A vida é um processo dinâmico no tempo e no espaço, resultante da interação celular provida pelas junções comunicantes (JCs), canais formados por conexinas (Cxs) que permitem a passagem de moléculas de até 1kDa, e íons. O foco deste trabalho foi caracterizar a modulação de Cxs no desenvolvimento, adaptação visual e após trauma mecânico localizado na retina, através de técnicas como PCR em tempo real, western blot e imuno-histoquímica. No desenvolvimento, a Cx43 apresentou alta expressão no início (255%, P<0.01), a Cx45 teve alta expressão em todos os estágios, as Cx50 e Cx36 são pouco expressas no início (4-9%, P<0.01), mas muito expressas no final e no adulto. Na adaptação ao escuro houve regulação de 115% do RNam da Cx36 após 24h, evidenciando uma plasticidade do acoplamento frente às condições de iluminação. Na neurodegeneração, a expressão da Cx36 não variou nos diferentes tempos pós-lesão, mas a Cx43 aumentou após 7 dias. O papel do acoplamento na degeneração foi estudado utilizando bloqueadores e abridores de JCs combinados com métodos para avaliar a viabilidade celular (TUNEL, FluoroJade e LDH). Finalmente, o bloqueio das JCs diminuiu a morte celular secundária, mas a abertura gerou um efeito inicial pró-apoptótico que depois de 4h foi diluído no tecido. / Life is a dynamic process in time and space, resulting from an interaction provided by gap junctions (GJs), channels composed of connexins (Cxs) that permits the passage of molecules up to 1kDa and ions. The aim of this study was analyze the modulation of Cxs during development, dark adaptation and after local mechanical trauma in the retina using techniques like real time PCR, western blot and imunohistochemistry. In development, Cx43 was highly expressed in the beginning (255%, P<0.01), Cx45 was highly expressed during all development, Cx50 and Cx36 were virtually absent in the beginning (4-9%, P<0.01), but highly expressed in the end of development. In Dark-adaptation, Cx36 was up-regulated after 24h (115%, P < 0.05) suggesting a plasticity of the neuronal coupling in response to light conditions. In neurodegeneration, Cx36 expression didnt ranged in different days after lesion, but the Cx43 increased after 7 days. The coupling was studied by using GJ blockers and openers combined with methods to evaluating cellular viability (TUNEL, FluoroJade and LDH). Finally, blocking the cellular coupling reflects in a decrease of secondary death. GJ openers seems act allowing the spread of death in the beginning, but this effect be diluted after 4h in the tissue.

Submitted by Eduardo Barros de Almeida Silva (eduardo.philippe@ufpe.br) on 2015-04-17T12:44:08Z No. of bitstreams: 2 Tese Henriqueta Dias Cardoso.pdf: 5265290 bytes, checksum: e2e8c3ba450de08f6e92ede26a203fc0 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-17T12:44:08Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese Henriqueta Dias Cardoso.pdf: 5265290 bytes, checksum: e2e8c3ba450de08f6e92ede26a203fc0 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013-02-26 / FACEPE / Os ácidos graxos essenciais (AGEs) têm sido indicados como potenciais agentes preventivos e terapêuticos em uma grande variedade de doenças neurodegenerativas assim como indispensáveis para o desenvolvimento cerebral. O principal objetivo deste trabalho foi investigar os mecanismos relacionados com a perda de neurônios dopaminérgicos induzida pela deficiência crônica em AGEs previamente detectada na substância negra (SN) de ratos Wistar jovens (J), estendendo a análise também a animais adultos (A). Para isso, foram utilizadas dietas balanceadas e que diferiram apenas na fonte lipídica, sendo óleo de soja para os grupos controles (C) e óleo de coco para os grupos experimentais (E). As dietas foram fornecidas às mães a partir do acasalamento e mantidas por uma (F1) ou duas (F2) gerações. Marcadores de insulto oxidativo: lipoperoxidação (LP), atividade das enzimas superóxido dismutase total (SOD-t), catalase (CAT) na SN e corpo estriado (CE) foram avaliados em animais AF1 e em JF2 e AF2. Indicadores de neurodegeneração na SN e CE destes animais foram avaliados utilizando a técnica de marcação com o fluoróforo, Fluoro Jade C. Análise quantitativa do tamanho e nº de neurônios dopaminérgicos e da distribuição de células imunorreativas ao fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) foi realizada em animais AF2. Os níveis de nitrito, como indicador da produção de óxido nítrico na SN e CE, foram analisados em animais JF2 e AF2. A dieta experimental reduziu em ~28%, ~50% e ~60% os níveis de ácido docosahexaenóico (DHA) na SN dos grupos experimentais AF1, JF2 e AF2 respectivamente, comparado aos seus controles. Nos animais EAF1 um aumento em ~17% e ~45% na atividade da SOD-t foi observado na SN e CE comparado ao grupo controle, o evitou níveis danosos de lipoperoxidação. Por outro lado, um aumento nos níveis de lipoperoxidação (~34%) foi detectado na SN de animais EJF2, acompanhados de não reatividade da SOD-t e de uma redução em 4,8 vezes na atividade da CAT. Sinais de neurodegeneração foram evidenciados em neurônios dopaminérgicos e não dopaminérgicos da SN do grupo EJF2. No CE, o aumento da LP em ~39% foi acompanhado de redução em 3,8 vezes e 2,8 vezes da atividade da SOD-t e CAT, respectivamente, só foram observados nos animais do grupo EAF2. A dieta experimental não alterou os níveis de nitrito na SN, mas aumentou de forma significativa estes níveis no CE de animais jovens (30%) e adultos (1,8 vezes). A deficiência crônica em DHA até a idade adulta comprometeu o crescimento do corpo celular e aumentou a perda de neurônios dopaminérgicas na SN rostro-dorso-medial (~35%) afetando também aqueles localizados na região caudo-ventro-lateral deste núcleo. Uma redução de ~22% no número de células BDNF+ foi também observada na SN. Os resultados mostram que a restrição dietética em AGEs por duas gerações até a idade adulta é capaz de induzir lipoperoxidação na SN e CE devido a comprometimento na atividade das enzimas anti-oxidantes, perda de células BDNF+ na SN e aumentados níveis de óxido nítrico no CE. Tidos em conjunto, tais mecanismos podem estar atuando de forma sinérgica na degeneração de neurônios dopaminérgicos induzida pela deficiência em DHA.

