O processo de reparo ósseo depende de uma resposta inflamatória inicial e transitória, a qual envolve a participação de diversos leucócitos, como células da linhagem monócito/macrófago. O receptor CCR2 é importante para o recrutamento de macrófagos durante as respostas imunes, além de ter um papel na regulação da osteoclastogênese. Assim, o objetivo do presente estudo foi investigar papel de células CCR2+ no processo de reparo ósseo alveolar pós-exodontia em camundongos, por meio de análises microscópicas (MicroCT, histomorfometria, análise de birrefringência e imuno-histoquímica) e moleculares (PCRArray) comparativas entre as linhagens C57Bl/6 (WT) e CCR2KO, ao longo dos períodos de 0 hora, 7, 14 e 21 dias pós-exodontia do incisivo superior direito. Como resultado geral das análises microscópicas, constatamos que a ausência de células CCR2+ não afetou o resultado final do reparo ósseo alveolar em camundongos CCR2KO, mas levou a alterações transitórias e estatisticamente significantes (p<0,05) para quantificação de infiltrado inflamatório, vasos sanguíneos, fibroblastos, fibras colágenas, osteoblastos e osteoclastos. Além disso, a ausência de células CCR2+ resultou em diminuição (p<0,05) de células F4/80+ e CCR5+ no infiltrado inflamatório ao longo do processo de reparo ósseo alveolar de camundongos CCR2KO, demonstrando o papel do receptor CCR2 no recrutamento de macrófagos (células F4/80+), bem como sugerindo que as células F4/80+ apresentam dupla positividade para os receptores CCR2 e CCR5. Neste contexto, o receptor CCR5 seria o responsável pela migração remanescente, ainda que reduzida, de células F4/80+ nos animais CCR2KO. Considerando os resultados moleculares, a ausência de CCR2 resultou na alteração da expressão de diferentes marcadores em camundongos CCR2KO, tais como: o fator de crescimento TGF1, marcadores de matriz COL1, MMP1a, MMP2 e MMP9, marcadores ósseos RUNX2, DMP1, RANKL, RANK e CTSK, e marcadores de MSCs CD106, COT-4, NANOG, CD146 e CD105, bem como de marcadores imunológicos como as citocinas IL-6 e TNF-a, receptores de quimiocinas CCR1, CCR5 e CXCR1,e as quimiocinas CCL12, CCL20, CCL25 e CXCL12. Em conclusão, estes resultados indicam que células CCR2+ desempenham diferentes funções no reparo ósseo alveolar em camundongos, influenciando tanto a resposta inflamatória, como os eventos teciduais observados ao longo deste processo. / The bone repair process depends of an initial and transitory inflammatory response, which involves the participation of various leukocytes subsets, as of the monocyte/macrophage lineage. The CCR2 receptor is important to macrophage recruitment during immune responses, and play an active role in the regulation of osteoclastogenesis. Thereby, the purpose of this study was to investigate the role of CCR2+ cells in the alveolar bone repair process in mice, by means of microscopic (MicroCT, histomorphometry, birefringence analysis and immunohistochemistry) and molecular (PCRArray) comparative analysis between C57BL / 6 (WT) and CCR2KO mice during periods of 0 hour, 7, 14 and 21 days post-extraction of the right upper incisor. As a result of the microscopic analysis, we noted that the absence of CCR2+ cells did not affect in the overall outcome of alveolar bone repair in CCR2KO mice, but resulted in transient and statistically significant (p<0.05) alterations of inflammatory infiltrate, blood vessels, fibroblasts, collagen fibers, osteoblasts and osteoclasts counts. Furthermore, the absence of CCR2+cells resulted in a decrease (p<0.05) of CCR5+ and F4/80+ cells in the inflammatory infiltrate along the alveolar bone repair process in CCR2KO mice, demonstrating the role of CCR2 receptor in macrophages migration (F4/80+ cells), as well as suggesting that the F4/80+ cells are double positive for CCR2 and CCR5. In this context, CCR5 receptor could be responsible for the remaining (but reduced) migration, of the F4/80 + cells in CCR2KO mice. According to molecular results, the absence of CCR2 resulted in an altered expression of different markers in CCR2KO mice, such as: growth factor TGF1, the matrix markers COL1, MMP1a, MMP2 and MMP9, the bone markers RUNX2, DMP1 RANKL, RANK and CTSK, and MSCs markers CD106, OCT-4, NANOG, CD146 and CD105, as well as immunological markers as IL-6 and TNF-, chemokine receptors CCR1, CXCR1 and CCR5, and the chemokines CCL12, CCL20, CCL25 and CXCL12. In conclusion, these results indicate that CCR2+ cells have different functions in alveolar bone repair in mice, influencing the inflammatory response and also tissue events observed throughout the process events.

