Les cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) projettent dans le corps genouillé latéral dorsal (CGLd) et le colliculus supérieur (CS). Initialement, les projections établissent des connexions imprécises avec les cibles puis elles se raffinent grâce à des mécanismes activité-dépendant. D’abord, j’ai cherché à déterminer la contribution de la libération synaptique dans le raffinement des cartes visuelles en utilisant un modèle où Rim 1 et 2, protéines essentielles à la libération synaptique calcium-dépendante, sont délétées dans les CGRs. J’ai montré que la libération synaptique était nécessaire à la ségrégation œil spécifique dans le CGLd mais pas dans le CS, qu’elle était impliquée dans le raffinement de la topographie de la projection ipsilatérale mais qu’elle n’était pas impliquée dans la rétinotopie des projections controlatérales dans le CS. Ensuite, j’ai cherché à identifier un microdomaine de signalisation AMPc au niveau des cônes de croissance impliqué dans le raffinement des projections rétiniennes. La compartimentation spatiale des signaux AMPc pourrait expliquer qu’ils soient capables de réguler des voies de signalisation distinctes de façon spécifique. J’ai montré que la perturbation des signaux AMPc dans les radeaux lipidiques entraine des défauts de raffinement des projections dans le CS tandis que leur perturbation à la membrane mais en dehors des radeaux lipidiques n’entraine pas de défauts. J’ai aussi montré que la perturbation de la signalisation AMPc dans une petite fraction de CGRs d’un œil suffit à perturber largement la carte œil spécifique, suggérant une coopération entre les projections nécessaire à leur raffinement. / Retinal ganglion cells (RGCs) project to the dorsal lateral geniculate nucleus (dLGN) and to the superior colliculus (SC). Initially, retinal projections establish imprecise connections with the target cells then refine through activity-dependent mechanisms.First, I studied the role of synaptic release in the visual maps refinement, using a mouse model where Rim 1 and 2, which are proteins important for calcium-dependent synaptic release, are deleted in the RGCs. I found that synaptic release is important for eye specific segregation in the dLGN but not in the SC, that it is involved in the refinement of the ipsilateral projection topography but that it is not involved in the contralateral projection retinotopy in the SC.Second, I identified a microdomain of cAMP signaling in growth cones involved in the refinement of retinal projections. The spatial compartmentation of cAMP signals could explain the fact that cAMP signals are able to regulate specifically different signaling pathways. I found that cAMP signals perturbation within the lipid rafts of the RGCs induces defects in the refinement of retinal projections in the SC while their perturbation at the membrane level but outside the lipid rafts does not induce defects.I also showed that cAMP signaling perturbation only in a fraction of RGCs in one eye is sufficient to extensively disturb the eye specific map, suggesting that a cooperation between the projections is necessary for their refinement.

La libération conditionnelle totale est une mesure d’aménagement de la peine d’incarcération que les commissaires accordent à certains détenus incarcérés dans les prisons fédérales ou provinciales canadiennes. Cette mesure leur donne la possibilité de purger le reste de leur peine en collectivité sous certaines conditions. Cependant, peu d’auteurs se sont intéressés aux critères pris en compte par les commissaires, lorsqu’ils décident d’octroyer ou de refuser ce type de libération anticipée aux détenus. À fortiori, des études francophones axées sur les décisions que les commissaires ont accordées aux détenus. Pour tenter de combler cette lacune, j’ai entrepris ce projet de recherche qui porte uniquement sur les décisions des commissaires qui siègent à la Commission des libérations conditionnelles du Canada. Mon objectif était de comprendre la façon dont les commissaires motivent leur décision d’accorder la libération conditionnelle totale aux détenus, eu égard aux exigences légales. Ces exigences légales sont liées au fait que les commissaires n’accordent la libération conditionnelle que s’ils sont d’avis que le risque de récidive que présente le détenu est acceptable en société, et que l’octroi de cette libération conditionnelle contribuera à la protection de celle-ci, en favorisant sa réinsertion sociale en tant que citoyen respectueux des lois. Pour y arriver, ma question de recherche était la suivante : comment les commissaires justifient-ils que leur décision d’octroyer la libération conditionnelle totale au détenu est conforme aux exigences légales ? Dans ma recherche, j’ai analysé 100 rapports provenant du registre des décisions de la Commission. Dans ces rapports, les commissaires ont accordé la libération conditionnelle totale à des détenus purgeant des peines de ressort fédéral sur une période d’une année (2017-2018), dans la province du Québec. Les résultats de l’analyse thématique de ces rapports révèlent que les commissaires mettent l’accent sur trois critères principaux. D’abord, les commissaires interprètent positivement les rapports et recommandations favorables que les intervenants, ayant interagi avec le détenu pendant sa période d’incarcération, leur fournissent. Ensuite, les changements positifs que le détenu a opérés avant et pendant sa période d’incarcération sont interprétés par les commissaires comme une démonstration de sa volonté de ne pas récidiver. Le détenu capable de prouver aux commissaires qu’il a effectué des changements observables et mesurables lors de son parcours carcéral est celui à qui ce type de libération anticipée est octroyée. Enfin, le soutien positif des proches du détenu est considéré comme un facteur de protection supplémentaire pour les commissaires. Toutes ces dimensions sont les critères sur lesquels les commissaires se basent pour justifier que leur décision d’accorder la libération conditionnelle totale au détenu est conforme aux exigences légales.

