L'AMPc té un paper clau com a missatger intracel.lular regulant la transmissió dels senyals extracel•lulars en diferents teixits i controlant múltiples processos cel lulars. Els nivells intracel.lulars d'AMPc es controlen mitjançant la seva síntesi, catalitzada per l'enzim adenilat ciclasa, i mitjançant la seva degradació a través de l'acció de les fosfodiesterases (PDE) de nucleòtids cíclics. Hi ha 11 famílies de PDEs. La PDE4 representa a una família de fosfodiesterases específiques d'AMPc formada per quatre gens paràlegs (PDE4-D), cadascun dels quals és capaç de generar múltiples variants d’splicing. La PDE4A, la PDE4B i la PDE4D es troben expressades en diferents tipus de cèl lules inflamatòries on tenen un important paper com reguladores dels processos inflamatoris. La inhibició selectiva, tant in vitro com in vivo, de PDEs ha demostrat tenir diferents efectes antiinflamatoris. En aquest treball es mostra la implicació de la isoforma PDE4B, i en concret la seva variant de splicing PDE4B2, durant el procés neuroinflamatori del model animal d’Esclerosis Múltiple, l’Encefalomielitis Autoimmune Experimental (d’EAE). Els resultats mostren un augment de l’expressió de l’ARNm de PDE4B2 a la medul•la espinal de ratolins EAE que correlaciona amb l’expressió d’alguns marcadors inflamatoris de forma dependent a la simptomatologia clínica dels animals. També s’observa que l’enzim PDE4B es trova localitzat principalment en cèl•lules presentadores d’antigen (APCs) com les cèl•lules dendrítques i els macròfags/micròglia. A més, els ratolins PDE4B-/- mostren una aparició temprana dels símptomes clínics en comparació amb els ratolins wildtype, amb alteracions en l’expressió de l’ARNm d’algunes citocines. L’alteració selectiva de la PDE4B2 en el model d’EAE en ratolí i la seva participació en el desenvolupament de la malaltia com s’ha observat en els animals PDE4B-/- presenta noves possibilitats sobre l’ús d’inhibidors selectius per les diverses isoformes (i variants d’splicing) tant per aplicacions terapèutiques com per investigar mecanismes d’inflamació en malalties neurodegeneratives. / Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an animal model of multiple sclerosis that courses with neuroinflammation, axonal damage and demyelination. The model is characterized by T- and B-cell responses to myelin oligodendrocyte glycoprotein which produce a wide range of pro- and anti-inflammatory cytokines. The modulation of cAMP levels through pharmacological manipulation of phosphodiesterases (PDEs) provokes profound anti-inflammatory responses. In the EAE model, amelioration of the clinical signs and delayed onset is observed after PDE4 inhibition and the PDE4B gene has been related to the inflammatory immune response in mice. Here we analyzed post-immunization changes in the expression of mRNA coding for the PDE4B2 splice variant by semiquantitative real-time PCR and in situ hybridization. The results showed an upregulation of PDE4B2 mRNA in the spinal cord of EAE mice which correlates with FoxP3 and TGF-β mRNAs expression in a score-dependent manner. We also found that PDE4B enzyme is mainly localized in antigen-presenting cells (APCs) such as dendritic cells and microglia/macrophages. PDE4B-/- mice show an earlier onset of the disease compared to wildtype mice, with alterations in some cytokine mRNA expression. The results point to a protective role of the PDE4B enzyme and PDE4B2 splice variant in particular, during EAE pathogenesis by modulating cAMP levels in APCs and controlling the cytokine environment for T-cell differentiation.

El Objetivo General de esta Tesis ha sido investigar la formación y función de heterómeros entre receptores de dopamina y otros receptores que puedan estar implicados en la regulación de la transmisión dopaminérgica, como receptores de galanina, histamina, adrenérgicos o receptores sigma-1. Basándonos en que tanto la galanina como la dopamina modulan la liberación de acetilcolina en el hipocampo, se ha demostrado que los receptores de dopamina de la familia D1 (receptores D1 y D5) pueden formar heterómeros con los receptores de galanina Gal1 y Gal2 y se ha estudiado la función de estos heterómeros en la liberación de acetilcolina en el hipocampo. En el estriado, los receptores de dopamina D1 se localizan en las neuronas GABAérgicas dinorfinérgicas donde también se localizan receptores de histamina H3. Este hecho permite formular la hipótesis de que estos receptores de histamina modulen la transmisión dopaminérgica mediante la formación de heterómeros y que esto pueda explicar algunos de los resultados contradictorios sobre las interacciones funcionales entre receptores H3 y receptores de dopamina. Teniendo en cuenta todo ello, se ha demostrado que los receptores de dopamina D1 pueden formar heterómeros con los receptores de histamina H3 y se han estudiado las implicaciones funcionales de estos heterómeros en cultivos celulares y en el estriado. Las vías dopaminérgicas y especialmente la señalización mediada por los receptores D1 y D2 de dopamina, están profundamente implicadas en la adicción a cocaína. Una gran parte de los efectos mediados por la cocaína se atribuyen a una sobre-estimulación de la señalización de los receptores de dopamina debida al incremento de dopamina ocasionado por la inhibición por cocaína del transportador de dopamina (DAT). Sin embargo, la cocaína, además de interaccionar con DAT, puede unirse a otras proteínas como los receptores sigma-1. En este contexto, es interesante conocer si los receptores sigma 1 pueden