Dados da Literatura têm demonstrado que a CTX, toxina majoritária do veneno de serpente Crotalus durissus terrificus apresenta efeitos anti-inflamatório, imunomodulatório e antitumoral. A CTX modula, particularmente, as funções de macrófagos, células fundamentais para os mecanismos da defesa inata e de importância central na gênese e progressão tumoral. No início da progressão tumoral, os macrófagos apresentam fenótipo pró-inflamatório, caracterizado pela liberação de citocinas inflamatórias, tais como IL-1, IL-6 e TNF-<font face=\"Symbol\">a, reativos intermediários do nitrogênio (RNI) e do reativos intermediários do oxigênio (ROI). No contexto tumoral, os macrófagos inflamatórios inibem o crescimento tumoral, erradicando as células tumorais e estimulando a resposta imune. Por outro lado, os macrófagos anti-inflamatórios encontrados quando o tumor está estabelecido, ou seja, quando atinge o tamanho de 1 cm3, contribuem para a progressão do tumor por produzir mediadores pró-angiogênicos por expressarem baixos níveis das citocinas inflamatórias, perda da capacidade de liberação e de produção de ROI e RNI, importantes para ação tumoricida. Estudos realizados pelo nosso grupo demonstraram que a CTX, após 14 dias de uma única administração, estimula a liberação de peróxido de hidrogênio e produção de óxido nítrico, além de modular a secreção de citocinas por macrófagos obtidos da cavidade peritoneal de ratos normais. Desta forma, considerando que esses mediadores são fundamentais no controle de progressão tumoral, é relevante investigar se a CTX estimula a produção desses mediadores pelos macrófagos obtidos de animais portadores de tumor. Portanto, o objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos da CTX sobre a função e o metabolismo de macrófagos peritoneais obtidos de ratos portadores de tumor de Walker 256. Para tanto, ratos machos da linhagem Wistar foram injetados, por via s.c., no flanco posterior direito, o volume de 1 mL de salina estéril contendo 2x107 de células tumorais. Numa primeira abordagem, a CTX (18<font face=\"Symbol\">mg/animal) foi administrada no subcutâneo dos animais no 5º dia após a inoculação das células tumorais. Após 14 dias da inoculação das células tumorais, macrófagos peritoneais foram obtidos e os seguintes parâmetros foram avaliados: a) liberação de H2O2 e, produção de NO e citocinas pró-inflamatórias (IL-1<font face=\"Symbol\">b, TNF-<font face=\"Symbol\">a e IL-6) e b) a atividade máxima da hexoquinase, glicose-6-fosfato desidrogenase, citrato sintase e a produção de 14CO2 de glicose [U-14C] e glutamina [U-14C]. O tratamento com a CTX estimulou a produção de H2O2 e de NO, a secreção das citocinas IL-1<font face=\"Symbol\">b e do TNF-<font face=\"Symbol\">a e a atividade do metabolismo de glicose e glutamina. Em outra abordagem, a administração da CTX foi concomitante à inoculação das células tumorais. Após 14 dias, os macrófagos apresentaram as atividades secretórias e metabólicas estimuladas. Esses dados colocam a CTX não apenas como ferramenta científica para investigar as funções e o metabolismo de macrófagos, como também para a melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na progressão tumoral. / Crotoxin (CTX), the major toxin of Crotalus durissus terrificus venom induces an inhibitory effect on tumoral growth and modulates, particularly, the functions of macrophages, fundamental cells to provide a defense mechanism against tumor cell. In early tumor progression, macrophages are avidly phagocytic (inflammatory cell) releasing reactive nitrogen intermediates-RNI/ROI and cytokines TNF-<font face=\"Symbol\">a, IL-1<font face=\"Symbol\">b and IL-6. However, when the tumor is installed, tumor-associated macrophage (angiogenic cell) presents a decrease in these abilities. Our group demonstrates that CTX stimulates the H2O2 release and NO production and the secretion of the cytokines by peritoneal M<font face=\"Symbol\">&#198; obtained from non-tumor-bearing rats. Thus, considering that these are key mediators in the control of tumor progression, it is important to investigate whether CTX stimulates the production of these mediators by macrophages obtained from tumor-bearing animals. The aim of this work was to evaluate the CTX effect on macrophage functions and metabolism of peritoneal macrophage obtained of Walker 256 tumor-bearing rats. For this purpose, male Wistar rats were inoculated subcutaneously in the right flank with 1 ml of sterile suspension of 2×107 Walker 256 tumor cells. In a first approach, CTX (18<font face=\"Symbol\">mg/animal) was administered subcutaneously animals on day 5 after inoculation of tumor cells. After 14 days of tumor cell inoculation, peritoneal macrophages were obtained and the following parameters were evaluated: a) release of H2O2 and NO production and pro-inflammatory cytokines (IL-1<font face=\"Symbol\">b, TNF-<font face=\"Symbol\">a and IL-6) and b) maximal activity of hexokinase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, citrate synthase and 14CO2 production from [U-14C]-glucose and [U-14C]-glutamine. The treatment with CTX stimulated NO or H2O2 production, cytokine secretion and glucose and glutamine metabolism. In another set of experiments, CTX injected concomitant with tumor cell inoculation. After 14 days macrophages presented metabolism and secretory activity stimulated. These data CTX not only as a scientific tool to investigate the functions and metabolism of macrophages, but also for better understanding of the mechanisms involved in tumor progression.

