Orientadores : Sonia Maria Alves Bueno, Ricardo de Lima Zollner / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-06T11:50:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Duarte_IsaSantos_D.pdf: 749498 bytes, checksum: 83d66753c75e7828fd4a8b858aecf473 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: A alergia é uma enfermidade do sistema imunológico que afeta aproximadamente de 20 a 30% da população mundial. Dentre as reações alérgicas, a reação de hipersensibilidade imediata é mediada pelas imunoglobulinas E (IgE). Os indivíduos geneticamente predispostos a manifestar reações por hipersensibilidade imediata e polissensibilizados aos alérgenos ambientais são considerados atópicos e, geralmente, possuem teores de IgE total até 10.000 vezes mais elevados do que as pessoas não-atópicas. O conhecimento das interações entre a IgE e ligantes de afinidade pode levar ao desenvolvimento de novos tratamentos da hipersensibilidade imediata, por exemplo a terapia de adsorção seletiva através de circulação extracorpórea, assim como ao desenvolvimento de métodos de obtenção de IgE purificada, para aplicação nas áreas de diagnóstico, pesquisa molecular, dentre outras. Os adsorventes empregados na terapia de adsorção seletiva, bem como na purificação de IgE, geralmente são anticorpos anti-IgE imobilizados em agarose, os quais são de alto custo e difícil obtenção. Este trabalho avaliou o desempenho de adsorventes alternativos ao Sepharose-anti-IgE, visando a remoção de IgE total e específica aos ácaros Dermatophagoides pteronyssinus e Blomia tropicalis de amostras plasmáticas e a preparação de soluções enriquecidas em IgE, como uma das etapas do processo de purificação de IgE. Os adsorventes estudados constituíram-se de lectinas (concanavalina A e Lens culinaris), aminas (poli-L-lisina e aminohexil) e o aminoácido D-triptofano, imobilizados em agarose. Dentre eles, o gel agarose-Lens culinaris mostrou-se o mais promissor para aplicação na terapia de adsorção seletiva de IgE e o gel Sepharose-concanavalina A mostrou-se o mais adequado para ser usado na obtenção de soluções enriquecidas em IgE. Experimentos cromatográficos foram realizados visando estabelecer condições experimentais (velocidade superficial, número de passagens de plasma pela coluna, temperatura e razão entre volume de plasma e volume de leito) mais favoráveis à adsorção de IgE em agarose-Lens culinaris. Posteriormente, essas condições foram utilizadas nos experimentos de simulação in vitro de circulação extracorpórea, nos quais o gel agarose-Lens culinaris removeu de 40,7 a 42,8% de IgE¿s total e específicas. A obtenção da solução enriquecida em IgE foi realizada por meio de duas etapas cromatográficas, empregando-se os princípios de afinidade (colunas agarosejacalina e Sepharose-concanavalina A) e de exclusão por tamanho (permeação em gel). A solução final enriquecida em IgE obtida, continha como principais impurezas, IgA e IgG. Como resultado das duas etapas, 36,6% de IgE foi recuperada e o fator de enriquecimento em IgE, em relação a IgA, IgG, IgM e albumina, foi de 75,8. Apesar do gel Sepharose-anti- IgE apresentar desempenho melhor tanto na remoção quanto na purificação de IgE, os adsorventes agarose-Lens culinaris e Sepharose-concanavalina A apresentam custos mais atrativos / Abstract: Allergy is a disorder of the imune system, affecting approximately 20%-30% of the general population. Among allergic reactions, immediate hypersensitivity is mediated by immunoglobulin E (IgE). Individuals that have a genetic predisposition for responses to immediate hypersensitivity are named atopic and generally have elevated serum IgE concentration, up to 10,000-fold higher than in the normal population. The knowledge of the interactions between IgE and affinity ligands may lead to the development of new methods of treatment for immediate hypersensitivity, for example, IgE selective adsorption therapy through extracorporeal circulation, as well as to new methods for obtaining purified IgE, which is employed in diagnostic and in molecular research. The adsorbents employed in IgE selective adsorption therapy, as well as in IgE purification, are usually antibodies anti-IgE immobilized on agarose, which have high costs and are difficult to obtain. This work assessed the performance of adsorbents (alternative to Sepharose-anti-IgE) for the removal of total IgE and IgE specific for the airbone allergens