A constante perda da diversidade biológica frente às pressões antrópicas tem concentrado atenções sobre a necessidade de se conhecer a diversidade genética das espécies que ainda restam como um primeiro passo para o desenvolvimento de estratégias de manejo. Técnicas de genética molecular fornecem uma estimativa do número de formas distintas numa área, bem como medidas de quão diferentes elas são. Dentre estas técnicas, o sequenciamento de DNA mitocondrial e nuclear, aliado à análise de seqüências microssatélite, geram informações potencialmente capazes de evidenciar a variação contida entre indivíduos, sendo uma ferramenta excelente para ser utilizada em análise filogenética, diferenciação interespecífica e intraespecífica. Neste trabalho utilizamos 1670pb de uma região do DNA mitocondrial incluindo o citocromo b e uma parte da região controle e 630pb do gene nuclear c-mos Para analisar a relação filogenética entre as espécies de crocodilianos brasileiros. Marcadores produzidos por PCR-RFLP baseados em seqüência do gene citocromo b no DNA mitocondrial foram desenvolvidos para a identificação molecular das seis espécies brasileiras de crocodilianos. Esta técnica além de importante na identificação das espécies poderá ser utilizada como metodologia oficial de controle da comercialização e exportação de carne e couro de jacaré. O Caiman latirostris apresenta a mais extensa distribuição geográfica entre todos os crocodilianos. No presente trabalho utilizamos marcadores microssatélites para testar a hipótese da variação genética ser relacionada com distância geográfica, em pequena e grande escala, e se a variabilidade genética das espécies esta correlacionada com diferentes sub-biomas no litoral e interior. Não foi possível a transferência de marcadores microssatélites para a espécie Paleosuchus trigonatus, sendo assim novos marcadores genéticos foram caracterizados para espécie pela construção de bibliotecas enriquecidas de DNA microssatélite. / Constant loss of biological diversity due to antropic pressure has concentrated attention upon the need to know the genetic diversity of remaining species as the first step in developing management strategies. Molecular techniques provide an estimate of the number of distinct forms, as well as measurements of the extent of their differences. Among these techniques, mitochondrial and nuclear DNA sequencing along with microsatellite sequences provide information that is potentially capable of detecting any variation between individuals, which makes it an excellent tool for phylogenetic analyses, as well as inter and intraspecific differentiation. In the present work, we used a 1670bp region of mitochondrial DNA including cytochrome b and a 630bp portion of the nuclear gene c-mos to analyze the phylogenetic relationship among Brazilian crocodilian species. PCR-RFLP markers based on cytochrome b mitochondrial DNA were developed for the molecular identification of six Brazilian crocodilian species. This technique is not only important for the identification of species, but it is also useful as an official methodology for controlling commercialization and exportation of crocodilian meat and leather. Broad-snouted caimans (Caiman latirostris) geographic distribution comprises one of the widest latitudinal ranges among all crocodilians. In the present study, we used microsatellite markers to test the hypothesis that genetic variation is related to geographic distance, on a small and large scale, and if the genetic variability of a species is correlated to coastal and inland subbiomes. It was not possible to transfer microsatellite markers to Paleosuchus trigonatus, so new genetic markers were characterized for the species by constructing a microsatellite enriched DNA library.

A técnica de PCR pode ser empregada para a detecção e identificação de agentes patogênicos e, tem por isso grande aplicabilidade em estudos de epidemiologia molecular. Particularmente no que se refere às infecções por Leishmania spp., a detecção do seu agente é de suma importância em animais sorologicamente positivos, no caso de inquéritos para a detecção direta em vetores e em animais de vida livre, cujo anti-soro para provas sorodiagnósticas, não são disponíveis. A PCR ainda pode oferecer o recurso de identificação molecular do agente em pesquisa, quando marcadores filogeneticamente informativos são amplificados e seqüenciados. Neste sentido, foi realizado o presente trabalho, cujo objetivo foi avaliar o desempenho analítico e diagnóstico de PCRs baseadas em primers direcionados a marcadores universais para diagnosticar Leishmania spp. localizados em dois genomas da célula parasitária, a saber, kDNA (maxicírculo e minicírculo) e DNA nuclear. Foram avaliadas PCRs baseadas em primers direcionados ao (i) DNA de kinetoplasto (kDNA) minicirculo, ao gene codificador de Citocromo B e Citocromo C Oxidase subunidade II presentes no (ii) kDNA maxicírculo, e ao gene codificador Citicromo C, presente no (iii) DNA nuclear. Pelos resultados infere-se que a PCR direcionada ao kDNA de minicírculo apresentou uma sensibilidade analítica muito superior às PCRs direcionadas ao DNA maxicirculo e nuclear. Pelo menos uma combinação dos primers de cada marcador foi capaz de detectar DNA de todas as espécies da Coleção de Leishmania do Instituto Oswaldo Cruz (CLIOC), tornando-os uma ferramenta útil para identificação de espécies de Leishmania spp. A PCR direcionada ao kDNA de minicírculo apresentou uma sensibilidade diagnóstica também muito superior às PCRs direcionadas ao DNA maxicirculo e nuclear. Amostras de baço e medula óssea produzem informações complementares para diagnóstico post-mortem de Leishmania spp. em cães soropositivos. Finalmente, as amostras de aspirado de medula óssea demonstraram ser uma alternativa confirmatória para o diagnóstico laboratorial do agente em animais soropositivos assintomáticos. / The PCR technique can be employed for the detection and identification of pathogens, and therefore has wide application in molecular epidemiology studies. Particularly in relation to infection by Leishmania spp., the detection of its agent is important in seropositive animals, in the case of surveys for direct detection in vectors and in free-living animals, whose anti-serum for serodiagnosis test are not available. PCR can also offer the molecular identification of the agent, when phylogenetically