A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa progressiva e incurável, caracterizada pela perda seletiva dos neurônios motores (NM) superiores e inferiores com uma sobrevida média de 3 anos. As manifestações clínicas dependem da topografia e comprometimento dos NM. De causa desconhecida, descrições apontam para a participação das células gliais (astrócitos, microglia e célula de Schwann) na toxicidade neuronal. A retração precoce do axônio no músculo esquelético sugere a participação da célula de Schwann na morte neuronal retrógrada (dying back). Este estudo descreveu as alterações na expressão gênica no nervo motor extensor curto do hálux ainda funcionante dos pacientes ELA e o ramo motor do nervo acessório de sujeitos-controle (19 ELA, sendo 9 ELA espinhal e 5 ELA bulbar; 5 controles), utilizando-se plataformas expandidas de microarranjos de DNA (microarray) e análises de bioinformática (DAVID e os seus bancos de dados Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes e o Gene Onthology Consorciun Anottation). Os resultados foram validados por PCRq e Redes de Interação de Proteínas foram geradas pelo Cytoscape. Foram encontrados 138 genes diferencialmente expressos entre esses grupos. O ribossomo e a síntese proteica foram apontados como elementos centrais no estudo em eventos relacionados tanto à neurotoxicidade quanto a protetivos. As Redes destacaram o gene EPS8 na ELA (ambas as formas, ELA bulbar e espinhal) em relação aos controles e o gene FAU na ELA bulbar em relação à ELA espinhal. Os genes e as vias apontados neste estudo deverão ser testados como alvos terapêuticos em estudos futuros envolvendo a ELA / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is an incurable progressive neurodegenerative disease characterized by the selective loss of upper and lower motor neurons (MN), with a median survival of 3 years. Clinical manifestations depend on onset site and involvement of the MN. Although the cause of ALS is unknown, reports point towards the participation of glial cells (astrocytes, microglia and Schwann cells) in the neuronal toxicity. The early retraction of the axonium indicates a participation of the Schwann cells in retrograde neuronal death (dying back). The current study described the abnormalities in the genic expression of the functioning extensor hallucis brevis motor neuron from ALS subjects, and the motor branch of the accessory nerve from control subjects (19 ALS, being 9 spinal and 5 bulbar types; 5 controls), through an expanded platform of DNA microarrays and bioinformatics analyses (DAVID, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, and Gene Onthology Consortium Annotation databases). The results were validated by Quantitative PCR (PCRq) and Protein-Protein interaction network generated by Cytoscape. A total of 138 differentially expressed genes were found in these groups. In this study, the ribosome and protein synthesis were pointed as central elements related both to neurotoxicity and protective events. These networks highlighted the EPS8 gene in ALS (in both types, bulbar and spinal) when correlated to controls, and the FAU gene in bulbar ALS in relation to spinal ALS. The genes and pathways identified in this study should be tested as therapeutic targets in future studies approaching ALS

A Doença de Parkinson é uma doença altamente incapacitante e de grande prevalência. Pouco se sabe sobre sua etiologia e os tratamentos atuais consistem na diminuição dos sintomas, uma vez que ainda não foi encontrada uma maneira de reverter o déficit de neurônios dopaminérgicos observados nos pacientes acometidos. Sabe-se que os receptores purinérgicos são encontrados por todo o sistema nervoso central, não só no indivíduo adulto como também em diferentes estágios do desenvolvimento embrionário e estão envolvidos com proliferação e diferenciação celular. Este trabalho estudou a participação dos receptores purinérgicos em modelo animal de doença de Parkinson por lesão dos neurônios dopaminérgicos da via nigroestriatal com 6-OH dopamina (6-OHDA). Realizamos a análise do perfil de expressão gênica dos diferentes receptores após a lesão e subsequente modulação. Observamos expressão gênica alterada dos receptores P2X7 e P2Y6 até 5 semanas após a lesão. O uso do antagonista do receptor P2X7 Brilliant Blue G (BBG) induziu a regeneração da via nigroestriatal e o uso do antagonista do receptor P2Y6 MRS2578 preveniu a morte dos neurônios. Como esses efeitos foram acompanhados pela inativação de células microgliais, supõe-se que o controle do microambiente neuroinflamatório causado pela injeção de 6-OHDA seja a principal causa do efeito antiparkinsoniano observado pelo tratamento com BBG e MRS2578. Além disso, o transplante celular com células precursoras neuraisnão foi capaz de reverter o comportamento hemiparkinsoniano dos animais lesionados. Apesar do uso concomitante com BBG reduzir o comportamento, parece que esse efeito deve-se ao BBG per se, uma vez que o tratamento somente com o antagonista de P2X7 foi mais eficaz. De maneira geral, a modulação da atividade dos receptores purinérgicos se mostrou uma ferramenta promissora na pesquisa de cura e compreensão das bases moleculares da Doença de Parkinson / Parkinson\'s disease is a highly disabling and prevalent disease. Little is known about its etiology and the current treatments consist in the reduction of the symptoms, since there is no known method to reverse the dopaminergic neurons deficit observed in patients. Purinergic receptors are found throughout the central nervous system, not only in the adult individual but also at different stages of embryonic development, and are involved in proliferation and differentiation. This work investigated the role of purinergic receptors in the animal model of Parkinson\'s disease induced by 6-OH dopamine (6-OHDA) injection and consequent death of dopaminergic neurons of the nigrostriatal pathway. Patterns of purinergic receptors gene expression after the lesion and subsequent modulation were analyzed. We observed altered gene expression of P2X7 and P2Y6 receptors within 5 weeks of injury. The use of the P2X7 receptor antagonist Brilliant Blue G (BBG) induced the regeneration of the nigrostriatal pathway and treatment with P2Y6 receptor antagonist MRS2578 prevented the death of the neurons. Since these effects were accompanied by the inactivation of microglial cells, it is assumed that the control of neuroinflammatory milieu caused by the 6-OHDA injection is the main cause of the antiparkinsonian effect observed by the treatment with BBG and MRS2578. In addition, transplantation with neural precursor cells was not able to reverse the hemiparkinsonian behavior of injured animals. Although concomitant use with BBG improved cell engraftment, it appears that this effect is due to BBG per se, since treatment with only this P2X7receptor antagonist was more effective. In general, modulation of purinergic receptor activity showed to be a promising tool in the research of cure and understanding of the molecular bases of Parkinson\'s Disease.

