Pseudomonas aeruginosa é um importante agente de pneumonia, particularmente em pacientes submetidos à ventilação mecânica, que pode evoluir para sepse, com elevadas taxas de letalidade. Na sepse, o processo inflamatório sistêmico exacerbado favorece o desequilíbrio entre as vias de coagulação e fibrinólise e a instalação de um estado pró-coagulante, com o aparecimento de trombose microvascular, coagulação intravascular disseminada e falência de múltiplos órgãos. Conhecendo a potente atividade pró-inflamatória da toxina ExoU produzida por P. aeruginosa, decorrente de sua atividade fosfolipásica A2, o objetivo desta tese foi investigar seu potencial de indução de alterações hemostáticas relacionadas à patogênese da sepse. Utilizando modelo de sepse em camundongos inoculados, por via intratraqueal, com suspensões de P. aeruginosa produtora de ExoU (PA103) ou de cepa com deleção do gene exoU, não produtora da toxina, foi mostrado que ExoU determinou maior gravidade da infecção, maior taxa de letalidade, leucopenia, trombocitose, hiperpermeabilidade vascular e transudação plasmática, evidenciadas, respectivamente, pela maior concentração de proteínas nos lavados broncoalveolares (LBAs) e acúmulo do corante Azul de Evans, previamente inoculado nos animais, por via endovenosa, no parênquima renal. ExoU favoreceu, também, a ativação plaquetária, confirmada pela maior concentração de plaquetas expressando P-selectina em sua superfície, maior número de micropartículas derivadas de plaquetas e maior concentração plasmática de tromboxano A2. A histopatologia dos pulmões e rins dos animais infectados com PA103 confirmou a formação de microtrombos, que não foram detectados nos animais controles ou infectados com a cepa mutante. Nos pulmões, a produção de ExoU determinou intensa resposta inflamatória com maior concentração de leucócitos totais e polimorfonucleados, interleucina-6 e fator de necrose tumoral-α nos LBAs. A análise imunohistoquímica mostrou intensa deposição de fibrina nos alvéolos e septos interalveolares. A atividade pró-coagulante dependente do fator tissular detectada nos LBAs dos camundongos infectados com PA103 foi independente da produção do inibidor da via de ativação do fator tissular (TFPI), mas associada ao aumento da produção do inibidor do ativador do plasminogênio-1 (PAI-1). Para investigar a participação do fator de ativação plaquetária (PAF) na liberação de PAI-1, foi pesquisada a atividade da enzima PAF-acetil-hidrolase (PAF-AH) nos LBAs dos camundongos. A atividade de PAF-AH apresentou-se significativamente elevada nos LBA dos camundongos infectados com PA103. O tratamento dos animais com um inibidor do PAF, antes da infecção, resultou na diminuição significativa das concentrações de PAI-1 e de leucócitos totais, bem como da atividade pró-coagulante dos LBAs. In vitro, ExoU induziu maior expressão do RNA mensageiro de PAI-1 e maior liberação da proteína PAI-1 nos sobrenadantes de células epiteliais respiratórias da linhagem A549. O tratamento das células A549 com um anticorpo anti-receptor de PAF, antes da infecção, reduziu significativamente a concentração de PAI-1 nos sobrenadantes de células infectadas com a cepa selvagem. Estes resultados demonstraram um novo mecanismo de virulência de P. aeruginosa através da atividade pró-trombótica de ExoU e a possibilidade de utilização da identificação de ExoU em isolados clínicos de pacientes graves como um marcador prognóstico para estes pacientes. / Pseudomonas aeruginosa is an important agent of pneumonia, mainly in patients undergoing mechanical ventilation, which can progress to sepsis with high mortality rates. In sepsis, the systemic inflammatory process favors exacerbated imbalance between the coagulation and fibrinolysis pathways and the installation of a procoagulant state, leading to microvascular thrombosis, disseminated intravascular coagulation and multiple organ failure. Knowing the powerful proinflammatory activity of the P. aeruginosa toxin ExoU, secondary to its phospholipase A2 activity, the goal of this study was to investigate the ExoU potential to induce hemostatic changes related to sepsis pathogenesis. By using a murine model of pneumosepsis, obtained by the intratracheal injection of suspensions of the ExoU-producing PA103 P. aeruginosa strain or of its isogenic mutant PA103ΔexoU, defective in the toxin synthesis, ExoU was shown to enhance the severity of the infection and to induce higher mice mortality rate as well as leukopenia, thrombocytosis, vascular hyperpermeability and plasma transudation, evidenced, respectively, by the higher protein concentration in the bronchoalveolar lavage fluids (BALF) and accumulation of Evans blue dye, previously intravenous injectioned, in mice renal parenchyma. ExoU also favored platelet activation, evidenced by the higher concentration of platelets expressing P-selectin on their surface, greater number of platelet-derived microparticles and increased plasma concentration of thromboxane A2. Histopathology of the lungs and kidneys of PA103-infected animals confirmed the formation of microthrombi, which were not detected