Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-03-28Bitstream added on 2014-06-13T18:41:06Z : No. of bitstreams: 1 moreno_fbmb_dr_sjrp.pdf: 4373891 bytes, checksum: f5d8f544b8871aeb85c60a9d3288cd99 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Esta tese tem como foco o estudo estrutural de uma lectina presente em sementes da espécie vegetal Lotus tetragonolobus (LTA). Inicialmente a LTA, previamente purificada, foi cristalizada. Os cristais foram obtidos a uma temperatura constante de 20ºC, durante 30 dias, utilizando a técnica de cristalização por difusão de vapor. Dois conjuntos de dados foram coletados a 2.00 e 2.35 Å de resolução, através da fonte de Raios X do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (Campinas – Brasil). Os cristais são monoclínicos e apresentam simetria do tipo P21, com parâmetros de cela de a=68.89, b=65.83 e c=102.53 Å. A substituição molecular foi feita utilizando-se o monômero da lectina presente na espécie Arachis Hypogae (Peanut). O homotetrâmero, produto da substituição, foi utilizado como ponto de partida para o refinamento cristalográfico. Diversos ciclos de refinamento por satisfação das restrições parciais foram feitos até a conversão total para valores satisfatórios de Rfree e Rfactor. A análise da estrutura revelou que a LTA possui uma forma tetramérica não identificada dentre outras lectinas de leguminosas. Sua estrutura é composta por dois dímeros, um deles semelhante ao dímero GS4 presente na lectina de Griffonia simplicifolia e outro que é único, caracterizado por ser um dímero do tipo LTA-dímero. Diversos fatores são responsáveis pela forma de tetramerização diferenciada da LTA, dentre os quais podemos destacar a influência da glicosilação no resíduo ASN4. Para investigarmos a estrutura da LTA em meio aquoso foi utilizada a técnica de espalhamento de Raios X a baixo ângulo (SAXS), que mostrou que a LTA possui a mesma forma tetramérica em solução da que foi observada no retículo cristalino... / The lectin, LTA, an agglutinin found in Lotus tetragonolobus seeds have been crystalized. Crystals grew at a temperature of 20º C during a month and were obtained using the vapor diffusion method. Two data sets were collected at 2.00 and 2.35 Å resolution using a sincrotron radiation source at Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (Campinas – Brasil). The LTA crystals are monoclinic belonging to the P21 space group with a=68.89, b=65.83 and c=102.53 Å. The Molecular replacement was performed using the Arachis Hypogae lectin monomer (Peanut) that yielded an homotetramer which was used to initiate the crystallographic refinement. Several steps of restrained refinement were performed to obtain the best values for Rfree and Rfactor. Structural analysis of the LTA showed that its tetramer adopts a new structural oligomerization in contrast of that observed for others legume lectins. Its structure contains two GS4-like dimers disposed in an unusual dimer-interface, named as LTA-dimer. Several properties are involved in the new mode of tetramerization adopted for LTA, which includes the glycosilation at ASN4. The LTA tetramer investigation at aqueous solution was perfomed by Small Angle XRay Scattering (SAXS), showing that LTA behaves as a tetramer in solution which corroborates with the crystalline structure. Our investigations suggest that the L-fucose binding sites of LTA are disposed in a conformation that permits to perform two dimensional type-2 cross-linking interaction with divalent L-fucosyloligosaccharides.

Made available in DSpace on 2015-05-14T12:59:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1655231 bytes, checksum: 254c31110cb1231f1b493b372fc7eb41 (MD5) Previous issue date: 2009-06-10 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Lectins constitute a class of glycoproteins which are capable of binding carbohydrates selectively and reversibly, distinguishing small structural differences in complex oligosaccharides. Some studies have shown that binding of lectins to carbohydrate surface of normal and tumor cells leads to various biological effects such as, cell proliferation in normal lymphocytes and apoptosis in tumor cells. This study investigated the assessment of cytotoxic lectins of legumes Canavalia ensiformis (ConA), Canavalia brasiliensis (Conbr) and Cratylia floribunda (CFL) in normal, mouse peritoneal macrophage, and tumor cells. Initially the cytotoxic activity of the lectins was evaluated by reduction of tetrazolium (MTT) salt assay and measured the content of nucleic acids (CAN). ConA, Conbr and CFL not decreased the viability of peritoneal macrophages, but showed to be cytotoxic for J774, MCF-7, Molt-4 and HL-60 lineages. The MTT assay was more sensitive to the effects of lectins on cell viability and ConA was the most cytotoxic, followed by Conbr and CFL. The IC50 values ranged from around 10, 20 and 45μg/mL at ConA, Conbr and CFL respectively. The genotoxic potential of lectins was also