Les aérogels sont des matériaux nano-structurés ultralégers, hautement poreux et présentant une surface spécifique élevée. Les bio-aérogels sont une nouvelle génération d'aérogels entièrement bio-sourcés, offrant de ce fait de grands potentiels pour des applications à l’interface avec le vivant tout en valorisant la biomasse. Dans le cadre de cette thèse, la pectine a été utilisée pour produire des bio-aérogels. Deux principaux objectifs ont été atteints : • Le premier était de déterminer et de maîtriser les corrélations existantes entre les caractéristiques de la pectine et les conditions de préparation d’une part, avec la structure interne de l'aérogel et ses propriétés physico-chimiques d’autre part. • Le second était d’évaluer et développer les aérogels de pectine pour deux applications distinctes : l'isolation thermique et la libération de médicaments. Il a été établi que les différents mécanismes de formation du réseau, la gélification et la séparation de phase, jouaient un rôle majeur sur la morphologie et les propriétés finales de l'aérogel. La conductivité thermique des aérogels de pectine s'est révélée très faible, de l'ordre de 0,015 à 0,020 W/(m.K), et a présenté une courbe de dépendance en forme de U avec leurs densités. Les aérogels ont également été utilisés en tant que matrices supports de médicament. Les cinétiques de libération du médicament en milieu liquide ont été corrélées aux structures et densités des aérogels de pectine. Des aérogels composites, de type cellulose-pectine et silice-pectine, ont été préparés et utilisés comme supports de médicament menant à une libération prolongée du principe actif dans le temps. Dans cette thèse, nous avons mis en évidence le potentiel élevé des aérogels de pectine utilisés en tant que biomatériaux avancés, versatiles et aux fonctionnalités ajustables. / Aerogels are ultra-light, highly porous and nano-structured materials with high specific surface area. Bio-aerogels are a new generation of aerogels that are fully biomass-based, which opens up a lot of potentials in biomass valorization and life science applications. In this work pectin was used to produce bio- aerogels. Two main objectives were achieved : • The first was to understand and correlate the characteristics of pectin and the preparation conditions with the internal structure of aerogel and its physico-chemical properties. • The second was to evaluate and develop pectin aerogels as advanced bio-materials for the two different applications : thermal insulation and drug delivery. Various mechanisms of network formation, gelation and non-solvent induced phase separation, were demonstrated to play a very important role in aerogel morphology and properties. Thermal conductivity of pectin aerogels was very low, around 0.015 - 0.020 W/(m.K), and showing U-shape dependence on density. When used as drug delivery matrices, the kinetics of drug release was correlated with pectin aerogels’ structure and density. Composite cellulose-pectin and silica-pectin aerogels were synthesized and also used as drug carriers; a prolonged release was recorded. A high potential of pectin aerogels to be used as versatile bio-materials with advanced tunable functionalities was demonstrated.

La frequence elevee et les consequences considerables des maladies parodontales sur la qualite de vie orale et la sante generale font de ces pathologies une preoccupation de sante publique. Le developpement de traitements innovants est un moteur essentiel du progres dans la prise en charge de ces maladies. Ce travail s’interesse a l’utilisation d’agents antimicrobiens (non-antibiotiques) et anti-inflammatoires comme adjuvants au debridement mecanique des poches parodontales. Il est consacre a la mise au point et a l’optimisation d’une forme galenique appelee implant forme in-situ (IFIS), a base de polymeres biocompatibles et resorbables, concue pour le traitement des poches parodontales. Ce dispositif est injecte dans la lesion ou il libere de facon prolongee une combinaison d’antiseptique (chlorhexidine) et d’anti-inflammatoire (ibuprofene). Nos resultats montrent (i) in-vitro la superiorite de l’IFIS en termes de proprietes mecaniques et antimicrobiennes sur des systemes actuellement commercialises pour le meme usage et (ii) in-vivo, chez l’animal, un effet positif de l’IFIS sur la cicatrisation parodontale. Cette etude valide l’usage d’IFIS a base d’acide Poly(D,L-lactique-co-glycolique) (PLGA) comme support de liberation controlee de principes actifs dans la poche parodontale. Elle montre egalement que la combinaison d’un antiseptique et d’un anti-inflammatoire au sein du meme systeme de liberation locale pourrait ameliorer le traitement des parodontites tout en limitant le recours aux antibiotiques. / Periodontal diseases are highly prevalent oral conditions which strongly impact the oral quality of life and general health. Progress in the management of periodontal diseases depends, at least partly, on the development of novative and effective periodontal treatments. This work is concerned with the use of non-antibiotic antimicrobials and antiinflammatory drugs as adjunctive periodontal therapy. The aim was to develop a novel polymer-based, biocompatible and resorbable local drug delivery system (in-situ forming implants -ISFI-), which could be injected into periodontal pockets and control the delivery of both an antiseptic (chlorhexidine) and an anti-inflammatory agent (Ibuprofen). The physical key properties and antimicrobial activity of the proposed implants were very promising in vitro suggesting an improvement as compared to currently marketed drug delivery systems for periodontitis treatment. In vivo results are consistent with the latters, showing a positive effect of ISFI on periodontal wound healing in an experimental mice model of periodontitis. Data from this study support Poly(D,L-lactic-co-glycolic) acid (PLGA) as an attractive formulation for local drug-delivery into periodontal pockets. Our results further suggest that the local delivery of both an antiseptic and an anti-inflammatory drug is a promising adjunctive treatment of periodontitis. This should additionnaly reduce the use of systemic antibiotics in periodontal treatment and contribute to the combat against the development of bacterial resistances.