Dermatophagoides pteronyssinus and Blomia tropicalis from plasma samples, as well as in the production of IgE enriched solutions, considered as a step of IgE purification. The adsorbents studied were lectins (concanavalina A and Lens culinaris), amines (poli-L-lisina e aminohexil) and the aminoacid D-tryptophan, all of them immobilized on agarose. Among them, Lens culinaris-agarose showed the best performance for IgE selective adsorption therapy, and Sepharose¿concanavalin A was considered the most appropriate for the production of IgE enriched solutions. Chromatographic experiments were accomplished in order to determine operating conditions (superficial velocity, number of times the plasma passed through the column, temperature, and ratio of plasma volume to bed volume) more favorable to IgE adsorption on Lens culinaris-agarose. The selected conditions were utilized in in vitro simulation assays of extracorporeal circulation, in which the Lens culinaris-agarose removed from 40.7% to 42.8% of total and specific IgE. The production of IgE enriched solutions was carried out with two chromatographic steps, employing affinity (columns jacalin-agarose and Sepharose-concanavalin A) and size exclusion (gel permeation) principles. The IgE enriched final solution contained IgA and IgG as the major impurities. As a result of both steps, 36.6% of IgE was recovered and the IgE enrichement number concerning IgA, IgG, IgM, and albumin was 75.8. Despite Sepharose-anti-IgE has better performance in removal and purification of IgE, Lens culinaris-agarose and Sepharose-concanavalin A adsorbents have more attractive costs / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Doutora em Engenharia Quimica

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Foram investigados os efeitos do veneno da serpente Bothrops insularis e de suas fraÃÃes, lectina, L-aminoÃcido oxidase, trombina sÃmile e fosfolipase A2, no rim isolado e sistema vascular de rato. As fraÃÃes foram purificadas a partir de uma combinaÃÃo de procedimentos cromatogrÃficos, usando colunas de HPLC de exclusÃo molecular, troca iÃnica, fase reversa e colunas de baixa pressÃo de afinidade. Foi utilizada a perfusÃo de rim isolado de rato e a soluÃÃo de Krebs-Henseleit modificada (Bowman, 1970; Fonteles et al. 1998). ParÃmetros selecionados da funÃÃo renal foram avaliados durante as condiÃÃes experimentais, com a infusÃo do veneno e suas fraÃÃes, aos 60, 90, e 120 minutos. Os primeiros 30 minutos serviram de controle interno. No leito arterial sistÃmico de rato (Ferreira, 1965) a pressÃo arterial foi avaliada por manÃmetro conectado por cÃnula à artÃria carÃtida comum, e o veneno injetado na veia jugular. Os registros foram realizados a cada 10 minutos apÃs a administraÃÃo de doses crescentes do veneno, atà a infusÃo da dose de 300mcg, aos 60 minutos. Na PerfusÃo do leito arterial mesentÃrico isolado de rato (McGregor, 1965), utilizou-se a soluÃÃo de Krebs-Henseleit em fluxo constante de 4mL/minuto. A pressÃo de perfusÃo foi registrada manometricamente. A avaliaÃÃo estatÃstica foi determinada por anÃlise de variÃncia (ANOVA) e teste de Bonferroni, com nÃvel de significÃncia menor de 5%. No rim, o grupo tratado com o veneno apresentou reduÃÃo em todos os parÃmetros avaliados, com exceÃÃo da absorÃÃo de potÃssio. Com a lectina a pressÃo de perfusÃo aumentou inicialmente e caiu em seguida, juntamente com o fluxo urinÃrio e o ritmo de filtraÃÃo glomerular. Houve aumento na reabsorÃÃo de sÃdio e potÃssio, com reduÃÃo no clearance osmÃtico. Com a trombina-sÃmile, ocorreu aumento inicial seguido de queda no final em quase todos os parÃmetros, com exceÃÃo da resistÃncia vascular renal. A reabsorÃÃo tubular do sÃdio e do cloro caiu; houve elevaÃÃo inicial do transporte de potÃssio; com aumento seguido de queda do clearance osmÃtico. Com a L-aminoacido oxidase houve queda em todos os parÃmetros avaliados. Com a fosfolipase A2 houve elevaÃÃo nos parÃmetros fisiolÃgicos e vasculares; no transporte tubular de potÃssio e no clearance osmÃtico; com queda na reabsorÃÃo de sÃdio e cloro. Todos os rins mostraram, no final, sinais de necrose tubular aguda, com exceÃÃo dos perfundidos com a trombina-sÃmile. Excetuando os tratados com veneno, todos os rins apresentaram, ao final, extravasamento protÃico para o espaÃo de Bowman. No leito arterial sistÃmico o veneno produziu reduÃÃo na pressÃo arterial sistÃmica diretamente