Apesar dos múltiplos avanços na compreensão gênica e taxonômica do Paramixovírus de serpentes (OPMV), apenas a patogenia pulmonar é razoavelmente conhecida nos viperídeos. O objetivo do presente estudo foi investigar, através de exames anátomo-patológicos, imunoistoquímicos, microbiológicos, hematológicos e sorológicos, a patogenia do Paramixovírus em jibóias (Boa constrictor). Dez animais foram inoculados por via endotraqueal com uma suspensão viral de OPMV. Os animais foram submetidos à eutanásia aos pares, aos 3, 7, 14, 21 e 60 dias após a infecção. Dois indivíduos foram utilizados como controle negativo. Lavados traqueais e amostras de sangue foram colhidas antes da inoculação, às necrópsias e nos animais dos grupos remanescentes. A presença de anticorpos anti-OPMV foi detectada aos 2 mPI através da técnica de inibição de hemaglutinação. A análise estatística dos resultados hematológicos demonstrou não haver diferença significativa entre os dados obtidos nos diversos tempos. À necrópsia amostras de órgãos foram colhidos para análises histopatológica, imunoistoquímica, bacteriológica e virológica (isolamento e RT-PCR). Macroscopicamente, apenas um animal (7dPI) apresentou pneumonia piogranulomatosa. As principais lesões microscópicas pulmonares observadas foram infiltração granulocítica, associada à formação de ninhos de células mononucleares, formação de sincícios; presença de hiperplasia e hipertrofia epiteliais em todos os tempos experimentais. Em pâncreas pôde ser diagnosticada formação de sincícios e presença de infiltrado mononuclear; em baço foi observada histiocitose, eventualmente associada à infiltração granulocítica perifolicular; gliose de padrão difuso ou focal. Os ensaios imunoistoquímicos e isolamento viral, com confirmação da presença do OPMV por RT-PCR, foram positivos em pulmão, fígado, baço e pâncreas dos 3 aos 21 dPI, sendo negativos aos 60 pPI. O diagnóstico molecular de lavado traqueal após passagem em cultura celular foram positivos aos 3, 7, 14 e 21d PI.. A ausência de sinais clínicos associada à detecção de lesões, isolamento e diagnóstico positivo por RT- PCR sugerem que as jibóias podem representar uma importante fonte assintomática de infecção até os 21 d PI. / Despite multiple advances in the genetic and taxonomic understanding of ophidian paramyxovirus (OPMV), only pulmonary pathogenesis is reasonably known in viperids. The objective of the present study was to investigate the pathogenesis of paramyxovirus infection in Boidae by pathological, imunohistochemical, microbiological, hematological and serological studies. Ten Boa constrictor snakes were infected by endotracheal inoculation with a viral solution. The animals were euthanatized in pairs at 3, 7, 14 and 21 days and at 2 months after infection. Two uninfected boas were sacrificed before and after the experimental study and were used as negative controls. Tracheal washes and blood were collected from all snakes. Seroconversion was detected at 2 mPI by hemagglutination inhibition assays. Estatistical analysis of the hematological data by Friedman Test revealed no diferences between them. At necropsy, samples of all major organs were obtained for histopathological, immunohistochemical, bacteriological and virological (viral isolation and RT-PCR). At necropsy, only one snake (7 days PI) had gross changes in the lung. The most consistent microscopic findings in the lungs were granulocyte infiltration, associated with the formation of mononuclear cell nests, formation of syncytia, and presence of epithelial hyperplasia and hypertrophy. Formation of syncytia was observed in pancreas, a mononuclear infiltrate was also observed; splenic histiocytosis with perifollicular granulocyte infiltration; diffuse and focal pattern of gliosis was detected in the CNS of most of the animals. Immunohistochemical examination and viral isolation, with confirmation of the virus\' presence by RT-PCR, were positive for lung, liver, spleen and pancreas from 3 to 21 dPI and negative at 2 m PI. Virus isolation from tracheal washes, with confirmation by molecular diagnosis were positive at times 3, 7, 14 and 21 dPI. At 2 mPI all results were negative. The immunohistochemical results associated with virus isolation and RT-PCR suggest that the virus was probably eliminated from the organism at 2 mPI. The absence of clinical symptoms associated with the detection of lesions and with isolation and a positive diagnosis by PCR in the present study suggest that Boa constrictors may represent an important source of infection for other reptiles.

