INTRODUÇÃO: A Injúria Renal Agurda (IRA) é uma síndrome com morbidade e mortalidade elevadas. O desenvolvimento de IRA e disfunção cardíaca aguda (DCA) no período pós-operatório de cirurgias vasculares compartilham fatores de risco e mecanismos fisiopatológicos. Neste estudo, levantamos a hipótese que o desenvolvimento de IRA em pacientes submetidos a cirurgias vasculares aumentaria o risco de DCA. Também avaliamos a Dilatação mediada pelo Fluxo (FMD), como medida de disfunção endotelial e testes de agregabilidade plaquetária com o intuito de identificar características relacionadas ao mecanismo fisiopatológico que levam a estes eventos em pacientes submetidos a cirurgias vasculares. MÉTODOS: Utilizamos dados coletados prospectivamente de uma coorte de pacientes submetidos a revascularização periférica, aórtica ou carotídea. A injúria renal aguda e eventos cardiovasculares foram avaliados nos primeiros sete dias após a cirurgia. Em um subgrupo de pacientes, o Doppler da artéria braquial foi realizado antes do procedimento cirúrgico para acessar a Dilatação mediada pelo Fluxo (FMD). Em outro subgrupo, foram realizados testes de agregabilidade plaquetária. RESULTADOS: Dos 287 pacientes incluídos na análise, 102 apresentaram IRA e 59 tiveram eventos cardiovasculares (EvCv). O número de pacientes com EvCv foi progressivamente maior conforme a gravidade da IRA com base no KDIGO; 15% no grupo sem IRA, 22% no KDIGO 1, 42,8% no KDIGO 2 e 55% no KDIGO 3, p < 0,001. Os pacientes com IRA apresentaram maior permanência na UTI (2,5 vs. 6 dias) e uma maior taxa de mortalidade (6,6 versus 23,5%), p < 0,001. A taxa de mortalidade em pacientes com IRA e EvCv foi duas vezes a mortalidade de pacientes com EvCv apenas (47,1 vs 19,4%). A mediana de FMD foi de 5,7%, sem diferença entre os grupos IRA e não IRA, p = 0,6. Uma maior agregabilidade plaquetária foi associada ao desenvolvimento de IRA (5 vs 6,9 ?). Na análise multivariada, a presença de IRC (clearance de creatinina < 60 ml / min / 1,73m²), instabilidade hemodinâmica, evento cardiovascular e agregabilidade plaquetária foram preditores independentes de IRA. CONCLUSÃO: Este estudo confirmou que o desenvolvimento de injúria renal aguda e eventos cardiovasculares aumenta significativamente a morbidade e mortalidade de pacientes submetidos a cirurgia vascular eletiva. Nossos dados sugerem que a realização de testes de agregabilidadade plaquetária antes da cirurgia pode ser usada para avaliar a eficácia da terapia antiplaquetária e estratificar o risco de IRA e EvCv após a cirurgia vascular / BACKGROUND: Acute Kidney Injury (AKI) is a common syndrome with increased morbidity and mortality. The development of AKI and acute cardiac dysfunction (ACD) in the post-operative period of vascular surgery share risk factors and pathophysiological mechanisms. In this study, we hypothesized that the development of AKI in patients submitted to vascular surgeries would increase the risk of ACD. We also assessed the Flow-mediated Dilation (FMD), as a measure of endothelial dysfunction, and Platelet Aggregability tests to predict AKI and cardiovascular events in the early post-operative period of vascular surgeries. METHODS: We utilized a prospectively collected data from a cohort of patients undergoing peripheral, aortic or carotid revascularization. Acute kidney injury and cardiovascular events were assessed during the first seven days after surgery. In a subgroup of patients, brachial artery Doppler was performed prior to the surgery to access the Flow-Mediated Dilation (FMD). In another subgroup, platelet aggregability tests were performed. RESULTS: Of 287 patients included in the analysis, 102 had AKI and 59 developed cardiovascular events (CvEv). Number of patients with CvEv was progressively higher by maximum KDIGO stage during first week of surgery; 15% in the non-AKI group, 22% in KDIGO 1, 42.8% in KDIGO 2 and 55% in KDIGO 3, p < 0.001. Patients with AKI had a longer ICU stay (2.5 vs. 6 days) and a higher mortality rate (6.6 vs. 23.5%), p < 0.001. Mortality rate in patients with AKI and CvEv was two-fold the mortality of patients with CvEv only (47,1 vs 19.4%). The median FMD was 5.7%, with no difference between the AKI and non-AKI groups, p = 0.6. Higher platelet aggregability was associated with AKI development (5 vs 6,9 ?). In the multivariate analysis, presence of CKD (creatinine clearance < 60 ml/min/1,73m²), hemodynamic instability, cardiovascular event and platelet aggregability were independent predictors of AKI. CONCLUSION: This study confirmed that the development of acute kidney injury and cardiovascular events significantly increase morbidity and mortality of patients undergoing elective vascular surgery. Our data suggests that Platelet Aggregability before surgery can be used to evaluate efficacy of antiplatelet therapy and stratify risk for AKI and CvEv after vascular surgery

Orientador: Gilberto De Nucci / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-24T16:13:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maziero_AlineMendes_D.pdf: 2175096 bytes, checksum: b3e712ed8baf6a7f7d4ef12131b9e85a (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Os eosinófilos participam de processos inflamatórios e alérgicos. Estando relacionados com o sistema de imunidade inata do organismo, eles representam uma linha fundamental de defesa contra invasão microbiana e, quando ativados, produzem uma série de mediadores solúveis que atuam nas respostas inflamatórias e alérgicas. A relação entre a atividade dos eosinófilos e plaquetas foi observada nas últimas décadas por muitos cientistas. Estas observações incluem o aumento do número de eosinófilos associados a desordens plaquetárias, incluindo alterações na cascata de coagulação e agregação plaquetária. Com base nessas observações, a interação entre os eosinófilos e plaquetas foram analisadas na agregação plaquetária. Plaquetas humanas foram incubadas com a fração citosólica de eosinófilos, linhagem celular promielocítica humana HL-60 clone 15 e proteína catiônica do eosinófilo (ECP). A agregação em plasma rico em plaquetas (PRP) foi induzida por difosfato de adenosina, fator de ativação plaquetária, ácido araquidônico e colágeno, e as plaquetas lavadas (PL) foram ativadas por trombina. A agregação induzida por todos os agonistas foi inibida de maneira concentração de células dependente pela fração citosólica de eosinófilos. Esta inibição foi apenas parcialmente revertida pela prévia incubação dos eosinófilos com L-Nitro-Arginina-metil-éster (L-NAME). A prévia incubação com indometacina não impediu a inibição induzida pela fração citosólica. A separação da fração citosólica de eosinófilos por gel filtração em Sephadex G-75 mostrou que a atividade inibitória