Objetivou-se caracterizar clinicamente a Doença Inflamatória de Vias Aéreas (DIVA) assim como verificar o comportamento da atividade dos macrófagos alveolares destes animais. Utilizaram-se 17 eqüinos adultos machos e fêmeas, com idade variando entre 11 e 24 anos, sendo oito do Regimento Escola de Cavalaria Andrade Neves (grupo Controle) e nove da Polícia Militar do Rio de Janeiro (grupo Doente, com DIVA). Estes animais não apresentavam história pregressa recente (dois meses) compatível com doença respiratória, nesse período não foram submetidos a nenhum tipo de tratamento e apresentavam resultados de leucogramas e determinações de fibrinogênio plasmático dentro da normalidade. Realizaram-se exames físicos, endoscópicos, mensurações da diferença de pressão intrapleural máxima (Ventigrafia), e citologia broncoalveolar. Para o grupo Controle os animais foram selecionados levando-se em conta os resultados de normalidade nos exames executados. O grupo Doente foi selecionado considerando-se achados de anormalidade compatíveis com alterações inflamatórias pulmonares no mínimo em dois exames, sendo obrigatórios os exames endoscópicos e de citologia broncoalveolar. Para a avaliação da atividade macrofágica, macrófagos alveolares obtidos através de lavagem broncoalveolar foram cultivados a 37ºC em atmosfera de 7% CO2, aderidos em lamínulas de vidro estéril, de 13 mm de diâmetro em placas de 24 poços contendo 300 µL de RPMI 1640 enriquecido com 10% de Soro Fetal Bovino inativado pelo calor. Realizaram-se testes de fagocitose de Zymosan (por uma hora) e de interação com Promastigotas de Leishmania braziliensis cepa 3456 (por uma até 48 horas pós infecção). A análise das funções vitais e das mensurações da diferença de pressão intrapleural máxima revelou, ainda que dentro de valores fisiológicos, diferenças significativas apenas para a temperatura corpórea e freqüência cardíaca. Para os achados do exame do exame físico, não foi detectada diferença estatística entre os grupos. Com relação ao lavado broncoalveolar, o grupo Doente apresentou aumento na contagem celular total, moderado aumento na porcentagem de neutrófilos, discreta redução na porcentagem de macrófagos, porém com aumento no número de macrófagos espumosos e de células epiteliais além de discreto aumento na porcentagem de eosinófilos. Não observou-se diferença, entre os grupos, na capacidade fagocítica com relação ao Zymosan. Porém, uma diferença significativa na capacidade fagocítica após uma hora de interação e redução do índice de sobrevivência de L. braziliensis após 48 horas de cultivo no grupo Doente foi observada. Os resultados demonstraram que a DIVA nos animais de policiamento apresentou caráter assintomático e que os macrófagos alveolares provenientes destes animais, quando comparados aos do grupo Controle, não apresentaram alteração em sua capacidade fagocítica para Zymosan, mas sim para L. braziliensis e um maior estado de ativação, caracterizado pela maior redução no índice de sobrevivência deste parasita após 48 horas de cultivo. / The objectives were to characterize clinically the inflammatory airway disease (IAD), as well as to verify the behavior of the alveolar macrophages activity in the horses. Seventeen adult horses, from both sexes, from 11 to 24 years old, were used, eight from the Regimento Escola de Cavalaria Andrade Neves (Control group) and nine from the Polícia Militar do Rio de Janeiro (Diseased group, with IAD). These animals did not present recente previous history (two months) compatible with respiratory disease. In this period the horses did not undergo any kind of treatment and presented leucogram and plasmatic fibrinogen determination results under normality. Physical and endoscopic examination, measurement of the maximal intrapleural pressure (Ventigraphy) and bronchoalveolar cytology were done. For the Control group, the animals were selected considering the normal results of the exams. The Diseased group was selected considering abnormal findings compatible with inflammatory pulmonary alterations at least in two exams, obligatory the endoscopic examination and bronchoalveolar cytology. To evaluate the macrophagic activity, alveolar macrophages obtained through bronchoalveolar lavage were cultured under 37oC in a 7% CO2 atmosphere, adhered to 13 mm diameter sterile glass cover slips , in 24 wells polystyrene plates containing 300µL of RPMI 1640 enriched with 10% Foetal Calf Serum inactivated by heat. Assays for phagocytosis of Zymosan (for 1h) and for promastigotes of Leishmania braziliensis strain 3456 binding (for one until 48 hours post-infection) were done. The vital functions and the measurement of the maximal intrapleural pressure measurement analyses showed, even under physiological values, significant differences for body temperature and heart rate. There was not statistical difference between the groups for the physical examination findings. In relation to the bronchoalveolar lavage, the Diseased group presented an increase in total cell count, a moderate increase in neutrophil percentage, a discrete reduction in macrophage percentage, but with a higher number of foamy macrophages and epithelial cells, and also a discrete increase of eosinophil percentage. It was not observed any difference between groups in the phagocytic capability in relation to Zymosan. However, a significant difference in the phagocytic capability after one hour interaction and a reduction of the survival index of L. braziliensis after 48 hours of culture in the Diseased group was observed. The results demonstrated that IAD in the police horses presented an asymptomatic characterization and that the alveolar macrophages from these horses, when compared to the Control group, did not present alteration in their phagocytic capacity for Zymosan, but did for L. braziliensis, and a greater activation status, characterized by a greater reduction of the survival index of L. braziliensis after 48 hours of culture.

Estudos prévios em nosso laboratório mostraram na interface materno-fetal de camundongos, aos 10 dias de gestação, a expressão máxima do fator de inibição de migração de macrófagos (MIF) pelas células trofoblásticas e de seus receptores (CD44/CD74) pelas células deciduais, tornando estas células potenciais alvos da ação desta citocina. Dentre funções atribuídas a esta citocina, destacam-se ações pró-inflamatórias sobre a resposta imunológica e sobre processos de proliferação e sobrevivência celular. Neste contexto, este estudo tem como objetivo analisar uma possível participação de MIF na ativação de processos de sobrevivência celular mediados pela proteína quinase Akt, nas células deciduais de camundongo, in vitro. Utilizou-se cultivo primário de células deciduais que receberam MIF recombinante de camundongo (mrMIF) associado ou não a inibidores da via PI3K/AKT (LY294002 e Wortmannin). As culturas foram analisadas por meio de reações imuno-histoquímicas, Western blot e ensaios de morte celular. Assim como in vivo, o complexo receptor de MIF, CD74/CD44 foi imunolocalizado nas células deciduais cultivadas. A adição de MIF exógeno reduziu os níveis de apoptose. MIF também interferiu no processo de sobrevivência das células deciduais in vitro diminuindo as taxas de morte por apoptose quando desafiadas com peróxido de hidrogênio. Além disto, as células tratadas com mrMIF apresentaram maior expressão de pAKT e pMDM2. Dados da literatura mostram que a via AKT é responsável por ativar mecanismos de sobrevivência celular e sua ativação por MIF nas células deciduais pode indicar um papel para esta citocina na homeostase decidual, garantindo a integridade da barreira materno-fetal e, desta forma, a manutenção desta interface imprescindível para o sucesso da gestação. / Previous studies from our laboratory showed that the maternal-fetal interface in mouse at gestation day 10 exhibits high levels of macrophage inhibiting migration factor (MIF) expressed by trophoblast cells and its receptors (CD44/CD74) by decidual cells, making these cells potential targets for this cytokine action. Among the roles attributed to this cytokine, it can be highlighted the pro inflammatory actions on the immune response and on proliferation and cellular survival processes. In this context, this study aim to analyze the possible role of MIF in the activation of survival mechanisms mediated by the protein kinase Akt in mouse decidual cells in vitro. We have used primary culture of decidual cells receiving recombinant mouse MIF (mrMIF) with or without the PI3K/AKT pathway inhibitor (LY294002 and Wortmannin). Cultures were analyzed by immunohistochemical reactions, Western blotting and cell death analysis. As in vivo, the MIF receptor complex, CD74/CD44 was immunolocalized in the cultured decidual cells. The addition of exogenous MIF reduced the apoptotic rates in decidual cells. MIF also interfered in the process of survival of decidual cells in vitro by decreasing rates of cell death by apoptosis when challenged with hydrogen peroxide. In addition, cells treated with mrMIF have higher expression of pAKT and pMDM2. Recent studies show that AKT pathway is responsible for cell survival. In this context, AKT activation by MIF in decidual cells may indicate a role for this cytokine in decidual homeostasis by ensuring the integrity of the maternal-fetal barrier and thereby, maintaining this essential interface and successful pregnancy.