informative markers are amplified and sequenced. In this sense, we performed the present study, whose aim was to evaluate the analytical and diagnostic performance of PCR based on universal primers that target markers to diagnose Leishmania spp located in two distinct genomes of the parasite cell, namely, kDNA (maxicírcle and minicircle) and nuclear DNA. PCRs were evaluated based on primers targeted to the kinetoplastids (i) DNA (kDNA) minicircles, the cytochrome B and cytochrome C oxidase subunit II genes present in the (ii) kDNA maxicircle and the gene encoding Citicromo C, present in (iii) nuclear DNA. Based on the results, the PCR directed to the kDNA minicircle showed an analytical sensitivity much higher than the PCR targeting the kDNA maxicircle and nuclear DNA. At least one combination of primers of each marker was able to detect DNA from all CLIOC - Leishmania collection of Oswald Cruz institute species, which qualifies a useful tool for species identification of Leishmania spp. The PCR targeted to minicircle kDNA also showed to have a diagnostic sensitivity much higher than PCRs directed to kDNA maxicircle and nuclear DNA. Spleen and bone marrow samples produces additional information post-mortem diagnosis of Leishmania spp. on seropositive dogs. Finally, samples of bone marrow aspirate are an alternative for confirmatory laboratory diagnosis of the agent in asymptomatic seropositive animals.

O gênero Helicoverpa Hardwick, 1965 (Lepidoptera: Noctuidae: Heliothinae) compreende insetos pragas de distribuição cosmopolita. Historicamente no Brasil, H. zea (Boddie) é a principal praga do gênero, no entanto, em 2013 foi reportado pela primeira vez no território brasileiro H. armigera (Hübner). Estudos filogenéticos, morfológicos e ecológicos têm relacionado estas duas espécies como irmãs. A possibilidade de hibridação entre H. armigera e H. zea em condições naturais desperta interesse sobre os mecanismos genéticos, reprodutivos, de desenvolvimento e comportamentais de especiação dessas espécies. Além disso, H. armigera e H. zea são pragas severas para diversos cultivos, o que torna o entendimento destes processos crucial para o desenvolvimento de estratégias de controle. Dentro deste contexto, nosso objetivo foi confirmar a viabilidade e a adaptabilidade da prole híbrida entre as linhagens brasileiras de H. zea e H. armigera. Associado a isso, nós também testamos a tolerância da linhagem híbrida a deltametrina e plantas geneticamente modificadas (Bt). E por último, aplicamos marcadores moleculares em indivíduos oriundos do campo para identificar a ocorrência natural de possíveis indivíduos híbridos em diferentes cultivos e regiões do território brasileiro. Nossos resultados confirmam a possibilidade de surgimento de uma prole híbrida fértil entre as linhagens brasileiras de H. zea e H. armigera. Assim como os marcadores nucleares sugerem a presença de indivíduos híbridos em condições naturais no território brasileiro. Os mecanismos pré-copulatórios de especiação parecem ser menos efetivos na manutenção do isolamento reprodutivo, visto que os testes de escolha revelaram cruzamentos interespecíficos recíprocos entre as espécies. A linhagens híbridas tiveram um menor intervalo de tempo entre cada geração (T) ao serem comparadas com as linhagens parentais puras, porém a capacidade de fêmeas gerarem fêmeas e a capacidade de manter a população em crescimento (Ro, rm,) foram menores que as linhagens puras, indicando uma tendência à extinção das populações ao longo das gerações. As proles híbridas tiveram índice de sobrevivência a deltametrina equivalente ao da linhagem parental H. armigera, já os indivíduos híbridos da geração F2 (F1xF1) apresentaram menor sobrevivência em relação a H. armigera. Não houve sobrevivência das linhagens parentais e híbridas nos testes de sobrevivência ao algodão Bt. A baixa viabilidade de cruzamentos híbridos em laboratório e a baixa frequência no campo confirmaram isolamento reprodutivo entre H. zea e H. armigera, mesmo que parcial. / The genus Helicoverpa Hardwick, 1965 (Lepidoptera: Noctuidae: Heliothinae) includes insect pests of cosmopolitan distribution. Historically in Brazil, H. zea is the main pest of the genus (Boddie), however in 2013 H. armigera (Hübner was first reported in Brazil). Phylogenetic, morphological and ecological traits have suggested these two species are \"sibling species\". The possibility of hybridization between H. armigera and H. zea under natural conditions arouses interest in genetic, reproductive, developmental and behavioral mechanisms of speciation between these species. In addition, H. armigera and H. zea are severe pests in several crops, which makes the understanding of these processes critical to the development of control strategies. Within this context, our goal was to carry out interspecific bioassays of behavior and development to confirm the viability and fitness of hybrid offspring between Brazilian strains of H. zea and H. armigera. Furthermore, we tested the tolerance of the hybrid strains to deltamethrin and genetically modified cotton plant (Bt). Finally, we applied molecular markers in specimens from different regions and hosts to identify the possible occurrence of natural hybrid specimens in Brazil. Our results confirm the possibility of emergence of a fertile hybrid offspring between Brazilian strains of H. zea and H. armigera. In addition nuclear markers suggest the presence of individual hybrids in natural conditions in Brazil. Pre-copulatory speciation mechanisms are not effective in the maintenance of reproductive isolation, since the choice tests showed reciprocal interspecific crosses between species. The hybrid strains showed lower developmental time among generations (T) when compared with the parental strains. However, hybrid females have lower reproductive capacity and maintaining growing population (Ro, RM, λ), indicating an extinction trend of populations over generations. The hybrid individuals F1 showed equivalent survival to deltamethrin than H. armigera parental strain, however hybrid individuals F2 (F1xF1) showed lower survival to H. armigera. There were no survival of the parental and hybrid strains to Bt cotton. The low viability of interspecific crosses in the laboratory and the low frequency in the field confirmed reproductive isolation between H. zea and H. armigera Brazilian strains, even partial.