Les polymères à empreintes moléculaires (MIP) sont des matériaux synthétiques capables de mimer les anticorps biologiques. En effet, ils possèdent deux des principales caractéristiques de ces derniers, à savoir : la capacité de reconnaître et de se lier spécifiquement à des molécules cibles. De plus, leur synthèse facile, leur bas coût de production, leur haute spécificité et stabilité par rapport aux anticorps naturels font des MIP une alternative intéressante. En effet, les propriétés de reconnaissance moléculaire des MIP permettent d'envisager leur utilisation dans une vaste gamme d’applications. Ils sont ainsi largement exploités dans les sciences séparatives pour l'analyse d'échantillons environnementaux ou agro-alimentaires, ou comme élément de reconnaissance dans des biocapteurs. Récemment, des applications de ces matériaux dans les domaines biologiques et biomédicaux ont émergé comme pour la détection, l'extraction et l"élimination de molécules indésirables dans l'organisme, la vectorisation ou l'administration contrôlée des médicaments. Dans nos recherches, nous avons développé des MIP dégradables par voie biochimique ou enzymatique, ayant une application potentielle en tant que système de libération contrôlé de molécules. En général, les MIPs sont synthétisés par polymérisation radicalaire libre en utilisant une formulation composée de monomères fonctionnels, d'agents de réticulation, et d'une molécule cible servant à réaliser l'empreinte moléculaire. Dans ce travail de thèse, nous avons utilisé pour la synthèse de MIP dégradable des agents de réticulation clivables contenant, soit une fonction chimique dégradable par voie chimique ou enzymatique (ponts disulfures et phosphatediester), soit un disaccharide issus d'agro-ressources et pouvant être naturellement hydrolysé par des enzymes. En présence d'un réactif spécifique (agent réducteur ou enzyme), les liaisons dites "sensibles" aux réactifs chimiques ou enzymatiques peuvent être clivées, ce qui entraîne une dégradation de la matrice polymérique. Le polymère perdra alors sa capacité de reconnaissance et de liaison à la molécule cible et permettra la libération de celle-ci. Nous pensons donc, que les nouveaux MIP dégradables pourraient avoir un énorme potentiel comme vecteurs "intelligents" dans des applications médicales tels que les systèmes de libération contrôlée de médicament. Finalement, nous avons étudié la dégradation par des microorganismes de la structure de base de ce type de polymères, en utilisant comme modèles des chaines linéaires et réticulées. / Molecularly imprinted polymers (MIPs) are biomimetic synthetic receptors that possess two of the most important features of biological antibodies – the ability to recognize and bind specific target molecules. Owing to their easier preparation, lower cost, higher specifity and stability compared to antibodies, they have the potential to be widely applied for environemental and food analysis. Recently, MIPs also emerged in the biochemical field as diagnostic tools, chemicals traps to remove undesirable substance from the body, or drug delivery systems, where usually the combination of biocompatibility and degradability after its use is desirable. Here, we developed biochemically or enzymatically degradable MIPs, which have potential applications as activation-modulated drug delivery systems. In general, MIPs are prepared by radical polymerization of functional monomers and cross-linkers in the presence of a target molecule acting as template. Degradable MIPs were synthesized using cleavable cross-linkers containing a degradable group (disulfide bond or phosphate ester bond) or derived from a natural disaccharide. In the presence of a cleaving reagent (reducing agent or enzyme), the chemo or enzyme-sensitive bond could be cleaved, resulting in the degradation of the polymer matrix. The degraded polymers looses the binding sites structure resulting in the loss of recognition and binding capacity towards the target molecules, and thus in the release of bound molecules. These degradable MIPs provide new opportunities as “smart” vectors for controlled delivery of active molecules in biomedical applications. Finally, the biodegradation of the polymer backbone by bacteria was investigated.