O uso da cocaína na forma de crack vem crescendo nos últimos anos quando comparado às demais vias de administração. Contribuem para esse fato a obtenção quase imediata de efeitos e a maior facilidade de uso, que dispensa a necessidade de material injetável. O usuário de crack sofre os efeitos não só da cocaína, mas também de seu produto de pirólise, a metilecgonidina (AEME). Existem evidências de que a cocaína leva à neurodegeneração, entretanto a participação da AEME nesse processo ainda não foi estudada. A proposta deste estudo foi investigar a participação da AEME no processo neurodegenerativo utilizando cultura primária de hipocampo realizada a partir de fetos de ratos. Foram realizados ensaios de viabilidade celular (MTT) e da atividade da lactato desidrogenase (LDH), além da avaliação morfológica por microscopia de fluorescência. Foi estudada também a participação do dano oxidativo no processo de neurodegeneração, como a formação de aduto de DNA; atividade das enzimas antioxidantes glutationa peroxidase (GPx), glutationa redutase (GR) e glutationa S-transferase (GST); e a produção de malonaldeído (MDA), um biomarcador de peroxidação lipídica. Tanto a cocaína quanto a AEME mostraram-se neurotóxicas. A partir dos ensaios de viabilidade e da avaliação morfológica foi possível inferir que, em células hipocampais, a cocaína leva à morte celular tanto por necrose quanto por apoptose e que a provável via envolvida na neurodegeneração da AEME é a apoptose. A AEME não causou lesão direta ao DNA, uma vez que não foi observada a formação de adutos nem com a desoxiguanosina (d-G), a base nitrogenada mais reativa, nem com DNA comercial. Mais ainda, nossos resultados mostraram que a AEME e a cocaína, nas concentrações de 1 e 2 mM, respectivamente, foram equipotentes e a incubação concomitante das duas substâncias nessas concentrações apresentou efeito aditivo após 48 horas de exposição. A morte de células hopocampais evidenciada a partir de 24 horas de exposição foi precedida pela diminuição da atividade da GPx após 3 horas de incubação tanto com a AEME e a cocaína, quanto com a associação entre essas substâncias. A atividade da GST também diminuiu, no entanto, somente após 6 horas de exposição, antecedendo a morte celular. Não foi observada alteração na atividade da GR. Houve um aumento, porém, não estatisticamente significativo, de MDA após 48 horas de incubação. Nossos resultados sugerem uma maior susceptibilidade à neurodegeneração com o uso de crack do que com a cocaína isoladamente. / Smoking crack has increased in the last years when compared to the other routes of cocaine administration. Its advantage is the quicker and stronger high effects and its ease of use without the need of needles. Smoking crack involves inhaling not only cocaine, but also its pyrolysis product, methylecgonidine (AEME). There are evidences that cocaine causes neurodegeneration, but AEME involvement in this process has not been studied yet. The aim of this study was to investigate AEME participation in neurodegeneration using a primary hippocampus culture made from rat fetuses. Cellular viability assays (MTT), lactate dehydrogenase activity (LDH) and morphological evaluations with fluorescence microscopy were performed. The involvement of oxidative injury in the neurodegeneration process was also studied through DNA adduct formation; the evaluation of antioxidants enzymes activities as glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR) and glutathione S-transferase (GST); and the production of malonaldehyde (MDA), a lipoperoxidation biomarker. Both cocaine and AEME showed neurotoxic effects. Through viability assays and morphologic evaluations we can suggest that, in hippocampal cells, cocaine cell death mechanism involves not only necrosis, but also apoptosis and that AEME pathway involved in neurodegeneration is only apoptosis. AEME did not produce a direct DNA injury, as no DNA adduct was observed with desoxyguanosine (d-G), the most reactive nitrogenous base, nor with commercial DNA. Moreover, our results showed that 1 and 2 mM of AEME and cocaine, respectively, were equipotent and the concomitant incubation of both compounds in those concentrations showed additive effect after 48 hours of exposure. Hippocampal cell death at 24 hours was preceded by a decrease in GPx activity after 3 hours of incubation with AEME, cocaine and association between these two compounds. GST activity also decreased but only after 6 hours of exposure, also before cell death. There was no alteration in GR activity. There was an increase, although not statistically significant, in MDA after 48 hours of exposure. As smoking crack abusers are exposed to both cocaine and AEME, our results suggest a higher susceptibility to neurodegeneration in smoking crack than with cocaine alone.