The use of stem cells is a promising therapeutic approach for tissue engineering by their ability to boost tissue regeneration, and to model in vitro human genetics disorders since it provides continuous supplies of cells with differentiation potential. Our study has been focused in the identification of molecules or mechanisms that could contribute to a better osteogenesis in mesenchymal stem cells (MSC). To achieve our goals we have explored the osteopontential differences of stem cells from different sources. In this regard, we have observed that MSCs from human exfoliated deciduous teeth (SHED) presented higher in vitro osteogenic differentiation potential (OD) as compared to MSCs derived from human adipose tissue (hASCs). Through microarray analysis and cell sorting, we have shown that IGF2 and CD105 expression levels contribute to these osteopontential cell differences, that is, higher IGF2 expression levels and lower CD105 expression levels were associated with the increased osteogenic potential of SHED as compared to hASCs. The molecular mechanisms associated with the diferent expression levels of IGF2 and CD105 in these cells were also investigated. Despite the advantages of adult MSCs they can exhibit drawbacks such as restricted self-renewal and limited cell amounts. Induced Pluripotent Stem Cells (iPSC) technology has emerged as an alternative cell source, as they provide more homogeneous cellular populations with prolonged self-renewal and higher plasticity. We verified that the OD of MSC-like iPSC differs from MSCs and it depends on the iPSCs originating cellular source. Comparative in vitro osteogenesis analysis showed higher osteogenic potential in MSC-like cells derived from iPS-SHED when compared with MSC-like cells from iPS-FIB and SHED. iPSCs can be also used as a tool to model genetic disorders. We have thus proposed to verify if it could be possible to in vitro model Treacher-Collins syndrome, a condition with deficient craniofacial bone development. We have compared the effects of pathogenic mutations in TCOF1 gene in cell proliferation, differentiation potential between MSCs, dermal fibroblasts, neural-crest like and MSC-like cells differentiated from iPSCs.TCS cells showed changes in cell properties anddysregulated expression of chondrogenesis markers during osteogenic and chondrogenic differentiation. In summary, the comparative analysis of stem cells of different sources allow us to identify markers that may facilitate osteogenesis and that it is possible to establish an in vitro model to Treacher-Collins syndrome / O uso de células-tronco trata-se de uma abordagem terapêutica promissora para a engenharia de tecidos, devido à sua capacidade na regeneração de tecidos, e para modelamento in vitro de distúrbios genéticos humanos, uma vez que fornece um abastecimento contínuo de células com potencial de diferenciação. Nosso estudo se propos a identificar moléculas e mecanismos que contribuem na otimização da osteogênese de células-tronco mesenquimais (MSCs). Para atingir nossos objetivos exploramos as diferenças no potencial osteogênico (PO) de MSCs de diferentes fontes. Observamos que MSCs de polpa de dente decíduo humano (SHED) apresentaram maior PO em comparação com as MSC derivadas de tecido adiposo humano (hASCs). Através de análise de microarray de expressão e cell sorting, demonstramos que os níveis de expressão de IGF2 e CD105 contribuem para as diferenças do PO, onde a maior expressão de IGF2 e menor expressão de CD105 estão associadas a maior PO em SHED quando comparado as hASCs. Também investigamos os mecanismos moleculares associados aos diferentes níveis de expressão de IGF2 E CD105 em ambas as fontes celulares. Apesar das vantagens, as MSCs podem apresentar pontos negativos como restrita auto-renovação e menor quantidade de células. Células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) surgem como uma fonte celular alternativa, proporcionando populações celulares homogêneas com auto-renovação prolongada e maior plasticidade. O PO de MSC-like iPSC difere de MSCs, e este potencial é dependente da fonte celular em que as iPSCs são obtidas. Análise comparativa de PO in vitro demonstrou maior osteogênse em células MSC-like derivadas de iPS-SHED quando comparada as células MSC-like de iPSCs-fibroblastos e SHED. iPSCs também podem ser utilizadas como ferramenta para investigar doenças genéticas humanas. Propomos a modelagem in vitro da síndrome de Treacher-Collins (TSC), doença que acomete as estruturas craniofaciais durante o desenvolvimento ósseo. Comparamos os efeitos de mutações patogênicas no gene TCOF1 na proliferação celular, potencial de diferenciação entre MSCs, fibroblastos dérmicos, neural-crest like e células MSC-like diferenciadas de iPSCs. Células de pacientes TCS exibiram alterações em propriedades celulares e na expressão de marcadores osteogênicos e condrogênicos. Em resumo, a análise comparativa de células-tronco de diferentes fontes permitiu a identificação de marcadores e mecanismos que podem facilitar a osteogênese e tambem demonstramos que é possível modelar in vitro a síndrome de Treacher-Collins