Les plaquettes sont considérées comme l'un des réservoirs les plus importants non seulement des facteurs de croissance, mais aussi des facteurs neurotrophiques qui pourraient contribuer à la réparation des lésions vasculaires et à la prévention de la détérioration neurologique. Parmi ces facteurs, le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (Brain-Derived Neurotrophic Factor ou BDNF) – une protéine appartenant à la famille des neurotrophines– est largement exprimée à la fois dans l'hippocampe et au niveau des plaquettes. Les plaquettes constituent un important réservoir de BDNF; cependant, on ne sait que peu de choses sur les facteurs modulant la libération de ce dernier dans la circulation et si les médicaments antiplaquettaires affectent cette sécrétion. Dans le cadre de ce projet, nous avons émis l’hypothèse principale que les différentes voies d’activation plaquettaire peuvent mener à une libération de BDNF, où celle-ci est affectée par les antiplaquettaires. A cette fin, les plaquettes ont été isolées à partir d’échantillons sanguins de volontaires sains (Groupe 1), de patients souffrant de maladies cardiovasculaires stables requérant la prise de médicaments antiplaquettaires [en prévention secondaire et en double thérapie à l’acide acétylsalicylique (ASA ou Aspirine) en association avec un antagoniste du récepteur P2Y12], (Groupe 2) ou en monothérapie à l’ASA (Groupe 3), versus de patients atteints de maladies valvulaires ou de cardiomyopathies ne requérant pas la prise de médicaments antiplaquettaires (Groupe 4). L’agrégation plaquettaire a été étudiée par agrégométrie optique en réponse à des agonistes spécifiques : adénosine diphosphate (ADP), acide arachidonique (AA), épinéphrine, collagène et Thrombin-receptor activated peptide 6 (TRAP-6 amide). Les antiplaquettaires testés sont dirigés contre la cyclo-oxygénase-1 ou COX-1 (ASA), contre le récepteur de P2Y12 de l’ADP (AR-C) et contre le récepteur αIIbβ3 du fibrinogène (Abciximab). La libération du BDNF a été quantifiée par ELISA. La présence du BDNF et de son récepteur Tropomyosin-Related Kinase Receptor type B (TrKB) a été détectée par immunobuvardage. Nous avons montré que l’activation des plaquettes par les différents agonistes testés induit une agrégation plaquettaire de l’ordre de 80% et permet de libérer jusqu’à 5 fois plus de BDNF, passant de 2500 pg / 250 x 106 plaquettes à l’état basal à approximativement 13000 pg / 250 x 106 plaquettes à l’état stimulé. Tous les antiplaquettaires testés réduisent la libération de BDNF par les plaquettes stimulées. Cependant, le niveau d’inhibition et sa significativité dépendent de la nature de l’agoniste; à savoir que l’ASA réduit significativement la sécrétion de BDNF en réponse à l’AA, à l’épinéphrine et au TRAP-6; alors que l’AR-C était plus efficace en réponse à l’ADP, l’AA et l’épinéphrine. L’Abciximab est un antagoniste qui inhibe la sécrétion de BDNF en réponse à tous les agonistes, en inhibant aussi l’agrégation plaquettaire. Notons que la libération de BDNF en réponse au collagène est inhibée par l’ASA et l’AR-C, alors que l’agrégation n’a pas été affectée. Ainsi, aucune corrélation positive et significative entre l’agrégation plaquettaire et la libération de BDNF n’a pu être obtenue. La présence des antiplaquettaires réduits à différents degrés la libération de BDNF chez les différents groupes des patients, malgré que son expression intraplaquettaire était similaire entre les groupes. On remarque que les antiplaquettaires réduisent plus significativement la quantité du BDNF relâchée chez les patients sous mono ou double thérapie antiplaquettaire en comparaison avec les volontaires sains et les patients atteints de maladies valvulaires. Nous avons aussi démontré que le BDNF exogène active les plaquettes isolées et lavées chez les volontaires sains, en induisant une forte agrégation stable et irréversible. Par contre, le BDNF exogène n’arrive pas à agréger les plaquettes en plasma riche en plaquettes. De plus, nos résultats indiquent que la forme tronquée du récepteur BDNF, le TrKB, est exprimée au niveau des plaquettes de volontaires sains. L’inhibition de l’activité kinase du TrKB abolit l’agrégation induite par le BDNF. Ces résultats suggèrent que l’action du BDNF dans les plaquettes lavées pourrait passer par l’intermédiaire du TrKB. Cette étude nous permet de conclure que le BDNF est présent dans les plaquettes et est libéré suite à l’activation plaquettaire et que cette libération est réduite par les antiplaquettaires. Cependant, l’agrégation plaquettaire ne semble pas être associée directement à la sécrétion du BDNF, ce qui suggère que d’autres mécanismes sous-jacents pourraient intervenir dans le contrôle de cette sécrétion. Les antiplaquettaires réduisent la libération de BDNF et il semble que l’action pro-agrégante du BDNF sur les plaquettes lavées passe par l’intermédiaire du TrKB, sans exclure la possibilité que d’autres types de récepteurs plaquettaires soient impliqués dans le signal déclenché par le BDNF. L’implication physiopathologique du BDNF libéré suite à l’activation plaquettaire ou sa biodisponibilité en présence des antiplaquettaires au niveau cardiovasculaire reste à être élucidée afin de révéler son potentiel diagnostique ou thérapeutique. / Platelets are considered one of the most important reservoirs not only of growth factors but also of neurotrophic factors that may contribute to the repair of vascular lesions and prevention of neurological deterioration. Among these factors, the Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF), a protein belonging to the neurotrophin family, is largely expressed in both the hippocampus and platelets. In fact, platelets constitute an important reservoir of BDNF; however, little is known about the factors controlling its release into the circulation and whether antiplatelet drugs affect this secretion. Henceforth, the