As bactérias são reconhecidas pelos macrófagos através dos receptores do tipo Toll (TLR), que ativam as vias do NF-&#954;B e das MAPKs, resultando em respostas como a fagocitose e a produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (ROS/RNS), que causam a morte do microrganismo. P. aeruginosa, uma causa comum de pneumonia associada à ventilação mecânica, é uma bactéria que utiliza diversas estratégias de virulência e defesa, incluindo mecanismos antioxidantes. O objetivo deste trabalho foi verificar a relação entre o papel da 1-Cys peroxirredoxina LsfA está envolvida na virulência de P. aeruginosa. Linhagens mutantes com deleção em lsfA ou com uma mutação pontual neste gene (troca da Cys45 por Ala, RB302) foram construídas, sendo mais sensíveis a peróxido de hidrogênio que a linhagem selvagem PA14, como verificado pelo halo de inibição de crescimento. A atividade peroxidásica de LsfA foi medida in vitro pelo ensaio de tiocianato férrico e apenas a proteína com a sequência selvagem foi ativa, enquanto uma mutação na Cys45 aboliu completamente a sua atividade. Infecção de macrófagos J774 com as linhagens &#916;lsfA ou C45A resultaram em uma diminuição da morte dos macrófagos, aumento do clearance bacteriano e aumento da secreção de TNF-&#945; em comparação aos macrófagos infectados com a linhagem PA14, sugerindo uma maior ativação das vias do NF-&#954;B e das MAPKs nos macrófagos infectados com as linhagens mutantes. Para verificar se LsfA poderia alterar o estado oxidativo dos macrófagos, eles foram infectados com as linhagens PA14 ou RB302 (C45A) e incubadas com carbóxi-H2DCFDA, um indicador que se torna fluorescente quando oxidado. Macrófagos infectados com a linhagem mutante demonstraram um maior estado oxidativo em comparação aos macrófagos infectados com a linhagem selvagem, confirmando que LsfA limita a ativação dos macrófagos, resultando numa menor produção de TNF-&#945; e diminuição da citotoxicidade. A via das MAPKs e do NF-&#954;B são requeridos para a produção máxima de TNF-&#945; nos macrófagos infectados com a linhagem RB302, o que foi demonstrado utilizando-se de inibidores farmacológicos para essas vias. Como esperado, quando os macrófagos foram infectados com a linhagem RB302 na presença do antioxidante N-acetil-cisteína, houve uma redução da produção de TNF-&#945; a níveis semelhantes dos macrófagos infectados com a linhagem selvagem. Em modelo de pneumonia aguda, todos os camundongos infectados com a linhagem PA14 morreram 48h pós-infecção, enquanto os camundongos infectados com a linhagem RB302 sobreviveram por mais de 60 dias após a infecção. Houve uma redução do número de bactérias nos pulmões, baço e fígado nos camundongos infectados com a linhagem RB302 em comparação aos camundongos infectados com a linhagem PA14. Também foi observado um aumento na produção de citocinas pró-inflamatórias nos camundongos infectados com a linhagem RB302 em comparação aos camundongos infectados com PA14. Com isso, foi demonstrado pela primeira vez o envolvimento de uma 1-Cys peroxirredoxina de bactérias na virulência, com a modulação da resposta imune do hospedeiro in vitro e in vivo. / Bacteria are recognized by macrophages via Toll-Like Receptors (TLR), leading to a signaling pathway that activates NF-&#954;B and MAPKs. Killing in phagossomes is achieved by reactive oxygen and nitrogen species (ROS/RNS) generation. P. aeruginosa is a common cause of ventilator associated pneumonia and it uses several strategies for virulence and defense, including antioxidant mechanisms. In this work, we show for the first time that the 1-Cys peroxiredoxin LsfA is implicated in P. aeruginosa virulence. Mutant strains with a deletion in lsfA or with a mutation (Cys45 to Ala, RB302) were constructed and they were more sensitive to H2O2 than the wild type strain PA14, as verified by a growth inhibition assay. In vitro peroxidasic activity of LsfA was measured by ferric-thiocyanate assay, and while the wild-type protein was active, the mutation in Cys45 abolished its activity. Infection of J774 macrophages with &#916;lsfA or C45A strains resulted in lower cell death, increased bacterial clearance and higher TNF-&#945; production in comparison to PA14-infected macrophages, suggesting a higher level of MAPKs and NF-&#954;B activation due to the mutant strains. To verify whether LsfA could modify the oxidative state of infected macrophages, they were infected with PA14 or RB302 strains and incubated with carboxy-H2DCFDA, an indicator that emits fluorescence when oxidized. Macrophages infected with mutant strains showed a higher oxidative state in comparison to PA14-infected cells, thus confirming that LsfA limits macrophages activation that leads to TNF-&#945; production and cytotoxic activity. MAPKs and NF-&#954;B pathways are required to full production of TNF-&#945; in macrophages infected with RB302, as shown using pharmacological inhibitors for those pathways. When macrophages were infected with RB302 in the presence of the antioxidant N-acetyl-cysteine, there was a reduction in TNF-&#945; production as compared to PA14, as expected. In an acute pneumonia model, all PA14-infected mice died at 48h post-infection, while C45A-infected mice survived as long as 60 days. There was also reduction in bacterial counts in the lungs, spleen and liver of mice infected with RB302, in comparison to PA14-infected mice. A greater pro-inflammatory cytokine production was observed in mice infected with mutant strain in comparison to mice infected with PA14. Altogether, this work shows for the first time the role of a bacterial 1-Cys Prx that modulates host immune response in vitro and in vivo.