modular la funcionalidad de los receptores de dopamina D1 y D2 mediante un proceso de heteromerización. Por ello, se ha demostrado que los receptores D1 y D2 de dopamina pueden formar heterómeros con los receptores sigma-1 e investigado el efecto que ejerce la cocaína, mediado por estos heterómeros, en la transmisión dopaminérgica. El receptor de dopamina D4 pertenece a la familia de receptores de dopamina D2 y, en humanos, es el único que presenta formas polimórficas, las más comunes D4.4, D4.2 y D4.7. Existe una clara relación entre la forma polimórfica D4.7 del receptor D4 humano con el trastorno de hiperactividad y déficit de atención. No existen muchas diferencias funcionales entre las formas polimórficas por lo que no se conoce cuales son las repercusiones bioquímicas de expresar una u otra forma. Nuestra hipótesis de trabajo es que podían existir diferencias en la capacidad de formar heterómeros con otros receptores de dopamina como el D2 y que estos heterómeros podrían modular la liberación de glutamato en el estriado, lo que podría ser relevante en el trastorno de hiperactividad y déficit de atención. Por ello, se ha demostrado que los receptores D2 y D4 de dopamina pueden formar heterómeros en células vivas y en el tejido estriatal y se ha estudiado su papel en la liberación de glutamato en el estriado. Otra particularidad del receptor de dopamina D4 es que es el único receptor dopaminérgico en la glándula pineal de rata sin que se conozca cual es su función a pesar de que se expresa de manera circadiana. Dado que la glándula pineal está bajo el control de los receptores alfa-1B y beta-1 adrenérgicos, cuya activación está altamente relacionada con la regulación del ritmo circadiano y la síntesis y liberación de serotonina y melatonina, una posibilidad es que los receptores de dopamina D4 puedan modular la función de los receptores adrenérgicos de la glándula pineal mediante un proceso de heteromerización. Para estudiar esta posibilidad se ha demostrado que los receptores D4 de dopamina pueden formar heterómeros con los receptores alfa-1B y beta-1 adrenérgicos y se ha investigado su presencia y función en la glándula pineal de rata. / DOPAMINE RECEPTOR´S HETEROMERS. NEW MECHANISMS FOR THE REGULATION OF DOPAMINERGIC TRANSMISSION The main objective of this Thesis has been to investigate the formation and function of heteromers between dopamine and other receptors that might be implicated in the regulation of dopaminergic transmission, such as galanin, histamine, adrenergic or sigma-1 receptors. Firstly, it has been demonstrated that dopamine D1-like family receptors (D1 and D5) can form heteromers with galanin Gal1 and Gal2 receptors. The functional association of these heteromers has been studied within the context of the liberation of acetylcholine in the hippocampus. Secondly, it has been shown that dopamine D1 receptors can form heteromers with histamine H3 receptors. The functional implications of these heteromers have been studied using cellular cultures and native striatum tissue. Thirdly, it has been demonstrated that dopamine D1 and D2 receptors can form heteromers with sigma-1 receptors. The effect of cocaine on the dopaminergic transmission mediated by these heteromers has been investigated. Fourthly, it has been shown that dopamine D2 and D4 receptors can form heteromers both in living cells and striatal tissue and their role on the release of glutamate in the striatum has been studied. Finally, it has been shown that dopamine D4 receptors can form heteromers with adrenergic α1B and β1 receptors, their presence and function has been investigated in rat pineal gland.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000432146-Texto+Completo-0.pdf: 1043859 bytes, checksum: 1179861d46757576425c11737bcf1dc7 (MD5) Previous issue date: 2011 / Cannabidiol, the main non-psychotropic constituent of Cannabis sativa, has a large number of pharmacological effects including anticonvulsant, sedative, hypnotic, antipsychotic, antiinflammatory and neuroprotective, as demonstrated in both clinical and pre-clinical studies. Many neurodegenerative disorders involve cognitive deficits, and this has led to interest in whether cannabidiol could be useful in the treatment of memory impairment associated to these diseases. Here, we used an animal model of cognitive impairment, induced by iron overload in order to test the effects of cannabidiol in memory-impaired rats. Rats received vehicle or 10. 0 mg/kg Fe+2 orally at postnatal days 12-14. When animals reached the age of 2 months, they received an acute intraperitoneal injection of vehicle or cannabidiol (5. 0 or 10. 0 mg/kg) immediately after the training session of the novel object recognition task. In order to investigate the effects of chronic cannabidiol, neonatally iron-treated rats received daily intraperitoneal injections of cannabidiol (5. 0 or 10. 