Made available in DSpace on 2017-07-25T19:30:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lilian Schafascheck.pdf: 1885444 bytes, checksum: 0039d2e4db0312592da136c4b19798b8 (MD5) Previous issue date: 2015-12-10 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The wheat breeding starts with the selection of the parent to make the crossing blocks, aiming at segregating populations with high yield potential and divergent, to evaluate the adaptability and phenotypic stability in different wheat regions. Therefore, the objectives of this study were to estimate the genetic dissimilarity among wheat genotypes through agronomic characterization, molecular genotyping and coefficient parentage, cluster analyses of genotypes by means of multivariate statistical methods, and to evaluate the adaptability and phenotypic stability by GGE biplot methodology. It was evaluated 43 new wheat lines developed by the breeding program of UEPG and cultivar commercial Safira®. The genetic dissimilarity among the genotypes was obtained from the Generalized Mahalanobis Square Distance (D2) through seven agronomic traits, coefficient parentage (COP) and Jaccard index for SSR and AFLP markers. The genotypes were grouped according to the genetic dissimilarity through the UPGMA and principal component analysis (PCA) methods. The principal component analysis (PCA) enabled the reduction the set of seven variables on three principal components, explaining 67% of the total phenotypic variance. The coefficients of the eigenvectors indicated that the CP1 was more related to grain quality (thousand kernels weight and weight hectoliter) and the vegetative cycle. CP2 in most was influenced by the grain yield (48.4%) and CP3 negatively associated with the plant height (72.08%). CP analysis allowed the identification of groups of different wheat genotypes through agronomic characteristics. The dendrograms obtained through molecular genotyping (SSR and AFLP) and agronomic characterization demonstrated the formation of eight groups, while the coefficient parentage only five groups of genotypes. The cophenetic correlations between the matrices of genetic dissimilarity were low. Nevertheless, the analysis methods were efficient in estimating the genetic dissimilarity among the genotypes and enabled highlight wheat lines which showed higher agronomic performance. To estimate the adaptability and stability of wheat genotypes were evaluated in crops 2010, 2011 and 2012 in Ponta Grossa, for characteristics plant height, reproductive cycle and grain yield. From the results of the graphical analysis, it could identify the ideals genotypes characterized by high agronomic adaptation combined with phenotypic stability. The lines of the UEPG program L8, L15, L17, L31, L34, L38 and L40 showed high adaptation agronomic and phenotypic stability for grain yield. This group of wheat lines showed higher potential productive than that commercial cultivar Safira®, making them strong candidates in the future as new commercial cultivars recommended for the municipality of Ponta Grossa. / O melhoramento genético de trigo inicia com a seleção dos parentais para compor os blocos de cruzamentos, visando populações segregantes com alto potencial produtivo e divergente, até a avaliação da adaptabilidade e estabilidade fenotípica nas diferentes regiões tritícolas. Diante disso, os objetivos deste trabalho foram estimar a dissimilaridade genética entre genótipos de trigo através da caracterização agronômica, da genotipagem molecular e do coeficiente de parentesco, realizar a análise de agrupamento dos genótipos por meio de métodos estatísticos multivariados, bem como avaliar a adaptabilidade e estabilidade fenotípica através da metodologia GGE biplot. Foram avaliadas 43 novas linhagens de trigo desenvolvidas pelo programa de melhoramento da UEPG e a cultivar comercial Safira®. A dissimilaridade genética entre os genótipos foi obtida a partir da Distância Quadrada Generalizada de Mahalanobis (D2) através de sete características agronômicas, do coeficiente de parentesco (COP) e do índice de Jaccard para os marcadores SSR e AFLP. Os genótipos de trigo foram agrupados de acordo com a dissimilaridade genética através dos métodos UPGMA e da análise de componentes principais (ACP). A análise de componentes principais (ACP) possibilitou a redução do conjunto de sete variáveis em três componentes principais, explicando 67% da variância fenotípica total. Os coeficientes dos autovetores indicaram que o CP1 foi mais relacionado a qualidade de grãos (peso de mil grãos e peso do hectolitro) e ao ciclo vegetativo. O CP2 em maior parte foi influenciado pelo rendimento de grãos (48,4%) e o CP3 associado negativamente com a estatura de plantas (72,08%). A análise CP permitiu a identificação de diferentes grupos de genótipos de trigo a partir da caracterização agronômica. Os dendrogramas obtidos da genotipagem molecular (SSR e AFLP) e da caracterização agronômica demonstraram a formação de oito grupos, enquanto pelo coeficiente de parentesco apenas cinco grupos de genótipos. As correlações cofenéticas entre as matrizes de dissimilaridade genética foram baixas. Apesar disso, as metodologias de análise foram eficientes em estimar a dissimilaridade genética entre os genótipos e possibilitaram destacar as linhagens de trigo que evidenciaram desempenho agronômico superior. Para estimar a adaptabilidade e estabilidade os genótipos de trigo foram avaliados nas safras de 2010, 2011 e 2012 em Ponta Grossa, para as características estatura de planta, ciclo reprodutivo e rendimento de grãos. A partir dos resultados da análise gráfica, foi possível identificar os genótipos ideais, caracterizados pela alta adaptação agronômica e estabilidade fenotípica. As linhagens do programa de melhoramento da UEPG L8, L15, L17, L31, L34, L38 e L40 evidenciaram alta adaptação agronômica e estabilidade fenotípica para o rendimento de grãos. Esse grupo de linhagens de trigo apresentou potencial produtivo superior a cultivar comercial Safira®, tornando-as no futuro fortes candidatas como novas cultivares comerciais recomendadas para o município de Ponta Grossa.