A inflamação é fundamental para a manutenção da homeostasia e para a resposta do organismo à injúria. A resposta inflamatória deve ser adequada aos estímulos agressores; no sistema nervoso central, sua inadequação conduz à gênese de diferentes doenças neurodegenerativas. A proteína anexina A1 (ANXA1) e os receptores ativados por proliferadores de peroxissomo (PPAR) controlam a inflamação, pois ambos inibem o desenvolvimento da inflamação e aceleram sua resolução. Nosso grupo de pesquisa tem mostrado que a ANXA1 modula a expressão de PPAR&#947; em macrófagos. Assim, o presente trabalho investigou a modulação da expressão do PPAR&#947; e das suas funções em células da microglia pela ANXA1. Foram empregadas células imortalizadas da linhagem BV2 (microglia murina), inalteradas ou transfectadas para redução da expressão de ANXA1, tratadas com ANXA1 exógena (recombinante - rANXA1) ou com agonista ou antagonista de PPAR&#947; (pioglitazona e GW9662, respectivamente). Os resultados obtidos mostraram que: 1) tratamento com rANXA1 aumenta as expressões gênica (RT-PCR) e proteica (Western Blotting) de PPAR&#947;, e ambas as expressões estão reduzidas em células com deficiência endógena de ANXA1, sendo que tal efeito foi revertido pela ação da rANXA1; 2) tratamento com rANXA1 não induz a expressão dos fatores de transcrição ligados a expressão de PPAR&#947;: proteínas ligantes de elementos de resposta ao cAMP - CREB - e transdutores de sinais e ativadores de transcrição - STAT6 - (Western Blotting), mas os níveis de ambos os fatores estão reduzidos em células transfectadas, e tal efeito não foi revertido pelo tratamento com rANXA1; 3) tratamento com pioglitazona ou com rANXA1 individualmente aumenta a fagocitose de células PC12 apoptóticas (citometria de fluxo), mas o tratamento simultâneo não altera a fagocitose induzida por pioglitazona ou rANXA1; no entanto, tratamento com GW9662 inibiu a fagocitose induzida pelo tratamento com rANXA1; 4) o tratamento com rANXA1 aumenta a expressão de CD36 (citometria de fluxo); a expressão de CD36 está reduzida em células transfectadas e tal expressão não é revertida pelo tratamento com rANXA1. Em conjunto, os dados obtidos mostram a modulação da ANXA1 sobre PPAR&#947; em células da micróglia, com possível ação sobre a fagocitose de células apoptóticas, e que a redução da expressão de ANXA1 reduz acentuadamente a expressão dos fatores de transcrição STAT6 e CREB, bem como a expressão de CD36. A elucidação dos efeitos resultantes destas alterações desencadeadas pela deficiência de ANXA1 endógena poderá contribuir para compreensão da fisiopatologia da neuroinflamação. / Inflammation is a key process in maintaining homeostasis and is essential for the body\'s response to injury. The inflammatory response must be proportional to the aggressor stimuli; in the central nervous system, a failed proper modulation leads to the development of different neurodegenerative diseases. Protein annexin A1 (ANXA1) and peroxisome proliferated-activated receptors (PPAR) control inflammation, as both inhibit development of inflammation and accelerate its resolution. Our research group has demonstrated that ANXA1 modulates PPAR&#947; expression in macrophages. Thus, the present work investigated the modulation of PPAR&#947; expression and its functions in microglia cells by ANXA1. In order to assess such, immortalized cells from cell line BV2 (murine microglia), either unadulterated or transfected for reduced expression of ANXA1, were treated with exogenous ANXA1 (recombinant protein - rANXA1) or either with PPAR&#947; agonist or antagonist (pioglitazone and GW9662, respectively). The obtained results demonstrated that: 1) treatment with rANXA1 increases both gene (RT-PCR) and protein (Western Blotting) expressions of PPAR&#947;, and also that both expressions are reduced in cells with endogenous deficiency of ANXA1, and such effect was reversed by the actions of rANXA1; 2) treatment with rANXA1 does not promote the expression of transcription factors associated with PPAR&#947; expression: cAMP response element binding protein - CREB - and signal transductor and activator of transcription 6 - STAT6 (Western Blotting), but the expression levels of both factors are reduced in transfected cells, and such effect was not reversed by treatment with rANXA1; 3) individual treatment with pioglitazone or rANXA1 increases phagocytosis of apoptotic PC12 cells (flow cytometry), but simultaneous treatment does not affect pioglitazone/rANXA1-induced phagocytosis; however, treatment with GW9662 inhibited rANXA1-induced phagocytosis; 4) treatment with rANXA1 increases CD36 expression (flow cytometry); the expression of CD36 is reduced in transfected cells, and such expression is not reversed by treatment with rANXA1. The obtained data demonstrate the modulation ANXA1 exerts upon PPAR&#947; in microglia cells, with a possible action upon phagocytosis of apoptotic cells, and that reduction of ANXA1 expression greatly reduces the expression of transcription factors STAT6 and CREB, as well as the expression of CD36. Elucidation of such effects that arise from a deficiency of endogenous ANXA1 will contribute to a better comprehension of the pathophysiology of neuroinflammation.