0 mg/kg) for 14 days. Twenty-four hours after the last injection, they were submitted to object recognition training. Retention test sessions were performed 24 hours after training. Results indicated that animals that received iron in the neonatal period show severe memory deficits. A single acute injection of cannabidiol at the highest dose was able to partially recover memory in iron-treated rats. Chronic cannabidiol improved recognition memory in iron-treated rats in a dose-dependent manner. Acute or chronic cannabidiol does not affect memory in control rats. The present findings provide evidence that suggest the potential use of cannabidiol for the treatment of cognitive decline associated to neurodegenerative disorders. Further studies, including clinical trials are warranted in order to determine the usefulness of cannabidiol in humans suffering from neurodegenerative disorders. / O canabidiol é o principal constituinte não-psicotrópico da Cannabis sativa e possui uma ampla variedade de efeitos farmacológicos, incluindo efeito anticonvulsivante, sedativo, hipnótico, antipsicótico, antiinflamatório e neuroprotetor como demonstrado em estudos clínicos e pré-clínicos. Muitas doenças neurodegenerativas envolvem déficits cognitivos e isto tem levado ao questionamento sobre a possibilidade de utilização do canabidiol no tratamento dos danos de memória associado a essas patologias. No presente trabalho utilizou-se um modelo animal de dano cognitivo induzido pela sobrecarga de ferro a fim de investigar os efeitos do canabidiol na disfunção de memória. Ratos Wistar machos receberam veículo ou 10. 0 mg/kg Fe⁺² por via oral nos dias 12-14 pós-natal. Quando os animais completaram 2 meses de idade (idade adulta), receberam uma injeção intraperitonial aguda de veículo ou canabidiol (5. 0 ou 10. 0 mg/kg) imediatamente após a sessão de treino da tarefa de reconhecimento do objeto. Para investigar os efeitos do uso crônico de canabidiol os ratos tratados com ferro no período neonatal receberam injeções diárias intraperitoniais de canabidiol (5. 0 ou 10. 0 mg/kg) durante 14 dias. Vinte e quatro horas após a última injeção eles foram submetidos ao treino de reconhecimento de objeto. As sessões de teste de retenção foram realizadas 24 horas após o treino. Os resultados indicaram que os animais que receberam ferro no período neonatal apresentaram déficits severos de memória. Uma única injeção aguda de canabidiol na sua dose mais alta foi capaz de recuperar parcialmente a memória dos ratos tratados com ferro. O uso crônico de canabidiol melhorou a memória de reconhecimento dos ratos tratados com ferro de forma dose dependente. O uso agudo ou crônico de canabidiol não afeta a memória dos ratos controles. Os resultados do presente trabalho fornecem evidências que apontam para o uso do canabidiol no tratamento de déficit cognitivo associados às doenças neurodegenerativas. Investigações futuras, envolvendo ensaios clínicos seriam necessárias para determinar a utilidade deste fármaco no tratamento de seres humanos acometidos por doenças neurodegenerativas.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciênicas Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-25T22:19:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 296777.pdf: 4228661 bytes, checksum: 0dea9378b34975e780e61a4b234324c4 (MD5) / A doença de Parkinson (DP) é a doença neurodegenerativa motora mais prevalente na população, com maior incidência nos idosos. Algumas características importantes desta doença, como o seu caráter progressivo, a presença de sintomas não motores que em grande parte não respondem aos fármacos antiparkinsonianos disponíveis atualmente, e a perda de eficácia e o aparecimento de efeitos colaterais sérios após o tratamento crônico com fármacos dopaminérgicos, representam verdadeiros desafios às comunidades clínica e acadêmica. Existe um grande esforço na busca de agentes neuroprotetores e modificadores da DP, ou que aliviem os efeitos colaterais do tratamento, principalmente as discinesias, associados ao uso crônico daL-DOPA. Nas últimas duas décadas, um número crescente de trabalhos clínicos e experimentais tem sugerido o potencial do exercício físico como um agente paliativo ou adjuvante na DP. Os resultados desta tese demonstram que a capacidade neuroprotetora do exercício físico é dependente do modelo experimental utilizado, sendo observada em camundongos hemiparkinsonianos após lesão unilateral com 6-OHDA intra-estriatal. A prevenção da disfunção mitocondrial e do estresse oxidativo são mecanismos potencialmente envolvidos nesta ação neuroprotetora do exercício. Por outro lado, o mesmo protocolo de corrida em esteira durante seis semanas não protegeu a degeneração da via nigro-estriatal induzida pelo tratamento intranasal com MPTP em camundongos.Além disso, foi possível caracterizar uma série de propriedades modificadoras do exercício nos modelos experimentais da DP utilizados no presente estudo. O exercício em esteira ergométrica durante seis semanas atenuou os prejuízos motores e cognitivos induzidos, respectivamente, pela administração intra-estriatal de 6-OHDAe intranasal de MPTP em camundongos. Enquanto o exercício voluntário durante 14 dias em rodas de correr reduziu a severidade das discinesias induzidas pelaL-DOPA em camundongos hemiparkinsonianos. Estes benefícios foram acompanhados de importantes modificações na plasticidade dos núcleos da base dos animais exercitados. O exercício melhorou a função da via indireta dos núcleos da base nos animais tratados com MPTP, através do aumento do número e resposta de receptores do tipo D2 para dopaminae da diminuição do turnover dopaminérgico. O exercício também preveniu modificações na neurotransmissão glutamatérgica e sinalização intracelularno estriado,potencialmente envolvidas no desenvolvimento das discinesias induzidaspelaL-DOPA. Em conjunto, os resultados do presente estudo indicam o potencial do exercício físico como um agente modificador da DP, sendo este capaz de aliviar os prejuízos motores e cognitivos em animais submetidos a modelos experimentais da DP, além de diminuir as discinesiasinduzidas pelo tratamento comL-DOPA, enquanto a neuroproteção ainda permanece controversa.