evaluated using the comet assay, showing that proteins had a high rate of lesions in DNA from MCF-7, Molt-4 and H-60 cells, reaching a damage frequency exceeding 70% in concentration of 50 μg/mL for all lectins. The lectins caused morphological changes as assessed by differential staining with ethidium bromide and acridine orange, characteristic of apoptosis, and necrosis can be observed in higher lectin concentrations in tumor cell lines. In tests that evaluated the apoptosis, ConA, Conbr and CFL caused internucleossomal fragmentation, loss of membrane integrity which is characteristic of late apoptosis or necrosis, and mitochondrial depolarization. It was concluded that ConA, Conbr and CFL exhibited cytotoxicity to tumor cells causing cell death by apoptosis, therefore these proteins can be considered as a class of molecules with antitumor potential. / Lectinas constituem uma classe de glicoproteínas que ligam-se reversivelmente e seletivamente à carboidratos, sendo capazes de distinguir pequenas diferenças estruturais em oligossacarídeos complexos. Estudos têm mostrado que a ligação de lectinas a carboidratos de superfície de células normais e tumorais provoca vários efeitos biológicos, tais como, proliferação celular em linfócitos normais e apoptose em células tumorais. Neste trabalho, foi investigado a citotoxicidade das lectinas de plantas Canavalia ensiformis (ConA), Canavalia brasiliensis (Conbr) e Cratylia floribunda (CFL), sobre linhagens de células normais e tumorais. Inicialmente, a atividade citotóxica das lectinas foi avaliada pelos ensaios de redução do sal de tetrazólio (MTT) e medida do conteúdo de ácidos nucléicos (CAN). As lectinas ConA, Conbr e CFL não diminuíram a viabilidade de células normais (macrófagos peritoneais), no entanto, mostraram-se citotóxicas para as linhagens tumorais J774, MCF-7, MOLT-4 e HL-60. O ensaio de MTT foi o mais sensível aos efeitos das lectinas sobre a viabilidade celular do que o ensaio de CAN, sendo ConA a lectina mais citotóxica, seguida de Conbr e CFL. Os valores de CI50 variaram em torno de 10, 20 e 45μg/mL, para ConA, Conbr e CFL repectivamente. O potencial genotóxico das lectinas também foi avaliado usando o teste do cometa, mostrando que essas proteínas produziram alto índice de lesões do DNA nas células MCF-7, MOLT-4 e HL-60, atingindo uma freqüência de danos superior a 70% na concentração de 50μg/mL para todas as lectinas. Nessas mesmas linhagens tumorais, as lectinas também causaram alterações morfológicas, avaliadas por coloração diferencial com brometo de etídeo e laranja de acridina, características de apoptose, sendo possível observar necrose nas concentrações mais elevadas. Nos ensaios que avaliaram apoptose, as lectinas ConA, Conbr e CFL causaram fragmentação internucleossomal e perda da integridade de membrana, nas maiores concentrações testadas e despolarização mitocondrial. Concluiu-se que as lectinas ConA, Conbr e CFL são citotóxicas para as células tumorais causando morte celular por apoptose, podendo ser consideradas como uma classe de moléculas com elevado potencial antitumoral.

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Determina el efecto de las lectinas hemaglutinantes de Lupinus mutabilis (tarwi) en la activación y expresión de citoquinas proinflamatorias en monocitos humanos infectados con Leishmania peruviana y Leishmania braziliensis. Se procedió a purificar las lectinas del extracto de semillas de L. mutabilis mediante dos métodos cromatográficos: exclusión molecular seguido de intercambio aniónico. Para el aislamiento de monocitos humanos de sangre periférica se diseñó y aplicó un método de separación seriada empleando dos polímeros de distintas densidades. El cultivo de monocitos fue tratado con diferentes dosis de fracción de lectinas hemaglutinantes (FrPG) obtenidas por cromatografía de exclusión molecular y lectina purificada (LP) obtenida por cromatografía de intercambio aniónico. Se evaluó la viabilidad celular, producción de anión superóxido y liberación de óxido nítrico. Las concentraciones óptimas de FrPG y LP fueron probadas en cultivos de monocitos humanos infectados con L. peruviana y L. braziliensis, en los que se evaluó la expresión de citoquinas proinflamatorias. Las concentraciones de 50, 75 µg/ml de FrPG y 20 µg/ml de LP produjeron el incremento significativo de la producción de anión superóxido en cultivo de monocitos no infectados. La producción de anión superóxido en monocitos previamente tratados e infectados con L. peruviana fue significativa con 75 µg/ml de FrPG y 20 µg/ml de LP, mientras que en monocitos infectados con L. braziliensis solo se presentó con 20 µg/ml de LP. No se produjo liberación de óxido nítrico en ninguna de las concentraciones de FrPG y LP en los cultivos de monocitos no infectados o infectados con las especies de Leishmania evaluadas. Se incrementó la expresión génica de mRNA para IL-1α y TNF-α solo en los cultivos de monocitos infectados con L. peruviana en presencia de LP a 20 µg/ml. Se concluye que el tratamiento con lectina purificada de tarwi induce la producción de anión superóxido en monocitos no infectados e infectados con L. peruviana y L. braziliensis y favorecen el incremento de la expresión de citoquinas proinflamatorias solo en monocitos infectados con L. peruviana. / Universidad Nacional Mayor de San Marcos (Lima). Vicerrectorado de Investigación y Posgrado / Tesis