Submitted by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2018-12-03T17:13:22Z No. of bitstreams: 1 MICHELLE ANTUNES.pdf: 2333470 bytes, checksum: 8ad88d537e1a1c446e2d18440cf12514 (MD5) / Approved for entry into archive by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2018-12-03T17:13:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 MICHELLE ANTUNES.pdf: 2333470 bytes, checksum: 8ad88d537e1a1c446e2d18440cf12514 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-12-03T17:13:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MICHELLE ANTUNES.pdf: 2333470 bytes, checksum: 8ad88d537e1a1c446e2d18440cf12514 (MD5) Previous issue date: 2017 / A doença de Parkinson (DP) é a segunda doença neurodegenerativa mais prevalente na população idosa, tendo como principal característica neuropatológica a depleção de dopamina (DA) estriatal, condição esta, que conduz ao aparecimento dos sintomas motores da doença. Além de sintomas motores, os pacientes acometidos com essa doença apresentam ainda sintomas não motores e neuropsiquiátricos onde destaca-se a depressão. Atualmente, nenhuma das drogas utilizadas é totalmente eficaz para a DP, nesse contexto, terapias promissoras ainda precisam ser exploradas. Alguns estudos demonstraram que o consumo de flavonoides podem diminuir a incidência e os sintomas de doenças neurodegenerativas e de transtornos depressivos. Nosso estudo anterior já constatou que o flavonoide hesperidina (4'-methoxy-7-O-rutinosyl-3',5-dihydroxyflavanone), intervém na DP e no comportamento tipo depressivo via estresse oxidativo, em um modelo induzido por 6-hidroxidopamina (6-OHDA) em camundongos. Baseando-se nas evidências, se torna interessante investigar o efeito da hesperidina em outros parâmetros da DP no modelo da 6-OHDA, além de seu efeito antidepressivo no modelo da bulbectomia olfatória (BO). Para avaliar a DP, a hesperidina ou o veículo (50 mg/kg) foram administrados via oral (gavagem) durante 28 dias. Após este período, os camundongos foram submetidos a testes comportamentais. Para avaliar a depressão no modelo OB, a hesperidina ou o veículo (50 mg/kg) foram administrados via oral (gavagem) durante 13 dias. Após este período, os camundongos foram submetidos aos testes comportamentais e neuroquímicos. No modelo induzido pela 6-OHDA, o tratamento com a hesperidina protegeu contra a inibição das enzimas mitocondriais dos complexos I, II, IV e V, da enzima Na+/K+ ATPase, diminuição do potencial de membrana mitocondrial, e aumento das atividades das caspases 3 e 9 e níveis de marcadores de inflamação. Além disso, a administração do flavonoide culminou na restauração dos níveis de fatores neurotroficos, assim como dos neurônios positivos para tirosina hidroxilase (TH), e níveis de DA e seus metabolitos no estriado. O tratamento com hesperidina também atenuou as alterações comportamentais de rotação, ansiedade, anedonia, memória e nos danos olfatórios induzidos pela 6-OHDA. No modelo de depressão induzido pela OB, o tratamento oral com hesperidina foi efetivo em reverter o declínio dos fatores neurotróficos, o aumento das citocinas pro-inflamatórias e da atividade da enzima acetilcolinesterase (AchE) no hipocampo, bem como o aumento da atividade locomotora, os prejuízos na memória, o comportamento tipo depressivo e a anedonia decorrentes da remoção dos bulbos. No modelo de DP induzido pela 6-OHDA pode-se propor que a hesperidina atua na restauração dos neurônios dopaminérgicos através do restabelecimento dos fatores neurotróficos, controle das citocinas, e modulação da atividade mitocondrial e apoptótica no estriado, o que reflete na recuperação dos prejuízos comportamentais. No modelo da depressão, indica-se que a reparação hipocampal sobre os fatores neurotróficos e marcadores inflamatórios são responsáveis pelo reestabelecimento comportamental no tratamento com hesperidina. Estes resultados certificam o efeito potencial da hesperidina no tratamento da DP e dos distúrbios depressivos, indicando que esse flavonoide pode atuar como terapia multialvo, associando DP e os transtornos mentais. Isso se deve à 4 regulação de fatores neurotróficos, inflamatórios e apoptóticos, atividades enzimáticas (AchE e Na+/K+ ATPase), disfunção mitocondrial e recuperação neuronal dopaminérgica. / Parkinson's disease (PD) is the second most prevalent neurodegenerative disease in the elderly population. Its main neuropathological characteristic is the striatal dopamine (DA) depletion, which leads to the appearance of the motor symptoms of the disease. In addition to motor symptoms, the patients with this disease also present non-motor and neuropsychiatric symptoms where depression stands out. Currently, none of the drugs used is fully effective for PD, in this context, promising therapies still need to be explored. Some studies have shown that consumption of flavonoids may decrease the incidence and symptoms of neurodegenerative diseases and depressive disorders. Our previous study has found that the flavonoid hesperidin (4'-methoxy-7-O-rutinosyl-3 ', 5-dihydroxyflavanone) plays a role in PD and in the depressive behavior via oxidative stress in mice induced by 6-hydroxydopamine (6 -OHDA). Based on the evidence, is interesting to investigate the effect of hesperidin in other parameters of PD in the 6-OHDA model, besides the its antidepressant effect in olfactory bulbulometric (BO) model. To evaluate the PD, hesperidin or vehicle (50 mg / kg) were administered orally (gavage) for 28 days. After this period, the mice were submitted to behavioral tests. To assess depression in the OB model, hesperidin or vehicle (50 mg / kg) were administered orally (gavage) for 13 days. After this period, the mice were submitted to behavioral and neurochemical tests. In the 6-OHDA-induced model, treatment with hesperidin protected against inhibition of mitochondrial enzymes of complexes I, II, IV and V, Na + / K + ATPase enzyme, against the decrease in mitochondrial membrane potential, and against the increase of caspases 3 and 9 activities and inflammatory markers levels. In addition, flavonoid administration culminated in restoration of neurotrophic factors levels, as well as tyrosine hydroxylase (TH) positive neurons, DA and its metabolites levels in the striatum. The treatment with hesperidin also attenuated the behavioral changes of rotation, anxiety, anhedonia, memory and olfactory damage induced by 6-OHDA. In addition, in depression model OB-induced, oral hesperidin treatment was effective in reversing the decline of neurotrophic factors, increase of proinflammatory cytokines levels and acetylcholinesterase (AchE) activity in the hippocampus, as well as increase of locomotor activity, memory impairment, depressive behavior and anhedonia due to removal of bulbs. In DP model induced by 6-OHDA it can be proposed that hesperidin acts in the restoration of dopaminergic neurons through the reestablishment of neurotrophic factors, cytokine control, and modulation of mitochondrial and apoptotic activity in striatum, which reflects in the recovery of damages behavioral. In depression model, it is indicated that hippocampal repair on neurotrophic factors and inflammatory markers are responsible for behavioral reestablishment by hesperidin treatment. These results confirm the potential effect of hesperidin in the treatment of PD and depressive disorders, indicating that this flavonoid can act as a multi-target therapy, associating PD and mental disorders. This is due to the regulation of neurotrophic, inflammatory and apoptotic factors, enzymatic activities (AchE and Na+/K+ ATPase), mitochondrial dysfunction and dopaminergic neuronal recovery.