O RAGE é um receptor transmembrana, imunoglobulina-like que existe em múltiplas isoformas e interage com um amplo repertório de ligantes extracelulares. O RAGE é expresso em níveis baixos na maioria das células, porém o aumento da presença de seus ligantes no domínio extracelular faz com que o RAGE inicie uma cascata de sinalização intracelular complexa, resultando em estresse oxidativo, ativação do fator de transcrição NF-B, aumento da expressão de citocinas, além da indução de sua própria expressão. O envolvimento do RAGE neste amplo espectro de sinalização vincula este receptor a diversas condições patológicas. Nesta tese utilizamos 3 modelos experimentais que induzem inflamação sistêmica (Leishmania amazonensis, Lipopolissacarídeo e sepse) e 1 modelo experimental que mimetiza a denervação neuronal (modelos experimentais in vivo). Além disso utilizamos diferentes abordagens de bloqueio do RAGE a fim de elucidar a função deste receptor. Com base em nossos resultados os modelos experimentais foram eficientes em induzir o aumento do RAGE e sua sinalização no sistema nervoso central, desencadeando a síntese e liberação de moléculas pró-inflamatórias e o aumento do estresse oxidativo, culminando em neuroinflamação e neurodegeneração. As intervenções de bloqueio do RAGE foram eficientes em inibir as vias de sinalização intracelular mediadas pelo receptor, comprovando a via de ação. Levando em conta nossos principais resultados concluímos que: a) RAGE atua como mediador da perda neuronal em resposta ao insulto inflamatório em diversas estruturas do SNC, b) está presente no corpo dos neurônios dopaminérgicos e envolvido na morte destes neurônios; c) o aumento do RAGE é tempo-dependente e a morte dos neurônios está vinculada a ação deste receptor. / RAGE is a transmembrane, immunoglobulin-like receptor that exists in multiple isoforms and interacts with a broad repertoire of extracellular ligands. RAGE is expressed at low levels in most cells, but the increased presence of its ligands initiates a complex intracellular signaling cascade resulting in oxidative stress, activation of transcription factor NF-B, increased expression of cytokines in addition to concomitant upregulation of RAGE itself. In this thesis we used 3 experimental models which induce systemic inflammation (Leishmania amazonensis, Lipopolysaccharide and sepsis) and 1 experimental model that mimics neuronal denervation (experimental models in vivo). In addition, different approaches to block RAGE were used to elucidate the function of this receptor. Based on our results the experimental models were efficient in inducing the increase of RAGE and its signaling in the central nervous system, triggering the synthesis and release of proinflammatory molecules and the increase of oxidative stress, culminating in neuroinflammation and neurodegeneration. The RAGE blocking interventions were effective in inhibiting receptor-mediated signaling, proving the signaling pathway. Considering our main results, we conclude that: a) RAGE acts as a mediator of neuronal loss triggered by inflammatory insults in various CNS structures; b) RAGE is present in the body of dopaminergic neurons and is involved in the death of these neurons; c) the increase of RAGE is time-dependent, and the neuronal death is dependent on the action of this receptor.

Nos seres humanos o triptofano é metabolizado por várias vias, produzindo compostos biologicamente importantes chamados quinureninas, serotonina, ácidos indólicos, compostos ácidos nicotínicos (niacina) e ácido quinolínico. Em condições normais, pouquíssimo triptofano aparece convertido em ácido nicotínico. Sabe-se que o acúmulo de triptofano e seus metabólitos está relacionado ao dano cerebral encontrado tanto na hipertriptofanemia quanto em doenças neurodegenerativas. Nesse trabalho, nós investigamos o efeito da administração de triptofano sobre vários parâmetros comportamentais no teste de campo aberto e de estresse oxidativo e o efeito de creatina e piruvato, sobre os efeitos do triptofano. Quarenta ratos Wistar, machos, de 60 dias, foram aleatoriamente divididos em 4 grupos: salina; triptofano; piruvato + creatina; triptofano + piruvato + creatina. Os animais receberam 3 injeções subcutâneas de triptofano (2 μmol/g peso corporal cada um em intervalos de 3 horas) e/ou piruvato (200 μg/g peso corporal 1 hora antes do triptofano) e/ou creatina (400 μg/g peso corporal 2 vezes por dia durante 5 dias antes do treino); os controles receberam solução salina (NaCl 0.85g%) nos mesmos volumes (30 μL/g peso corporal) das outras substâncias Uma vez que, a redução progressiva da atividade exploratória no campo aberto pode ser interpretada como um indicador de que os animais reconheceram e lembraram do ambiente nossos resultados mostram que o triptofano aumentou a atividade dos animais, sugerindo a redução da habilidade de habituação ao ambiente e um déficit de aprendizagem/memória causada por este aminoácido. O triptofano também induziu aumento de TBA-RS e a redução de sulfidrilas totais no hipocampo, indicando indução de estresse oxidativo. Os efeitos do triptofano no campo aberto e no estresse oxidativo, foram totalmente prevenidos pelo pré-tratamento com creatina mais piruvato, dois potentes antioxidantes, reforçando a hipótese de estresse oxidativo. Nossos achados, estão de acordo ao que pode ser observado em pacientes afetados pela hipertriptofanemia e doenças neurodegenerativas, ou em outras doenças em que