foi concentrada na fração de peso molecular mais baixo. As células HL -60 clone 15 diferenciadas em eosinófilos por 5 e 7 dias foram capazes de inibir a agregação plaquetária. A proteína de ECP inibiu a agregação plaquetária em PRP e PL. Esta inibição foi mais evidente em PL, e o ensaio de citotoxicidade com MTT demonstrou a viabilidade de plaquetas testadas, indicando que a inibição observada pela proteína ECP não ocorre simplesmente pela morte celular. A proteína EDN, clonada e expressa em sistema eucarioto, também apresentou efeito de inibição sobre a agregação plaquetária em PRP, enquanto que a proteína MBP não apresentou efeito de inibição da agregação plaquetária significativo. Os nossos resultados indicam que os eosinófilos desempenham um papel fundamental na inibição da agregação plaquetária / Abstract: Eosinophils participate in allergic and inflammatory processes, being related to innate immunity system of the body, they represent a fundamental line of defense against microbial invasion and when activated produce a number of soluble mediators that act in inflammatory and allergic responses. The relationship between the activity of eosinophils and platelets has been observed in recent decades by many scientists. These observations include increased numbers of eosinophils associated with platelet disorders, including changes in the coagulation cascade and platelet aggregation. Based on these observations, the interaction between eosinophils and platelets in platelet aggregation was analyze. Human platelets were incubated with eosinophil cytosolic fraction, promyelocytic human HL-60 clone 15 cell lineage, and eosinophil cationic protein (ECP). Platelet rich plasma (PRP) aggregation was induced by adenosine diphosphate, platelet activating factor, arachidonic acid, and collagen, and washed platelets (WP) were activated by thrombin. Aggregation induced by all agonists was dose dependently inhibited by eosinophil cytosolic fraction. This inhibition was only partially reversed by previous incubation of the eosinophils with L-Nitro-Arginine-Methyl-Ester (L-NAME). Previous incubation with indomethacin did not prevent the cytosolic fraction induced inhibition. The separation of eosinophil cytosolic fraction by gel filtration on Sephadex G-75 showed that the inhibitory activity was concentrated in the lower molecular weight fraction. HL-60 clone 15 cells differentiated into eosinophils for 5 and 7 day were able to inhibit platelet aggregation. The ECP protein inhibited the platelet aggregation on PRP and WP. This inhibition was more evident in WP, and the citotoxicity MTT assay proved the viability of tested platelets, showing that the observed inhibition by the ECP protein does not occur simply by cell death. The EDN protein, cloned and expressed in eukaryotic system, also showed inhibitory effect on platelet aggregation in PRP, whereas the protein MBP had no effect significative inhibiting platelet aggregation. Our results indicate that eosinophils play a fundamental role in platelet aggregation inhibition / Doutorado / Farmacologia / Doutora em Farmacologia

Orientador: Sisi Marcondes Paschoal / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-26T18:31:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bonfitto_PedroHenriqueLeite_M.pdf: 791921 bytes, checksum: 967c29bbcdf8e6df7bd3a2d919b84111 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: As plaquetas são importantes células na inflamação, entretanto, os trabalhos que estudam as citocinas na reatividade plaquetária são raros. O objetivo do presente trabalho foi estudar os efeitos do fator de necrose tumoral-alfa (TNF-?) em plaquetas. Ensaios de agregação foram realizados incubando-se plaquetas com crescentes concentrações de TNF-? (1 - 3000 pg/ml) por diferentes intervalos de tempo (5 - 60 min), na ausência ou presença do antagonista não seletivo dos receptores TNFR1 e TNFR2, o R7050. Também foi estudado o efeito do TNF-? na viabilidade plaquetária utilizando-se o MTT. O efeito do TNF-? na mobilização de Ca2+ em plaquetas foi investigado através de ensaios de fluorescência utilizando-se o fluo-3-AM; os ensaios de western blotting foram realizados para o estudo da ativação da enzima c-Src e do receptor de fibrinogênio. Finalmente, foram determinados os níveis intraplaquetários de AMPc e GMPc por ELISA. O TNF-? inibiu a agregação plaquetária induzida por ADP ou trombina de forma dependente da concentração da citocina e do tempo de incubação. O efeito inibitório máximo do TNF-? na agregação induzida por ADP (5 ?M) foi obtido com a concentração de 300 pg/ml por um tempo de incubação de 30 min (90 ± 7% de inibição), o qual foi significativamente prevenido pela pré-incubação das plaquetas com o R7050. A viabilidade plaquetária não foi modificada pela incubação por 60 min com o TNF-? (30 e 3000 pg/ml). A incubação de plaquetas com TNF-? (300 pg/ml, 30 min) reduziu em 53% o aumento da concentração de Ca2+ total causado pela adição de trombina (200 mU/ml). A queda da concentração de Ca2+ citosólica plaquetária causada pelo TNF-? foi em decorrência da diminuição em 1,8 e 3,4 vezes da mobilização interna do íon e do influxo do mesmo, respectivamente. O TNF-? reduziu em 60% os níveis de AMPc em plaquetas ativadas com ADP. Por outro lado, o TNF-? aumentou significativamente os níveis de GMPc em plaquetas ativadas por ADP (aumento de 51%). A pré-incubação de plaquetas com o inibidor da guanilil ciclase ODQ não reduziu o efeito inibitório do TNF-? na agregação induzida por ADP. Os ensaios de western blotting mostraram que o TNF-? reduziu significativamente a fosforilação do resíduo de Tyr416 da c-Src em plaquetas ativadas. Da mesma forma, o TNF-? reduziu em 37% a fosforilação do resíduo de Tyr773 da subunidade ?3 da integrina ?IIb?3 (receptor de fibrinogênio) em plaquetas ativadas por ADP. Portanto concluímos que o TNF-? inibe a agregação plaquetária via receptores TNFR1 e/ou TNFR2, sem reduzir a viabilidade das plaquetas. O efeito inibitório do TNF-? na agregação é acompanhado pela redução de Ca2+ citosólico e inibição de c-Src e do receptor de fibrinogênio em plaquetas, sendo estes independentes de AMPc ou GMPc / Abstract: Platelets have been described as important cells in inflammation; however, the effects of cytokines on platelet reactivity are rarely studied. The objective of the present work was to investigate the effects of the tumor necrosis factor-alpha (TNF-?) in platelets. Aggregation assays were carried out incubating platelets with increasing TNF-? concentrations (1 - 3000 pg/ml) for different intervals of times (5 - 60 min), in the absence or in presence of the non-selective antagonist of TNFR1 and TNFR2, R7050. Effect of TNF-? on platelet viability was determined using