in controls or in animals infected with the bacterial mutant. In lungs, ExoU induced an intense inflammatory response with high concentrations of total and polymorphonuclear leukocytes, interleukin-6 and tumor necrosis factor-α in mice BALF. Immunohistochemical analysis showed intense fibrin deposition in the alveoli and interalveolar septa. The tissue factor-dependent procoagulant activity detected in BALF from PA103-infected mice did not depend on decreased production of tissue factor pathway inhibitor (TFPI) production, but was associated with increased concentration of plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1). To investigate the role of platelet activating factor (PAF) in PAI-1 release, we compared the activity of the enzyme PAF-acetylhydrolase (PAF-AH) in BALF from control and infected mice, and we observed that PAF-AH activity was significantly elevated in BALF from PA103-infected animals. Mice treatment with a PAF inhibitor prior to infection resulted in a significant reduction of PAI-1 concentration, as well as of BALF total leukocytes and procoagulant activity. In vitro, ExoU induced higher expression of PAI-1 m RNA and increased release of PAI-1 protein in supernatants from A549 epithelial respiratory cell cultures. A549 cell treatment with an anti-PAF receptor prior to infection significantly reduced PAI-1 concentration in supernatants from cells infected with the wild type strain. These results show a novel mechanism by which a baterial product can favor a prothrombotic activity and ExoU production by infecting P. aeruginosa isolates may have prognostic implications for patients.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Hypertension is a multifactor clinical condition, which is accompanied by a low-grade inflammation and alterations in platelet function. These modifications may be related to an imbalance in the regulation of adenine nucleotides (ATP, ADP and AMP), adenosine and acetylcholine (ACh) levels. This regulation is performed by purinergic [NTPDases, ecto-5 - nucleotidase and adenosine deaminase (ADA)] and cholinergic [Acetylcholinesterase (AChE) and Butyrylcholinesterase (BuChE)] system enzymes, present in blood, respectively. These enzymes can be modulated by regular practice of physical exercise, which has been recommended for the treatment of hypertension. Thus, the aim of this study was to investigate the effect of six swimming training weeks on blood pressure, on purinergic and cholinergic systems enzymes activities in blood as well as on platelet aggregation and classic inflammatory markers in rats with hypertension induced by methyl Nω-nitro-L-arginine ester hydrochloride (L-NAME) administration. In order to better understand chronic changes, we also evaluated the effect of a single acute bout of exercise on the activity of the enzymes already mentioned. The animals were divided into four groups (n = 10): control, exercise, LNAME and exercise L-NAME. After 60 days of treatment, animals were euthanized and platelets, lymphocytes, whole blood and serum were used for experimental determinations. The results showed that swimming training was able to reduce blood pressure in hypertensive rats, and to prevent the increase in NTPDase, ecto-5'-nucleotidase and ADA activities in lymphocytes and platelets. This probably contributed in preventing platelet aggregation. Chronically, swimming was also effective in preventing the increase in AChE (in lymphocytes and whole blood) and BuChE (in serum) activities. Regarding to the expression of NPTDase1, exercise per se triggered a reduction in the expression of this enzyme, but had no significant effects in hypertensive rats. The prevention of the increase in cholesterol, triglycerides, C-reactive protein levels and myeloperoxidase activity generated by swimming practice reinforces the fact that exercise reduced inflammation in hypertensive rats. In response to a single acute bout of exercise, was observed an increase in the activity of cholinergic system enzymes in whole blood, lymphocytes and serum, and purinergic system enzymes in platelets. However, there was a decrease in the activity of NTPDase and ADA in lymphocytes. It can be concluded that this study allowed us to unveil, in part, the mechanisms related to the protective processes arising from regular physical exercise on hypertension related to inflammation and platelet aggregation. The results also reinforce the importance of measuring the purinergic and cholinergic systems enzymes as parameters of inflammatory response. Also, it is concluded that regular physical exercise has antithrombotic and anti-inflammatory effects by modulating the activity purinergic and cholinergic systems enzymes in hypertension. It is suggested that these responses have been derived from the adaptations that occur in the body due to each acute stimulus that promotes enough impact to break homeostasis and promote beneficial adaptations. Thus, moderate aerobic exercise has a key role in acting as an adjuvant in the treatment of hypertension. / A hipertensão é uma condição clínica multifatorial que, na maioria dos casos, está acompanhada de um quadro inflamatório de baixo grau e alterações nas funções plaquetárias. Essas modificações podem estar relacionadas a um desequilíbrio na regulação dos níveis de nucleotídeos de adenina (ADP, ADP e AMP), da adenosina e da molécula acetilcolinesterase (ACh), que é realizada pelas enzimas do sistemas purinérgico [NTPDases, ecto-5 -nucleotidase e adenosina desaminase (ADA)] e colinérgico [Acetilcolinesterase (AChE) e Butirilcolinesterase (BuChE)] presentes no sangue, respectivamente. A atividade dessas enzimas pode ser modulada pela prática regular de exercícios físicos, a qual tem sido recomendada para o tratamento da hipertensão. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi verificar o efeito de seis semanas de natação sobre a pressão arterial, a atividade de enzimas dos sistemas purinérgico e colinérgico em sangue, bem como sobre a agregação plaquetária e marcadores inflamatórios clássicos em ratos com hipertensão induzida através de administração de metila Nω-Nitro-L-arginina cloridrato de éster (L-NAME). Com o objetivo de melhor compreender as alterações crônicas, avaliouse, também, o efeito de uma única sessão aguda de exercício sobre a atividade das enzimas já mencionadas. Os animais foram divididos em quatro grupos (n = 10): Controle, Exercício, L-NAME e L-NAME Exercício. Após 60 dias de tratamento, os animais foram submetidos à eutanásia e as plaquetas, os linfócitos, o sangue total e o soro foram usados para as determinações experimentais. Os resultados obtidos mostraram que o treinamento com natação foi capaz de reduzir a pressão sanguínea em ratos hipertensos, além de prevenir o aumento da atividade das enzimas NTPDase, ecto-5 -nucleotidase e ADA em linfócitos e plaquetas, o que provavelmente contribuiu para prevenir a agregação plaquetária. Cronicamente, a natação também foi eficaz na prevenção do aumento da atividade das enzimas AChE em linfócitos e sangue total e BuChE em soro. Com relação à expressão da NPTDase1, o exercício per se gerou a redução da expressão desta enzima, mas não apresentou efeitos significativos nos ratos hipertensos. A prevenção do aumento dos níveis de colesterol, triglicerídeos, proteína C-reativa e mieloperoxidase gerada pela prática da natação reforça o fato de que o exercício reduziu a inflamação em ratos hipertensos. Como resposta a uma única sessão aguda de exercício, verificou-se o aumento da atividade das enzimas dos sistemas colinérgico em sangue total, linfócitos e soro e do sistema purinérgico em plaquetas. Entretanto, ocorreu a diminuição da atividade da NTPDase e da ADA em linfócitos. Pode-se concluir que este estudo permitiu desvendar em parte os mecanismos relacionados aos processos protetores advindos da prática regular de exercício físicos na hipertensão relativos aos processos inflamatórios e à agregação plaquetária. Os resultados ainda reforçam a importância da dosagem das enzimas dos sistemas purinérgico e colinérgico como parâmetros da resposta inflamatória. Conclui-se, também, que a prática regular de exercício físico possui efeitos antitrombóticos e antiinflamatórios através da modulação da atividade das enzimas dos sistemas purinérgico e colinérgico na hipertensão. Sugere-se que estas respostas tenham sido provenientes das adaptações ocorridas no organismo decorrentes de cada estímulo agudo, que gerou estímulos suficientes para quebrar a homeostase do organismo e promover adaptações benéficas. Desta forma, o exercício físico aeróbico moderado possui um papel fundamental na atuação como coadjuvante no tratamento da hipertensão.

Pseudomonas aeruginosa é um importante agente de pneumonia, particularmente em pacientes submetidos à ventilação mecânica, que pode evoluir para sepse, com elevadas taxas de letalidade. Na sepse, o processo inflamatório sistêmico exacerbado favorece o desequilíbrio entre as vias de coagulação e fibrinólise e a instalação de um estado pró-coagulante, com o aparecimento de trombose microvascular, coagulação intravascular disseminada e falência de múltiplos órgãos. Conhecendo a potente atividade pró-inflamatória da toxina ExoU produzida por P. aeruginosa, decorrente de sua atividade fosfolipásica A2, o objetivo desta tese foi investigar seu potencial de indução de alterações hemostáticas relacionadas à patogênese da sepse. Utilizando modelo de sepse em camundongos inoculados, por via intratraqueal, com suspensões de P. aeruginosa produtora de ExoU (PA103) ou de cepa com deleção do gene exoU, não produtora da toxina, foi mostrado que ExoU determinou maior gravidade da infecção, maior taxa de letalidade, leucopenia, trombocitose, hiperpermeabilidade vascular e transudação plasmática, evidenciadas, respectivamente, pela maior concentração de proteínas nos lavados broncoalveolares (LBAs) e acúmulo do corante Azul de Evans, previamente inoculado nos animais, por via endovenosa, no parênquima renal. ExoU favoreceu, também, a ativação plaquetária, confirmada pela maior concentração de plaquetas expressando P-selectina em sua superfície, maior número de micropartículas derivadas de plaquetas e maior concentração plasmática