main hypothesis of this project is that platelet activation pathways lead to BDNF release which is affected by antiplatelet agents. For this purpose, platelets were isolated from the blood of four groups of human subjects following their consent. Group 1 consisted of healthy volunteers; Group 2 and Group 3 consisted of patients with stable cardiovascular disease on, respectively, dual antiplatelet therapy (aspirin + P2Y12 receptor antagonist) or monotherapy (aspirin) as secondary prevention; and Group 4 consisted of patients with valvular disease or cardiomyopathy who are not on antiplatelet therapy. Platelet aggregation was studied by optical aggregometry in response to the following agonists: adenosine diphosphate (ADP), arachidonic acid (AA), epinephrine, collagen, and thrombin-receptor activated peptide 6 (TRAP-6 amide). The antiplatelet agents that were tested antagonize cyclooxygenase-1 (COX-1) (acetylsalicylic acid (ASA) or aspirin), ADP P2Y12 receptor (AR-C), and fibrinogen receptor αIIbβ3 (Abciximab). BDNF release was quantified by ELISA. BDNF protein and its Tropomyosin-Related Kinase Receptor Type B (TrKB) receptor were detected by immunoblotting. Our results show that platelet activation in response to several agonists tested induced 80% platelet aggregation and augmented BDNF release by 5 folds, from 2500 pg / 250 x 106 platelets at baseline to approximately 13000 pg / 250 x 106 after stimulation. Moreover, all the tested antiplatelet agents reduced the release of BDNF by stimulated platelets. However, the level of reduction varied differentially between platelet antagonists depending on the platelet agonist used. Indeed, ASA significantly reduced BDNF secretion in response to AA, epinephrine, and TRAP-6, whereas AR-C was more effective in response to ADP, AA, and epinephrine. Abciximab inhibited BDNF secretion as well as platelet aggregation in response to all agonists. Noteworthy, the release of BDNF in response to collagen was inhibited by ASA and AR-C, while platelet aggregation was not affected. Accordingly, no significant correlation between platelet aggregation and BDNF release could be obtained. Although intra-platelet expression was similar in the different groups, the presence of antiplatelet agents reduced the release of BDNF to varying degrees between groups. As such, antiplatelet agents reduced BDNF release more significantly in patients on dual or mono antiplatelet therapy (Groups 2 and 3) as compared to healthy volunteers (Group 1) and valvular disease patients (Group 4). We have also shown that exogenous BDNF activated isolated/washed platelets from healthy volunteers, inducing strong, stable, and irreversible aggregation. In contrast, exogenous BDNF could not induce aggregation of platelets in platelet-rich plasma. In addition, our results indicate that the truncated form of the BDNF receptor, TrKB, is expressed in platelets of healthy volunteers. Hence, the inhibition of TrKB kinase activity abolished BDNF-induced aggregation. These results suggest that the action of BDNF in washed platelets might ensue through TrKB. We conclude from this study that BDNF is present in platelets and released following platelet activation, and its release is reduced by antiplatelet agents. However, platelet aggregation does not appear to be directly associated with BDNF secretion, suggesting that other underlying mechanisms may be involved in controlling its secretion. Antiplatelet agents reduce the release of BDNF, and it appears that the pro-aggregating action of BDNF on washed platelets ensues, non-exclusively, through TrKB, which means that other types of platelet receptors may also be involved in BDNF signaling. The pathophysiological implication of BDNF released following platelet activation or its bioavailability in the presence of antiplatelet agents in the cardiovascular system thus remain to be elucidated in order to reveal its diagnostic or therapeutic potential.

Les leucémies sont une famille de cancers issus de la prolifération maligne des cellules hématopoïétiques. La leucémie myéloïde aigüe (AML) représente 30% des leucémies chez les adultes et menace surtout les personnes âgées de 64 ans et plus. Actuellement, la chimiothérapie est la méthode principale de prise en charge de l’AML, mais celle-ci comporte des effets secondaires importants ainsi qu’un risque de récidive qui freinent son développement. Le redéploiement de molécules déjà utilisées pour d’autres maladies est une stratégie émergente dans le traitement du cancer. Par exemple, la chlorpromazine (CPZ), un antipsychotique, démontre une activité contre les lignées cellulaires issues d’AML, mais son activité au niveau du système nerveux central entraine des effets indésirables. Compte tenu de l’activité de CPZ contre les cellules leucémiques, nous avons mis au point un système de vectorisation des médicaments original pour le traitement de l’AML. La CPZ est d’abord incluse dans une cyclodextrine (CD) : molécule cage à base de glucose et ce complexe est ensuite encapsulé dans un liposome : vésicules à contenu aqueux délimitées par une ou plusieurs bicouches phospholipidiques. Ce système de “drug-in-CD-in-liposomes” (DCL) est conçu pour circuler longtemps dans le sang après injection intraveineuse mais ne pas passer la barrière hémato-encéphalique (BHE).Il a été nécessaire d’optimiser la formulation avec ses trois composants principaux : CD, CPZ et phospholipides. Ainsi, une évaluation physico-chimique approfondie a été réalisée pour les interactions CD/CPZ, CD/phospholipides et CPZ/phospholipides. La calorimétrie de titration isotherme (ITC) a permis de déterminer la stœchiométrie et la constante d’association pour les complexes d’inclusion CD/CPZ, démontrant les associations les plus importantes avec la Sugammadex ou la SBE-β-CD. La spectroscopie RMN 2D ROESY a mis en évidence des géométries d’inclusion différentes