MTT. The effect of TNF-? on the Ca2+ mobilization in platelets was investigated through fluorescence assays using fluo-3AM and Western blotting assays were carried out to determine the activation of c-Src and the fibrinogen receptor. Finally, the cAMP and cGMP levels in platelets were determined by ELISA. TNF-? dose- and time-dependently inhibited ADP or thrombin-induced platelet aggregation. The inhibitory effect of TNF-? on ADP(5 ?M)-induced platelet aggregation was maximum in a concentration of 300 pg/ml incubated with platelets for 30 min (90 ± 7% of inhibition), which was significantly prevented by the incubation of platelets with R7050. Platelet viability was not modified by TNF-? (30 and 3000 pg/ml) incubated for 5 to 60 min. Incubation of platelets with TNF-? (300 pg/ml, 30 min) reduced the increased total Ca2+ concentration induced by thrombin (200 mU/ml) by 53%. Decreasing Ca2+ internal mobilization (1,8 fold) and decreasing in external Ca2+ influx (3,4 fold) led to a reduction of total cytosolic Ca2+ in TNF-? activated platelets. TNF-? reduced the cAMP levels in ADP-activated platelets by 60%. On the other hand, TNF-? significantly increased cGMP levels in ADP-activated platelets (51% increase). Pre-incubation of platelets with the guanylyl cyclase inhibitor ODQ did not modify the inhibitory effect of TNF-? on ADP-induced platelet aggregation. Western blotting analysis showed that TNF-? significantly reduced phosphorylation on Tyr416 of c-Src in activated platelets. Similarly, TNF-? reduced by 37% the Tyr773 phosphorylation of ?3 subunit of ?IIb?3 integrin (fibrinogen receptor) in ADP-activated platelets. Therefore, our results show that TNF-? inhibits platelet aggregation via TNFR1 and/or TNFR2 receptors, without affecting platelet viability. The inhibitory effect of TNF-? on aggregation is accompanied by a reduction in cytosolic Ca2+ and the inhibition of c-Src and fibrinogen receptor activation, which are cAMP and cGMP-independent effects / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Farmacologia

INTRODUÇÃO: Racional: A alta atividade plaquetária residual (AAPR) em uso do AAS é considerada um fator de mau prognóstico em portadores de síndrome isquêmica miocárdica instável (SIMI). Adicionalmente, as taxas de prevalência de AAPR verificadas em diferentes estudos realizados na fase aguda das SIMI são consideradas elevadas em relação às verificadas em portadores de doença arterial coronariana estável. Todavia, não está bem demostrado se essa elevada prevalência de AAPR diagnosticada na fase aguda das SIMI representa um fenômeno transitório, desaparecendo na fase tardia, ou se é um estado permanente, independente da fase aguda. MÉTODOS: O objetivo primário do presente estudo foi o de comparar, em pacientes com SIMI sem supradesnível do segmento ST, a resposta antiplaquetária ao AAS nas fases aguda e tardia na mesma população. Foram incluídos 70 pacientes com SIMI sem supradesnível de ST (77% com angina instável e 22% com IAM sem supra de ST), com idade média de 64,97 anos, sendo 54% do sexo feminino, todos em uso de AAS na dose de 100 a 200mg por pelo menos sete dias anteriores à inclusão. Os pacientes foram submetidos a cinco testes de agregação plaquetária na fase aguda, e os mesmos testes foram repetidos na fase tardia, três meses depois: VerifyNowAspirin®, agregometria de sangue total (AST) com ácido aracdônico (AA) e colágeno, tromboxane B2 sérico, PFA-100. RESULTADOS: De acordo com os testes COX-1 específicos (VFN e AST com AA), a AAPR em uso do AAS foi mais prevalente na fase aguda das SIMI do que na fase tardia (VFN: 32,1% versus 16%, p=0,049; e AST com AA: 31,4% versus 12,8%, p=0,015). Os testes não específicos (AST com colágeno, PFA) e o teste bioquímico não conseguiram demonstrar diferenças entre as fases. A correlação entre os cinco testes realizados foi considerada fraca ou moderada. CONCLUSÃO: A alta prevalência de AAPR, apesar do uso da AAS durante as SIMI, reflete mais provavelmente um estado de hiper-reatividade plaquetária transitória, que se reverte na fase crônica e estável da DAC, de acordo com os testes COX-1 específicos. A correlação entre os testes plaquetários foi apenas moderada nos dois cenários / BACKGROUND: The high residual platelet activity (HRPA) in response to acetylsalicilic acid (ASA) is considered a poor prognostic factor in patients with acute coronary syndromes (ACS). Additionally, the HRPA prevalence rates reported by different studies in ACS patients are considered high compared to those reported in patients with stable coronary artery disease. However, it is not well demonstrated whether this high HRPA prevalence diagnosed during the acute phase represents a transient phenomenon, disappearing in the late phase, or if it is a permanent state, independent of the acute phase. The aim of this study was to compare platelet aggregation in response to ASA during the ACS acute phase with the platelet aggregation in chronic stable phase. METHODS: Inclusion of patients with non ST ACS who were on aspirin at a dose of 100mg to 200mg per day for at least seven days prior to inclusion. We conducted five tests of platelet aggregation in the first 48 hours and repeated them three months later: VerifyNow Aspirin® (VFN), Whole Blood aggregometry (WBA) with arachidonic acid (AA) and collagen, thromboxane B2, PFA-100®. We analyzed 70 patients (77% with unstable angina and 22% with non ST AMI), mean age 64.97 years, 54% female. According to the COX-1 specific tests, the HRPA was more frequent in the acute phase than in the chronic phase (VerifyNowAspirin®: 31.4% versus 12.8%, p=0.015; and WBA with AA: 32.1% versus 16%, p=0.049; respectively). The non specific tests (AST with collagen and PFA) and the biochemical test sTXB2 failed to show differences between the phases. The correlation between the five tests was considered weak or moderate. CONCLUSION: The high prevalence of RPA despite the use of aspirin during the acute phase of the SCA most likely reflects a state of transient platelet hyperreactivity, which is reversed in the chronic phase. The correlation between platelet tests was only moderate in both scenarios