proporcional à quantidade de veneno administrada, excetuando a dose de 10mcg, alÃm de intensa hemorragia pulmonar com proliferaÃÃo de neutrÃfilos e linfÃcitos nos alvÃolos, hemorragia no rim e congestÃo generalizada. No leito arterial mesentÃrico se observou uma reduÃÃo na presÃo quando o veneno foi administrado em leito arterial prÃ-contraÃdo com fenilefrina, como tambÃm isoladamente, na ausÃncia de fenilefrina. O veneno da Bothrops insularis mostrou potencial hemorrÃgico e vasodilatador semelhante aos outros venenos de serpentes do gÃnero, com atividade necrotizante superior nos rins, onde provocou necrose tubular aguda, ao contrario do observado com outros venenos do mesmo gÃnero, em experimentos no rim isolado de rato. / We investigated the biochemical and biological effects of the whole venom from Bothrops insularis (popularly known as âgolden lancetâ), and four of its fractions, a thrombin-like enzyme, a lectin-like substance, an L-amino acid oxidase and a phospholipase A2, in perfused rat kidneys and vascular sistem. The fractions were purified by a combination of Sephadex gel filtration in HPLC columns, and ion-exchange chromatography on DEAE-Sephadex in reverse phase, low-pressure affinity columns. We used a modified isolated perfused rat kidney assay, with Krebs-Henseleit solution as the perfusion fluid (Bowman, 1970; Fonteles et al., 1998). Selected parameters of renal function during stable experimental conditions were evaluated before and at 60, 90, and 120 minutes after infusion of venom and its fractions, with the first 30 minutes interval constituting the paired control. In the systemic vascular bed (Ferreira, 1965), the arterial pressure was evaluated by a manometer connected through a canule to carotid common artery and the venom was injected into the jugular vein, with registers made at every 10 minutes after administration in increasing doses, until an infusion of 300mcg was reached at 60 minutes. In the isolated rat mesenteric blood vessels method (McGregor, 1965), the perfusions were done with Krebs-Henseleit solution, at a constant flow rate of 4mL/minute. The perfusion pressure was measured manometrically. Statistical evaluations were performed by analysis of variance (ANOVA) and Bonferroni test, at the 5% significance level. In perfused kidney studies, the group treated with the whole venom showed a fall in all physiological parameters, except in potassium transport. With the lectin-like fraction, the perfusion pressure rose initially, followed by a fall, along with urinary flow and glomerular filtration rate. Sodium and potassium tubular reabsorption increased, with a fall in the osmotic clearance. The thrombin-like fraction promoted an initial rise followed by a fall in the end, in almost all parameters except in the renal vascular resistance. The sodium and chloride tubular reabsorption fell. There was an initial rise in the potassium transport, and an initial rise followed by a fall in the osmotic clearance. With the L-amino acid oxidase fraction, there was a fall in all the parameters studied. The Phospholipase A2 fraction induced a rise in the physiological and vascular parameters, as also in the potassium transport and osmotic clearance; accompanied by a fall in sodium and chloride reabsorption. With the exception of the thrombin-like fraction, all the substances tested induced acute tubular necrosis in perfused kidneys in the end. Protein extravasation into the Bowman space was evidenced in all perfused kidneys except in those treated with the whole venom; but was more intense with the thrombin-like fraction. In the systemic arterial bed, the whole venom raised arterial pressure in a dose-dependant manner, except at the concentration of 10mcg; in addition to causing intense pulmonary hemorrhage with neutrophils and alveolar lymphocyte proliferation, renal hemorrhage, and generalized vascular dilatation and congestion. In the isolated mesenteric artery, there was a marked fall in perfusion pressure when the whole venom was infused into the vessel pre-contracted with phenillephrine, as also in the isolated vessel without phenillephrine. We conclude that Bothrops insularis venom shows vasodilatation and hemorrhagic potential, like other venoms of the genus; but, different from other Bothrops venoms, it also reveals a significant necrotic activity when perfused into isolated rat kidney, causing acute tubular necrosis,