Submitted by Raniere Barreto (raniere.barros@ufvjm.edu.br) on 2018-05-10T17:58:30Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) alcides_alves_freitas.pdf: 1707403 bytes, checksum: f9233629066db73fd877b2885aa875bd (MD5) / Approved for entry into archive by Rodrigo Martins Cruz (rodrigo.cruz@ufvjm.edu.br) on 2018-05-14T14:47:32Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) alcides_alves_freitas.pdf: 1707403 bytes, checksum: f9233629066db73fd877b2885aa875bd (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-14T14:47:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) alcides_alves_freitas.pdf: 1707403 bytes, checksum: f9233629066db73fd877b2885aa875bd (MD5) Previous issue date: 2017 / O boldo da terra (Plectranthus barbatus) ? popularmente utilizado para o tratamento de dist?rbios gastrintestinais e para doen?as hep?ticas. Devido ? exist?ncia de um grande n?mero de esp?cies dispon?veis para pesquisa e estudos farmacol?gicos, o estudo dessa planta torna-se importante para o conhecimento t?cnico-cient?fico, especialmente com a finalidade do desenvolvimento de novos f?rmacos. Com isto, o objetivo desse trabalho foi detectar prote?nas ativas de Plectranthus barbatus (boldo da terra) e avaliar a atividade biol?gica em c?lulas A549 e RAW264.7. As amostras dos procedimentos de extra??o das folhas e caule do P. barbatus foram submetidas ? quantifica??o de prote?na. Foi detectado em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 12% prote?nas com peso molecular em torno de 30kDa e 94kDa o que ? descrito na literatura como lectinas e lipoxigenases. Os extratos foram caracterizados por cromatografia l?quida de alta efici?ncia com picos aparentes em 16 e 27 minutos. N?o foi detectada atividade de inibi??o da tripsina. Os resultados dos testes biol?gicos em cultura de c?lulas demonstraram que o extrato purificado de inibidores de protease n?o alterou a viabilidade celular de ambas as linhagens, no entanto, foi capaz de inibir a produ??o de ?xido n?trico na concentra??o de 10 ?g/ml para folha e caule e 100 ?g/ml para folha. Este trabalho demonstra pela primeira vez a extra??o de prote?nas em folhas e caule de Plectranthus barbatus e a atividade dessa mol?cula em cultura celular. Esse extrato n?o alterou a viabilidade celular de ambas as linhagens celulares, podendo ser caracterizados como n?o citot?xico nas concentra??es testadas. Conclui-se, portanto, que embora as folhas, caules e flores do Plectranthus barbatus seja utilizado amplamente pela popula??o esse trabalho demonstrou a detec??o de lectina e lipoxigenase at? agora desconhecidos nessa esp?cie em estudo. / Disserta??o (Mestrado Profissional) ? Programa de P?s-Gradua??o em Tecnologia, Sa?de e Sociedade, Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, 2017. / The boldo da terra (Plectranthus barbatus) is popularly used for the treatment of gastrointestinal disorders and for liver diseases. Due to the existence of a large number of species available for research and pharmacological studies, the study of this plant becomes important for technical-scientific knowledge, especially for the purpose of developing new drugs. With this, the objective of this work was to detect active proteins of Plectranthus barbatus and to evaluate the biological activity in cells A549 and RAW264.7. Samples of P. barbatus leaf and stem extraction procedures were submitted to protein quantification. SDS-PAGE was detected in 12% proteins with molecular weight around 30kDa and 94kDa which is described in the literature as lectins and lipoxygenases. The extracts were characterized by high performance liquid chromatography with apparent peaks at 16 and 27 minutes. No trypsin inhibition activity was detected. The results of the biological tests in cell culture demonstrated that the purified protease inhibitor extract did not alter the cell viability of both strains, however, it was able to inhibit the production of 10 ?g / ml nitric oxide to leaf and And 100 ?g / ml for leaf. This work demonstrates for the first time the extraction of proteins in leaves and stem of Plectranthus barbatus and the activity of this molecule in cell culture. This extract did not alter the cellular viability of both cell lines and could be characterized as non-cytotoxic at the concentrations tested. It was concluded, therefore, that although the leaves, stems and flowers of Plectranthus barbatus were used extensively by the population, this work demonstrated the detection of lectin and lipoxygenase hitherto unknown in this species under study.