Leptospirose é uma zoonose mundial que causa grandes prejuízos econômicos e sociais. Os mecanismos de patogenicidade da leptospira ainda não estão totalmente elucidados. Nesse trabalho foi avaliado o papel de três proteínas hipotéticas de superfície na patogenia da leptospirose: LIC11009, LIC11360 e LIC11975. Os genes foram clonados a partir do DNA da L. interrogans sorovar Copenhageni e as proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade. RT-qPCR mostrou a transcrição dos genes em leptospiras. As proteínas recombinantes reagiram com soro de humanos diagnosticados com leptospirose. rLIC11009 induziu somente resposta imune Th1 em camundongos, enquanto que rLIC11360 e rLIC11975 induziram resposta Th1 e Th2. As três proteínas recombinantes se ligaram à laminina e plasminogênio, enquanto rLIC11360 e rLIC11975 também se ligaram à fibronectina plasmática e fibrinogênio. Em adição, rLIC11360 se ligou ainda aos reguladores do sistema complemento fator H e C4BP. Os resultados sugerem que as proteínas estudadas podem auxiliar a leptospira a evadir e invadir o hospedeiro. / Leptospirosis is a worldwide zoonosis that causes great economic and social losses. The pathogenic mechanisms of leptospira are not yet fully elucidated. In this study we evaluated the role of three hypothetical surface proteins in the leptospiral pathogenesis: LIC11009, LIC11360 and LIC11975. Genes were cloned from DNA of L. interrogans serovar Copenhageni and the recombinant proteins were purified by affinity chromatography. RT - qPCR data have shown that the genes are fully transcribed in leptospires. Recombinant proteins reacted with sera from humans diagnosed with leptospirosis. rLIC11009 induced Th1 immune response in mice, whereas rLIC11360 and rLIC11975 promoted both Th1 and Th2. The three recombinant proteins interacted with laminin and plasminogen while, rLIC11360 and rLIC11975, also interacted with plasma fibronectin and fibrinogen. In addition, rLIC11360 interacted with the complement regulators factor H and C4BP. These results suggest that the proteins tested can help leptospires to evade and invade the host.

A leptospirose é uma zoonose de distribuição mundial causada por espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira. Resultados experimentais demonstraram que a patogênese pode estar relacionada com a capacidade destas bactérias em aderir a proteínas da matriz extracelular, escapar da resposta imune do hospedeiro e de produzir toxinas. Este trabalho teve como objetivo identificar proteínas secretadas por Leptospira interrogans sorovar Pomona estirpe Fromm kennewicki (patogênica) e Leptospira biflexa sorovar Patoc estirpe Patoc I (saprófita), através de análise proteômica. As leptospiras foram cultivadas em meio EMJH suplementado com soro de coelho ou albumina bovina. Os sobrenadantes foram filtrados, dialisados e liofilizados para aplicação das tecnologias de análise proteômica utilizando gel bidimensional e análise em solução. A análise dos peptídeos obtidos, nos dois procedimentos, foi realizada utilizando-se LC/MS/MS. Foi possível a identificação de 159 proteínas diferentes nas amostras de L.interrogans, entre as quais 64 foram positivas em pelo menos uma das ferramentas usadas para a predição. Em L. biflexa, 104 proteínas diferentes foram identificadas, entre elas 43 proteínas foram positivas pela análise in silico. Entre as proteínas identificadas, estão aquelas que possuem peptídeo sinal sec ou tat dependentes. Em outras, a predição da localização celular é desconhecida ou podem ter múltiplos sítios de localização, e ainda, proteínas que não possuem peptídeo sinal e que podem ser secretadas por mecanismos não convencionais. Muitos destas são proteínas hipotéticas sem domínios conservados detectados. No que diz respeito à atividade proteolítica, foi identificada a presença de metaloproteases no secretoma de L.interrogans. Não houve detecção da presença significativa de proteases bacterianas em amostras de L. biflexa. A identificação e a caracterização funcional de proteínas secretadas poderão contribuir para a elucidação dos mecanismos patogênicos e no desenvolvimento de novas estratégias para o tratamento e prevenção de leptospirose. / Leptospirosis is a zoonosis of worldwide distribution caused by pathogenic spirochetes of the genus Leptospira. The mechanisms by which leptospires invade the host and cause the disease are not yet fully understood. Experimental results have shown that the pathogenesis may be related to the ability of these bacteria to bind to extracellular matrix proteins, to escape hosts immune responses and to produce toxins. This work aimed to identify secreted proteins by Leptospira interrogans serovar Pomona strain Fromm kennewicki (pathogenic) and Leptospira biflexa serovar strain Patoc Patoc I (saprophyte) through proteomic analysis. The leptospires were grown in EMJH supplemented with rabbit serum or BSA. Supernatants were filtered, dialyzed and lyophilized to proteomic technology, two-dimensional gel and non-gel. The analysis of the obtained peptides in two procedures was performed using LC/MS/LC. It was possible to identify 159 different proteins in the samples of L.interrogans; among them, 64 were positive proteins in at least one of the tools used for prediction. In L. biflexa, 104 different proteins were identified; among them, 43 positive proteins were positive by in silico analysis. Among the identified proteins are those that possess sec or tat dependent signal peptide. In others, the prediction of the cellular location is unknown or may have multiple sites of localization, and even proteins which have no signal peptide can be secreted by unconventional mechanisms. Many of these are hypothetical proteins with no detected putative conserved domains. The presence of metalloproteases has been identified in the L.interrogans´ secretome, using proteolytic assay. There was no significant detection of the presence of bacterial proteases in samples of L. biflexa. The identification and functional characterization of secreted proteins may contribute to the elucidation of pathogenic mechanisms and in the developing of new strategies for the treatment and prevention of leptospirosis.