Distúrbios de hemostasia são uma das principais manifestações clínicas observadas nos acidentes por serpentes do gênero Bothrops. Tendo em vista a importância da ativação de fatores da cascata de coagulação no desenvolvimento da patologia no envenenamento, o presente trabalho descreve o isolamento e a caracterização bioquímica e funcional de uma metaloprotease capaz de induzir a ativação de fatores de coagulação, a partir da peçonha de Bothrops moojeni. A metaloprotease foi isolada por três etapas cromatográficas utilizando colunas de exclusão molecular (Sephacryl S-200), interação hidrofóbica (Phenyl Sepharose) e troca aniônica (ES 502N). A protease isolada, denominada moojenactivase, é uma glicoproteína com massa molecular de aproximadamente 89 kDa e ponto isoelétrico de 4,92, sendo composta por três cadeias com massas de 66; 17 e 14 kDa, ligadas por pontes dissulfeto. A determinação da sequência de aminoácidos por espectrometria de massas evidenciou grande identidade sequencial com outras metaloproteases, indicando a presença dos domínios metaloprotease, desintegrina-like e lectinas-like e classificando-a como uma protease da classe PIIId. Funcionalmente, a moojenactivase foi capaz de induzir a cogulação de plasma humano pela ativação dos fatores II (protrombina) e X da cascata de coagulação, gerando -trombina e fator X ativado, respectivamente. A protease apresentou atividade fibrinogenolítica, especialmente sobre a cadeia da molécula de fibrinogênio, porém não foi capaz de induzir a formação do coágulo de fibrina pela ativação deste. A moojenactivase foi parcialmente inibida quando incubada em condições de pH entre 3,5 e 5,0 e em pH 9,0, além de temperaturas acima de 60ºC, bem como na presença de ions Cu2+, além dos inibidores EDTA, SDS, DTT e soro anti-ofídico crotalico/botrópico. A protease induziu agregação plaquetária e não apresentou atividades fibrinolítica e hemorrágica. Células mononucleares de sangue periférico (PBMC) tratadas com a protease foram capazes de produzir TNF- assim como expressar fator tecidual (Fator III da coagulação) na forma ativa, fazendo com que essas células apresentassem caráter procoagulante. Com o objetivo avaliar os efeitos nos parâmetros hematológicos in vivo, a moojenactivase foi administrada em ratos (3g/Kg) onde foi observado que a protease foi capaz de prolongar o tempo de sangramento dos animais e induzir a diminuição do número de plaquetas sanguíneas, caracterizando um quadro de trombocitopenia. Ainda, o plasma dos animais administrados com a moojenactivase apresentaram valores elevados do tempo de protrombina e tempo de tromboplastina parcialmente ativada, assim como redução na concentração de fibrinogênio. Na análise dos parâmetros da série branca, foi observado aumento leucocitário na circulação, com predominância de neutrófilos até 3h após a administração, indicando a instalação de um quadro inflamatório. Com relação à análise da série vermelha, a moojenactivase não foi capaz de alterar nenhum dos parâmetros estudados. Os resultados obtidos no presente trabalho mostram, pela primeira vez, o isolamento de uma metaloprotease da classe P-IIId da peçonha de Bothrops moojeni capaz de atuar sobre diferentes ii eventos do processo hemostático, sendo essa ação prócoagulante responsável pelo quadro de incoagulabilidade sanguínea em animais. Os dados gerados podem auxiliar no entendimento dos distúrbios de coagulação em pacientes envolvidos em acidentes por serpentes da espécie Bothrops moojeni, levando ao melhor direcionamento na terapia anti-ofídica. Ainda, a função da moojenactivase sobre componentes biológicos credencia a molécula para uma possível aplicação biotecnológica em processos que envolvem o sistema hemostático. / Haemostasis disorders are a major clinical manifestation induced by Bothrops snake envenomations. Considering the relevance of the activation of coagulation factors during the envenomation pathophysiology, the present work describes, for the first time, the isolation and functional and biochemical characterization of a coagulation factor activator metalloprotease from Bothrops moojeni snake venom. The protease was purified by three chromatographic procedures using size exclusion (Sephacryl S-200), hydrophobic interaction (Phenyl Sepharose) and anion exchange (ES 502N) chromatographies. The isolated protease, named moojenactivase, is a glycoprotein with molecular mass of approximately 89 kDa by SDS-PAGE, and composed of 66 kDa, 17 kDa and 14 kDa disulfide linked chains, with pI of 4,92. The amino acid sequence determination of tryptic peptides from moojenactivase by mass spectrometry presented fragments with high identity to snake venom metalloproteases, confirming the presence of the metalloprotease, disintegrin-like and lectin-like domains, which allowed its classification as a PIIId class snake venom metalloprotease. Regarding its functional properties, the protease was capable to induce human plasma coagulation by inducing activation of coagulation factors II and X, forming-thrombin and factor X activated, respectively. Also, moojenactivase presented fibrinogenolitic activity, by cleaving preferentially -chain of fibrinogen, however was not capable to induce the formation of fibrin clot from fibrinogen. The enzyme stability was assessed and showed that moojenactivase presented a reduced functional activity when preincubated in pH values ranging from 3,5 to 5,0 and at pH 9,0, and in temperature conditions over 60ºC. Cu2+ ions and inhibitors such as EDTA, SDS, DTT and crotalic/bothropic antiophidian serum reduced the protease activity. Moojenactivase induced platelet aggregation, but no fibrinolytic and haemorrhage activities. In order to evaluate the stimulation of peripheral blood mononuclear cells (PBMC), cells were treated with the protease and we observed the release of proinflammatory cytokine TNF- and expression of active Tissue Factor (coagulant factor III), inducing a procoagulant state on PBMC. In order to evaluate in vivo haematological effects, the protease (3 g/Kg) was administered in rat (i.v.) and was observed that moojenactivase induced a prolonged bleeding time and reduced platelet counting (indicating a thrombocytopenia state). Moreover, the evaluation of the hemostasis parameters was assessed by the the prothrombin time and activated partial thromboplastin time assays and showed a prolonged clot time on both tests, and also a decrease in fibrinogen plasma levels. The leukogram analysis showed an increase in the circulating leukocyte number up to 3 hours after moojenactivase administration, composed predominantly of neutrophils. However, parameters envolving red cells shows that the protease do not affect. The results obtained in the present work show, for the first time, the isolation of a PIIId class metalloprotease from Bothrops moojeni snake venom involved on the activation of several hemostatic events, inducing a pro coagulant activity and leading to blood unclottable state in experimental animals. These data can assit in understanding coagulation disturbs in iv patients involved in Bothrops moojeni envenomation and leading to a better anti ophidic therapy guidance. Moreover, moojenactivase functional activities accredits this protease as a possible molecular instrument applied on biotechnological prospect related to the hemostasis.