O câncer de pulmão é o tipo de câncer mais letal em todo o mundo, contabilizando 1.3 milhões de mortes anualmente. O câncer de pulmão de não-pequenas células (CPNPC) representa aproximadamente 85% dos casos diagnosticados. Apesar de o conhecimento da biologia molecular destes tumores ter aumentado muito, o prognóstico do CPNPC continua desfavorável, com uma sobrevida média de 10 meses. Um dos motivos deste mau prognóstico é a dificuldade relacionada à detecção precoce, de modo que a maioria dos pacientes diagnosticados apresenta estágios avançados. A falta de avanço clínico se dá muitas vezes pela dificuldade de compreender o microambiente que circunda o tumor, o qual está relacionado, entre outros fatores, à capacidade metastática e a resistência à quimioterapia. Nesse contexto, o estabelecimento e o avanço do processo neoplásico resultam em uma estimulação da resposta imunológica do hospedeiro contra o avanço tumoral. Uma das células recrutadas são os macrófagos, os quais desempenham um papel fundamental tanto na resistência tumoral, quanto na progressão da neoplasia. Essas células apresentam uma plasticidade celular de amplo espectro – a qual dificulta a análise da influência dessas células em relação a determinadas patologias - podendo, de acordo com o estímulo ambiental, apresentarem propriedades anti ou pró-inflamatórias. Essa plasticidade confere ao macrófago uma característica que o faz ser central no estabelecimento do microambiente tumoral. Nesse contexto, sabe-se que os agentes quimioterápicos, e outras moléculas, induzem a morte celular, principalmente, pelo processo apoptótico, sendo que a remoção dessas células e dos corpos apoptóticos é realizada pelos fagócitos, ocorrendo, assim, uma modulação do sistema imune, principalmente em relação aos macrófagos. Portanto, o presente trabalho tem por objetivo analisar a influência dos macrófagos e da apoptose na sobrevida de pacientes com CPNPC, verificar se a fagocitose de células apoptóticas advindas de diferentes indutores apresentam diferentes capacidades imunomodulatórias sobre o macrófago e buscar ferramentas que auxiliem na caracterização dos fenótipos dos macrófagos. Para tanto, inicialmente, realizou-se uma meta-análise de dados clínicos correlacionando macrófagos e apoptose com o desfecho clínico de pacientes com CPNPC. Em seguida, induziu-se a apoptose na linhagem de CPNPC A549 com os indutores cisplatina (droga padrão-ouro na clínica), taurina cloramina (um oxidante biológico produzido por macrófagos e neutrófilos) e ácido bromopirúvico (um inibidor metabólico), sendo as células apoptóticas postas em contato com os macrófagos. Para verificar a modulação dos macrófagos, analisou-se as citocinas liberadas. Por fim, através de bioinformática e RT-PCR, criaram-se duas assinaturas gênicas de macrófagos. Nossos resultados mostraram que há discrepâncias quanto ao papel dos macrófagos e da apoptose no desfecho dos pacientes com CPNPC. Nas análises in vitro, observamos que existem diferenças entre a eficiência da fagocitose das células apoptóticas advindas do tratamento com taurina cloramina quando comparada aos demais tratamentos. Observou-se também que ocorre uma modulação diferencial nos macrófagos que fagocitaram as células apoptóticas advindas do tratamento com cisplatina e taurina cloramina. Por fim, as assinaturas gênicas criadas conseguiram caracterizar de forma robusta não somente os fenótipos dos macrófagos in vitro, mas também seus fenótipos em determinados contextos clínicos, além da capacidade de correlacionar genes com o desfecho de determinadas patologias. / Lung cancer is the most lethal type of cancer in the world, and is responsible for 1.3 million deaths annually. Non small cell lung cancer represents approximately 85% of all cases diagnosed. Even though the knowledge of the molecular biology of these tumors has increased, the prognosis of NSCLC continues to be unfavorable, with an overall survival of 10 months. One reason for this difficulty is the poor prognosis associated with early detection, since most of the patients diagnosed with this pathology have advanced stages. The lack of clinical progress occurs often due to the difficulty of understanding the microenvironment surrounding the tumor, which is related with metastatic capacity and resistance to chemotherapy. In this context, the establishment and advancement of the neoplastic process result in a stimulation of the host immune response against tumor. One of recruited immune cells are the, which plays a key role in tumor resistance or progression. These cells exhibit a broad spectrum of cellular plasticity (which results in the difficulty to correlate these cells in human pathologies) may, depending on the environmental stimulus, presenting anti or pro-inflammatory properties. This plasticity confers to macrophage a key role in the establishment of tumor microenvironment. It is known that chemotherapy agents, and other molecules induce cell death mainly by apoptosis, and the removal of these cells and apoptotic bodies by phagocytes modulates the immune system, especially macrophages. Therefore, this study aims to analyze the influence of macrophages and apoptosis in patients’ outcome and survival in NSCLC, to verify whether the phagocytosis of apoptotic cells obtained from different inducers had to capacity to modulate differently the macrophages and lastly found tools that can help in the characterization of macrophges’ phenotypes. For that, firstly was made a meta-analysis of clinical data correlating macrophages and apoptosis with clinical outcome of patients with NSCLC. Further, apoptosis was induced in NSCLC cell line A549 with the inducers Cisplatin (gold standard in clinic), Taurine Chloramine (physiological oxidant) and Bromopyruvic Acid (metabolic inhibitor), and the apoptotic cells were putted in contact with macrophages. To verify the macrophages’ modulation, we analyzed the cytokines released. Lastly, using bioinformartics and RT-PCR, we constructed two gene signatures of macrophages. Our results showed discrepancies concerning the role of macrophages and apoptosis in NSCLC patients’ outcome. In in vitro analysis, we observed that the phagocytosis efficiency of apoptotic cells induced by Taurine Chloramine was different when compared to the others treatments. We also observed a differential modulation of macrophages that phagocytosed the apoptotic cells obtained from the treatment of Cisplatin and Taurine Chloramine. Finally, the gene signatures created were capable to characterize robustly not only the macrophages’ phenotypes in vitro, but also the phenotypes in clinical contexts, predicting the correlation between genes expression and diseases outcomes.