A Nattectina é uma toxina isolada do veneno de Thalassophryne nattereri que possui homologia com lectinas tipo C. Este estudo consistiu em avaliar a ação da Nattectina sobre as funções de macrófagos e a influência de citocinas Th1/Th2 nessa ativação. Nossos resultados mostram que a Nattectina induziu o aumento da expressão de moléculas coestimuladoras dependente da sinalização MAPK p38 e PI3K em macrófagos derivados da medula óssea, e também um aumento na capacidade endocítica e expressão de MHC de classe II dependentes da sinalização ERK1/2 e da ligação da Nattectina ao carboidrato. Verificamos ainda que alterações induzida pela Nattectina nos macrófagos são consistentes com a ativação clássica M1 dependente de IL-12 e IFN-<font face=\"Symbol\">g, e regulada negativamente por IL-4, IL-10 e IL-13. Por fim, verificamos uma ação coadjuvante da IL-4 com IFN-<font face=\"Symbol\">g na mobilização de SPMs (Small Peritoneal Macrophages) para cavidade peritoneal e na ativação de macrófagos. Dessa forma, a Nattectina pode ser considerada um importante agente imunomodulador capaz de modular as funções de macrófagos. / Nattectin is a toxin isolated from Thalassophryne nattereri fish venom that has homology with C-type lectin. This study was carried out to evaluate the action of Nattectin on macrophage functions and the influence of Th1/Th2 cytokines in this activation. Our results show that Nattectin induced the increased expression of costimulatory molecules dependent on MAPK p38 and PI3K signaling in bone marrow-derived macrophages, and also an increase in endocytic capacity and MHC class II expression dependent on ERK1/2 signaling and binding of Nattectin to carbohydrate. We also found that modifications induced by Nattectin in macrophages are consistent with classical (M1) activation of macrophages dependent on IL-12 and IFN-<font face=\"Symbol\">g cytokines, and negatively regulated by IL-4, IL-10 and IL-13. Finally, it was demonstrated an adjuvant role of IL-4 with IFN-<font face=\"Symbol\">g in mobilization of SPMs (Small Peritoneal Macrophages) to peritoneal cavity and also in macrophage activation. Thus, Nattectin can be considered an important immunomodulatory agent able to modulate macrophage functions.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:33:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_cristian_kaefer.pdf: 618934 bytes, checksum: 3a187e51605cfbd7fbc2329acd8b0568 (MD5) Previous issue date: 2012-02-16 / The outer membrane of mammalian sperm is covered by the glycocalyx, a layer rich in carbohydrates which is crucial for the functions and interactions of male gametes with the extracellular environment. Several factors affect the motility and functional integrity of sperm, being the damage caused by excessive production of reactive oxygen species (ROS), an important factor. Lectins are proteins that bind specifically to carbohydrate residues. These proteins are useful tools for investigating the distribution and changes of membrane glycoconjugates. Studies have investigated the oxidative stress in sperm cells, however, to date, no studies have been conducted to evaluate the effect of plant lectins on oxidative stress in spermatozoa. The present study aimed to investigate the pattern of binding and the effects of lectins ConA, extracted from Canavalia ensiformis, ConBol, extracted from C. boliviana, and ConBr, extracted from C. brasiliensis, on motility, viability, lipid peroxidation, and ROS generation in bovine sperm. The three lectins bound to sperm, but with some differences. It was observed that the lectin ConA did not bind to the equatorial segment located between the acrosomal cap and post-acrosomal region. In 18% of sperm cells labeled with ConBol there was not binding in the acrosome region and 45% of ConBr labeled cells showed a fragmented binding to the sperm head. Sperm incubation with Canavalia lectins produced a decrease in motility. ConA and ConBr demonstrated a strong effect to decline motility soon after incubation (13.3 ± 3.3% in both lectins vs. 60 ± 5.7%) (P<0.05). The lowest motility values found was at the 15 µg/ml concentration after 2h incubation for ConBr (1.6 ±1.7%). The cell viability and lipid peroxidation were not affected by any lectin tested (P>0.05). However, ConA, ConBol and ConBr lectins showed similar behavior causing a increase of ROS production over time compared with control (P<0.05). In