Dissertação (mestrado) - Pontifícia Universidade Católica do Paraná, Curitiba, 2010 / Bibliografia: f.32-43 / A lectina purificada do veneno de Bothrops jararacussu (BJcuL) é específica para ligação com D-galactose e foi descrita como inibidora da proliferação de carcinoma renal e pancreático humano, bem como da proliferação de glioma e células endoteliais. O pre / The lectin extracted from Bothrops jararacussu (BJcuL) is specific for D-galactosides. It was described as an inhibitor of human pancreatic carcinoma proliferation as well as for glioma and endothelial cells. This study aimed to evaluate the in vitro effe

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2016-03-04T18:04:54Z No. of bitstreams: 1 Alana Alves Farias Análise da marcação...2015.pdf: 1042656 bytes, checksum: 8c570ad74d5f6150c8fb9527f324b2d4 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2016-03-04T18:05:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Alana Alves Farias Análise da marcação...2015.pdf: 1042656 bytes, checksum: 8c570ad74d5f6150c8fb9527f324b2d4 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-04T18:05:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alana Alves Farias Análise da marcação...2015.pdf: 1042656 bytes, checksum: 8c570ad74d5f6150c8fb9527f324b2d4 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz, Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / ntrodução e objetivos: O glioblastoma multiforme é um glioma de alto grau que apresenta um prognóstico ruim. O diagnóstico definitivo é estabelecido pela avaliação histológica, porém este pode apresentar conflitos na classificação, com isso surge à necessidade de ferramentas que auxiliem o patologista em sua análise. Atualmente, maior ênfase tem sido dada a alterações na glicosilação, pois estão associadas a neoplasias, e a descoberta da capacidade de lectinas em reconhecer tais alterações fez destas, ferramentas aplicáveis para o diagnóstico biomédico. Dessa forma, o objetivo deste trabalho é analisar a marcação das lectinas CpL, WGA e Con A em células da linhagem C6 e astrócitos. Métodos: As células foram cultivadas em condições estéreis, a 37ºC em atmosfera com 5 % de CO2 até atingirem confluência. Em seguida, foram lavadas com PBS e marcadas com as lectinas CpL, WGA e Con A numa concentração de 1 mg/ml, o controle negativo foi obtido com adição do carboidrato inibidor das lectinas (D-galactose, β-N-acetilglucosamina e glicose), respectivamente, numa concentração de 0,1 M. A incubação se deu por uma hora com proteção da luz, a análise foi realizada em microscópio de fluorescência. Para a quantificação em citometria de fluxo, as células foram marcadas obedecendo ao mesmo protocolo anterior, com exceção do tempo de incubação que se deu por 15 minutos. Posteriormente, as células foram lavadas, centrifugadas, transferidas para tubos e ressuspensas em PBS para a realização da leitura em citômetro. Resultados: A lectina CpL apresentou melhor marcação para os astrócitos, porém, ainda assim, mostra baixo desempenho comparado com as demais lectinas. Já a lectina WGA apresentou marcação eficiente tanto para astrócitos quanto para as células C6, esta última apresentou o dobro de emissão. Desta forma, é possível inferir que as lectinas CpL e WGA não são capazes de reconhecer diferenças importantes no perfil de glicoconjugados nas membranas das células C6 e dos astrócitos. Entretanto, a lectina Con A revelou marcação eficiente em relação às células C6 capaz de definir a forma celular, mostrando que há uma distribuição quase uniforme destes carboidratos ao longo da superfície da membrana, e ainda exibiu mediana de fluorescência cerca de 99 vezes superior em relação aos astrócitos. Assim, a Con A mostrou ser um marcador capaz de diferenciar as células da linhagem de glioma murino das células de cultura primária. Conclusão: Com base nestes resultados podemos inferir que a lectina Con A pode auxiliar numa identificação mais eficiente com possibilidade de um diagnóstico mais seguro. / Introduction and objectives: Glioblastoma multiforme is a high-grade glioma that has a poor prognosis. The definitive diagnosis is established by histological assessment. However, this can present conflicts in grading gliomas, which justifies new tools to assist the pathologist in his analysis. Currently, it is known that there are changes in glycosylation pattern of molecules associated with cancer, and the discovery of the ability of lectins to recognize these changes made these tools applicable for biomedical diagnosis. Thus, the aim of this study is to analyze the labelling of C6 and astrocyte lineage cells with fluorescent lectins CpL, WGA and Con A. Methods: The cells were cultured under sterile conditions at 37°C in an atmosphere with 5% CO2 until they reached confluence. They were then washed with PBS and labeled with CpL, WGA, or Con A lectins in a concentration of 1 mg/ml. Negative controls were incubated with the carbohydrate that competitively inhibits the reaction (D-galactose, β-N-acetylglucosamine and glucose, respectively), at a concentration of 0.1 M. The incubation occurred for one hour with protection from the light, the analysis was performed on a fluorescence microscope. For