A paracoccidioidomicose é uma micose sistêmica da América Latina causada pelo fungo dimórfico Paraccoccidioides brasiliensis. Os TLRs, e os CLRs são \"Receptores de Reconhecimento Padrão\" (PRRs) que reconhecem os \"Padrões Moleculares Associados aos Patógenos\" (PAMPs). O objetivo deste trabalho foi caracterizar os receptores de macrófagos de camundongos resistentes (A/J) e susceptíveis (B10.A) ao P. brasiliensis envolvidos na interação com o fungo, através do estudo do efeito do tratamento dos macrófagos com agonistas ou antagonistas dos receptores de manose (MR), receptores do tipo Toll 4 (TLR4), receptores de beta-glucanas (dectina-1) e receptores de complemento CR3 (CD11b/CD18), na interação fungo-macrófago. O tratamento dos macrófagos com o agonista de MR (manana), ativou ambos os macrófagos A/J e B10.A. O bloqueio dos receptores MR, TLR4 e CR3 com anticorpos monoclonais específicos, induziu inibição dos macrófagos, mostrando a importância destes receptores no reconhecimento dos carboidratos presentes na parede do fungo. O tratamento com os agonistas de dectina-1 (laminarina e curdlan) induziram ativação dos macrófagos, porém de maneira distinta entre as linhagens. A laminarina pareceu ativar macrófagos B10.A e inibir A/J; curdlan por sua vez, pareceu ativar macrófagos A/J e inibir B10.A.Estes dados sugerem que diferentes perfis de ativação dos macrófagos atuem no reconhecimento do fungo. / Paracoccidioidomycosis is a systemic mycosis of Latin America caused by Paraccoccidioides brasiliensis, a dimorphic fungus. The TLRs and CLRs are \"Pattern Recognition Receptors\" (PRRs) which recognize \"Pathogen Associated Molecular Patterns\" (PAMPs). The aim of our work was to characterize the macrophages receptors from resistant (A/J) and susceptible (B10.A) mice to P. brasiliensis involved in the interaction with the fungus. We studied the effect of macrophages treatment with agonists or antagonists of mannose receptors (MR), Toll like receptors 4 (TLR4), <font face=\"Symbol\">b-glucans receptors (dectin-1) and complement receptors CR3 (CD11b/CD18), in the interaction fungus-macrophages. The macrophages treatment with mannan agonist of MR activated both A/J and B10.A macrophages. The blockade of MR, TLR4 and CR3 receptors with specific monoclonal antibodies, induced macrophages inhibition, showing the importance of these receptors in the recognition of common carbohydrates presents on the cell wall of the fungus. The macrophages treatment with laminarin and curdlan agonists of dectin-1, induced macrophages activation, however in the distinct manner between both macrophages lineages. Laminarin appeared to activate B10.A macrophages and inhibit A/J; whereas curdlan appeared to activate A/J macrophages and inhibit B10.A. These data suggest that a different profile of macrophages activation plays in the fungus recognition.

Circovírus suíno 2 (PCV2) é responsável pelas doenças associadas ao circovírus suíno (PCVAD do inglês Porcine circovirus associated disease) que engloba várias condições clínicas. Acomete suínos nas principais áreas produtoras do mundo causando grandes prejuízos. A situação acerca do conhecimento acerca da complexa patogenia e os múltiplos fatores de risco permitem compreender apenas em parte o verdadeiro impacto das PCVADs em suínos, sendo este um conhecimento mais amplo e dependente de resultados obtidos com infecções experimentais. Os objetivos do presente trabalho foram: i) verificar a infectividade do isolado brasileiro de PCV2 em animais infectados experimentalmente; ii) verificar a transmissão horizontal do isolado brasileiro de PCV2 em animais infectados experimentalmente; iii) avaliar a patologia do isolado brasileiro nos animais infectados experimentalmente; e iv) avaliar a resposta imune humoral nos animais infectados experimentalmente com o isolado brasileiro. Foram utilizados nove leitões divididos em três grupos com três animais cada: i) G1 animais inoculados por via intra-nasal, com aproximadamente 49 dias de idade; ii) G2 animais não inoculados mantidos na mesma baia que os G1; e iii) GC animais controle. Amostras de soro, suabes (nasal e fecal) e dados de desempenho foram coletados semanalmente. Amostras de tecidos foram coletadas durante a necropsia, aos 42 dias após a inoculação (dpi). Os animais do GC foram acompanhados até 140 dias de idade. A infecção pelo PCV2 foi avaliada através da descrição das manifestações clínicas, alterações anatômicas e histológicas, quantificação do DNA de PCV2 nas amostras de soro, suabes e tecidos e detecção de anticorpo anti-PCV2 no soro. As técnicas utilizadas foram coloração de tecido pela Hematoxilina-Eosina (HE), reação em cadeia pela polimerase quantitativa (PCRq), imunohistoquímica (IHQ) e ELISA ( do inglês enzyme-linked imunossorbente assay). Os resultados demonstraram que o isolado brasileiro induziu infecção subclínica nos animais inoculados (G1), demonstrado através da detecção de baixa carga de DNA viral nos tecido e soros, ausência de sinais clínicos e achados histopatológicos característicos de PCVAD, além da ausência de soroconversão nos três animais inoculados. A transmissão horizontal foi demonstrada, pois em um animal contactante (G2) foi recuperado o DNA de PCV2 em vários tecidos. No entanto, a ausência de soroconversão, não permitiu avaliar a resposta imune humoral nos diferentes grupos (G1 e G2). Fatores como idade dos animais no momento da inoculação (49 dias), via de inoculação, inóculo e ausência de co-agentes podem ter contribuído para o desencadeamento dos resultados observados. / Porcine circovirus 2 (PCV2) is responsible for the porcine circovirus associated diseases (PCVAD) that encompasses several clinical conditions. It affects the main pig producing areas of the world, causing extensive damage. Currently, knowledge about the complex pathogenesis associated with the multiple risk factors provides insight into the true impact of PCVADs, depending on the extensive knowledge based on the experimental infections. The aims of this study were: i) verify the infectivity of the brazilian PCV2 in experimentally infected animals; ii) verify the horizontal transmission of the Brazilian PCV2 in experimentally infected animals; iii) evaluete the