ocorra o acúmulo de triptofano. É possível que o estresse oxidativo possa estar enolvido nos mecanismos que levar à lesão cerebral, sugerindo que a suplementação de creatina e piruvato poderia beneficiar os pacientes afetados por esses transtornos. Estudos adicionais serão necessários para compreensão de como o triptofano é causador de dano, se é pelo seu acúmulo ou pelo acúmulo de seus metabólitos. Além disso, também será necessária uma maior investigação para avaliar se a suplementação com creatina e piruvato é possível de ser recomendada à pacientes com hipertriptofanemia ou doenças degenerativas. / In human, tryptophan is metabolised by multiple pathways, producing several compounds, namely kynurenines, serotonin, indolic acids, nicotinic acid (niacin) compounds and quinolinic acid. Under normal conditions, very little tryptophan appears converted to nicotinic acid. It is known that the accumulation of tryptophan and its metabolites is related to brain damage associated with both hypertryptophanemia and neurodegenerative diseases. In this work, we investigated the effect of tryptophan administration on various parameters of behavior in the open field task and oxidative stress, and the effects of creatine and pyruvate, on the effect of tryptophan. Forty, sixty-day-old male Wistar rats, were randomly divided into 4 groups: saline; tryptophan; pyruvate + creatine; pyruvate + creatine. Animals received 3 subcutaneous injections of tryptophan (2 μmol/g body weight each one at 3 h of intervals) and/ or pyruvate (200 μg/g body weight 1 h before tryptophan) and/or 400 μg/g body weight twice a day for 5 days before tryptophan twice a day for 5 days before training; controls received saline solution (NaCl 0.85 g%) at the same volumes (30 μL/g body weight) than the other substances Since the progressive reduction of exploratory activity in open field ca be interpreted as an indicator that animals recognize and remember the environment ours results showed that tryptophan increased the activity of the animals, suggesting a reduction in the ability of habituation to the environment and a deficit in learning/memory caused by this amino acid. Tryptophan induced increase of TBA-RS and total sulfhydryls in the hippocampus, indicating induction of oxidative stress. The effects of tryptophan in the open field, and in oxidative stress were fully prevented by the combination of creatine plus pyruvate, two powerful antioxidants, reinforcing the idea of oxidative stress. In case these findings also occur in humans affected by hypertryptophanemia or other neurodegenerative disease in which tryptophan accumulates, it is feasible that oxidative stress may be involved in the mechanisms leading to the brain injury, suggesting that creatine and pyruvate supplementation could benefit patients affected by these disorders. Additional studies are needed to understand how tryptophan is causing damage if it is by is accumulation or accumulation of metabolites. In addition, further research is needed to assess whether supplementation with creatine and pyruvate can be recommended to patients with degenerative diseases or hipertriptophanemia.

Orientador: Prof. Dr. Daniel Carneiro Carrettiero / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Neurociência e Cognição, 2014. / As inclusões de Tau fosforilada são o principal marcador das doenças neurodegenerativas classificadas como taupatias, sendo a doença de Alzheimer (DA) a forma mais prevalente. A presença de ubiquitina nas inclusões de Tau é uma evidência para um defeito em sua degradação, pois proteínas ubiquitinadas são prontamente degradadas pelo proteassoma. A proteína BAG2 é um co-chaperona conhecida por ter como alvo a degradação da Tau por uma via mais eficiente que a via dependente da ubiquitina. Sabendo que a redução da temperatura leva a fosforilação de Tau, o presente estudo investiga se a co-chaperona BAG2, em condição de hipotermia, tem participação no aumento da Tau fosforilada. Utilizando a linhagem de células SH-SY5Y não diferenciadas e diferenciadas (expressão do gene MAP2 como controle) como um modelo, nós demonstramos o efeito da redução de temperatura, de 37°C a 34°C, sobre a expressão do mRNA BAG2 via PCR em tempo real. Para confirmar o efeito de BAG2 na degradação de Tau fosforilada (pTau), foram avaliados os níveis de Tau fosforilada através de Western blot. Ao comparar a expressão de BAG2 entre células indiferenciadas e diferenciadas, verificamos uma redução da expressão de BAG2 mRNA, sugerindo que BAG2 tem sua expressão suprimida na diferenciação. A redução de temperatura causou uma redução significativa da expressão de BAG2 em células não diferenciadas, enquanto em células diferenciadas não demonstrou nenhuma diferença. Este resultado sugere a existência de um limiar de expressão de BAG2. Tal como esperado, a redução de temperatura em células não diferenciadas, que mostraram a maior inibição de BAG2, causou um aumento significativo na fosforilação de Tau. Da mesma forma, nenhum efeito sobre células diferenciadas foi visto ao reduzir a temperatura, pois não haviam demonstrado diminuição significativa na expressão BAG2. Curiosamente, embora BAG2 seja sempre reduzida em células diferenciadas em relação a não diferenciadas, independentemente da temperatura, a 37°C não existe nenhuma diferença nos níveis de pTau entre as células indiferenciadas e diferenciadas. Além disso, a diminuição dos níveis de pTau entre as células não diferenciadas e