selon la taille et le type de substitution des CDs. Par ailleurs, l’inclusion de la CPZ dans les CDs accélère légèrement la photodégradation de l’antipsychotique. Quant à l’interaction CD/phospholipides, la SBE-Et-β-CD déstabilise les liposomes multilamellaires (MLVs) composés de palmitoylstearoylphosphatidylcholine (PSPC) pour des concentrations supérieures à 25 mM, tandis que les autres CDs sont sans effet. En outre, des études de turbidité ont démontré que les liposomes unilamellaires (SUV) ne sont pas perturbés en présence de la plupart des CDs. Une étude de l’interaction entre CPZ et PSPC a démontré que la quantité maximale qu’il est possible d’encapsuler était égale à 3,75 mol%. Par la suite, des DCL contenant CPZ ont été préparés par la méthode « dehydration-rehydration vesicles » (DRV) mais le pourcentage du principe actif encapsulé (EE) s’avérait faible (environ 10%). Ainsi la méthode DRV combinée à l’utilisation d’un gradient de concentration de sulfate d’ammonium a été mise en œuvre, ce qui a permis d’augmenter l’EE à 27% tout en gardant une taille compatible avec l’administration IV. Par la suite, la cytotoxicité de ces formulations a été évaluée sur 4 lignées cellulaires humaines issues d’AML (HL-60, MOLM13, MV4-11 and OCI-AML). Les liposomes contenant la CPZ ont tous démontré un effet cytotoxique tandis que les liposomes vides avaient tendance à stimuler la croissance cellulaire et les CD seules étaient sans effet. Pourtant, l’activité des DRVs avec CD était inférieure à celle des DRV/CPZ, selon l’ordre suivant : DRV-SGM/CPZ < DRV-SBE-β-CD/CPZ < DRV-HP-γ-CD/CPZ. L’activité était inversement proportionnelle à la constante d’affinité, suggérant une libération retardée. Cette hypothèse a été confortée par le fait que l’activité des DRV CD/CPZ était plus importante après une exposition de 72h qu’après 24h.Ces résultats sont prometteurs pour la mise au point de systèmes à libération contrôlée de CPZ pour le traitement d’AML. / Leukemia is a group of cancers caused by malignant clonal proliferation of hematopoietic stem cells. Accounting for 30% of all leukemias in adults, acute myeloid leukemia (AML) is especially a threat for older people with a median age of 64 years. Presently, chemotherapy is the main therapeutic method for AML but severe side-effects and possibility of relapse have hampered its development. “Repurposing” of drugs used in other diseases is a current trend for the treatment of cancer. For example, chlorpromazine (CPZ), a widely used anti-psychotic drug, shows effective activity in AML cell lines, but can also cause side effects in the central nervous system.Basing on the inhibiting capability of CPZ against leukemia-related cell lines, we have designed and developed a novel nanometric drug delivery system for AML treatment. CPZ is first entrapped in the hydrophobic internal cavity and forms inclusion complexes with cyclodextrin (CD), a cask-like molecule composed of glucose units, then the CD/CPZ inclusion complexes are encapsulated in liposomes, phospholipid vesicles consisting of a series of lipid bilayers enclosing aqueous compartments. The “drug-in-CD-in-liposomes” (DCL) system provides a promising strategy which is capable of achieving long circulation time in the blood after intravenous administration while circumventing the blood-brain barrier (BBB). It was necessary to optimize the formulation for its three main components: CD, CPZ and phospholipid. Therefore, a comprehensive physicochemical investigation of the interaction between CD/CPZ, CD/lipid and CPZ/lipid was performed. Isothermal titration calorimetry (ITC) was used to obtain the stoichiometry and association constant of the CPZ-CD inclusion complexes, showing that sugammadex and SBE-β-CD has the highest complexation ratio. 2D ROESY NMR revealed different inclusion processes depending on the size and chemical modification of CDs. Photodegradation experiments indicated that CDs can slightly accelerate CPZ's photodegradation. As far as liposome stability was concerned, SBE-Et-β-CD was found to have an obvious interaction with palmitoyl stearoyl phosphatidylcholine (PSPC) multilamellar liposomes (MLVs) above 25 mM, while the other CDs were without effect. However, turbidity measurements indicated that small unilamellar liposomes (SUVs) remain intact in presence of CDs. A study of the interaction between CPZ and PSPC showed that the maximum proportion of CPZ that could be incorporated into the lipid membrane was 3.75 mol%. Subsequently, DCL systems containing CPZ was prepared by the dehydration-rehydration vesicles (DRV) method. However, low drug encapsulation efficiency (EE) was obtained (about 10% of added drug). Therefore, an active loading strategy, the ammonium sulphate gradient method, was used in combination with the DRV method. As a result, the EE of CPZ increased to about 27% and yielded liposomal formulations with suitable size for IV administration.Finally, the cytotoxicity of CPZ, CDs, empty liposomes and liposomes containing CD/CPZ complexes was evaluated against a panel of leukemia cell lines. CPZ was found to show a growth-inhibiting effect on the human leukemia cell lines (HL-60, MOLM13, MV4-11 and OCI-AML), while empty liposomes were observed to slightly promote their growth and CDs alone had no significant cytotoxicity. However, a difference in activity was observed with the DRV containing CD/CPZ complexes, which were less active than DRV containing free CPZ, with the order: DRV-SGM/CPZ < DRV-SBE-β-CD/CPZ < DRV-HP-γ-CD/CPZ. The activity was inversely proportional to the formation constant of CD/CPZ complexes obtained by ITC, suggesting a delayed release from the complexes. This was confirmed by varying the exposure time; the activity of DRV CD/CPZ being relatively higher in a longer incubation.These results suggest that the DCL system could provide controlled release of CPZ for the treatment of AML.