Este trabalho teve como objetivos estudar o relacionamento genético entre espécies do gênero Passilfora, utilizando análises filogenéticas, morfométricas e marcadores microssatélites. Na literatura, a variação no formato das folhas das passifloras é tida como uma estratégia de escape contra o ataque de borboletas da tribo Heliconiinae. As análises revelaram que a variação foliar é determinada basicamente pela inércia filogenética, porém fatores seletivos relacionados à estratégia de escape também agem nesta característica. Os microssatélites são, hoje, a classe mais informativa existente de marcadores moleculares. Assim, duas bibliotecas enriquecidas em seqüências contendo microssatélites, uma derivada de P. pohlii e outra de P. alata, foram construídas com o objetivo de desenhar primers que amplificassem essas regiões repetitivas. Os marcadores microssatélites apresentaram altas taxas de transferibilidade, revelando sua utilidade em estudos genéticos não apenas para as espécies utilizadas na construção da biblioteca, mas também para espécies da família Passifloraceae. / This work aims at studying the genetic relationship among species of the Passiflora genus, using phylogenetic, morphometric and microsatellite marker analyses. In the literature, variation in leaf shape of the passifloras is taken as a strategy of escape against butterflies from the Heliconiinae tribe. Analysis showed that variation in leaf shape is determined basically by phylogenetic inertia; however, selective factors related to escape strategy are acting on this character too. Microsatellites are the most informative class of molecular markers existing nowadays. So, two libraries enriched with microsatellite sequences, one derived from P. pohlii and other from P. alata, were constructed with the aim of designing primers to amplify those repetitive regions. The microsatellite markers did show a high transferability ratio, revealing their utility in genetic studies, not only for the species used on the library construction, but also to species of the Passifloraceae family.

Leguminosas do gênero Stylosanthes são amplamente utilizadas na pecuária Brasileira e por sua alta qualidade nutricional são importantes para pastagens em consorcio com gramíneas. Um dos materiais mais cultivados é o denominado Campo Grande, lançado pela EMBRAPA Gado de Corte e formado pela mistura das espécies Stylosanthes capitata Vog. (80%) e Stylosanthes macrocephala M.B Ferreira et Sousa Costa (20%). De ambas as espécies que formam essa mistura, a espécie S. capitata vem sendo utilizada na pesquisa do Projeto Temático FAPESP Nº 08/58075-8 Experimentos FACE para analisar os efeitos do elevado CO e do aquecimento sobre a fotossíntese, expressão gênica, bioquímica, crescimento, dinâmica de nutrientes e produtividade de duas espécies forrageiras tropicais contrastantes que tem por objetivo determinar os efeitos do elevado nível de CO2 e do aquecimento nas espécies forrageiras S. capitata e Panicum maximum crescendo em consorcio. Antes do plantio, foi observado que o lote de sementes de S. capitata, enviadas gentilmente pela EMBRAPA Gado de Corte, apresentava sementes de diversa coloração desde amarelas, vermelhas até pretas. Em vista que a análise da expressão gênica das plantas submetidas aos tratamentos de CO2 e temperatura é um dos objetivos do projeto, surgiu a necessidade de fazer uma avaliação mais rigorosa das sementes a fim de determinar a pureza genética do lote de sementes de S. capitata, assim como determinar a presença de possíveis contaminações com S. macrocephala. Sendo assim, este trabalho teve como objetivo avaliar a pureza genética de plantas da espécie S. capitata em comparação a S. macrocephala, selecionando e utilizando marcadores moleculares ideais para essa análise. Para a etapa de seleção dos marcadores, foram plantadas separadamente as sementes de diferentes cores de cada uma das espécies S. capitata e S. macrocephala. Depois de germinadas, o DNA das folhas foi extraído e analisado com os três tipos de marcadores moleculares disponíveis, RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), SSR (Simple Sequence Repeat) e ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat polymorphic DNA). Os marcadores moleculares RAPD (OPB10), SSR (SC18-01B3, SC18-01E11, SC18-01TF11A) e ISSR (UBC1, UBC2, UBC834, UBC851, UBC862, UBC864, UBC885, UBC886) foram testados, dos quais os ISSR mostraram-se ideias, pois apresentaram claros perfis eletroforéticos diferenciando cada uma das espécies. Posteriormente à análise das sementes, foi realizada a análise de pureza genética de material vegetal de S. capitata plantado no campo para o referido projeto temático. Uma vez que S. macrocephala não foi objeto de pesquisa do projeto, sementes desta espécie foram plantadas separadamente em oito vasos, com vinte sementes cada. Após o crescimento das plantas, o DNA de folhas de ambas as espécies foi extraído e amplificado com os marcadores