diferenciadas em 34°C sugere que a fosforilação da Tau é regulada de modo diferente em células diferenciadas, de forma que pode ser desvinculada expressão de BAG2. Foi observado também em células não diferenciadas que a super expressão de BAG2 submetida a redução de temperatura resgatou o aumento na fosforilação da Tau. Este resultado sugere uma relação direta entre a redução da temperatura, a redução da expressão BAG2 e o aumento nos níveis de proteína Tau fosforilada em células indiferenciadas. Estes dados suportam a hipótese de que as mudanças na temperatura podem conduzir a uma modificação condicional de vias celulares relacionados com a progressão das taupatias. / The presence of inclusions of phosphorylated Tau is a hallmark of many neurodegenerative disorders classified as "tauopathy," of which Alzheimer's disease (AD) is the most prevalent form. The abundance of ubiquitin on Tau inclusions points to a defect in Tau protein clearance since ubiquitinated proteins are promptly degraded by proteasome. The BAG2 protein is a co-chaperone that targets phosphorylated Tau for degradation by a more-efficient ubiquitin-independent pathway. Given that temperature reduction leads to Tau hyperphosphorylation, the present study investigates if the co-chaperone BAG2 participates in the cold-induced up-regulation of phosphorylated Tau. Using undifferentiated and differentiated MAP2-expressing SH-SY5Y cells as a model, we demonstrated the effects of temperature reduction, from 37°C to 34°C, on BAG2 mRNA expression via realtime PCR. To confirm an effect of BAG2 at the protein level, we tested levels of phosphorylated Tau via Western blot. When comparing BAG2 expression between differentiated cells and undifferentiated cells, a decrease in BAG2 mRNA suggests that BAG2 is downregulated on differentiation. Cold treatment of undifferentiated cells caused a significant decrease in BAG2 expression, while cold treatment of differentiated cells did not yield a significant decrease. This result suggests that inhibition of BAG2 expression via either of these mechanisms approaches a limiting threshold. As expected, cold treatment of undifferentiated cells, which showed the greatest inhibition of BAG2, caused a significant increase in phosphorylated Tau protein. Similarly, no effect on Tau phosphorylation was seen on cold treatment of differentiated cells, which had shown no significant decrease in BAG2 expression. Interestingly, although BAG2 is always reduced in differentiated cells relative to undifferentiated, irrespective of temperature, at 37°C there is no difference in pTau levels between undifferentiated and differentiated cells. Further, a decrease in pTau levels between undifferentiated and differentiated cells at 34°C suggests that Tau phosphorylation is differently regulated in differentiated cells, in a manner that may be uncoupled to BAG2 expression. Next, we overexpressed BAG2 in undifferentiated cells that were next subjected to cold treatment, and observed that BAG2 overexpression was able to rescue the increase in Tau phosphorylation that accompanied the temperature-dependent decrease in BAG2. This result suggests a direct link between temperature-dependent inhibition of BAG2 expression and an increase in levels of phosphorylated Tau protein in undifferentiated cells. These data support the hypothesis that changes in temperature can lead to a conditional modification of cellular pathways related to tauopathies progression.

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, da Universidade do Extremo Sul Catarinense - UNESC, para obtenção do grau de Doutora em Ciências da Saúde. / O envelhecimento é um processo complexo ainda não plenamente compreendido, apresenta mecanismos que determinam fenômenos fisiológicos, bem como patológicos. Este processo pode levar a diferentes doenças ou disfunções como a incontinência urinária (IU) e fecal (IF), bem como a doenças neurodegenerativas relacionadas às habilidades funcionais, cognitivas, emocionais e psíquicas. Todas estas alterações comprometem a qualidade de vida dos idosos e a longevidade. Portanto, o objetivo deste estudo foi realizar a caracterização social, demográfica e de saúde que possam estar associadas as IU e IF em idosos longevos. Este é um estudo transversal que utilizou uma amostra censitária de indivíduos idosos com 80 anos ou mais que aceitaram participar do estudo. Este estudo incluiu 165 idosos longevos com idade geral de 84,8 3,7 anos, sendo 63% do sexo feminino, 65,5% moradores da zona rural, com uma mediana de 6 filhos, a mediana de escolaridade de 3 anos. Auto avaliaram a saúde como boa a ótima em 77,6% embora 32,7% apresentam algum grau de dependência. As comorbidades hipertensão arterial sistêmica (HAS), diabetes mellitus (DM) e cardiopatias representaram 75,8%, 17% e 33,3%, respectivamente. A média de índice de massa corpórea (IMC) foi de 25,6 4,6, embora, 38,8% reportaram fazer atividade física. Os anti hipertensivos (75,2%), tranquilizantes (34,5%) e relaxante muscular (10,3%) foram os fármacos mais usados. A perda de memória, estado cognitivo e mental apresentam-se alterados em mais de 50% dos idosos. A ansiedade e sintomas depressivo estavam presentes em 12,7% e 46,7%, respectivamente, dos idosos. A vitamina D reduzida foi encontrada em 31,9% dos indivíduos. A prevalência de IU e constipação foi de 43,6%, enquanto a prevalência de IF foi de apenas 1,8%, não sendo esta última significativa no estudo. O tipo mais frequente de IU foi de urgência com 50,4%. O sexo (<0,001), parto vaginal exclusivo (<0,001), IMC (p<0,001), prática de atividade física (p=0,017), comorbidades como a DM (p=0,027), sintomas depressivos (p=0,025) e constipação (p=0,045) foram estatisticamente significativos ao associar com a IU. Na Regressão de Poison revelou que os fatores associados a alta prevalência da IU foram o sexo feminino, IMC e DM. A prática de exercício físico se tornou protetora nesse caso (p<0,005). A constipação que é um fator de risco e de piora para IU, apresentou relação direta com uso de relaxante muscular, sintomas depressivos, idade e deficiência de vitamina D (p<0,005). No que concerne a qualidade de vida, verifica-se que os idosos com IU apresentam escores mais baixos nos domínios da