flow cytometry quantitation, cells were labeled following the same previous protocol, except that the incubation time was 15 minutes. Subsequently, the cells were washed, centrifuged, transferred to tubes and resuspended in PBS to carry out the reading on a cytometer. Results: The CpL lectin better labeled astrocytes. However, it showed a poor performance compared to other lectins. On the other hand, the WGA lectin efficiently marked both astrocytes and C6 cells; the latter presented the double emission compared to the former. Thus, it is possible to infer that the CpL and WGA lectins are not able to recognize important differences in the glycosylation profile in the membranes of C6 cells and astrocytes. However, the lectin Con A efficiently marked C6 cells, defining their morphology and showing that there is a nearly uniform distribution of glucose along the surface of the membrane, which was not observed in astrocytes. This also exhibited a median fluorescence about 99 times greater than that obtained for astrocytes. Thus, Con A showed to be a marker capable of differentiate cells of murine glioma lineage from primary astrocytes. Conclusion: Based on these results we can infer that the Con A lectin may be a tool for a more efficient identification of glioma cells in histopathological analysis.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissFAHB.pdf: 1628733 bytes, checksum: fd3eaf59b3ea3ad27f519f1d97d21f33 (MD5) Previous issue date: 2007-11-01 / Financiadora de Estudos e Projetos / Lectins are (glico) proteins of non immune origin able to cause cellular agglutination or precipitation of glicoconjugates. Legume lectin refers to plant lectins that are found exclusively in species of the Leguminosae family. A notable characteristic of legume lectins is that all their proteins share tertiary structure consisting of a jelly-roll motif, which is basically composed by β sheet, but present great variability the quaternary association. This variability is considered responsible for conferring different degrees of stability to the legume lectins. This work presents the isolation and characterization of the camptosemin, a protein of legume lectins family, isolated from seeds of Camptosema ellipticum, a plant that belongs to the Brazilian open pasture. Camptosemin found to be a tetrameric protein, whose protomers exhibits approximately 26 kDa. It was able to agglutinate erythrocyte of all ABO sanguineous types and it was showed high affinity for N-acetylgalactosamin carbohydrate. Spectroscopic assays have demonstrated that camptosemin is an extremely resistant protein against the thermal and chemical unfolding. Through the analysis of the unfolding curves and the refolding assays, a model of two states for the unfolding of the protein was proposed. According to this model, at the equilibrium, only presents native tetramers and unfolded monomers. The obtained values of Tm and are in agreement with the ones described for other lectins. G O H Δ 2 / Lectinas são (glico)proteínas de origem não imune capazes de causar aglutinação celular e/ou precipitação de glicoconjugados. O termo lectina de legume refere-se às lectinas de plantas que são encontradas exclusivamente em exemplares da família Leguminosae. Uma característica notável das lectinas de legumes é que todas as proteínas compartilham estrutura terciária constituída pelo motivo jelly-roll , que é basicamente composto por folhas-β, mas apresentam grande variabilidade nas formas de associação quaternária. Acredita-se que esta variabilidade seja responsável por conferir diferentes graus de estabilidade a estas lectinas. Este trabalho descreve o isolamento e a caracterização da camptosemina, uma proteína da família das lectinas de leguminosas, isolada a partir de sementes de Camptosema ellipticum, uma planta pertencente ao cerrado brasileiro. Camptosemina mostrou-se como uma proteína tetramérica, cujos protômeros apresentam aproximadamente 26 kDa, capaz de hemoaglutinar todos os tipos sanguíneos do sistema ABO e com afinidade de ligação ao carboidrato N-acetilgalactosamina. Ensaios de estabilidade estrutural utilizando técnicas espectroscópicas demonstraram que camptosemina é uma proteína extremamente resistente a desnaturação térmica e química. Através da análise das curvas de desnaturação e dos ensaios de reenovelamento, foi proposto um modelo de dois estados para o processo de desnaturação da proteína, no qual, durante o equilíbrio, só existem tetrâmeros completamente enovelados e monômeros completamente desnaturados. Os valores de Tm e obtidos estão em conformidade com os de outras lectinas, encontrados na literatura. G O H Δ 2