O uso do ácido acetilsalicílico, universalmente aceito na prevenção e tratamento da doença aterosclerótica, pode resultar em respostas terapêuticas variáveis classificando os pacientes em respondedores (normais) ou baixo respondedores (resistentes). A dose de 100mg/dia pode inibir de forma insuficiente a agregação plaquetária. Por isso, doses maiores têm sido utilizadas ou, eventualmente, associadas a outros antiplaquetários visando à redução do número de baixo respondedores. O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos do ácido acetilsalicílico na redução da agregação plaquetária in vitro. Para tal, 152 indivíduos de ambos os sexos, não aparentados, de qualquer etnia, sem limite de faixa etária, portadores de doença arterial coronária crônica, atendidos no Ambulatório de Coronariopatias do Instituto Dante Pazzanese de Cardiologia, foram incluídos no estudo. Na primeira consulta, todos foram submetidos à anamnese e exame clínico completo e estavam em uso prévio de ácido acetilsalicílico 100mg/dia, por um período superior a 30 dias. Os pacientes selecionados foram divididos em dois grupos: grupo AAS 200, composto por aqueles que foram tratados com ácido acetilsalicílico na dose de 200mg/dia e grupo Ômega 3 composto por aqueles tratados com ácido acetilsalicílico 100mg/dia em associação a ácido graxo ômega 3 na dose de 1.000mg/dia. A agregação plaquetária foi mensurada, in vitro, pelo agregômetro Multiplate, na primeira e segunda consulta. Adicionalmente, amostras de sangue foram obtidas para análise bioquímica e identificação dos polimorfismos nos genes COX-1 (rs 384787; rs 3842798) relacionado com a atividade do ácido acetilsalicílico e ITGB 3 relacionado com a codificação da glicoproteína IIIa (GPIIIa-rs 5918), subunidade do receptor de fibrogênio. Análise da função plaquetária (Aspitest) foi realizada em ambos os grupos. Os valores de corte para o Aspitest, relativo à medida de inibição da ciclooxigenase 1 pelo ácido acetilsalicílico, foram: <= 30 AUC para os muito bons respondedores, > 30 e 40 AUC para os não respondedores. Para a dosagem plasmática de tromboxane, utilizou-se o kit Elisa e, para sua qualificação, a espectrofotometria. Para o DNA genômico, extraído do sangue total periférico, utilizou-se o sistema automatizado QIA cube seguido pela amplificação, pela PCR, da região do DNA que continha o polimorfismo. Os dados foram analisados pelo software SPSS-20 e o nível de significância adotado de 5% (p < 0,05). O teste paramétrico t Student foi utilizado para os dados com distribuição normal (teste Kolmogorov-Smirnov) e os testes não paramétricos Mann-Whitney ou Wilcoxon para os demais dados. A frequência das variáveis qualitativas foi determinada pelo teste do qui-quadrado. A redução dos níveis séricos de VLDL e triglicérides foram semelhantes nos dois grupos e a redução do número de monócidos foi estatisticamente maior no grupo ômega 3. Dos 152 pacientes incluídos no estudo, 38 (25,2%) não eram respondedores ao tratamento prévio com o ácido acetilsalicílico, na posologia de 100mg/dia. A frequência genotípica e alélica dos polimorfismos e a presença do alelo raro foram semelhantes nos grupos respondedor e não respondedor ao ácido acetilsalicílico. A função plaquetária e a produção de tromboxane foram semelhantes nos grupos AAS 200 e Ômega 3. A redução do Aspitest foi observada apenas no grupo não respondedor. A presença do alelo raro do polimorfismo rs 3842787 (gene PTGS1) associou-se à pior resposta do Aspitest e o alelo raro do polimorfismo rs 5918 (gene ITGB3) associou-se à pior resposta à concentração de tromboxane, após 30 dias de tratamento. Em conclusão, 1) os resultados desse estudo mostraram que a associação do ácido acetilsalicílico na dose de 100mg/dia e ômega3 na dose de 1.000mg/dia não reduziu a agregação plaquetária in vitro; 2) os pacientes não respondedores que fizeram uso de ácido acetilsalicílico na dose de 200mg/dia, após 30 dias, tiveram redução no Aspitest e passaram a ser considerados respondedores; 3) A presença dos alelos rs 384787 (COX1-PTGS1) foi responsável pela pior resposta ao Aspitest e a do alelo rs 5918 pela pior resposta ao tromboxane B2. A farmacogenética abre novas perspectivas para o tratamento clínico personalizado da antiagregação plaquetária. / The use of acetylsalicylic acid for the prevention and treatment of atherosclerotic disease may result in different therapeutic responses. Based on that, patients are classified in responders (normal) or low responders (resistant). In clinical practice, the use of 100mg/daily of acetylsalicylic acid may be insufficient for platelet aggregation inhibition, therefore either higher doses or combination with other antiplatelet agents have been used in order to reduce the rates of low responders. The aim of the present study was to evaluate the effects of acetylsalicylic acid in reducing platelet aggregation in vitro. One hundred, fifty-two subjects of both genders, unrelated, of any ethnicity, at any age, and with diagnosis of chronic coronary artery disease followed at the Coronary Artery Disease Section of Dante Pazzanese Institute of Cardiology were included in the study. All patients underwent anamnesis and clinical examination at first consultation. All subjects were on aspirin use (100mg/daily) for at least 30 days before inclusion. Patients were divided into two groups: group ASA, composed by those treated with 200mg of acetylsalicylic acid only and group Omega 3, composed by those treated with 100mg of acetylsalicylic acid in addition to 1.000 mg of omega 3 fatty acid. Platelet aggregation was measured by Multiplate aggregometer at first and second visits. In each visit, blood samples were obtained for biochemical analysis and identification of gene polymorphisms of COX-1 (RS 384 787; rs 3842798) related to the activity of acetylsalicylic acid and of 3 ITGB related glycoprotein IIIa (GPIIIa RS-5918) coding. Platelet function was also analyzed. Cut-off values for Aspitest related to inhibition of cyclooxygenase 1 by acetylsalicylic acid were <= 30 AUC for very good responders, > 30 <= 40 AUC for good responders, and > 40 AUC for non-responders. Elisa test was used for thromboxane plasmatic dosage assessment whereas spectrophotometry was used for its quality evaluation. For genomic DNA extracted from peripheral whole blood, we used QIA cube automated system followed by the amplification by PCR of the region of DNA containing the polymorphism. Data was analyzed by SPSS-20 software. P values < 0.05 were considered statistically significant. Parametric Student t test was used for data with normal distribution (Kolmogorov-Smirnov test) and non-parametric Mann-Whitney or Wilcoxon for other data. The frequency of qualitative variables was analyzed using chi-square test. There was a reduction of VLDL and triglycerides serum levels in both groups, however, the reduction of monocytes was statistically higher in Omega 3 group. Out of 152 patients included in the study, 38 (25.2%) were non responders to prior treatment with acetylsalicylic acid (100mg/daily). Genotypic and allelic polymorphism frequencies and the presence of the rare allele were similar in the responder and non-responder groups. Platelet function and thromboxane production were similar between groups ASA and Ômega 3. Aspitest reduction was observed only in the non-responder group. The presence of rare allele of rs 3842787 polymorphism (PTGS1 gene) was associated with worse response to Aspitest whereas the presence of rare allele of rs 5918 polymorphism (ITGB3 gene) was associated with poor response to thromboxane concentration. In conclusion, 1) the combination of aspirin 100mg/daily and omega 3 1.000 mg/daily did not reduce platelet aggregation in vitro; 2) Non-responders who received aspirin 200mg/daily presented reduction in the Aspitest and were considered responsive after 30 days of treatment; 3) The presence of the alleles rs 384,787 (COX1-PTGS1) was associated with worse response to Aspitest and the presence of the allele rs 5918 was associated with worst response to thromboxane B2. More data is needed to confirm our results. The pharmacogenetics will be an important tool for clinicians in order to customize specific treatment for each patient in platelet aggregation.