conclusion, this study demonstrates that sperm incubation with ConA, ConBol and ConBr lectins induce a decrease in motility and an increase generation of ROS that can led to a spermatozoon dysfunction. / A membrana externa dos espermatozoides de mamíferos é coberta pelo glicocálice, uma camada rica em carboidratos que é crucial para as funções e interações dos gametas masculinos com o ambiente extracelular. Vários fatores afetam a motilidade e a integridade funcional dos espermatozoides, sendo o dano causado pela produção excessiva de espécies reativas de oxigênio (ROS) um importante fator. Lectinas são proteínas que se ligam de forma especifica a resíduos de carboidratos. Essas proteínas são ferramentas úteis para a investigação da distribuição e alteração de glicoconjugados de membrana. Estudos investigaram o estresse oxidativo em células espermáticas, porém, até o momento, não foram realizados trabalhos para avaliar o efeito de lectinas vegetais no estresse oxidativo em espermatozoides. O presente estudo teve por objetivo investigar o padrão de ligação e os efeitos das lectinas ConA, extraída de Canavalia ensiformis, ConBol, extraída de C. boliviana, e ConBr, extraída de C. brasiliensis, na motilidade, viabilidade, peroxidação lipídica, e geração de ROS em espermatozoides bovinos. Foi observado que as três lectinas se ligaram aos espermatozóides, mas com algumas diferenças. A lectina ConA não se ligou ao segmento equatorial, localizado entre a capa acrossomal e a região pós-acrossomal. Em 18% dos espermatozoides marcados com ConBol não houve ligação da lectina na região do acrossoma. Já em 45% das células marcadas com ConBr houve uma ligação de aspecto fragmentado a cabeça do espermatozoide. A incubação com as lectinas do gênero Canavalia produziu um decréscimo na motilidade. ConA e ConBr demonstraram um grande efeito na diminuição da motilidade espermática logo após a incubação (13.3 ± 3.3% em ambas as lectinas vs. 60 ± 5.7%) (P<0.05). A motilidade mais baixa ocorreu com a concentração de 15 µg/ml de ConBr após 2h de incubação (1.6 ±1.7%). A viabilidade celular e a peroxidação lipídica não foram afetadas por nenhuma das lectinas testadas (P>0.05). No entanto, as lectinas ConA, ConBol e ConBr apresentaram comportamento similar causando um aumento na produção de ROS ao longo do tempo comparado com o controle (P<0.05). Em conclusão, este estudo demonstra que as lectinas ConA, ConBol e ConBr ligam-se aos carboidratos de membrana de espermatozoides bovinos e induzem uma diminuição da motilidade e aumento na geração de ROS, que pode levar a perda da função celular.

Introdução: Chlamydia trachomatis (CT) é causa da infecção sexualmente transmitida de origem bacteriana mais comum. Na mulher, a infecção genital pela CT pode causar cervicite, uretrite, endometrite, salpingite. Infecções persistentes ou recorrentes provavelmente representam um importante fator de risco para o desenvolvimento de sequelas associadas, como dor pélvica crônica, gravidez ectópica e infertilidade por fator tubário. A lectina ligadora de manose (MBL), componente doo sistema imune inato, tem importante papel na defesa antimicrobiana, reconhecendo vírus, fungos e patógenos bacterianos. O gene que codifica para a MBL é polimórfico, e a substituição de um único nucleotídeo resulta na produção de uma proteína instável, que é rapidamente degradada. Objetivo: Avaliar se mulheres brasileiras portadoras de um polimorfismo do gene da MBL apresentam diferentes susceptibilidades para a ocorrência de obstrução tubária, na presença ou ausência de uma infecção prévia por Chlamydia trachomatis. Métodos: Em estudo caso-controle, foram avaliadas 75 pacientes com obstrução tubária e 75 pacientes com tubas pérvias, atendidas na Divisão de Ginecologia do Hospital das Clínicas da Universidade de São Paulo (HCFMUSP). Anticorpos IgG anti-CT foram mensurados através de um ensaio de imunoabsorção enzimática para investigar uma infecção prévia pela CT. Para o polimorfismo, realizou-se coleta de células bucais e o DNA extraído foi analisado através de reação em cadeia da polimerase (PCR), digestão de endonuclease e gel de eletroforese, utilizando pares de primers específicos para a região polimórfica. Todo material foi mantido a -80°C e enviado em gelo seco para a Division of Immunology and Infectious Diseases da Weill Cornell Medicine em Nova York. Associações entre genótipos de MBL ou alelos e