O complexo da esclerose tuberosa (TSC) é uma doença genética que pode afetar órgãos específicos de qualquer sistema do organismo humano. Em geral, as lesões surgem pela inativação bialélica de um dos genes supressores tumorais Tuberous Sclerosis Complex 1 (TSC1) ou 2 (TSC2). Por outro lado, nas regiões corticais e subcorticais do cérebro, as lesões decorrentes de falhas de migração neuronal e sua arborização podem ser explicadas pela haploinsuficiência de TSC1 ou TSC2. As lesões do córtex cerebral apresentam-se comumente com epilepsia refratária, a qual, por sua vez, pode se associar a deficiência intelectual e transtornos do comportamento. Estes quadros clínicos podem estar presentes em pacientes com TSC sem lesão anatômica detectável à ressonância nuclear magnética do crânio. As proteínas hamartina ou tuberina, conhecidas também como TSC1 e TSC2, são codificadas respectivamente pelos genes TSC1 e TSC2. Elas agem juntas em um complexo molecular citosólico que inativa a pequena GTPase Rheb, a qual tem ação ativadora da cinase alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR), regulando diversos processos celulares, como proliferação, diferenciação, crescimento, migração e metabolismo. Com a hipótese de que a quantidade de TSC1 ou TSC2 no neurônio pode alterar suas funções de forma dependente do estado metabólico, tivemos, neste trabalho, o objetivo geral de caracterizar os padrões de expressão e atividade de TSC1 e TSC2 em dois modelos de neurodegeneração induzida no camundongo adulto e verificar se a redução de quantidade de TSC1 tem efeito sobre a extensão da lesão de neurônios dopaminérgicos em modelo de hemiparkinsonismo. No primeiro modelo empregado, cinco estruturas encefálicas de camundongos submetidos a dieta hiperlipídica mostraram alteração da quantidade de RNAm de Tsc1 e/ou Tsc2 ou sinais de estresse oxidativo. A redução de transcritos de Tsc1 e Tsc2 no córtex cerebral foi dependente de jejum realizado imediatamente antes da eutanásia. No córtex cingulado, houve evidência de estresse oxidativo. O aumento específico de RNAm foi observado no hipocampo (Tsc1 e Tsc2) e no estriado e hipotálamo (Tsc1), embora de forma independente do jejum, sugerindo se tratar de alterações relacionadas à dieta hiperlipídica. No modelo de hemiparkinsonismo, camundongos adultos submetidos a injeção intracerebral de 6-hidroxidopamina apresentaram redução da quantidade total de proteína S6 no lado encefálico tratado quando comparado ao segmento contralateral (p =0,004, r=0,8795; teste de Pearson, IC: 95%), sem alteração de TSC1 ou TSC2. Em análises de imunoperoxidase do encéfalo, descrevemos, de forma independente da lesão, a expressão de TSC1 no estriado, núcleos entopeduncular e arqueado e de TSC2 no tálamo e hipotálamo. Com o objetivo de obter um modelo de camundongo sem expressão pós-natal de Tsc1 em várias regiões encefálicas, de forma independente do tipo celular, realizamos cruzamentos entre uma linhagem de camundongo transgênico em que o gene Tsc1 contém sequências lox nos íntrons 16 e 18 e outra linhagem com Tsc1 tipo-selvagem (WT) em homozigose e o transgene para expressão da recombinase Cre em fusão ao domínio de ligação ao ligante do receptor de estrógeno humano (ESR1) sob o controle de expressão do promotor de ubiquitina C (UBC). Em F1, obtivemos camundongos portadores do transgene UBC-CreESR1 e heterozigotos para Tsc1 (Tsc1WT/Flox). Em F2, entre os animais homozigotos Tsc1Flox/Flox (N = 153) gerados por retrocruzamento, nenhum era portador do transgene (Nesperado = 85; Nobservado = 0; X2 = 348,185; p < 0,0001) É possível que o segmento genômico em que houve inserção do vetor lentiviral que carrega o transgene UBC-CreESR1 esteja ligado ao loco de Tsc1 no cromossomo 2 do camundongo, segregando juntos. O tratamento com 4-hidroxitamoxifeno de animais heterozigotos e portadores do transgene aumentou a quantidade de TSC1 no estriado (p < 0,05) e o cerebelo não apresentou alteração. É possível que mecanismos transcricionais ou traducionais, funcionais no estriado, tenham favorecido o aumento de TSC1 de forma dependente de 4-hidroxitamoxifeno / Tuberous sclerosis complex (TSC) is a genetic disorder that can affect any specific organs. In general, lesions are caused by biallelic inactivation of the tumor suppressor genes Tuberous Sclerosis Complex 1 (TSC1) or 2 (TSC2). On the other hand, in cortical and subcortical brain regions, lesions associated with neuronal migration and arborization failures can be explained by TSC1 or TSC2 haploinsufficiency. Brain cortical lesions commonly cause refractory epilepsy, which, in turn, may be associated with intellectual disabilities and behavioral disorders. These medical conditions may be present in TSC patients without detectable anatomic lesion on magnetic resonance images. TSC1 and TSC2 genes encode hamartin and tuberin, also known as TSC1 and TSC2, respectively. They act together in a cytosolic molecular complex that inactivates small GTPase Rheb, which is a mammalian target of rapamycin (mTOR) activator, regulating diverse cellular processes such as proliferation, differentiation, growth, migration and metabolism. With the hypothesis that the amount of TSC1 or TSC2 in the neuron can change its function depending on the metabolic state, the overall objective of this study was to characterize TSC1 and TSC2 