As fosfolipases A2 (PLA2s) catalisam a hidrólise de ácidos graxos na posição sn-2 das membranas fosfolipídicas e liberam, como subprodutos, ácidos graxos livres. As PLA2s do grupo IIA são encontradas em peçonhas de serpentes da família Viperidae e desempenham diversas atividades apresentando potencial miotóxico, neurotóxico, hemolítico, edematogênico, citotóxico, hipotensivo, anticoagulante, inibição/ativação da agregação plaquetária, bactericida e pró-inflamatório. Esse trabalho teve como objetivo o isolamento e a caracterização funcional de uma PLA2 isolada da peçonha de Bothrops jararaca. Para a purificação dessa proteína, denominada BJ-PLA2-I, foram necessários três passos cromatográficos consecutivos: cromatografia de exclusão molecular em Sephacryl S-200, cromatografia de troca iônica em Source TM 15Q/50mL e cromatografia de troca iônica em MonoQ TM 5/50 GL. A BJ-PLA2-I apresentou elevado grau de pureza por SDS-PAGE e por cromatografia de fase reversa C18, em HPLC. Apresentou ainda, características ácidas, com pI em torno de 4,4 e teve a sua massa molecular determinada por dois métodos, obtendo-se valores bem próximos de 14,8 kDa (SDS-PAGE) e 14,2 kDa (MALDI-TOF). Esse fato é comum considerando que a espectrometria de massas é um método mais preciso e determina de maneira mais exata a massa molecular. O sequenciamento N-terminal da BJ-PLA2-I resultou em 60 resíduos de aminoácidos. O alinhamento múltiplo com outras fosfolipases A2 de serpentes do mesmo gênero mostrou similaridade entre elas, mostrando identidade de 100% com a BJ-PLA2, fosfolipase A2 Asp-49, também isolada da Bothrops jararaca. Esse dado levanta a hipótese de que a BJ-PLA2-I purificada neste trabalho e a BJ-PLA2 se tratam da mesma proteína, entretanto essa hipótese só poderá ser confirmada quando a sequência completa da BJ-PLA2-I for obtida. Outros dados encontrados neste trabalho reforçam essa hipótese, isso porque, avaliando a atividade fosfolipásica, o efeito sobre as plaquetas e o pI, tanto a BJ-PLA2-I quanto a BJ-PLA2 apresentaram características semelhantes. A BJ-PLA2-I, sendo uma Asp-49, mostrou alta atividade catalítica e efeito inibidor da agregação plaquetária induzida por ADP (20,5 ?g/mL inibiu 50 % da agregação plaquetária). Ela também foi capaz de induzir a migração leucocitária após a administração de diferentes concentrações (5, 10 e 20 ?g/mL) da BJ-PLA2-I. Esse dado também foi encontrado no ensaio em que a concentração de 10 ?g/mL foi fixada e variou-se o tempo de 2, 4 e 24 horas, observando-se principalmente a migração de neutrófilos. Além disso, verificou-se a liberação das citocinas IL-6 e IL-1?, de proteínas totais e de prostaglandina E2 na reação inflamatória induzida pela BJ-PLA2-I. No entanto, não foi observado a produção de TNF-?, IL-10 e leucotrieno B4. A BJ-PLA2-I caracterizou-se como uma PLA2 pró-inflamatória, produzindo inflamação local aguda. A BJ-PLA2-I foi avaliada quanto ao seu potencial antitumoral em três linhagens celulares distintas (PBMC, HL-60 e HepG2). Observou-se que a enzima em questão possui baixo potencial antitumoral para a linhagem HL-60, reduzindo o número de células tumorais em apenas cerca de 20% nas concentrações testadas. Verificou-se pequena alteração na viabilidade celular das células de PMBC, nas maiores concentrações testadas (160 e 80 ?g/mL) e, na linhagem HepG2 não foi encontrada nenhuma alteração. Concluindo, as informações adquiridas neste trabalho são de suma importância para a melhor compreensão dos mecanismos envolvidos nas atividades biológicas desempenhadas pelas PLA2s. Além disso, a BJ-PLA2-I pode servir como modelo molecular para a formulação de fármacos mais eficazes a serem utilizados no tratamento de várias doenças. / Phospholipases A2 (PLA2s) catalyze the hydrolysis of fatty acids in the sn-2 position of membrane phospholipids, releasing free fatty acids as by-products. PLA2s of group IIA are found in snake venoms of the Viperidae family and perform various activities, including myotoxic, neurotoxic, hemolytic, edematogenic, cytotoxic, hypotensive, anticoagulant, inhibition/activation of platelet aggregation, bactericidal and proinflammatory effects. This work aimed at the isolation and functional characterization of a PLA2 isolated from Bothrops jararaca venom. For the purification of this protein, called BJ-PLA2-I, three consecutive chromatographic steps were used (size exclusion chromatography on Sephacryl S-200, ion exchange chromatography on Source 15Q/50 mL, ion exchange chromatography on MonoQ 5/50 GL). Confirmation of the purity of BJ-PLA2-I was evaluated by SDS-PAGE and reverse phase HPLC using a C18 column. BJ-PLA2-I has acidic characteristics, with pI around 4.4, and its molecular mass was determined by two methods, obtaining values close to 14.8 kDa (SDS-PAGE) and 14.2 kDa (MALDI-TOF). The N-terminal sequencing of BJ-PLA2-I resulted in 60 amino acid residues. Multiple alignment with other phospholipases A2 of snakes of the same genus showed high similarity between them, showing 100% identity with BJ-PLA2, an Asp-49 phospholipase A2 previously isolated from Bothrops jararaca venom. This finding raises the possibility that the PLA2 purified in this work is the same protein previously described (BJ-PLA2), however, this assumption can only be confirmed when the complete sequence of BJ-PLA2-I is obtained. Other data obtained in this study support this hypothesis, considering that the phospholipase activity, the effect on platelets and pI of both BJ-PLA2-I and BJ-PLA2 showed to be similar. BJ-PLA2-I, being an Asp-49 PLA2, showed high catalytic activity and inhibitory effect on the platelet aggregation induced by ADP (20.5 ?g/mL inhibited 50% of the platelet aggregation). It was also able to induce leukocyte migration after the administration of different concentrations (5, 10 and 20 ?g/mL) of BJ-PLA2-I. This fact was also found when the concentration of 10 ?g/mL was fixed and response times were varied (2, 4 and 24 hours), observing especially neutrophil migration. Furthermore, there was a release of IL-6 and IL-1?, total proteins and prostaglandin E2 in the inflammatory reaction induced by BJ-PLA2-I, however, the production of TNF-?, IL-10 and leukotriene B4 was not observed. BJ-PLA2-I was characterized as a proinflammatory PLA2 producing acute local inflammation. BJ-PLA2-I was evaluated for its antitumor potential on three different cell lines (PBMC, HL-60 and HepG2). It was observed that this enzyme showed a low antitumor potential on HL-60 tumor cell line, reducing the number of tumor cells in only about 20% at the concentrations tested. There was little change in cell viability of PBMC cells in the higher concentrations tested (80 and 160 ?g/mL), but no change was found on HepG2 tumor cell line. In conclusion, the information obtained in this work are of utmost importance for better understanding the mechanisms involved in the biological activities induced by PLA2s. Furthermore, BJ-PLA2-I may serve as a molecular model for the formulation of more effective drugs to be used in the treatment of various diseases.