O fungo termodimórfico Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis) é o agente causador da paracoccidioidomicose (PCM), doença endêmica na América Latina. A partir do reconhecimento de componentes fúngicos, macrófagos são ativados e adquirem propriedades que favorecem a eliminação do patógeno. Essas células produzem citocinas responsáveis pelo direcionamento da resposta adaptativa, sendo que o perfil Th1 é associado a proteção. Lectinas são proteínas que se ligam seletiva e reversivelmente a açúcares. Sua interação com glicanas da superfície de células da imunidade pode resultar em ativação e produção de citocinas, o que pode culminar em imunomodulação de efeito anti-infectivo. Nosso grupo trabalha com uma lectina de P. brasiliensis, denominada de Paracoccina (PCN) que se liga a N-acetilglicosamina. Assim, no presente trabalho objetivamos a produção de paracoccina recombinante (rPCN) expressa em Pichia pastoris e análise do papel ativador da rPCN em macrófagos. Demonstramos que esse organismo transformado secreta rPCN para o meio de cultura, com baixa contaminação de proteínas endógenas, o que possibilita o isolamento da proteína recombinante através de etapa cromatográfica única. Verificamos que a preparação obtida reproduz características da proteína nativa obtida de leveduras de P. brasiliensis e tem massa molecular aparente de 27 kDa. Demonstramos que rPCN estimula macrófagos murinos a produzirem citocinas pró-inflamatórias (IL-6, IL-12p40 e TNF-) e óxido nítrico (NO). Macrófagos estimulados com rPCN polarizam-se em direção ao perfil M1, como indicado pela maior expressão relativa de mRNA para iNOS2, SOCS3 e STAT1. Verificamos que TLR2 e TLR4 medeiam a ativação de macrófagos por rPCN, uma vez que a ausência de cada um desses receptores, com destaque para TLR4, afeta a produção de mediadores inflamatórios estimulada pelo componente fúngico. TLR4 é também responsável pela polarização de macrófagos em direção ao perfil M1, pois na ausência desse receptor não se detecta mensagem para iNOS2. Concluímos que o método de produção de rPCN via P. pastoris é eficiente e que a preparação obtida ativa macrófagos, levando-os a produzirem mediadores pró-inflamatórios e se polarizarem em direção ao perfil M1. Esses processos são essencialmente mediados por TLR4. Postula-se que paracoccina seja um agonista de TLR4 capaz de desencadear respostas que, sabidamente, conferem proteção contra a infecção por P. brasiliensis. / The dimorphic fungus Paracoccidioiddes brasiliensis (P. brasiliensis) is the causative agent of paracoccidioidomycosis (PCM), an endemic disease in Latin America. From the recognition of fungal components, macrophages are activated and acquire properties that favor the elimination of the pathogen. These cells produce cytokines that are responsible for directing the adaptive response, wherein Th1 immunity is protective. Lectins are proteins that bind selectively and reversibly to sugars. Their interaction with glycans in the surface of immune cell can result in activation and cytokine production, which may result in immunomodulatory anti-infective effect. Our group has been working with a lectin from P. brasiliensis called paracoccin (PCN) which binds to N-acetylglucosamine. In the present work we aimed to produce recombinant paracoccin (rPCN) expressed in Pichia pastoris and analysis of the role of rPCN in macrophages activation. We have demonstrated that this transformed organism secret rPCN to the culture medium and presents low contamination with endogenous proteins, which allows the isolation of recombinant protein by a single chromatography step. We found that the obtained preparation reproduces characteristics of the native protein from P. brasiliensis yeast and has apparent molecular mass of 27 kDa. We demonstrated that rPCN stimulates murine macrophages to produce pro-inflammatory cytokines (IL-6, IL-12 p40, and TNF-) and nitric oxide (NO). Macrophages stimulated with rPCN polarize toward the M1 profile, as indicated by increased relative expression of iNOS2, SOCS3, and STAT1. We found that TLR2 and TLR4 mediate macrophage activation by rPCN, since the absence of each of these receptors, especially TLR4, affects the production of inflammatory mediators stimulated by the fungal component. TLR4 is also responsible for macrophage polarization toward the M1 profile, because in the absence of this receptor, the message to iNOS2 is not detected. We conclude that the method used to rPCN production, by P. pastoris, is efficient and that the obtained preparation is able to active macrophage, inducing them to produce pro-inflammatory mediators and polarize into the M1 profile. These processes are primarily mediated by TLR4. It is postulated that Paracoccin corresponds to a TLR4 agonist, able to trigger responses that are known to provide protection against infection with P. brasiliensis.