Dans les tumeurs solides, l'hypoxie est un mécanisme de résistance à la radiothérapie bien connu. Il a déjà été démontré que, lorsque les microbulles (MB) sont exposées à une impulsion ultrasonore (US), celles-ci peuvent induire une vasodilatation dans les tissus musculaires. De plus, une impulsion thérapeutique peut être délivrée localement dans la tumeur en dirigeant le faisceau US. Cette approche est donc proposée comme thérapie provasculaire ciblée, guidée par l’imagerie ultrasonore dans les tumeurs afin de réduire l'hypoxie avant la radiothérapie. Le contrôle de la vasodilatation est induit par la production d'oxyde nitrique (NO) par la voie de signalisation cellulaire du eNOS dans les cellules endothéliales. Il a été démontré que l'augmentation de l'ATP extracellulaire active la voie de signalisation du eNOS. Il a aussi été démontré que l’oscillation des MB sous l’effet des US libèrent de l'ATP lorsque le tissu musculaire est traité. Cependant, les effets des différentes conditions ultrasonores et de MB sur la libération d'ATP n'ont pas encore été étudiés. Nous émettons donc l'hypothèse qu'il existe des conditions permettant de maximiser l’activation des voies de signalisation purinergiques (ATP) et d'optimiser leur durée d’activation pour une réponse provasculaire optimale. Les motivations de ce projet sont de tester divers paramètres et d'étudier les interactions MB/cellules dans des conditions d'écoulement, qui sont généralement difficile à mettre en place lorsqu'on utilise des boîtes de Pétri. Pour quantifier plus facilement les voies de signalisation, nous avons créé des puces microfluidiques avec quatre canaux parallèles dans lesquels des cellules ont pu être cultivées. Avec quatre canaux traités lors d’une même impulsion ultrasonore, nous avons aussi augmenté le nombre de données à traiter et nous pouvons observer les effets de plusieurs impulsions lorsque les MB étaient dans un écoulement. En outre, la puce que nous avons développé est capable de donner une concentration en MB différente dans chaque canal afin de pouvoir tester quatre concentrations de MB différente dans des conditions d’écoulement. Les objectifs de ce projet de maîtrise sont donc les suivants : (1) concevoir la puce microfluidique ; (2) être capable de cultiver des cellules dans les canaux microfluidiques ; (3) créer des protocoles pour mesurer la libération d'ATP et la viabilité cellulaire après une impulsion ultrasonore ; (4) observer la capacité de la puce à donner différentes concentrations de MB dans chaque canaux en conditions d’écoulement. Lors de la conception de la puce microfluidique, nous avons créé un environnement dans lequel les quatre canaux de la puce ont des concentrations différentes de microbulles fluides. Ainsi, nous avons atteint les objectifs du projet. Nous avons réussi à introduire dans le canal microfluidique des cellules endothéliales de cordon ombilical humain (HUVEC) et une lignée cellulaire de cancer du sein (4T1). Les monocouches cellulaires créées par chacune des deux lignées cellulaires ont été traitées avec succès par une impulsion thérapeutique ultrasonore lors de l’injection de MB. Nos résultats montrent qu'une augmentation du nombre de cycles et de la pression, libère plus d'ATP et induisent une mortalité cellulaire plus importante. En outre, nous avons établi un lien entre la libération d'ATP et la mortalité cellulaire en comparant différentes impulsions thérapeutiques ultrasonore. Cette analyse a permis de dégager deux tendances. Avec des impulsions à faible énergie, la libération d'ATP est augmenté et on constate une très faible augmentation de la mort cellulaire ; inversement, avec des impulsions à plus forte énergie, la libération d'ATP et la mortalité cellulaire ont augmentés et on atteint un plateau. Ainsi, nos résultats confirment que différents mécanismes de libération d'ATP peuvent être déclenchés par les thérapies MB et US. / In solid tumors, hypoxia is a well-known resistance mechanism to radiation therapy. It was previously shown that microbubbles (MBs), when exposed to an ultrasound pulse (US) can cause vasodilation in muscle tissue. Conceptually, the therapeutic pulse can be localized on the tumor by steering the US beam. This approach is therefore proposed as a targeted image-guided provascular therapy in tumors to reduce hypoxia before radiotherapy. However, the effects of US and MB conditions on the relative increase in tumor perfusion remain largely unknown. Vascular control is managed by the production of nitric oxide (NO) through the eNOS pathway inside the endothelial cells. Increases in extracellular ATP have been shown to be a signaling event for the activation of this pathway. Fittingly, MB and US have been shown to release ATP when muscle tissue was treated. However, the effects of therapeutic US and MB parameters on the treatment have not yet been described. We, therefore, hypothesize that there are conditions that will maximize the purinergic signaling pathways (ATP) and optimize their time course for an optimal provascular response. The motivation for this project came from the desire to test various parameters and study MB/cell interactions in flowing conditions, which are typically limited when using petri dish setups. To quantify more easily the signaling