moleculares ISSR previamente selecionados. Através de análises estatísticas dos perfis de eletroforese, foi possível verificar que as sementes de diferentes cores pertencem à mesma espécie e que a diferente coloração estaria mais relacionada com o grau de amadurecimento das sementes do que com possíveis contaminações. No entanto, independentemente da cor, os lotes individuais de sementes de S. capitata e S. macrocephala apresentaram algum grau de contaminação. Assim, conclui-se que para a melhor caracterização da espécie em estudo e aumentar a confiabilidade das análises de expressão gênica diferencial é necessário avaliar a pureza genética de S. capitata usando marcadores moleculares. A análise da expressão gênica diferencial permitirá determinar os efeitos de elevada concentração de CO2 e da elevada temperatura a nível molecular nas plantas forrageiras em estudo. / Legumes of the genus Stylosanthes are widely used in Brazilian cattle and for their high nutritional quality are important in consortium with grasses. One of the most cultivated materials is called \"Campo Grande\" released by EMBRAPA Gado de Corte and formed by the mixture of species Stylosanthes capitata Vog. (80%) and Stylosantes macrocephala MB Ferreira et Sousa Costa (20%). Of both species forming this mixture, the species S. capitata has been used in research of the Thematic Project FAPESP No. 08/58075-8 \"FACE experiments to analyze the effects of elevated CO and warming on photosynthesis, gene expression, biochemistry, growth, nutrient dynamics and productivity of two contrasting tropical forage species\" that aims to determine the effects of high levels of CO2 and warming on forage species S. capitata and Panicum maximum growing in consortium. Before planting, it was observed that the lot of seeds of S. capitata, kindly sent by EMBRAPA, presented seeds of different coloration from yellow, red to black. Given that the analysis of gene expression in plants exposed to elevated CO2 and warming is one of the major objectives, we decided to make a more accurate assessment of the seeds in order to determine the genetic purity of the seeds of S. capitata, as well as determine the presence of possible contamination with S. macrocephala. Therefore, this study aimed to evaluate the genetic purity of the species S. capitata plants compared to S. macrocephala, selecting and using ideal molecular marker for this analysis. For the selection of markers, were separately planted in pots the seeds of different colors of each of the species S. capitata and S. macrocephala. Once germinated, DNA was extracted from leaves and analyzed with the three available types of molecular markers, RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), SSR (Simple Sequence Repeat) and ISSR (Inter-simple sequence Repeat Polymorphic DNA). The RAPD molecular markers (OPB10), SSR (SC18-01B3, SC18-01E11, SC18-01TF11A) and ISSR (UBC1, UBC2, UBC834, UBC851, UBC862, UBC864, UBC885, UBC886) were tested, of which the ISSR were the selected, because they showed clear electrophoretic profiles differentiating each species. After the seed analysis, the analysis of genetic purity of plant material of S. capitata planted in the field for the thematic project was held. Once S. macrocephala was not the object of the research project, seeds of this species were planted separately in eight pots, with twenty seeds each. After the growth of plants, DNA from leaves of both species was extracted and amplified with the preselected molecular ISSR. Through statistical analysis of electrophoretic profiles, we found that seeds of different colors belong to the same species and the different coloring would be more related to the degree of ripening of seeds than with possible contamination. However, regardless of color, individual seed lots of S. capitata and S. macrocephala showed contamination. Thus, it is concluded that for better characterization of this species and increase the reliability of the analysis of differential gene expression is necessary to assess the genetic purity of S. capitata using molecular markers. The analysis of differential gene expression will determine the effects of elevated CO2 concentration and high temperature at the molecular level in forage plants under study.