Três décadas após a associação da infecção por HIV com o desenvolvimento da AIDS e seu reconhecimento como epidemia mundial, muitas questões permanecem em aberto e dificultam o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas e profiláticas mais satisfatórias. O desenvolvimento da AIDS é caracterizado pela tempestade de citocinas pró-inflamatórias no plasma, seguido por intensa imunossupressão e redução brusca na quantidade de células T CD4+ durante a replicação viral. Em contrapartida, macrófagos são cronicamente infectados pelo vírus e capazes de sobreviver por vários meses, atuando como importante reservatório viral. Apesar de não haver redução em número de células, macrófagos infectados apresentam problemas de diferenciação e deficiências funcionais. O reconhecimento de padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) e a presença de citocinas no microambiente celular determinam o padrão de diferenciação dos macrófagos em clássicos (M1) ou alternativos (M2). Nossos resultados indicam a reversão parcial da tempestade de citocinas no plasma durante o uso regular da terapia antirretroviral. Não foi observada liberação de óxido nítrico por macrófagos M1 e M2a após o estímulo com PAMPs, fornecendo indícios sobre o silenciamento desta via em macrófagos humanos. Macrófagos M1 e M2a de pacientes HIV+ apresentam redução progressiva na liberação de citocinas e quimiocinas após o estímulo com LPS ou -Glucana, com restauração parcial após o uso da terapia antirretroviral. Em conjunto, nossos resultados podem ser úteis no estabelecimento de um novo parâmetro para monitoramento da terapia antirretroviral, baseado na resposta funcional de macrófagos. / Three decades after the association of HIV infection with the AIDS development and its recognition as a global epidemic, many questions remain unanswered and hamper the development of new and more effective therapeutic and prophylactic approaches. The AIDS development is characterized by proinflammatory cytokines storm in plasma, followed by severe immunosuppression and abrupt reduction of CD4+ T cells during viral replication. In contrast, macrophages are chronically infected by the virus and can survive for several months, acting as important viral reservoir. However, although there is no cell number reduction, infected macrophages have several problems of differentiation and functional impairments. The recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) and the presence of cytokines in the cellular microenvironment determine the macrophage activation into the Classic (M1) or Alternative (M2) patterns. Our results indicated that cytokine storm on plasma is partially reversed during regular use of antiretroviral therapy. No release of nitric oxide was observed by M1 and M2a macrophages after stimulation with PAMPs, providing clues about the silencing of this pathway in human macrophages. Classical and alternatively activated macrophages have progressive reduction of cytokines and chemokines release after stimulation with LPS ou -Glucana, with partial restore after regular use of antirretroviral therapy. Together, our data may be useful in establishing a new approach to monitoring the antiretroviral therapy, based on functional response of macrophages.

Monócitos são células hematopoiéticas com função na imunidade inata e adquirida. De acordo com o estímulo que recebem, podem se diferenciar em macrófagos e potencializar suas funções efetoras, modulando a resposta imune e participando de vários processos fisiológicos e patológicos. Os macrófagos são muito heterogêneos e capazes de assumir diferentes fenótipos em resposta aos estímulos que recebem do microambiente. Em um ambiente gorvernado por interferon gama (IFN-γ), se diferenciam em células com aumentada capacidade de apresentação de antígenos e síntese de citocinas pró-inflamatórias (macrófagos M1). Por outro lado, quando são estimulados por interleucina-4 (IL-4), eles se diferenciam em um fenótipo antagonista com atividade de reparo (macrófagos M2). Dada a importância destas células no sistema imune, é necessário desenvolver e otimizar técnicas que sirvam de ferramentas para estudar a diferenciação de macrófagos em seus perfis fenotípicos bem como seu papel em doenças humanas. Assim, o objetivo deste estudo foi padronizar e comparar dois diferentes protocolos de isolamento de monócitos descritos na literatura e analisar seu impacto sobre a diferenciação de macrófagos. Isolamos monócitos do sangue periférico de cinco indivíduos saudáveis pelas técnicas de aderência e seleção positiva. Os monócitos foram diferenciados a macrófagos com suplementação de M-CSF. Depois da indução aos perfis M1 e M2, avaliamos marcadores de superfície celular, expressão de mRNA de citocinas, secreção de quimiocinas e fagocitose. Observamos que os métodos utilizados para isolar monócitos possuem diferentes purezas, mas que monócitos isolados por ambos métodos foram capazes de ser diferenciados a macrófagos em seus perfis M1 e M2. Análises de citometria de fluxo mostraram que há uma diminuição da expressão de CD14, principalmente em macrófagos M2, e manutenção (M2) ou aumento (m1) da expressão de HLA-DR. Monócitos (CD80-CD86high) induzidos aos fenótipo M1 são caracterizados pela regulação positiva de CD80 e regulação negativa de CD86 (CD80++CD86+). O perfil M2 foi caracterizado pela expressão de CD206high e ausência de CD163- (CD206highCD163-). A expressão do mRNA revelou que IL-1β e TNF-α foram marcadores de M1 e TGF-β e CCL18 foram marcadores de M2. Além disso, quimiocinas inflamatórias como CXCL9, CXCL10 e CCL5 foram significativamente aumentadas em macrophagos M1. Macrófagos M1 e M2 são ativos e funcionais como demonstrado no ensaio de fagocitose. Embora ambos métodos utilizados para isolar monócitos tiveram purezas diferentes, ambas técnicas forneceram monócitos capazes de serem diferenciados a macrófagos. / Monocytes are hematopoietic cells with a major role in innate and adaptative immunity. According to the stimulus they receive, they can differentiate into macrophages and