pathways, we created microfluidic chips with four parallel cell coated channels. This chip allowed us to increase the throughput when using a single US exposure in static conditions and with the ability to support multiple US exposures with MB replenishment in flowing conditions. Also, the custom-made chip multiplexes the bubble concentration to obtain four channels with different flowing microbubble concentrations. The goals of this master’s project were thus: (1) to design the microfluidic chip; (2) to demonstrate the capacity for cell culture; (3) create protocols for measuring ATP and cell viability after therapeutic pulses; (4) to demonstrate repeatable flowing conditions with the multiplexed MB concentration. On the design of the microfluidic chip, we were successful at creating an environment where four of the four channels in the chip have different concentrations of flowing microbubbles. Thus, fulfilling the project's goals. We have succeeded in seeding both Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and a breast cancer cell line (4T1) into the microfluidic channel. The cell monolayers created by both cell lines were successfully treated with an US and MB therapeutic pulse. Our results support that an increase in both, cycles and pressure, release more ATP and cause more cell death. Further, we linked ATP release to cell death by comparing different therapeutic pulses. From this analysis, two trends appeared. With lower energy pulses, ATP release increased sharply with a very small increase in cell death; conversely, with higher energy pulses, ATP release continued to increase with cell death but reached a plateau. Thus, our results support that different mechanisms of ATP release can likely be triggered by MB and US therapy.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Abstract : The major objective of our study is to investigate DNA damage induced by soft X-rays (1.5 keV) and low-energy electrons (˂ 30 eV) using a novel irradiation system created by Prof. Sanche’s group. Thin films of double-stranded DNA are deposited on either glass and tantalum substrates and irradiated under standard temperature and pressure surrounded by a N[subscript 2] environment. Base release (cytosine, thymine, adenine and guanine) and base modifications (8-oxo-7,8-dihydro -2’-deoxyguanosine, 5-hydroxymethyl-2’-deoxyuridine, 5-formyl-2’-deoxyuridine, 5,6-dihydrothymidine and 5,6-dihydro-2’-deoxy uridine) are analyzed and quantified by LC-MS/MS. Our results reveal larger damage yields in the sample deposited on tantalum than those on glass. This can be explained by an enhancement of damage due to low-energy electrons, which are emitted from the metal substrate. From a comparison of the yield of products, base release is the major type of damage especially for purine bases, which are 3-fold greater than base modifications. A proposed pathway leading to base release involves the formation of a transient negative ion (TNI) followed by dissociative electron attachment (DEA) at the N-g lycosidic bond. On the other hand, base modification products consist of two major types of chemical modifications, which include thymine methyl oxidation products that likely arises from DEA from the methyl group of thymine, and 5,6-dihydropyrimidine that can involve the initial addition of electrons, H atoms, or hydride ions to the 5,6-pyrimidine double bond. / Résumé: L'objectif majeur de ce projet étude est d'étudier les lésions d'ADN induites par les rayons X mous (1,5 keV) et des électrons de faible énergie (˂ 30 eV) à partir d'un nouveau système d'irradiation créé par le groupe du Pr. Sanche. De minces couches d'ADN double brin sont déposées soit sur du verre ou sur les substrats de tantale. Celles-ci sont irradiées sous une température et pression environnante, mais dans une atmosphère de N[indice inférieur 2]. Les bases relâchées (cytosine, la thymine, l'adénine et la guanine) et les produits de modification de base (8-oxo-7,8-dihydro-2'-désoxyguanosine, 5-hydroxyméthyl-2'-désoxyuridine, 5-formyl-2'-désoxyuridine, 5,6-dihydrothymine et 5,6-dihydrouridine) sont analysés et quantifiés par LC-MS/MS. Nos résultats révèlent un plus grand rendement de dommages dans les échantillons déposés sur le tantale que celles sur le verre. Cette différence peut être expliquée par l’interaction des électrons de faible énergie qui sont photo émis des substrats métalliques. D'après les résultats obtenus, la libération de bases est un produit majeur en comparaison avec la modification de bases. Ceci provient, en particulier, surtout des purines qui libèrent la base a un niveau trois fois plus grand que la modification de la base. Une voie proposée, conduisant à la libération de base, implique la formation d'ions négatifs transitoires (TNI), suivie par l'attachement d'électrons dissociatifs (DEA) à la liaison N-glycosidique. En outre, les produits de modification de base sont composés en deux grands types de modifications chimiques. L’un des produits est l’oxydation du groupe méthyle de la thymine, qui probablement consiste de en d'hydrure (-H[indice supérieur -]) par l'intermédiaire de DEA. Alors que l’autre modification chimique est la formation de 5,6-dihydropyrimidine qui implique l'addition d'hydrure à la double liaison du 5,6-pyrimidine.