permeabilidade tubária foram analisadas pelo teste de qui-quadrado de Pearson com ou sem correção de Yates. Resultados: Não houve diferença na detecção de anticorpos da CT entre os grupos. Mulheres com tubas obstruídas tiveram uma prevalência maior do genótipo AB (36%) versus (16%), resultado estatisticamente significativo (p < 0,01). De maneira semelhante, a distribuição do alelo A e do alelo variante B também apresentaram diferenças significantes entre os grupos (p < 0,01). Conclusão: Os achados sugerem, que embora a exposição à Chlamydia trachomatis tenha sido semelhante em ambos os grupos, a presença do alelo variante B do gene que codifica para a MBL aumenta o risco de desenvolvimento da obstrução tubária, subsequente à infecção pela CT ou outros agentes infecciosos. Nas mulheres brasileiras avaliadas a presença de tal polimorfismo genético aumentou a probabilidade de obstrução tubária em consequência de uma infecção do trato genital / Introduction: Chlamydia trachomatis (CT) is the cause of the most common bacterial sexually transmitted infection. In women, genital CT infection may cause cervicitis, urethritis, endometritis, salpingitis. Persistent or recurrent infections probably represent an important risk factor for the development of associated sequelae, such as chronic pelvic pain, ectopic pregnancy and tubal factor infertility. Mannose-binding lectin (MBL), a component of the innate immune system, has an important role in antimicrobial defense, recognizing viral, bacterial and fungal pathogens. The gene coding for MBL is polymorphic and a single nucleotide substitution results in production of an unstable protein, that is rapidly degraded. Objective: To evaluate whether Brazilian women with a polymorphism in the MBL gene present different susceptibilities to the occurrence of fallopian tube damage, in the presence or absence of a previous infection by CT. Method: In a case-control study, 75 patients with tubal obstruction and 75 patients with patent tubes were studied, all seen at the Gynecology Division of the Hospital das Clínicas of the University of São Paulo (HCFMUSP). IgG anti-CT antibodies were measured by enzyme-linked immunoassay to investigate a previous CT infection. For the polymorphism analysis, buccal cells were collected and the extracted DNA was analyzed by polymerase chain reaction (PCR), endonuclease digestion and gel electrophoresis using primer pairs specific for the polymorphic region. All material was maintained at -80 ° C and sent on dry ice to the Division of Immunology and Infectious Diseases at Weill Cornell Medicine in New York. Associations between MBL genotypes or alleles and tubal permeability were analyzed by the Pearson chi-square test with or without Yates correction. Results: There was no difference in CT antibody detection between the two groups. Women with obstructed tubes had a higher prevalence of being positive for the heterogenous genotype AB (36%) versus (16%) (p < 0.01). Similarly, the distribution of the normal A allele and variant B allele were also significant different between the two groups (p < 0,01). Conclusion: The findings suggest that while exposure to CT was similar in both groups of women the presence of the variant MBL B allele increases the risk for development of tubal obstruction, subsequent to a CT or other infection. In the Brazilian women evaluated possession of this genetic polymorphism increased the likelihood that blocked fallopian tubes will be a consequence of a genital tract infection

Introdução: Chlamydia trachomatis (CT) é causa da infecção sexualmente transmitida de origem bacteriana mais comum. Na mulher, a infecção genital pela CT pode causar cervicite, uretrite, endometrite, salpingite. Infecções persistentes ou recorrentes provavelmente representam um importante fator de risco para o desenvolvimento de sequelas associadas, como dor pélvica crônica, gravidez ectópica e infertilidade por fator tubário. A lectina ligadora de manose (MBL), componente doo sistema imune inato, tem importante papel na defesa antimicrobiana, reconhecendo vírus, fungos e patógenos bacterianos. O gene que codifica para a MBL é polimórfico, e a substituição de um único nucleotídeo resulta na produção de uma proteína instável, que é rapidamente degradada. Objetivo: Avaliar se mulheres brasileiras portadoras de um polimorfismo do gene da MBL apresentam diferentes susceptibilidades para a ocorrência