patology of Brasilian PCV2 in experimentally infected animals; iv) evaluete the humoral immune response in experimentally infected animals with the Brazilian isolate. Nine piglets were divided into three groups with three animal each: i) G1 inoculated animals by intranasally route, with approximately 49 days of age; ii) G2 non-inoculated animals maintained in the same pen that G1 and iii) GC control animals. Serum samples, swabs (nasal and fecal) and performance data were collected weekly. Tissue samples were collected during necropsy at 42 days post inoculation (dpi). Animals from GC were monitored up to 140 days of age. PCV2 infection was evaluated by clinical, anatomical and histological alteration, quantification of PCV2 DNA in serum samples, swabs and tissues and detection of PCV2 antibodies in serum. The techniques of tissue hematoxylin-eosin staining, polymerase chain reaction quantitative (PCRq), immunohistochemistry (IHC) and ELISA were used. The results showed that the Brazilian PCV2 virus induced subclinical infection in inoculated animals (G1), shown by the low viral DNA load in the tissue and serum, the lack of clinical and pathological signs of PCVAD and absence of seroconversion in the three inoculated animals. The horizontal transmission was demonstrated by the recovery of the viral DNA on one of contacting animals in various tissues. However, the absence of seroconversion, does not allowed the antibody levels evaluation in the different groups (G1 and G2). Factors such as age at the time of inoculation (49 days), route of inoculation, inoculum and absence of co-agents may contribute to the onset of the observed results.

Apesar dos múltiplos avanços na compreensão gênica e taxonômica do Paramixovírus de serpentes (OPMV), apenas a patogenia pulmonar é razoavelmente conhecida nos viperídeos. O objetivo do presente estudo foi investigar, através de exames anátomo-patológicos, imunoistoquímicos, microbiológicos, hematológicos e sorológicos, a patogenia do Paramixovírus em jibóias (Boa constrictor). Dez animais foram inoculados por via endotraqueal com uma suspensão viral de OPMV. Os animais foram submetidos à eutanásia aos pares, aos 3, 7, 14, 21 e 60 dias após a infecção. Dois indivíduos foram utilizados como controle negativo. Lavados traqueais e amostras de sangue foram colhidas antes da inoculação, às necrópsias e nos animais dos grupos remanescentes. A presença de anticorpos anti-OPMV foi detectada aos 2 mPI através da técnica de inibição de hemaglutinação. A análise estatística dos resultados hematológicos demonstrou não haver diferença significativa entre os dados obtidos nos diversos tempos. À necrópsia amostras de órgãos foram colhidos para análises histopatológica, imunoistoquímica, bacteriológica e virológica (isolamento e RT-PCR). Macroscopicamente, apenas um animal (7dPI) apresentou pneumonia piogranulomatosa. As principais lesões microscópicas pulmonares observadas foram infiltração granulocítica, associada à formação de ninhos de células mononucleares, formação de sincícios; presença de hiperplasia e hipertrofia epiteliais em todos os tempos experimentais. Em pâncreas pôde ser diagnosticada formação de sincícios e presença de infiltrado mononuclear; em baço foi observada histiocitose, eventualmente associada à infiltração granulocítica perifolicular; gliose de padrão difuso ou focal. Os ensaios imunoistoquímicos e isolamento viral, com confirmação da presença do OPMV por RT-PCR, foram positivos em pulmão, fígado, baço e pâncreas dos 3 aos 21 dPI, sendo negativos aos 60 pPI. O diagnóstico molecular de lavado traqueal após passagem em cultura celular foram positivos aos 3, 7, 14 e 21d PI.. A ausência de sinais clínicos associada à detecção de lesões, isolamento e diagnóstico positivo por RT- PCR sugerem que as jibóias podem representar uma importante fonte assintomática de infecção até os 21 d PI. / Despite multiple advances in the genetic and taxonomic understanding of ophidian paramyxovirus (OPMV), only pulmonary pathogenesis is reasonably known in viperids. The objective of the present study was to investigate the pathogenesis of paramyxovirus infection in Boidae by pathological, imunohistochemical, microbiological, hematological and serological studies. Ten Boa constrictor snakes were infected by endotracheal inoculation with a viral solution. The animals were euthanatized in pairs at 3, 7, 14 and 21 days and at 2 months after infection. Two uninfected boas were sacrificed before and after the experimental study and were used as negative controls. Tracheal washes and blood were collected from all snakes. Seroconversion was detected at 2 mPI by hemagglutination inhibition assays. Estatistical analysis of the hematological data by Friedman Test revealed no diferences between them. At necropsy, samples of all major organs were obtained for histopathological, immunohistochemical, bacteriological and virological (viral isolation and RT-PCR). At necropsy, only one snake (7 days PI) had gross changes in the lung. The most consistent microscopic findings in the lungs were granulocyte infiltration, associated with the formation of mononuclear cell nests, formation of syncytia, and presence of epithelial hyperplasia and hypertrophy. Formation of syncytia was observed in pancreas, a mononuclear infiltrate was also observed; splenic histiocytosis with perifollicular granulocyte infiltration; diffuse and focal pattern of gliosis was detected in the CNS of most of the animals. Immunohistochemical examination and viral isolation, with confirmation of the virus\' presence by RT-PCR, were positive for lung, liver, spleen and pancreas from 3 to 21 dPI and negative at 2 m PI. Virus isolation from tracheal washes, with confirmation by molecular diagnosis were positive at times 3, 7, 14 and 21 dPI. At 2 mPI all results were negative. The immunohistochemical results associated with virus isolation and RT-PCR suggest that the virus was probably eliminated from the organism at 2 mPI. The absence of clinical symptoms associated with the detection of lesions and with isolation and a positive diagnosis by PCR in the present study suggest that Boa constrictors may represent an important source of infection for other reptiles.