As doenças cardiovasculares (DCV) são responsáveis pela maioria das mortes ocorridas em todo o mundo. Os riscos para o desenvolvimento destas patologias podem ser amenizados, em parte, por meio de uma dieta rica em alimentos de origem vegetal. Neste sentido, os frutos nativos brasileiros, como os pertencentes à família Myrtaceae, podem contribuir para melhorar a qualidade da alimentação, pois apresentam altos teores de compostos bioativos, entre eles, os fenólicos (CBF). Pouco se sabe sobre os efeitos dos polifenóis destes frutos para redução do risco de desenvolvimento das DCV. Sendo assim, este trabalho buscou avaliar a bioacessibilidade dos CBF presentes em polpas de cambuci e jabuticaba e seus efeitos in vitro sobre mecanismos de ação relacionados às DCV. Para tanto, extratos ricos em polifenóis foram obtidos a partir de extrações em fase sólida (C18 e PA) das polpas de ambos os frutos, submetidas ou não à simulação da digestão gastrointestinal. Estes extratos tiveram seus efeitos inibitórios sobre a atividade da Enzima Conversora de Angiotensina I (ECA) e a agregação plaquetária induzida por adenosina difosfato avaliados in vitro. De acordo com os resultados obtidos, a digestão in vitro foi capaz de liberar os CBF da matriz alimentar. Tal bioacessibilidade parece ter sido importante apenas para a inibição da agregação plaquetária, uma vez que a capacidade inibitória destes compostos sobre a atividade da ECA não melhorou depois da digestão in vitro. Quanto aos resultados obtidos pelos extratos provenientes das colunas PA e C18, observa-se que as maiores concentrações de taninos nestes últimos não foram suficientes para melhorar a capacidade antiagregante, mas foram importantes para aumentar a inibição da atividade da ECA. Comparando-se as respostas apresentadas pelos dois frutos, os CBF presentes no cambuci exibiram, predominantemente, potenciais anti-hipertensivo e antiagregantedo maiores do que os da jabuticaba. Neste contexto, o consumo de cambuci e jabuticaba, bem como a utilização de seus polifenóis purificados, podem ser adjuvantes para a redução dos riscos relacionados ao desenvolvimento das DCV. / The cardiovascular diseases (CVD) are the leading cause of death worldwide. The risk of development of these disorders can be reduced, partially, by a vegetal-based diet. In this way, the Brazilian native fruits from Myrtaceae family may contribute to improve the diet quality, once they have high quantity of bioactive compounds, such as the phenolic (PC). The knowledge about the cardioprotective effects of consuming these fruit polyphenols is limited, so this study aimed to evaluate the bioaccessibility of the cambuci and jaboticaba PC and their in vitro potential on CVD-related mechanisms. First, gastrointestinal digestion simulation of each fruit pulp was done, and then the polyphenols rich extracts were obtained by solid phase extractions, before and after the pulps digestion. The polyphenols rich extracts had their phenolic concentrations determined and were used to evaluate the capacity of PC in inhibit the Angiotensin Converting Enzyme (ACE) activity and the platelet aggregation induced by ADP. The results were expressed as IC50, considering the total phenolic content per milliliter of reaction. According to the results, the in vitro digestion process was able to release the polyphenols from the food matrix. Therefore, the bioaccessibility had no significant effect on ACE activity, but decreased the IC50 values of platelet aggregation. In relation to the extracts from PA and C18 columns, the higher tannin concentration In comparison to the IC50 values presented by PA extracts, the higher concentrations of tannins in the last one were not enough to improve the antiaggregant effect, but were important to increase the inhibition of ACE activity. Cambuci polyphenols presented higher antihypertensive and antiaggregant potentials than the jaboticaba compounds. In this respect, the ingestion of cambuci and jaboticaba and the use of their purified polyphenols can be of particular importance in reducing the risk for the CVD development.

Introdução: O antecedente de AVCI e/ou AIT está presente em 5% dos pacientes com coronariopatia aguda e em até 17% dos pacientes com coronariopatia crônica. Esta população apresenta elevado risco para eventos cardiovasculares, assim como para desfechos hemorrágicos maiores (principalmente quando em uso de tratamento antitrombótico). A agregabilidade plaquetária apresenta papel fundamental no balanço isquêmico/hemorrágico; entretanto, esse mecanismo é pouco estudado em pacientes com evento cérebro vascular isquêmico prévio. O principal objetivo desse estudo é avaliar se pacientes com DAC e AVCI/ AIT prévio exibem alterações na agregabilidade plaquetária que justifiquem o risco aumentado para sangramento nesses indivíduos. Casuística e Métodos: Entre janeiro de 2013 e abril de 2015, 140 pacientes foram selecionados nos bancos de dados da unidade coronária e do serviço de cirurgia cardíaca do InCor- HCFMUSP. Critérios de inclusão: coronariopatia aguda prévia (há mais de 12 meses), antecedente de AVCI/AIT (anterior ao episódio de coronariopatia aguda), uso crônico de AAS e assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. Critérios de exclusão: AVCH prévio, uso de antiagregação plaquetária dupla ou anti-inflamatórios não esteroidais, trombofilia ou coagulopatia conhecida, trombocitopenia ou trombocitose, angioplastia ou cirurgia cardíaca nos últimos 6 meses, disfunção renal grave ou qualquer doença terminal. Desenho do estudo: Estudo de caso e controle (1:1), com os grupos caso (AVCI/AIT prévio) e controle (sem AVCI/AIT prévio) pareados por sexo, idade, tipo de coronariopatia aguda e tempo entre a coronariopatia aguda e a inclusão no estudo. A agregabilidade plaquetária foi mensurada pelo VerifyNow Aspirin®, VerifyNow P2Y12®, Agregometria óptica com agonista ADP, Agregometria óptica com agonista adrenalina e tromboelastrografia (Reorox®). Resultados: Os grupos controle (n=70) e caso (n=70), estavam bem pareados em relação à maioria das variáveis analisadas. A idade média da população global foi de 66 anos, 73% apresentavam IAM prévio, e o tempo médio entre o episódio de coronariopatia aguda e a inclusão no presente estudo foi de 5,31 anos. No momento da avaliação os pacientes do grupo caso apresentavam valores mais elevados de pressão