expression patterns and activity in two mice models of induced neurodegeneration; and check whether TSC1 reduction changes dopaminergic neurons damage extent in a hemiparkinsonins model. For the first model, five brain structures from mice fed with high fat diet showed alterations in Tsc1 and/or Tsc2 mRNA, or oxidative stress signals. Reduction of Tsc1 and Tsc2 transcripts in the cerebral cortex was dependent on fasting performed immediately prior to euthanasiaThere was evidence of oxidative stress in the cingulate cortex. Increase in mRNA was observed in the hippocampus (Tsc1 and Tsc2) and striatum and hypothalamus (Tsc1), although independent of the fasting, suggesting that this effect is related to the high fat diet. In hemiparkinsonism model, adult mice subjected to intracerebral injection of 6-hydroxydopamine had decreased levels of S6 in the brain treated side compared to the contralateral segment (p = 0.004, r = 0.8795; Pearson test, CI: 95 %), without alterations in TSC1 nor TSC2. Using imunoperoxidase analysis, we described TSC1 expression in the striatum, entopeduncular and arcuate nuclei, and TSC2 in the thalamus and hypothalamus, independently from the 6-OHDA lesion. To obtain a mouse model without TSC1 postnatal expression in different brain regions, independently of the cell type, we performed crosses between transgenic mouse strain in which the Tsc1 gene contains lox sequences in introns 16 and 18 and strain with Tsc1 wild-type (WT) and the transgene for expression of Cre recombinase fused to the binding domain of the human estrogen receptor (ESR1) ligand, controlled by ubiquitin C (UBC) promoter expression. In F1, we obtained mice carrying the transgene UBC-CreESR1 and heterozygous for Tsc1 (Tsc1WT/flox). In F2, among animals homozygous Tsc1Flox/Flox (N=153) generated by backcrossing, none was carrying the transgene (Nexpected = 85; Nobserved = 0; X2= 348.185, p <0.0001) It is possible that the genomic segment containing the lentiviral vector insertion bearing UBC-CreESR1 transgene is linked to the TSC1 region on mouse chromosome 2, and they segregate together. Treatment with 4-hydroxytamoxifen in animals heterozygous and positive for the transgene showed increased TSC1 in the striatum (p <0.05), while there was no change in the cerebellum. It is possible that transcriptional or translational functional striatum mechanisms favored TSC1 increasing, in a 4-hydroxytamoxifen-dependent manner

O exercício físico pode atenuar os efeitos do envelhecimento sobre o sistema nervoso central, por meio do aumento da expressão de neurotrofinas, tais como fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), o qual promove a ramificação dendrítica e melhora da maquinaria sináptica, pela interação com seu receptor TrkB. Receptores TrkB são produzidos no corpo da célula e transportados aos terminais axonais, por meio de SLP1, CRMP2, Rab27B e Sortilina onde são ancorados para realizar seu papel fisiológico. Sabendo que a relação entre o tráfego de receptores de neurotrofinas e o treinamento físico ainda é pouco conhecida, o objetivo do presente trabalho é analisar os níveis do receptor TrkB, bem como de seus transportadores anterógrados e retrógrados, no sistema nervoso central de ratos idosos, modelos de neurodegeneração, expostos a diferentes protocolos de treinamento físico moderado. Os ratos do primeiro grupo experimental foram expostos a 1mg/kg/dia de Rotenona ou DMSO durante 4 semanas, depois, juntamente com a exposição à rotenona, realizaram treinamento físico moderado em esteira, 5 vezes por semana, durante 40 minutos; ou permaneceram em repouso. Os ratos do segundo grupo experimental realizaram 6 semanas de treinamento, sendo em seguida expostos à rotenona por 4 semanas, e subdividos em dois grupos, um que continuou o exercício e outro que ficou sedentário. Os resultados encontrados sugerem que o treinamento físico parece reverter ou prevenir de maneira geral os danos presentes na neurodegeneração considerando as proteínas do tráfego de BDNF e seu receptor, e ainda, que a magnitude e direção destas alterações está diretamente relacionada ao protocolo de treinamento físico, bem como, a região do sistema nervoso central analisada / Physical exercise can attenuate the effects of aging on the central nervous system by increasing the expression of neurotrophins such as brain-derived neurotrophic factor (BDNF), which promotes dendritic branching and enhances synaptic machinery, through interaction with its receptor TrkB. TrkB receptors are synthesized in the cell body and are transported to the axonal terminals, through SLP1, CRMP2, Sortilin and Rab27B, to where receptors are anchored to perform its physiological role. However, the aspects of the neurotrophin receptors traffic after physical training is still a matter of investigation. Thus, the present study aims to analyze the expression levels of TrkB receptor and their anterograde carriers in aged Lewis rats, model of neurodegeneration, and its relationship with moderate exercise training. Rats from the first experimental group were exposed to 1mg/kg/day of Rotenone (ROT) or DMSO for 4 weeks, and then subjected or not to moderate exercise running on treadmill, five days a week, 40 minutes a day, combined with the drug. Rats from the second experimental group were trained for 6 weeks, followed by exposure to rotenone during 4 weeks, rats were then subdivided into two groups, one that continued the exercise and the other became sedentary. Results suggest that exercise training appears to reverse or prevent the impairment related to neurodegeneration considering the proteins involved in BDNF signaling, and also that the magnitude and direction of these changes in directly related to the physical training protocol, as well as the area of the central nervous system analyzed