Made available in DSpace on 2015-09-18T02:07:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000474864-Texto+Completo-0.pdf: 4783570 bytes, checksum: 1da454a8aaea971c62e4fff0a6d841a2 (MD5) Previous issue date: 2015 / Introduction : The cellular and physiological changes that accompany the aging process has pronounced effects in neurodegenerative diseases. Factors that produce neurodegeneration do so through different processes that culminate in a common signaling pathway cascade. Stem cells communicate via cellular signaling mechanisms, which is part of a complex system which governs and coordinates activities and cell functions. Understanding the mechanisms and forms of intercellular communication and their relationship in the activation of signaling cascades from the surface receptor to the cell nucleus during neurogenesis, will answer some pertinent questions to the mechanisms of action of stem cells in repair central nervous system. Objective : This study aimed to determine which RTKs being activated during neurogenesis of adult stem cells from human umbilical cord tissue. Methods : Adult stem cells were obtained from human umbilical cord tissue (n = 3) and subjected to specific inducers in neurodifferentiation means. The kit Human Phospho-RTK Array was used for evaluating the phosphorylation of the RTK and the expression determined by realtime PCR. Results : The mesenchymal stem cells obtained from umbilical cord tissue were confirmed by differentiation induction in adipocytes and osteocytes cells. The neurodifferentiation was confirmed by expression of genes that are expressed during neurogenesis in cells and neural cells, as well as immunocytochemistry technique markings which showed nuclear (DAPI) and cell processes (Fluoropan). During the neuroinduction processes and neurodifferentiation the phosphorylation levels of RTKs were variable, with no clear pattern. The Ryk receptor showed no significant changes in their levels of phosphorylation of the three samples studied and the different stages of differentiation, ie, mesenchymal, neuroinductions and neurodifferentiates cells. Conclusions : The tyrosine kinases are actively being phosphorylated during neuroinduction and neurogenesis, with varying standards between the different stages and between different samples, reflecting the variability of human adult stem cells. / Introdução : As alterações celulares e fisiológicas que acompanham o processo de envelhecimento tem efeitos pronunciados nas doenças neurodegenerativas. Os fatores que produzem neurodegeneração o fazem através de diferentes processos, que culminam em uma via comum de cascata de sinalização. As células-tronco se comunicam por mecanismos de sinalização celular, que faz parte de um complexo sistema que governa e coordena as atividades e funções celulares. Compreender os mecanismos e as formas de comunicação intercelular e a sua relação na ativação das cascatas de sinalização, desde o receptor de superfície até o núcleo celular, durante a neurogênese, permitirá responder algumas questões pertinentes aos mecanismos de ação das células-tronco no reparo do sistema nervoso central. Objetivo : Este estudo teve como objetivo determinar quais os RTKs que estão sendo ativados durante a neurogênese de células-tronco adultas de tecido de cordão umbilical humano. Metodologia : Células-tronco adultas foram obtidas de tecido de cordão umbilical humano (n=3) e submetidas a neurodiferenciação em meios indutores específicos. O kit Human Phospho-RTK Array foi utilizado para avaliação da fosforilação dos RTKs e a expressão determinada por PCR em tempo real. Resultados : As células-tronco mesenquimais obtidas do tecido do cordão umbilical foram confirmadas através da indução de diferenciação em células adipócitas e osteócitas. A neurodiferenciação foi confirmada através da expressão de genes que são expressos nas células durante a neurogênese e em células neurais, como também a técnica de imunocitoquímica que mostrou marcações nucleares (DAPI) e prolongamentos celulares (Fluoropan). Durante os processos de neuroindução e neurodiferenciação os níveis de fosforilação dos RTKs foram variáveis, sem um padrão definido. O receptor Ryk não apresentou alterações significativas nos seus níveis de fosforilação entre as três amostras estudadas e nas diferentes etapas de diferenciação, isto é, células-tronco mesenquimais, células neuroinduzidas e células neurodiferenciadas. Conclusões : Os receptores tirosina quinases estão sendo ativamente fosforilados durante a neuroindução e neurogênese, com padrões variáveis entre as diferentes etapas e entre diferentes amostras, refletindo a variabilidade das células-tronco adultas humanas.