Orientadora : Profª. Drª. Iara José de Messias-Reason / Co-orientadora : Profª. Drª. Angelica B. Winter Boldt / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa: Curitiba, 23/02/2015 / Inclui referências / Área de concentração: Análises clínicas / Resumo: A hanseníase é causada pelo patógeno intracelular obrigatório Mycobacterium leprae, que infecta principalmente macrófagos e células Schwann do hospedeiro. A lectina ligante de manose (MBL) e as ficolinas (FCNs) reconhecem padrões de açúcares e resíduos acetilados (PAMP), respectivamente, em uma ampla variedade de patógenos, incluindo o M. leprae. Este reconhecimento desencadeia a transativação das serina-proteases 1 e 2, associadas a MBL (MASP-1 e MASP-2), e em seguida, a ativação da via das lectinas do sistema complemento. O gene MASP1 apresenta diversos polimorfismos que estão associados à modulação das concentrações de MASP-1 e de mais duas outras proteínas, resultantes de processamento alternativo do pré-mRNA: MASP-3 e a forma não-enzimática MAp44, ambas envolvidas na regulação negativa do sistema complemento, através da competição pelos sítios de ligação aos PAMP nas moléculas de reconhecimento. Neste estudo, avaliamos possível associação entre polimorfismos do gene MASP1 e concentrações séricas de MASP-1, MASP-3 e MAp44 em 389 indivíduos da população brasileira e 210 da dinamarqueses (segundo grupo controle), assim como com a susceptibilidade à hanseníase em 196 pacientes e 193 controles do Sul do Brasil. As amostras foram genotipadas por PCR sequência-específica multiplex para g.8113G>A (rs7609662) e g.8795C>T (rs13064994), localizados no intron 01, e g.61897C>G (rs72549262), g.62223C>T (rs1109452) e g.62224G>A (rs850314), localizados no exon 12 do gene MASP1. Os níveis séricos das proteínas foram quantificados com ensaio imunofluorimétrico cronometrado (TRIFMA). Pacientes com hanseníase apresentaram concentrações séricas de MASP-3 e MAp44 menores do que controles (medianas: 4603 ng/ml vs. 5606 ng/ml para MASP-3, p<0.005; 1732 vs. 2350 ng/ml para MAp44, p<0.0001). Pacientes com a forma lepromatosa de hanseníase também apresentaram concentrações reduzidas de MASP-3 e MAp44, quando comparados a não-lepromatosos (P=0,0016 e P<0,0001). Houve também uma associação entre a presença do alelo T para o SNP rs1109452 e níveis séricos elevados de MASP-1 e diminuídos de MASP-3 nos três diferentes grupos analisados. O haplótipo GC CCG se associou com a susceptibilidade à hanseníase (P=0,028, OR=1,43 [IC95%=1,04-1,94]). O haplótipo do exon 12 apresentou associação com os níveis de MASP-3 em controles (P=0,012) e no grupo comparação (P=0,0006), e os genótipos destas variantes também apresentaram associação com níveis de MAp44 em pacientes (P=0,023), e com os níveis de MASP-3 nos controles (P=0,024) e no grupo de dinamarqueses (P<0,0001). Concentrações baixas de MAp44 e MASP-3 em pacientes com hanseníase podem ser decorrentes de polimorfismos no gene MASP1. Este efeito pode estar aliado a possível consumo das proteínas no processo da doença e/ou baixa produção das mesmas nesses indivíduos. Palavras-chave: MASP1, MASP-3, MAp44, serina protease associada a MBL, complemento, via das lectinas, hanseníase. / Abstract: Leprosy is caused by the obligate intracellular pathogen Mycobacterium leprae, which infects mainly macrophages and Schwann cells of the host. The mannose-binding lectin (MBL) and Ficolins (FCNs) recognize sugar patterns and acetylated molecules (PAMP) respectively in a wide range of pathogens including M. leprae. This recognition triggers the transactivation of mannan-binding lectin serine protease 1 and 2 (MASP-1 e MASP-2) followed by the activation of complement system lectin pathway. MASP1 gene presents several polymorphisms associated to the modulation of MASP-1 concentration as well as two other proteins resulting from alternative processing of pre-mRNA: MASP-3 and the non-enzimatic MAp44, both involved in the down-regulation of complement system by competing for PAMP binding sites at the recognition molecules. Here, we aimed to assess possible associations between MASP1 gene polymorphisms and the serum levels of MASP-1, MASP-3 and MAp44 in 389 individuals from Brazil and 210 from Denmark (second control group), as well as with susceptibility to Leprosy in 196 patients and 193 control subjects from South Brazil. Samples were genotyped by multiplex sequence-specific PCR for g.8113G>A (rs7609662) and g.8795C>T (rs13064994) located in intron 01 and g.61897C>G (rs72549262), g.62223C>T (rs1109452) and g.62224G>A (rs850314) located in exon 12 of MASP1 gene. Protein serum levels were quantified by time-resolved immunofluorometric assays (TRIFMA). Leprosy patients presented lower MASP-3 and MAp44 serum levels (median: 4603 ng/ml vs. 5606 ng/ml for MASP-3, p<0.005; 1732 vs. 2350 ng/ml for MAp44, p<0.0001). Patients presenting the lepromatous clinical form of Leprosy also showed lower MASP-3 and MAp44 serum levels when compared to non-lepromatous patients (P=0.0016 and P<0.0001). There was an association between the T allele of rs1109452 with higher MASP-1 and lower MASP-3 serum levels in all three groups. The GC CCG haplotype was related to susceptibility to Leprosy (P=0.028, OR=1.43 [CI95%=1.04-1.94]). The exon 12 haplotype distribution is associated to MASP-3 levels in controls (P=0.012) and Danish (P=0.0006), and the genotypes of this variants, also revealed an association with MAp44 levels in patients (P=0.023), with MASP-3 levels in controls (P=0.024) and MASP-3 levels in the Danish cohort group (P<0,0001). Low MASP-3 and MAp44 serum levels in leprosy may be conferred by haplotypes/genotypes of MASP1 gene in addition to possible protein consumption and/or low production in leprosy patients. Key-words: MASP1, MASP-3, MAp44, MBL-associated serine-protease, complement, lectin pathway, leprosy.