Apesar do grande desenvolvimento das biotecnologias da reprodução animal, como a produção in vitro de embriões (PIV), o diagnóstico genético pré-implantacional (PGD) ainda é aplicado com restrição na rotina da transferência de embriões em animais. Os recentes avanços da genômica têm permitido associar características fenotípicas com informações moleculares, possibilitando a realização da seleção assistida por marcadores moleculares. O objetivo do presente estudo foi de realizar o PGD de embriões bovinos em plataforma de alta densidade de SNP (BeadChip/6.909 SNP). A pequena quantidade de DNA genômico (gDNA) obtida na biópsia embrionária é a principal limitação para a análise de grande número de SNP. Dessa forma, a metodologia de amplificação total do genoma (WGA) (Repli-g Mini Kit, Qiagen, Hilden, Alemanha) foi utilizada para aumentar a quantidade de gDNA da biópsia e permitir a análise de milhares de SNP simultaneamente. Foram utilizados 88 embriões bovinos PIV, submetidos à micromanipulação pela técnica de microaspiração, possibilitando a formação de 3 grupos com diferentes números de células biopsiadas: G1) 5-10 (n=28); G2) 10-20 (n=37); G3) >100 - blastocisto eclodido (n=23). Todas as amostras foram submetidas ao mesmo protocolo de WGA e 4&micro;L de cada amostra foram utilizados para a genotipagem em plataforma iScan/Illumina. A qualidade dos genótipos foi avaliada pela análise do Call Rate (CR), 10o percentil do GCScore (GC10), Alelle Drop In (ADI) e Alelle Drop Out (ADO). O teste de Kruskal-Wallis foi utilizado para investigar diferenças na distribuição das variáveis entre os grupos. O coeficiente de correlação de postos de Spearman revelou correlação significativa entre todas as variáveis. Os resultados apresentaram correlação positiva entre o CR e GC10 (0,99/P<0,001), enquanto as taxas de ADI e ADO apresentaram correlação negativa com o CR e CG10 (ADI/CR: - 0,87; ADI/GC10:-0,88; ADO/CR:-0,87; ADO/GC10:-0,86), com P<0,001 para todas as variáveis. O teste de Kruskal-Wallis apontou para diferença significativa em todas as variáveis analisadas (CR, GC10, ADI e ADO) entre os 3 grupos de biópsias (G1, G2 e G3). O CR médio foi de 59,26%, 78,47% e 95,97%, para G1, G2 e G3, respectivamente. Foi desenvolvido programa computacional (mendelFix) baseado na Lei da Segregação, para inferência dos genótipos não determinados baseado no genótipo do progenitores, aumentando o CR dos grupos 1, 2 e 3 para 79,69%, 88,20% e 97,28%, respectivamente. Os resultados do presente estudo permitem concluir que é possível realizar a genotipagem de embriões bovinos em plataforma de alta densidade de SNP com amostras submetidas ao protocolo WGA/MDA, mas o número de células obtidas na biópsia embrionária afeta a qualidade da genotipagem. A associação das biotecnologias descritas no presente trabalho permite a aplicação da seleção assistida por marcadores moleculares em embriões bovinos, contribuindo para acelerar ainda mais o processo de melhoramento genético animal. / Despite the great development of animal reproduction biotechnology, such as embryo in vitro production (IVP), preimplantation genetic diagnosis (PGD) is still applied with restraint in animals embryo transfer. Recent advances in genomics have associated phenotypic characteristics with molecular information, allowing the development of marker assisted selection. The aim of this study was to perform PGD in bovine embryos using high-throughput SNP platform (BeadChip/6,909 SNP). The small amount of genomic DNA (gDNA) obtained from embryo biopsy is the main limitation for the high-density SNP analysis. Thus, the Whole Genome Amplification (WGA) (Repli-g Mini Kit, Qiagen, Hilden, Germany) was used to increase the amount of gDNA from embryo biopsy and allow the analysis of thousands SNP simultaneously. Eighty-eight IVP bovine embryos were subjected to micromanipulation by microaspiration, allowing the formation of three groups with different numbers of biopsied cells: G1) 5-10 (n=28); G2) 10-20 (n=37); G3) > 100 - hatched blastocyst (n = 23). All samples were subjected to the same WGA protocol, and 4&micro;L of each sample were used for genotyping on iScan/Illumina platform. The genotyping quality was assessed using the Call Rate (CR), 10th percentile GCScore (GC10), Alelle Drop In (ADI) and Alelle Drop Out (ADO). Kruskal-Wallis test was applied to investigate differences in the distribution of variables among groups. Spearman`s rank correlation coefficient revealed a significant correlation between all variables. The results showed a positive correlation between CR and GC10 (0.99/P <0.001), while ADI and ADO rates were negatively correlated with CR and CG10 (ADI/CR: -0.87; ADI/GC10: - 0.88; ADO/CR: -0.87; ADO/GC10: -0.86), P<0.001 for all variables. Kruskal Wallis pointed to significant differences in all variables (CR, GC10, ADO and ADI) among the 3 groups of biopsies (G1, G2 and G3). The CR average was 59.26%, 78.47% and 95.97% for G1, G2 and G3, respectively. Was developed a script (mendellFix) based on the \"Law of Segregation\", for inference of not determined genotypes based on the parents genotypes, thus increasing the CR of group 1, 2 and 3 to 79.69%, 88.20% and 97 28%, respectively. The results of this study show that it is possible to perform the genotyping of bovine embryos in highthroughput SNP platform with samples subjected to WGA/MDA protocol, but the number of cells obtained by embryo biopsy affects the quality of genotyping. The association of biotechnologies described in this work allows the application of marker-assisted selection in bovine embryo, contributing to further accelerate the process of animal breeding.