O leite produzido a ultra alta temperatura denominado oficiamente como UHT é o leite de maior aceitação no mercado consumidor brasileiro. Com a finalidade de ampliar o conhecimento sobre a segurança microbiológica do leite UHT, objetivou-se estudar tanto os Bacillus spp, que vêm sendo relatados como contaminantes do leite UHT no Brasil, como os eventuais esporos sobreviventes ao processamento. A partir de 65 análises de leite UHT para a determinação de microrganismos mesófilos aeróbios estritos e facultativos viáveis, no leite UHT procedente das indústrias sob Inspeção Federal no estado de São Paulo, 7 apresentaram contagens acima de 100 UFC/ml, indicando um percentual de 10,76 % de provas fora dos padrões para essa determinação, no período de jul a nov de 2003. Entretanto por atuação dos controles de qualidade das indústrias partidas foram inutilizadas e o leite que foi ao consumo apresentou 7,69% de microrganismos mesofílicos aeróbios acima dos padrões, sendo que 6.15% destes microrganismos foram considerados como Bacillus sporothermodurans. Dos isolamentos das contagens de microrganismos mesófilos acima dos padrões, foram efetuados estudos de seis cepas de Bacillus spp do leite UHT das indústrias, além de três cepas isoladas do leite UHT alvo de reclamações de consumidores procedente do Instituto Adolfo Lutz da capital de São Paulo. O objetivo do presente projeto foi, após a identificação cultural, microscópica, bioquímica e genética de culturas do Bacillus spp, estudar a patogenicidade das amostras em diversos modelos experimentais como: Teste do camundongo neonatos, alça ligada de coelho, inoculação intraperitoneal em camundongo BALB C e culturas celulares (Vero, HEp2 e Fibroblastos de Embrião de Galinha). As 3 amostras isoladas de leite de reclamações dos consumidores do Instituto Adolfo Lutz de São Paulo foram tipificadas preliminarmente pela técnica de Espectroscopia Infra-Vermelho a Transformada Fourier (FT- IR) como Bacillus flexus, enquanto que as amostras isoladas do leite procedente de três indústrias de São Paulo apresentaram presença de B. flexus e B.oleronius e Bacillus sporothermodurans. Exemplares de B.flexus testados quanto a patogenicidade apresentaram efeito citopático nas culturas celulares Vero, HEP2 e Fibroblastos de Embrião de Galinha e morbidade em camundongo BALB C. O Bacillus sporothermodurans não apresentou patogenicidade a nenhum dos modelos biológicos citados. / The milk produced at ultra high temperature, denominated UHT, is the most popular milk in the Brazilian market. With the intention of increasing the knowledge of microbiologic safety in UHT milk, we concentrated our study on the Bacillus spp, described as the most important contaminants of UHT milk in Brazil, and on possible survivors of the processing procedures. From the 65 analysis of UHT milk collected to determine the presence of strict, aerobe, mesophile microorganisms and viable options, coming from industries under Federal Inspection in São Paulo state, 7 presented a microbial count higher than 100CFU/ml, indicating a percentage of 10.76% samples outside the standard for this determination, in the period between July and November 2003. However, due to the quality control in industries, batches were rendered useless and the milk that went for consumption presented 7.69% mesophile microorganisms above standard, being these organisms 6.15% was considered Bacillus sporothermodurans. From the isolation of mesophile Bacillus counts above average, 5 strains Bacillus spp species from UHT industries were studied, as well as 3 strains isolated from UHT milk denounced by consumers of São Paulo city\'s Adolfo Lutz Institute. The aim of the project, following cultural, microscopic, biochemical and genetic identification of the Bacillus spp, was to study pathogenicity in samples from several experimental models, such as: neonatal mice; rabbit ileum loops, intraperitoneal inoculation of BALB C mice and cell cultures: Vero, Hep2 and Chick Embryo Fibroblasts. The three isolated samples of milk denounced by São Paulo consumers were typified as Bacillus flexus by the Fourier Infrared Transformed Espectroscopy (IF-FR) technique, while isolated samples of milk from 3 industries in São Paulo, accused the presence of the B. flexus, B. oleronius and Bacillus sporothermodurans. Samples of the B. flexus tested in terms of pathogenicity presented a citopatic effect upon cell cultures Vero, HeP2 and Chick Embryo Fibroblasts and a morbidity in mice BalbC. The Bacillus Sporothermodurans did not present pathogenicity in any of the biological models mentioned.