arterial sistólica (135,84 ± 16,09 vs 123,68 ± 16,11mmHg, p < 0,001), embora esse grupo utilizasse maior número de antihipertensivos (2,37 ± 1,09 vs 3,0 ± 1,23, p=0,006). Em relação a variáveis metabólicas, o perfil lipídico não presentou diferença significativa entre os grupos, entretanto o grupo caso apresentou maiores valores de creatinina (1,24 ± 0,35 vs 1,11 ± 0,27 mg/dL, p=0,037) e também de glicemia de jejum (116,16 ± 32,03 vs 134,88 ± 57,58 mg/dL, p=0,031). No que se refere à meta principal do estudo, a agregabilidade plaquetária foi similar nos dois grupos por todos os métodos utilizados: VerifyNow Aspirin® (525,00 ± 79,78 vs 530,35 ± 83,81 ARU nos grupos caso e controle, respectivamente, p=0,7), VerifyNow P2Y12® (262,14 ± 43,03 vs 251,74 ± 43,72 PRU, p=0,21), Agregometria óptica com agonista ADP (78,34 ± 9,02 vs 77,55 ± 9,70%, p=0,82), Agregometria óptica com agonista adrenalina (49,01± 23,93% vs 49,34 ± 21,7, p=0,77), e tromboelastografia (Firmeza máxima do coágulo: 2,136,00 ± 569,97 vs 2.001,27 ± 635,68 Pa, p=0,19). Conclusão: Em pacientes com doença arterial coronária crônica a agregabilidade plaquetária foi similar nos indivíduos com ou sem AVCI/AIT. Esses resultados apontam para que outros mecanismos sejam responsáveis pelo elevado risco hemorrágico dessa população / Background: Ischemic stroke (IS) or transient ischemic attack (TIA) history is present in 5% of patients with acute coronary syndrome (ACS) and in 17% of patients with stable atherosclerotic disease (CAD). This population has a higher risk for major cardiovascular events and an increased incidence of major hemorrhagic outcomes when subjected to modern antithrombotic regimens, Platelet aggregability have key role in \"ischemic-hemorrhagic\" balance, however, these factors are little known in the population with prior cerebrovascular event. The aim of this study is to evaluate whether patients with coronary artery disease and previous IS/ TIA exhibit alterations in platelet aggregation, justifying the increased bleeding risk of these individuals. Methods: Between January 2013 and April 2015, 140 participants were selected in the coronary care unit and cardiac surgery service databank. Inclusion criteria: prior ACS (over 12 months), history of IS/ TIA previous to ACS, chronic use of aspirin since ACS and agreement to the consent form. Exclusion criteria: prior hemorrhagic stroke, current dual antiplatelet therapy or anti-inflammatory non-steroidal, any thrombophilia or coagulopathy, thrombocytopenia, thrombocytosis, PCI or CABG in the last 6 months, severe renal impairment and any terminal illness. Study design: Case-control study (1:1), case group (previous IS/TIA) and control group (without previous IS/TIA) matched for sex, age, type of previous ACS, time between ACS and inclusion in the study. Platelet aggregation was assessed by VerifyNow Aspirin®, VerifyNow P2Y12®, Light transmission aggregometry aggonist with agonists adrenaline, Light transmission aggregometry aggonist with ADP, and thromboelastography (Reorox®). Results: The control group (n=70) and case group (n=70), were well matched. The mean age was 63 years, about 73% presented previous AMI and the index ACS occurred 5,31 years before study inclusion. At the evaluation day patients in the case group presented higher SBP levels (135.84 ± 16.09 vs 123.68 ± 16.11 mmHg, p < 0,001), although this group were using more antihypertensive medications (2.37 ± 1.09 vs 3.0 ± 1.23, p=0,006). In relation to metabolic profile, lipid profile did not presented diferences, however, case group presented higher values for creatinine (1.24 ± 0.35 vs 1.11 ± 0.27 mg/dL, p=0.037) and also presented higher values for fasting glucose.(116.16 ± 32.03 vs 134.88 ± 57.58 mg/dL, p=0.031) Platelet aggregation was statistically similar in both groups: VerifyNow Aspirin® (525.00 ± 79.78 vs 530.35 ± 83.81 ARU, p=0.7), VerifyNow P2Y12® (262.14 ± 43.03 vs 251.74 ± 43.72 PRU, p=0.21), Light transmission aggregometry aggonist with agonists ADP (78,34 ± 9,02 vs 77,55 ± 9,70%, p=0,82), Light transmission aggregometry aggonist with adrenaline (49,01 ± 23,93% vs 49,34 ± 21,7, p=0,77) and thromboelastography (maximum clot firmness: 2.136,00 ± 569,97 vs 2.001,27 ± 635,68 Pa, p=0,19). Conclusion: Platlet aggregability is similar in CAD patients with or without previous IS/TIA and this results point at other reasons to justify the high risk for bleeding in this patients

Neste trabalho visamos otimizar o isolamento da BnP1, uma SVMP presente no veneno de B. neuwiedi, e isolar disintegrinas desse veneno, ambas originadas de precursores tipo P-II, analisando as seqüências de cDNA e a ação sobre plaquetas. A purificação da BnP1 foi por exclusão molecular e troca iônica; duas novas disintegrinas, D2 e D4, foram isoladas por cromatografia em fase reversa; e outra disintegrina, MS, foi caracterizada a partir do SDS-PAGE. As proteínas foram parcialmente seqüenciadas por espectrometria de massas. Diferentes cDNAs foram clonados a partir da glândula de veneno de B. neuwiedi e os precursores da BnP1 e MS se localizaram em um cluster que inclui SVMPs classe P-I e P-II. O precursor de D4 correspondeu a uma SVMP tipicamente P-II. A BnP1, ao contrário das disintegrinas, não inibiu a agregação plaquetária induzida por diferentes agonistas. Este trabalho indica ainda que a biossíntese de SVMPs da classe P-II pode envolver processamento de mRNA, um novo mecanismo de geração de diversidade das SVMPs. / The aim of this study was to optimize the isolation of BnP1, a SVMP from B. neuwiedi venom, and isolate new disintegrins from this venom, both originated from P-II class precursors, and analyze the sequence of their precursors and their action on platelets. BnP1 was isolated by size exclusion and anion-exchange chromatography; the disintegrins D2 and D4 by reverse-phase chromatography and MS was isolated from SDS-PAGE. These proteins were partially sequenced by mass spectrometry. Several SVMPs cDNAs were cloned from B. neuwiedi venom gland, and BnP1 and MS precursors localized in a cluster enclosing P-I and P-II SVMPs. MS cDNA was tipical of P-II class of SVMPs. BnP1, unlike the disintegrins, was not able to inhibit platelet aggregation induced by different agonists. This work suggested that the biosynthesis of class P-II SVMPs include mRNA processing as a further step to generate venom diversity.