de obstrução tubária, na presença ou ausência de uma infecção prévia por Chlamydia trachomatis. Métodos: Em estudo caso-controle, foram avaliadas 75 pacientes com obstrução tubária e 75 pacientes com tubas pérvias, atendidas na Divisão de Ginecologia do Hospital das Clínicas da Universidade de São Paulo (HCFMUSP). Anticorpos IgG anti-CT foram mensurados através de um ensaio de imunoabsorção enzimática para investigar uma infecção prévia pela CT. Para o polimorfismo, realizou-se coleta de células bucais e o DNA extraído foi analisado através de reação em cadeia da polimerase (PCR), digestão de endonuclease e gel de eletroforese, utilizando pares de primers específicos para a região polimórfica. Todo material foi mantido a -80°C e enviado em gelo seco para a Division of Immunology and Infectious Diseases da Weill Cornell Medicine em Nova York. Associações entre genótipos de MBL ou alelos e permeabilidade tubária foram analisadas pelo teste de qui-quadrado de Pearson com ou sem correção de Yates. Resultados: Não houve diferença na detecção de anticorpos da CT entre os grupos. Mulheres com tubas obstruídas tiveram uma prevalência maior do genótipo AB (36%) versus (16%), resultado estatisticamente significativo (p < 0,01). De maneira semelhante, a distribuição do alelo A e do alelo variante B também apresentaram diferenças significantes entre os grupos (p < 0,01). Conclusão: Os achados sugerem, que embora a exposição à Chlamydia trachomatis tenha sido semelhante em ambos os grupos, a presença do alelo variante B do gene que codifica para a MBL aumenta o risco de desenvolvimento da obstrução tubária, subsequente à infecção pela CT ou outros agentes infecciosos. Nas mulheres brasileiras avaliadas a presença de tal polimorfismo genético aumentou a probabilidade de obstrução tubária em consequência de uma infecção do trato genital / Introduction: Chlamydia trachomatis (CT) is the cause of the most common bacterial sexually transmitted infection. In women, genital CT infection may cause cervicitis, urethritis, endometritis, salpingitis. Persistent or recurrent infections probably represent an important risk factor for the development of associated sequelae, such as chronic pelvic pain, ectopic pregnancy and tubal factor infertility. Mannose-binding lectin (MBL), a component of the innate immune system, has an important role in antimicrobial defense, recognizing viral, bacterial and fungal pathogens. The gene coding for MBL is polymorphic and a single nucleotide substitution results in production of an unstable protein, that is rapidly degraded. Objective: To evaluate whether Brazilian women with a polymorphism in the MBL gene present different susceptibilities to the occurrence of fallopian tube damage, in the presence or absence of a previous infection by CT. Method: In a case-control study, 75 patients with tubal obstruction and 75 patients with patent tubes were studied, all seen at the Gynecology Division of the Hospital das Clínicas of the University of São Paulo (HCFMUSP). IgG anti-CT antibodies were measured by enzyme-linked immunoassay to investigate a previous CT infection. For the polymorphism analysis, buccal cells were collected and the extracted DNA was analyzed by polymerase chain reaction (PCR), endonuclease digestion and gel electrophoresis using primer pairs specific for the polymorphic region. All material was maintained at -80 ° C and sent on dry ice to the Division of Immunology and Infectious Diseases at Weill Cornell Medicine in New York. Associations between MBL genotypes or alleles and tubal permeability were analyzed by the Pearson chi-square test with or without Yates correction. Results: There was no difference in CT antibody detection between the two groups. Women with obstructed tubes had a higher prevalence of being positive for the heterogenous genotype AB (36%) versus (16%) (p < 0.01). Similarly, the distribution of the normal A allele and variant B allele were also significant different between the two groups (p < 0,01). Conclusion: The findings suggest that while exposure to CT was similar in both groups of women the presence of the variant MBL B allele increases the risk for development of tubal obstruction, subsequent to a CT or other infection. In the Brazilian women evaluated possession of this genetic polymorphism increased the likelihood that blocked fallopian tubes will be a consequence of a genital tract infection