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-25Bitstream added on 2014-06-13T20:29:48Z : No. of bitstreams: 1 pesquero_nc_me_araiq.pdf: 1328191 bytes, checksum: b43c0dd0e4c51db5570dd9acd342760e (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / No presente trabalho foi avaliada a equivalência entre as formas nativa e recombinante da lectina Artin M utilizando como ligante a peroxidase de raiz forte (HRP) por meio da técnica de microbalança a cristal de quartzo. Para tal foi preparado um biossensor por meio da imobilização da lectina, tanto nativa como recombinante, na superfície do cristal de quartzo piezelétrico. A imobilização das lectinas foi realizada por meio da construção de uma monocamada auto organizada utilizando dois alcanotióis, ácido 11-mercaptoundecanóico e o 2-mercaptoetanol. Para o acoplamento das proteínas foram utilizados N-etil-N- (dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) e N-hidoxisuccinimida (NHS) que formam com os grupamentos carboxílicos um intermediário reativo. Após a preparação do biossensor foi utilizado um sistema de injeção em fluxo acoplado à microbalança de cristal a quartzo para o estudo da interação lectina-glicoconjugado. Desta forma, as interações da Artin M nativa e recombinante com a glicoproteína peroxidase de raiz forte foram estudadas por meio da determinação das suas constantes de afinidade aparente e de associação cinética, sendo que foram encontrados os valores de constante de afinidade aparente (4,6 ± 0,9) x 103 e (2,6 ± 0,5) x 103 L mol -1 para as interações jArtinM-HRP e rArtinM-HRP, e os valores de constante cinética (7 ± 3) x 103 e (7 ± 2) x 103 L mol -1 para as interações jArtinM-HRP e rArtinM-HRP. Os valores das constantes de interação obtidos evidenciaram a equivalência entre ambas as formas da lectina Artin M. Neste trabalho também foi determinada a constante de associação cinética da interação entre a lectina Artin M recombinante e linhagens celulares de leucemia mielóide aguda humana (NB4, K562 e U937), no intuito de melhor entender a diferença na citotoxicidade observada da Artin M sobre estas células... / In the present work was evaluated the equivalence between the native and recombinant forms of Artin M using horseradish peroxidase as ligand by means the quartz crystal microbalance technique. In this way, a biosensor was prepared immobilizing the lectin, native and recombinant forms, on piezoelectric quartz crystal surface. Lectins immobilization was realized constructing self assembled monolayers using the alkanethiols 11-mercaptoundecanoic acid and 2-mercaptoethanol. To the binding of proteins was used N-ethyl-N-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS), which form with carboxylic groups a reactive intermediary. After biosensor preparation was utilized a flow injection system coupled to quartz crystal microbalance to study the lectin-glycoconjugated interaction. Thus the native Artin M and recombinant Artin M interaction with horseradish peroxidase glycoprotein were studied by determining its apparent affinity constant and association kinetic constants. The values obtained to apparent affinity constant were (4,6 ± 0,9) x 103 e (2,6 ± 0,5) x 103 L mol -1 to jArtinM-HRP e rArtinM-HRP interactions, and the values obtained to association kinetic constant were (7 ± 3) x 103 e (7 ± 2) x 103 L mol -1 to jArtinM-HRP e rArtinM-HRP interactions. These constant values evidence the equivalence between native and recombinant forms of Artin M lectin. During this work were also determined the association kinetic constant of the interaction between recombinant Artin M and leukemic lineages from human acute myeloid leukemia (NB4, K562 and U937), with the purpose of a better understanding in the different cytotoxic effect of Artin M on these cells. In this way the values of association kinetic constant obtained was (0,3 ± 0,1) x 10-7 , (0,9 ± 0,1) x 10-7 e (2,7 ± 0,3) x 10-7 mL cel -1 to the interactions between Artin M and NB4, K562 and U937, respectively

Submitted by FABIANA DA SILVA FRANÇA (fabiana21franca@gmail.com) on 2017-11-09T15:00:32Z No. of bitstreams: 2 arquivototal.pdf: 1702586 bytes, checksum: 5715389a3db42245325c62c222830c1c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-09T15:00:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivototal.pdf: 1702586 bytes, checksum: 5715389a3db42245325c62c222830c1c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-11-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Cancer is one of the biggest public health problems in the world, being the second cause of death worldwide. The search for new compounds that selectively promote cancer cells death is becoming a constant, as a strategy in the treatment of the disease. Lectins are a class of glycoproteins that recognize and bind specifically to carbohydrate clusters expressed on the plasma membrane. Carbon nanotubes have been gaining considerable attention because they are promising nanocarriers, enabling the conjugation of several molecules on their surface, improving drug delivery and specific cell recognition. In the present work, the cytotoxic activity of Concanavalin