Circovírus suíno 2 (PCV2) é responsável pelas doenças associadas ao circovírus suíno (PCVAD do inglês Porcine circovirus associated disease) que engloba várias condições clínicas. Acomete suínos nas principais áreas produtoras do mundo causando grandes prejuízos. A situação acerca do conhecimento acerca da complexa patogenia e os múltiplos fatores de risco permitem compreender apenas em parte o verdadeiro impacto das PCVADs em suínos, sendo este um conhecimento mais amplo e dependente de resultados obtidos com infecções experimentais. Os objetivos do presente trabalho foram: i) verificar a infectividade do isolado brasileiro de PCV2 em animais infectados experimentalmente; ii) verificar a transmissão horizontal do isolado brasileiro de PCV2 em animais infectados experimentalmente; iii) avaliar a patologia do isolado brasileiro nos animais infectados experimentalmente; e iv) avaliar a resposta imune humoral nos animais infectados experimentalmente com o isolado brasileiro. Foram utilizados nove leitões divididos em três grupos com três animais cada: i) G1 animais inoculados por via intra-nasal, com aproximadamente 49 dias de idade; ii) G2 animais não inoculados mantidos na mesma baia que os G1; e iii) GC animais controle. Amostras de soro, suabes (nasal e fecal) e dados de desempenho foram coletados semanalmente. Amostras de tecidos foram coletadas durante a necropsia, aos 42 dias após a inoculação (dpi). Os animais do GC foram acompanhados até 140 dias de idade. A infecção pelo PCV2 foi avaliada através da descrição das manifestações clínicas, alterações anatômicas e histológicas, quantificação do DNA de PCV2 nas amostras de soro, suabes e tecidos e detecção de anticorpo anti-PCV2 no soro. As técnicas utilizadas foram coloração de tecido pela Hematoxilina-Eosina (HE), reação em cadeia pela polimerase quantitativa (PCRq), imunohistoquímica (IHQ) e ELISA ( do inglês enzyme-linked imunossorbente assay). Os resultados demonstraram que o isolado brasileiro induziu infecção subclínica nos animais inoculados (G1), demonstrado através da detecção de baixa carga de DNA viral nos tecido e soros, ausência de sinais clínicos e achados histopatológicos característicos de PCVAD, além da ausência de soroconversão nos três animais inoculados. A transmissão horizontal foi demonstrada, pois em um animal contactante (G2) foi recuperado o DNA de PCV2 em vários tecidos. No entanto, a ausência de soroconversão, não permitiu avaliar a resposta imune humoral nos diferentes grupos (G1 e G2). Fatores como idade dos animais no momento da inoculação (49 dias), via de inoculação, inóculo e ausência de co-agentes podem ter contribuído para o desencadeamento dos resultados observados. / Porcine circovirus 2 (PCV2) is responsible for the porcine circovirus associated diseases (PCVAD) that encompasses several clinical conditions. It affects the main pig producing areas of the world, causing extensive damage. Currently, knowledge about the complex pathogenesis associated with the multiple risk factors provides insight into the true impact of PCVADs, depending on the extensive knowledge based on the experimental infections. The aims of this study were: i) verify the infectivity of the brazilian PCV2 in experimentally infected animals; ii) verify the horizontal transmission of the Brazilian PCV2 in experimentally infected animals; iii) evaluete the patology of Brasilian PCV2 in experimentally infected animals; iv) evaluete the humoral immune response in experimentally infected animals with the Brazilian isolate. Nine piglets were divided into three groups with three animal each: i) G1 inoculated animals by intranasally route, with approximately 49 days of age; ii) G2 non-inoculated animals maintained in the same pen that G1 and iii) GC control animals. Serum samples, swabs (nasal and fecal) and performance data were collected weekly. Tissue samples were collected during necropsy at 42 days post inoculation (dpi). Animals from GC were monitored up to 140 days of age. PCV2 infection was evaluated by clinical, anatomical and histological alteration, quantification of PCV2 DNA in serum samples, swabs and tissues and detection of PCV2 antibodies in serum. The techniques of tissue hematoxylin-eosin staining, polymerase chain reaction quantitative (PCRq), immunohistochemistry (IHC) and ELISA were used. The results showed that the Brazilian PCV2 virus induced subclinical infection in inoculated animals (G1), shown by the low viral DNA load in the tissue and serum, the lack of clinical and pathological signs of PCVAD and absence of seroconversion in the three inoculated animals. The horizontal transmission was demonstrated by the recovery of the viral DNA on one of contacting animals in various tissues. However, the absence of seroconversion, does not allowed the antibody levels evaluation in the different groups (G1 and G2). Factors such as age at the time of inoculation (49 days), route of inoculation, inoculum and absence of co-agents may contribute to the onset of the observed results.