enhance effector functions by modulating the immune response and participating in various physiological and pathophysiological processes. Macrophages are very heterogeneous and are able to assume different phenotypes in response to the different stimuli they receive from the microenvironment. In a proinflammatory milieu ruled by interferon gamma (IFN-γ), they differentiate into cells with increased capacity to present antigens and synthesis of proinflammatory cytokines (M1 macrophages). On the other hand, when they are stimulated with interleukin 4 (IL-4), they differentiate into an antagonist phenotype with repair activity (M2 macrophages). Given the importance of these cells in the immune system, it is necessary to develop and optimize techniques that serve as useful tools for studying the differentiation of macrophages in their different phenotypic profiles as well as their roles in human diseases. In this regard, the aim of this study was to standardize and compare two different human monocyte isolation protocols described in the literature and analyze their impact on macrophage differentiation. We isolated peripheral blood monocytes from five healthy subjects by the adherence technique and positive selection. Monocytes were differentiated into macrophages with M-CSF supplementation. After M1 or M2 induction, we evaluated cell surface markers, mRNA cytokine expression, chemokine secretion and phagocytosis. We found that the methods used to isolate monocytes have different purities, but monocytes isolated from both methods were able to differentiate into the M1 and M2 profile. The monocyte and macrophage flow cytometry analysis demonstrated that CD14 decreased expression, mainly in M2 macrophages, and maintained (M2) or increased (M1) the HLA-DR expression. Monocytes (CD80-CD86high) induced to an M1 phenotype were characterized by upregulation of CD80 and down regulation of CD86. (CD80++CD86+) The M2 profile was characterized by the expression of CD206high and absence of CD163- (CD206highCD163-). The mRNA expression revealed that IL-1β and TNF-α were M1 markers and TGF-β and CCL18 were M2 markers. Further more, inflammatory chemokines as CXCL9, CXCL10 and CCL5 were significantly increased in M1 macrophages. M1 and M2 macrophages were active and functional as shown in the phagocytic assay. Although methods used for the isolation of monocytes yielded different purities, both techniques provided monocytes able to differentiate to macrophages.

Leishmaniasis is a disease that affects humans since ancient times. In the last 20 years an increased number of cases and expansion of the geographic occurrence of leishmaniasis has taken place. In Brazil, the disease is currently found in all states, especially in the North and Northeast regions, with different epidemiological profiles. In vitro studies have shown that the hormone |Insulin-Like Growth Factor| (IGF-I) enhances Leishmania infection in macrophage in vitro and, exacerbates Leishmania infection in vivo in experimental models, treatment with IGF-1. Individuals with a natural mutation of the receptor of growth hormone-releasing hormone (GHRH) and consequent deficiency of growth hormone (GH) and IGF-I have been described in Itabianinha, Sergipe, called Isolated deficiency of growth hormone (DIGH). This mutation affects the growth weight and height, but the immune response of these individuals has not been evaluated. To better understand the role of IGF-1 in susceptibility to Leishmania infection, the purpose of this work was to study the behavior of leishmania infection in vitro in human macrophages from these individuals with IGF-1 deficiency. Leishmania amazonensis infection was compared in monocytes-derived from peripheral blood from two groups of individuals: 1) Individuals affected with homozygous deficiency of GHRH/GH/IGF-I (dwarf phenotype) (n =8), 2) Homozygous controls without this mutation (normal phenotype) (n =7). The number of infected macrophages and the parasitic load/100 macrophages was compared between these groups. These data confirm the data from experimental model that of IGF-I interferes in Leishmania-macrophage interaction, increasing the parasitic load of this infection. / A leishmaniose é uma doença que acomete o homem desde tempos remotos. Um aumento do número de casos e ampliação de sua ocorrência geográfica tem ocorrido nos últimos 20 anos. No Brasil é encontrada atualmente em todos os estados, em especial nas regiões Norte e Nordeste, sob diferentes perfis epidemiológicos. Estudos in vitro mostraram que o peptídeo Insulin-Like Growth Factor type I (IGF-I), principal mediador das ações do hormônio de crescimento (GH), aumenta a infecção de macrófagos por Leishmania. Em modelos experimentais, o tratamento com IGF-I agrava a infecção por Leishmania. Em Itabaianinha, no nordeste do Brasil, foi descrito uma grande coorte de indivíduos homozigotos para a mutação c.57+1G>A (MUT/MUT) no receptor do hormônio liberador do hormônio de crescimento (GHRH), causando um nanismo acentuado devido à deficiência isolada do hormônio de crescimento (DIGH), com concentrações séricas vitalícias muito baixas de GH e IGF-I. O propósito deste trabalho foi avaliar, in vitro, o papel do IGF-I na susceptibilidade à infecção por Leishmania, de macrófagos humanos dos indivíduos com DIGH. O comportamento da infecção in vitro com Leishmania amazonensis foi comparado em macrófagos derivados do sangue periférico de dois grupos de indivíduos: indivíduos MUT/MUT (n= 8), e indivíduos controles homozigóticos normais, N/N (n=7). O número de macrófagos infectados/100 macrófagos e a carga parasitária destes macrófagos (número de amastigotas /100 macrófagos) foram comparados entre estes grupos. Os macrófagos dos indivíduos com DIGH são mais resistentes à infecção com promastigotas de Leishmania amazonensis que os dos N/N e não parecem responder ao estímulo in vitro com IGF-I. Estes resultados comprovam em células humanas, os achados em camundongos que mostram que o IGF-I agrava a infecção na interação macrófago-Leishmania amazonensis.