Submitted by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br) on 2012-10-30T13:25:06Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Tese_AnaliseComparativaPadroes.pdf: 2406192 bytes, checksum: 6858ce99ece9ddda05ed401668b6c9c9 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva(arosa@ufpa.br) on 2012-10-30T16:10:19Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Tese_AnaliseComparativaPadroes.pdf: 2406192 bytes, checksum: 6858ce99ece9ddda05ed401668b6c9c9 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-30T16:10:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Tese_AnaliseComparativaPadroes.pdf: 2406192 bytes, checksum: 6858ce99ece9ddda05ed401668b6c9c9 (MD5) Previous issue date: 2012 / O acidente vascular encefálico (AVE) pode ocorrer em qual região do Sistema Nervoso Central (SNC), sendo o córtex cerebral é uma das regiões mais frequentemente afetadas por essa desordem neural aguda, embora inexistam investigações que tenham comparado o padrão lesivo em diferentes regiões corticais após isquemia focal de mesma intensidade. O objetivo desta investigação foi avaliar o padrão degenerativo de diferentes áreas corticais após lesão isquêmica focal. Para isso, induziu-se isquemia focal por microinjeções estereotáxicas de endotelina-1 (ET-1) nos córtices somestésico, motor e de associação de ratos adultos (N=45). Nos animais controle injetou-se o mesmo volume de solução salina estéril (N=27). Os animais foram perfundidos 1, 3, e 7 dias após o evento isquêmico. O encéfalo foi removido, pós-fixado, crioprotegido e seccionado em criostato. A histopatologia geral foi avaliada em secções de 50 coradas pela violeta de cresila. Secções de 20μm foram submetidas à imunoistoquímica para marcação de astrócitos (anti-GFAP), micróglia/macrófagos ativados (anti-ED1) e microglia em geral (anti-Iba1). Avaliou-se os padrões lesivos qualitativamente (por inspeção em microscópio óptico) e quantitativamente (pela contagem do número de células nos lados ipsi e contralateral à lesão), pela estatística descritiva e comparações intra e intergrupos com análise de variância com correção a posteriori de Tukey. Os animais isquêmicos apresentaram conspícua perda tecidual, ativação microglial e astrocitose entre 3 e 7 dias após a indução isquêmica, o que não foi observado nos animais controle. A perda tecidual e a ativação de células gliais foram mais intensas no córtex somestésico, depois no córtex motor, com intensidade reduzida na área de associação, o que foi confirmado por análise quantitativa. Os resultados sugerem que uma lesão isquêmica de mesma intensidade induz um padrão diferencial de perda tecidual e neuroinflamação, dependendo da área cortical, e que as áreas sensoriais primárias e motoras são mais susceptíveis ao processo isquêmico do que áreas de associação. / Stroke can occur in any region of the central nervous system (CNS). The cerebral cortex is one of the most often affected areaby this acute neural disorder, but there are no studies that have compared the damaging pattern in different cortical regions after acomparable focal ischemia. The aim of this investigation was to evaluate the degenerative pattern of different cortical areas after focal ischemic injury. Focal ischemia was induced by stereotaxic microinjections of endothelin-1 (ET-1) into the somatosensory, motor and association cortices of adult rats (N = 45). The control animals were injected with the same volume of sterile saline (N = 27). The animals were perfused 1, 3 and 7 days after the ischemic event. The brain was removed, postfixed, cryoprotected, and sectioned in a cryostat. The general histopathology was evaluated in 50μm sections stained with cresyl violet. 20μm sections were submitted to immunohistochemistry for astrocytes (anti-GFAP), activated microglia / macrophages (anti-ED1) and overall microglial population (anti-Iba1). The damaging patterns werequalitatively evaluated under optical microscopy and quantitatively by counting the number of cells in the ipsilateral and contralateral sides to injury.Descriptive statistics and comparisons within and between groups were performed using analysis of variance with Tukey post-hoc test. Conspicuous ischemic tissue loss, microglial activation and astrocytosis were observed mainly 3 and 7 days after ischemia, which was not observed in control animals. The tissue loss and activation of glial cells were more intense in the somatosensory cortex, followed by the motor cortex. The association cortex displayed less damage compared to other cortical areas, which was confirmed by quantitative analysis. The results suggest that an ischemic lesion of the same intensity induces a differential pattern of tissue loss and neuroinflammation, depending on the cortical area, and that the primary sensory and motor areas are more susceptible to ischemia than association areas.