Submitted by Luanna Matias (lua_matias@yahoo.com.br) on 2015-03-05T13:24:15Z No. of bitstreams: 2 Tese - Eliete Souza Santana - 2011.pdf: 2587838 bytes, checksum: d103db38e37de5827898dc565d152e78 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Matias (lua_matias@yahoo.com.br) on 2015-03-05T16:23:32Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Eliete Souza Santana - 2011.pdf: 2587838 bytes, checksum: d103db38e37de5827898dc565d152e78 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-05T16:23:32Z (GMT). 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Within 1, 3, 6, 12, 18 and 24, and three, four, 38 and 49 days post-inoculation, two birds per treatment were sacrificed and vitelline sacs, spleen, bursa of Fabricius and ceca were coleted for Salmonella research, lymphocytes levels, and immunohistochemistry. The pathogen was isolated in organs studied in both tests and the lymphocytes levels decreased. Was observed that the dose influences the penetration, dissemination, and persistence of the pathogen elimination in turkeys. In Experiment 2, 160 turkeys were distributed into four treatments within 6.0x102CFU/mL, 7.0x105 CFU/mL, 8.0x109 CFU/mL of Salmonella Enteritidis and a control group. With 1, 3, 6, 12, 18 and 24 and three, four, 38 and 49 days were sampled blood, liver, spleen and bursa of Fabricius of two birds per treatment for electrophoretic, bacteriological and histopathological analysis, and also lymphocyte levels. There were differences in total serum protein data, as well as in bacterial isolation and tissue changes from 6 hours to 4 days before. The decrease of lymphocytes levels were registered from 3 hours post-inoculation. High mortality levels were observed in all groups in the first week, of which the main clinical and histopathological changes, as well the mortality levels were more evident in the group that received the highest dose. Was observed that serum proteins values, liver histopathological lesions, and decrease of lymphocytes levels occurs primarily in the first days post-infection. Experiment 3 consisted of 280 turkeys distributed in four treatments: placebo, control of lactulose; inoculated with 7.0x105 UFC/mL of Salmonella Enteritidis and inoculated with 7.0x105 UFC/mL of Salmonella Enteritidis and treated with lactulose. At seven, 21, 42 and 60 days were performed analisis of accomplishment. One bird of each quota was sacrificed and collected duodenum and jejunum from each for histomorphometric analysis, and ceca and inglúvios for enumerations of Enterobacteriaceae, Lactobacillus, Salmonella, pH measurements and biometric examination of intestines. Still, were collected liver, spleen, bursa of Fabricius and the gastrointestinal tract for bacteriological, histopathological, lymphocyte levels, and biometric examination. Were observed a lower weight gain in the group that received only the pathogen and increased only in patients that receiving lactulose. Were observed a higher correlation villous: crypt in the duodenum and jejunum of lactulose and placebo groups at seven and 21 days. Higher levels of UFC of Lactobacillus and Enterobacteriaceae were observed in the groups that receivied lactulose. Salmonella Enteritidis infections determine histopatological changes, decrease of lymphocyte levels and mortality. Lactulose increases beneficial bacteria, reduces the colonization of Salmonella, Promotes intestinal development and improved the animal performance, minimizes lymphocyte and tissue changes, reducing mortality and carrier state. / Foram desenvolvidos três experimentos com os objetivos de elucidar aspectos que envolvem a patogênese, clínica, alterações anatomopatológicas e imunológicas, bem como o controle com uso da lactulose e nas variáveis de desempenho de perus inoculados experimentalmente com Salmonella Enteritidis. Experimento 1 foi constituido de três tratamentos, sendo um grupo controle, um grupo inoculado com 6,0x102 UFC/mL e o terceiro inoculado com 7,0x105 UFC/mL de Salmonella Enteritidis. Com 1, 3, 6, 12, 18 e 24h e com três, quatro, 38 e 49 dias pós-inoculação, duas aves por tratamento foram sacrificadas e coletados sacos vitelínicos, baços, bursas de Fabricius e cecos, para pesquisa da Salmonella, contagem de linfócitos e imunoistoquímica. O patógeno foi identificado nos órgãos estudados em ambos os testes utilizados e o número de linfócitos foi reduzido. Em perus observou-se que a dose influencia a penetração, disseminação, eliminação e persistência do patógeno nos perus. No experimento 2 foram utilizados 160 perus, distribuidos em quatro tratamentos que receberam 6,0x102UFC/mL, 7,0x105 UFC/mL, 8,0x109 UFC/mL de Salmonella Enteritidis e um grupo controle. Com 1, 3, 6, 12, 18 e 24h e aos três, quatro, 38 e 49 dias foram coletados sangue, fígado, baço e bursa de Fabricius de duas aves por tratamento para análises eletroforéticas, bacteriológicas e histopatológicas e contagem de linfócitos, respectivamente. Houve diferença nos dados de proteínas séricas totais, assim como no isolamento bacteriano e nas alterações teciduais a partir de 6h até quatro dias. As depleções de linfócitos foram registradas a partir de 3h pós-inoculação. A mortalidade observada foi alta em todos os grupos na primeira semana, sendo que as principais alterações clínicas, histopatológicas e mortalidade foram mais evidentes no grupo que recebeu a maior dose. Verificou-se que os valores de proteínas séricas, lesões histopatológicas no fígado, bem como depleção de linfócitos ocorre principalmente nos primeiros dias pós-infecção. O Experimento 3 constituiu-se de 280 perus distribuídos em quatro tratamentos: placebo; controle da lactulose; inoculados com 7,0x105 UFC/mL e inoculados com 7,0x105 UFC/mL de Salmonella Enteritidis e tratados com a lactulose. Aos sete, 21, 42 e 60 dias foram realizadas análises de desempenho e uma ave de cada parcela foi sacrificada para coleta de duodenos e jejunos para análises histomorfométricas, inglúvios e cecos para enumerações de Enterobacteriaceae, Lactobacillus e Salmonella, aferições de pH e biometria de intestinos delgados e grossos. Ainda, foram coletados o fígado, baço, bursa de Fabricius e trato gastrintestinal, para análises bacteriológicas, histopatológicas, contagem de linfócitos, e exames biométricos. Observou-se, menor ganho de peso no grupo que recebeu somente o patógeno e maior no que recebeu somente a lactulose. Verificaram-se maiores relações vilos: criptas nos duodenos e jejunos dos grupos placebo e da lactulose aos sete e aos 21 dias. Maiores quantidades de unidades formadoras de colônias de Enterobacteriaceae e Lactobacillus foram observadas nos grupos que receberam a lactulose. Salmonella Enteritidis determina alterações histopatológicas e depleções linfocitárias e mortalidade. A lactulose aumenta bactérias benéficas, reduz a colonização de Salmonella, promove maior desenvolvimento intestinal e melhor desempenho, minimiza alterações teciduais e linfocitárias, reduzindo a mortalidade e o estado de portador.