O principal objetivo deste trabalho foi avaliar a presença de polimorfismos e de possíveis associações com características relacionadas com a resistência às parasitoses gastrintestinais e a prolificidade em ovinos da raça Santa Inês. Para avaliação da resistência às parasitoses gastrintestinais, amostras de fezes e de sangue de aproximadamente 700 animais, infectados naturalmente e oriundos de quatro propriedades diferentes, foram coletadas entre os meses de outubro e novembro de 2011, para avaliação das características condição corporal, grau de anemia avaliado pelo cartão FAMACHA, as características dos pelos dos animais, consistência das fezes, contagem de ovos por grama de fezes, hematócrito, contagem de células brancas, contagem de células vermelhas, hemoglobina e plaquetas. Para a avaliação da prolificidade, 340 ovelhas foram avaliadas quanto ao número total de cordeiros nascidos, divididos pelo número de partos de cada ovelha, assim como a correlação dessa característica com o peso médio ao nascimento de seus cordeiros e a eficiência produtiva da mãe ao parto. Foram selecionados 28 polimorfismos de base única (SNP) para o desenvolvimento deste estudo os quais foram genotipados por meio da plataforma Sequenom MassARRAY iPLEX. Foram analisadas as freqüências alélicas e genotípicas, o equilíbrio de Hardy-Weinberg, os efeitos de substituição alélica, de aditividade e de desvio de dominância. Os resultados obtidos demonstraram variabilidade considerável das características avaliadas na população e da maioria dos polimorfismos estudados. Foi verificado também efeito significativo (p&le;0,05) ou sugestivo (0,05&gt;p&le;0,10) de substituição alélica de pelo menos um SNP para cada uma das características avaliadas, indicando que esses polimorfismos podem auxiliar nos processos de seleção das características relacionadas com a resistência às parasitoses gastrintestinais e com a prolificidade. / The aim of this work was to evaluate the presence of polymorphisms and possible associations with characteristics associated with resistance to gastrointestinal parasites and prolificacy in Santa Ines sheep. To evaluate the resistance to gastrointestinal parasites, feces and blood samples of approximately 700 animals infected naturally and from four different properties, were collected between the months of October and November, 2011 to assess characteristics body condition, degree of anemia measured by FAMACHA card, the characteristics of the hair of sheep, feces consistency, egg counts per gram of feces, hematocrit, white blood cell count, red blood cell count, hemoglobin and platelets count. For the evaluation of prolificacy, 340 sheep were evaluated for the total number of lambs born, divided by the number of births from each dam, as well as the correlation of this feature with the average birth weight of their lambs and productive efficiency of dam. 28 single nucleotide polymorphisms (SNPs) were selected for the development of this study and were genotyped by Sequenom MassARRAY iPLEX platform. Allele and genotype frequencies, the Hardy-Weinberg equilibrium, the effects of allelic substitution, additivity and dominance deviation were analyzed. The results showed considerable variability of the characteristics evaluated in the population in study and in most of the polymorphisms. Significant effect was observed (p &le; 0.05) or suggestive (0.05&gt; p &le; 0.10) for allelic substitution of at least one SNP for each of the evaluated traits, indicating that these polymorphisms may help in the selection processes of characteristics related to resistance to gastrointestinal parasites and prolificacy.

O pinhão manso é uma pequena árvore tropical que adquiriu importância econômica pelo conteúdo de óleo em suas sementes e pela possibilidade de sua utilização para produção de biocombustível. As sementes e o óleo do pinhão manso são tóxicos devido principalmente à presença de ésteres de forbol, o que dificulta a sua utilização direta para o consumo humano e também dos resíduos para a alimentação animal. A falta de programas de melhoramento e cultivares comerciais e problemas com pragas e doenças estão desestimulando o cultivo do pinhão manso pelo mundo. Por se tratar de uma espécie semi-domesticada, a utilização de marcadores moleculares como ITS, PCR-RFLP, microssatélites e TRAP poderia auxiliar nos estudos de diversidade genética, visando o desenvolvimento de variedades adaptadas às necessidades dos agricultores. O objetivo deste estudo foi caracterizar a variabilidade genética de acessos de pinhão manso depositados no Banco de Germoplasma da Universidade Federal de São Carlos, além de possibilitar estudos sobre as relações entre as populações, centros de diversidade e determinar o sistema reprodutivo da espécie. Os resultados são discutidos destacando que a maior parte da diversidade encontra-se entre as populações estudadas. Os resultados derivados dos quatro marcadores utilizados corroboram que o centro de diversidade da espécie possivelmente está na América, com destaque para o México, Brasil e Colômbia. Os resultados apontam também para a diferenciação genética dos acessos atóxicos dos mexicanos quando comparados com os demais acessos tóxicos de pinhão manso. Os marcadores microssatélites desenvolvidos indicam que o pinhão manso apresenta um sistema misto de reprodução, combinando autofecundações, apomixia e cruzamento entre indivíduos aparentados, o que pode explicar a menor diversidade genética encontrada dentro das populações. Devido ao sistema misto de reprodução e aos acasalamentos correlacionados, a coleta de sementes de polinização aberta para fins de melhoramento ou conservação deve ser conduzida em um número de árvores acima de 100, visando garantir uma amostra estruturada / Physic nut (Jatropha curcas L.) is a tropical tree that has acquired economic importance for the content of oil in its seeds and the possibility of its use for biofuel production. However, oil seeds and physic nut are toxic because of the presence of secondary metabolites such as phorbol esters which makes its use directly for human consumption and also its waste for animal feed difficult. The lack of commercial varieties and problems with pests and diseases are making physic nut cultivation in the world unattractive. The use of molecular markers such as ITS, PCR-RFLP, microsatellites and TRAP can help in studies of genetic diversity, aimed at developing varieties adapted to farmers needs. The aim of this study was to characterize the genetic variability of physic nut accessions deposited in the Germplasm Bank of the \'Universidade Federal de São Carlos\', in addition to allowing studies on the relationship among accessions, centers of diversity and reproductive system. Results are discussed highlighting that most diversity is concentrated among populations. The four markers used indicated that the center of diversity of this species is probably in America with emphasis on Mexico, Brazil and Colombia. The microsatellite markers indicate that physic nut has a mixed system of reproduction, combining self-pollinations, apomixis and crossing between related individuals which may explain the small genetic diversity found within populations. Due to the mixed system of reproduction and correlated mating, the collection of open-pollinated seeds for plant breeding or conservation should be conducted in a number of trees above 100 in order to ensure a structured sample