A and CFL lectins on chronic monocytic (K562) and acute monocytic (THP-1) promyelocytic leukemia cells was investigated. To evaluate cell viabillity, the MTT salt reduction was used, which show the metabolic ability of the cell to convert that salt to crystals. It was observed that lectins reduces the viability of the two tested cells lines. However, this cytotoxic effect was observed only after 72 hours of treatment. The lectins were also cytotoxic to non-cancerous HUVEC endothelial cells, but this response may have been due to the fact that these cells have several glycoconjugates expressed in their membrane. Using the trypam blue dye, which marks only cells with broken membranes, then unviable cells, it was also observed that the lectin-nanotube conjugate had no significant activity compare to that demonstrated by the lectin alone, suggesting that the nanotubes do not seem to improve the effect of the lectins. Investigating which way of death these lectins were activating by flow cytometer assays, it was observed that the cells demonstrate positive labeling for propidium iodide, indicating that the treatment of 72 hours caused damage to the cell membrane. However, using the tetramethylrhodamine methyl ester probe, it was seen that treatment with the lectins caused mitochondrial depolarization on K562 and THP-1 cells, a factor related to apoptosis. In addition, CFL lectin caused cell cycle arrest of THP-1 cells, promoting accumulation of cells in the G0/G1 phase. Thus, it was concluded that Concanavalin A and CFL lectins demonstrate a cytotoxic effect on leukemic cells, possibly through the induction of cell death by apoptosis in cells, due to the depolarization of the mitochondrial membrane, possibly blocking the expression of cyclins and CDKs, promoting cell cycle arrest in THP-1 cells. In K562, treatment with CFL for 72 hours may be activating some extrinsic pathway of apoptosis by membrane receptor, leading to depolarization of the mitochondria and consequently releasing apoptogenic factors, but without promoting cell cycle arrest. In this way, the lectins studied demonstrate an interesting antileukemic potential. / O câncer representa um dos maiores problemas de saúde pública mundial, sendo a segunda causa de morte em todo o mundo. A busca por novos compostos que promovam a morte seletiva de células cancerígenas vem se tornando constante, como uma estratégia no tratamento da doença. As lectinas constituem uma classe de glicoproteínas que reconhecem e se ligam especificamente à grupamentos de carboidratos expressos na membrana plasmática. Os nanotubos de carbono vêm ganhando bastante atenção por serem nanocarreadores promissores, possibilitando a conjugação de diversas moléculas em sua superfície e aumentando a eficácia no transporte e a especificidade no reconhecimento celular. No presente trabalho, foi investigada a atividade citotóxica das lectinas Concanavalina A e CFL sobre linhagens de células de leucemia promielocítica crônica (K562) e monocítica aguda (THP-1). Para avaliar a viabilidade celular, foi utilizando o ensaio de redução do sal de MTT, o qual avalia a capacidade metabólica da célula converter esse sal em cristais, foi observado um efeito citotóxico das lectinas nas duas linhagens testadas. Entretanto, só foi observada diminuição da viabilidade apenas após 72 horas de tratamento com as lectinas. As lectinas também foram citotóxicos às células endoteliais HUVEC, não cancerígenas, porém essa resposta pode ter se dado pelo fato de essas células apresentarem diversos glicoconjugados na sua membrana. Foi também observado, por meio do teste de incorporação do corante azul de tripam, o qual marca apenas em células com membrana rompida, que o conjugado lectina-nanotubo não apresentou atividade diferente da demonstrada pela lectina sozinha frente as linhagens celulares, sugerindo que os nanotubos parecem não melhorar o efeito das lectinas estudadas. Investigando qual a via de morte ativada pelas lectinas por meio de ensaios de citometia de fluxo, foi observado que as células marcaram positivamente para o iodeto de propídeo, indicando que o tratamento de 72 horas causou danos à membrana celular. Entretanto, utilizando a sonda tetrametilrodamina metil-éster, foi visto que o tratamento com as lectinas causou a despolarização da membrana mitocondrial das células K562 e THP-1, fator relacionado à apoptose. Além disso, a lectina CFL causou a parada do ciclo celular de células THP-1, promovendo um acúmulo de células na fase G0/G1. Dessa forma, concluiu-se que as lectinas Concanavalina A e CFL demonstram efeito citotóxico às células leucêmicas, possivelmente pela indução da morte celular por apoptose nas células, devido a despolarização da membrana mitocondrial, possivelmente bloqueando a expressão de ciclinas e CDKs, promovendo parada no ciclo celular de células THP-1. Já em células K562, o tratamento com a CFL por 72 horas pode estar ativando alguma via extrínseca de apoptose por receptor de membrana, levando a despolarização da mitocôndria e consequentemente liberando fatores apoptogênicos, mas sem promover parada no ciclo celular. Desta forma, as lectinas estudadas demonstram um interessante potencial antileucêmico.