O leite produzido a ultra alta temperatura denominado oficiamente como UHT é o leite de maior aceitação no mercado consumidor brasileiro. Com a finalidade de ampliar o conhecimento sobre a segurança microbiológica do leite UHT, objetivou-se estudar tanto os Bacillus spp, que vêm sendo relatados como contaminantes do leite UHT no Brasil, como os eventuais esporos sobreviventes ao processamento. A partir de 65 análises de leite UHT para a determinação de microrganismos mesófilos aeróbios estritos e facultativos viáveis, no leite UHT procedente das indústrias sob Inspeção Federal no estado de São Paulo, 7 apresentaram contagens acima de 100 UFC/ml, indicando um percentual de 10,76 % de provas fora dos padrões para essa determinação, no período de jul a nov de 2003. Entretanto por atuação dos controles de qualidade das indústrias partidas foram inutilizadas e o leite que foi ao consumo apresentou 7,69% de microrganismos mesofílicos aeróbios acima dos padrões, sendo que 6.15% destes microrganismos foram considerados como Bacillus sporothermodurans. Dos isolamentos das contagens de microrganismos mesófilos acima dos padrões, foram efetuados estudos de seis cepas de Bacillus spp do leite UHT das indústrias, além de três cepas isoladas do leite UHT alvo de reclamações de consumidores procedente do Instituto Adolfo Lutz da capital de São Paulo. O objetivo do presente projeto foi, após a identificação cultural, microscópica, bioquímica e genética de culturas do Bacillus spp, estudar a patogenicidade das amostras em diversos modelos experimentais como: Teste do camundongo neonatos, alça ligada de coelho, inoculação intraperitoneal em camundongo BALB C e culturas celulares (Vero, HEp2 e Fibroblastos de Embrião de Galinha). As 3 amostras isoladas de leite de reclamações dos consumidores do Instituto Adolfo Lutz de São Paulo foram tipificadas preliminarmente pela técnica de Espectroscopia Infra-Vermelho a Transformada Fourier (FT- IR) como Bacillus flexus, enquanto que as amostras isoladas do leite procedente de três indústrias de São Paulo apresentaram presença de B. flexus e B.oleronius e Bacillus sporothermodurans. Exemplares de B.flexus testados quanto a patogenicidade apresentaram efeito citopático nas culturas celulares Vero, HEP2 e Fibroblastos de Embrião de Galinha e morbidade em camundongo BALB C. O Bacillus sporothermodurans não apresentou patogenicidade a nenhum dos modelos biológicos citados. / The milk produced at ultra high temperature, denominated UHT, is the most popular milk in the Brazilian market. With the intention of increasing the knowledge of microbiologic safety in UHT milk, we concentrated our study on the Bacillus spp, described as the most important contaminants of UHT milk in Brazil, and on possible survivors of the processing procedures. From the 65 analysis of UHT milk collected to determine the presence of strict, aerobe, mesophile microorganisms and viable options, coming from industries under Federal Inspection in São Paulo state, 7 presented a microbial count higher than 100CFU/ml, indicating a percentage of 10.76% samples outside the standard for this determination, in the period between July and November 2003. However, due to the quality control in industries, batches were rendered useless and the milk that went for consumption presented 7.69% mesophile microorganisms above standard, being these organisms 6.15% was considered Bacillus sporothermodurans. From the isolation of mesophile Bacillus counts above average, 5 strains Bacillus spp species from UHT industries were studied, as well as 3 strains isolated from UHT milk denounced by consumers of São Paulo city\'s Adolfo Lutz Institute. The aim of the project, following cultural, microscopic, biochemical and genetic identification of the Bacillus spp, was to study pathogenicity in samples from several experimental models, such as: neonatal mice; rabbit ileum loops, intraperitoneal inoculation of BALB C mice and cell cultures: Vero, Hep2 and Chick Embryo Fibroblasts. The three isolated samples of milk denounced by São Paulo consumers were typified as Bacillus flexus by the Fourier Infrared Transformed Espectroscopy (IF-FR) technique, while isolated samples of milk from 3 industries in São Paulo, accused the presence of the B. flexus, B. oleronius and Bacillus sporothermodurans. Samples of the B. flexus tested in terms of pathogenicity presented a citopatic effect upon cell cultures Vero, HeP2 and Chick Embryo Fibroblasts and a morbidity in mice BalbC. The Bacillus Sporothermodurans did not present pathogenicity in any of the biological models mentioned.