Made available in DSpace on 2013-12-27T01:01:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000452977-Texto+Completo-0.pdf: 5521705 bytes, checksum: 123159632e5331d0676a4575af283f7b (MD5) Previous issue date: 2013 / Modafinil is a drug that promotes increased alertness. It was approved for the treatment of excessive daytime sleepness in narcolepsy and obstructive sleep apnea. Some studies indicate that Modafinil can improve learning, memory and reverse cognitive loss induced by sleep deprivation and stress. This study was aimed to characterize the effects of modafinil on control adult rat’s memory. Further, its effects were also studied using three models of cognitive decline to assess modafinil effects on memory. The iron overload model on neonatal period related to the degenerative diseases, maternal deprivation on neonatal period that generates emotional and cognitive impairment on adulthood, and, paradoxal sleep deprivation, which is known to interfere with on memory consolidation. The first experiment investigated the effects of the drug on memory consolidation and retrieval using distinct paradigms of learning; object recognition and inhibitory avoidance (aversive memory task) in healthy adult rats. Male Wistar rats received a single injection of acute modafinil (0. 0; 0. 75; 7. 5 or 75 mg/kg) immediately after training or one hour before object recognition or inhibitory avoidance retention tests. Acute administration of modafinil to healthy rats did not affect memory consolidation or retrieval. The second experiment examined the acute or chronic administration of modafinil on the reversal of memory deficits induced by iron overload in the neonatal period, a model of cognitive decline related to neurodegenerative disorders. Rats treated with iron between 12 and 14 postnatal days received in adulthood, acute intraperitoneal injection of modafinil (0. 0; 0. 75; 7. 5 and 75 mg/kg) immediately after training in the recognition task object. A single injection of modafinil at the highest dose was able to recover recognition memory in rats treated with iron. In order to investigate the effects of chronic treatment with modafinil, irontreated rats received intraperitoneal injections of modafinil at the same doses for seventeen days. Twenty-four hours after the last injection, the animals were submitted to object recognition or inhibitory avoidance training. Memory retention tests were performed twenty four hours after training. Chronic administration of modafinil fully recovered memory deficits induced by iron both in recognition memory and emotional memory. Experiment III evaluated the effects of maternal deprivation combined with paradoxical sleep deprivation (PSP) on recognition memory. Wistar rats separated from their mothers for fourteen days, three hours per day, underwent PSP for twenty four hours in adulthood. The model allowed to investigate the ability to reverse such deficits with administration of modafinil that was effective in restoring cognitive decline caused by maternal deprivation and PSP. The use and commercialization of modafinil as a stimulant is widely proved. To support its application in the memory loss associated with neurodegenerative disorders, stress in early life and PSP, additional preclinical and clinical research are needed. This study shows, however, through the proposed models of cognitive decline, the drug effectiveness in reversing such memory deficits. / O Modafinil é um fármaco que promove o aumento do estado de alerta, e foi aprovado para o tratamento da sonolência diurna excessiva na narcolepsia e apnéia obstrutiva do sono. Alguns estudos indicam que o modafinil pode melhorar a aprendizagem, a memória e reverter déficits cognitivos induzidos pela privação de sono e estresse. No presente trabalho tivemos como objetivo caracterizar os efeitos do modafinil sobre a memória em ratos adultos saudáveis. Além disso, seus efeitos também foram estudados utilzando-se três modelos de declínio cognitivo para avaliar os efeitos do modafinil sobre a memória: o modelo da sobrecarga de ferro no período neonatal relacionado com as doenças neurodegenerativas, a separação materna no período neonatal que gera um prejuízo emocional e cognitivo na idade adulta e, por fim, a privação de sono paradoxal que interfere na consolidação da memória. No experimento I foram investigados os efeitos do fármaco sobre a consolidação e a evocação da memória utilizando-se distintos paradigmas de aprendizagem: reconhecimento de objetos e esquiva inibitória (tarefa de memória aversiva) em ratos adultos saudáveis. Ratos Wistar adultos receberam uma injeção aguda de modafinil (0,75; 7,5 ou 75 mg/kg) ou veículo imediatamente após o treino ou 1 hora antes do teste nas tarefas de reconhecimento de objetos ou de esquiva inibitória. A administração aguda de modafinil em ratos saudáveis não afetou a consolidação e nem a evocação da memória. O experimento II analisou os efeitos da administração aguda ou crônica de modafinil sobre os déficits de memória induzidos pela sobrecarga de ferro no período neonatal, um modelo de declínio cognitivo relacionado a distúrbios neurodegenerativos. Ratos tratados com ferro entre o 12º e 14º dia pós natal receberam, na idade adulta, uma injeção intraperitoneal aguda de modafinil (0,75; 7,5 e 75 mg/kg) ou veículo imediatamente após o treino da tarefa de reconhecimento de objeto. Uma injeção aguda de modafinil na dose mais elevada foi capaz de recuperar a memória de reconhecimento em ratos tratados com ferro. A fim de investigar os efeitos do tratamento crônico com modafinil, os ratos tratados com ferro receberam injeções diárias de modafinil nas mesmas doses por 17 dias. Vinte e quatro horas após a última injeção, os animais foram submetidos às tarefas de reconhecimento de objetos e esquiva inibitória. Os testes de retenção de memória foram realizados 24 horas após o treino. A administração crônica de modafinil recuperou completamente os déficits de memória induzidos pelo ferro, tanto na memória de reconhecimento quanto na memória emocional. O experimento III avaliou os efeitos da separação materna combinada com a privação de sono paradoxal (PSP) sobre a memória de reconhecimento. Ratos Wistar separados da mãe durante 14 dias, três horas por dia, foram submetidos a PSP por vinte e quatro horas na idade adulta. O modelo permitiu investigar a capacidade de reversão de tais déficits com a administração de modafinil que foi efetivo em recuperar o declínio cognitivo causado pela separação materna e pela PSP. A utilização e a comercialização do modafinil como estimulante são amplamente fundamentadas. Para dar suporte à sua aplicação na perda de memória associada às perturbações neurodegenerativas; ao estresse no início da vida e à PSP, pesquisas pré clínicas e clínicas adicionais são necessárias. Este estudo comprova por meio dos modelos de declínio cognitivo propostos, a efetividade do fármaco em reverter tais déficits de memória.