de tromboxano A2. A histopatologia dos pulmões e rins dos animais infectados com PA103 confirmou a formação de microtrombos, que não foram detectados nos animais controles ou infectados com a cepa mutante. Nos pulmões, a produção de ExoU determinou intensa resposta inflamatória com maior concentração de leucócitos totais e polimorfonucleados, interleucina-6 e fator de necrose tumoral-α nos LBAs. A análise imunohistoquímica mostrou intensa deposição de fibrina nos alvéolos e septos interalveolares. A atividade pró-coagulante dependente do fator tissular detectada nos LBAs dos camundongos infectados com PA103 foi independente da produção do inibidor da via de ativação do fator tissular (TFPI), mas associada ao aumento da produção do inibidor do ativador do plasminogênio-1 (PAI-1). Para investigar a participação do fator de ativação plaquetária (PAF) na liberação de PAI-1, foi pesquisada a atividade da enzima PAF-acetil-hidrolase (PAF-AH) nos LBAs dos camundongos. A atividade de PAF-AH apresentou-se significativamente elevada nos LBA dos camundongos infectados com PA103. O tratamento dos animais com um inibidor do PAF, antes da infecção, resultou na diminuição significativa das concentrações de PAI-1 e de leucócitos totais, bem como da atividade pró-coagulante dos LBAs. In vitro, ExoU induziu maior expressão do RNA mensageiro de PAI-1 e maior liberação da proteína PAI-1 nos sobrenadantes de células epiteliais respiratórias da linhagem A549. O tratamento das células A549 com um anticorpo anti-receptor de PAF, antes da infecção, reduziu significativamente a concentração de PAI-1 nos sobrenadantes de células infectadas com a cepa selvagem. Estes resultados demonstraram um novo mecanismo de virulência de P. aeruginosa através da atividade pró-trombótica de ExoU e a possibilidade de utilização da identificação de ExoU em isolados clínicos de pacientes graves como um marcador prognóstico para estes pacientes. / Pseudomonas aeruginosa is an important agent of pneumonia, mainly in patients undergoing mechanical ventilation, which can progress to sepsis with high mortality rates. In sepsis, the systemic inflammatory process favors exacerbated imbalance between the coagulation and fibrinolysis pathways and the installation of a procoagulant state, leading to microvascular thrombosis, disseminated intravascular coagulation and multiple organ failure. Knowing the powerful proinflammatory activity of the P. aeruginosa toxin ExoU, secondary to its phospholipase A2 activity, the goal of this study was to investigate the ExoU potential to induce hemostatic changes related to sepsis pathogenesis. By using a murine model of pneumosepsis, obtained by the intratracheal injection of suspensions of the ExoU-producing PA103 P. aeruginosa strain or of its isogenic mutant PA103ΔexoU, defective in the toxin synthesis, ExoU was shown to enhance the severity of the infection and to induce higher mice mortality rate as well as leukopenia, thrombocytosis, vascular hyperpermeability and plasma transudation, evidenced, respectively, by the higher protein concentration in the bronchoalveolar lavage fluids (BALF) and accumulation of Evans blue dye, previously intravenous injectioned, in mice renal parenchyma. ExoU also favored platelet activation, evidenced by the higher concentration of platelets expressing P-selectin on their surface, greater number of platelet-derived microparticles and increased plasma concentration of thromboxane A2. Histopathology of the lungs and kidneys of PA103-infected animals confirmed the formation of microthrombi, which were not detected in controls or in animals infected with the bacterial mutant. In lungs, ExoU induced an intense inflammatory response with high concentrations of total and polymorphonuclear leukocytes, interleukin-6 and tumor necrosis factor-α in mice BALF. Immunohistochemical analysis showed intense fibrin deposition in the alveoli and interalveolar septa. The tissue factor-dependent procoagulant activity detected in BALF from PA103-infected mice did not depend on decreased production of tissue factor pathway inhibitor (TFPI) production, but was associated with increased concentration of plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1). To investigate the role of platelet activating factor (PAF) in PAI-1 release, we compared the activity of the enzyme PAF-acetylhydrolase (PAF-AH) in BALF from control and infected mice, and we observed that PAF-AH activity was significantly elevated in BALF from PA103-infected animals. Mice treatment with a PAF inhibitor prior to infection resulted in a significant reduction of PAI-1 concentration, as well as of BALF total leukocytes and procoagulant activity. In vitro, ExoU induced higher expression of PAI-1 m RNA and increased release of PAI-1 protein in supernatants from A549 epithelial respiratory cell cultures. A549 cell treatment with an anti-PAF receptor prior to infection significantly reduced PAI-1 concentration in supernatants from cells infected with the wild type strain. These results show a novel mechanism by which a baterial product can favor a prothrombotic activity and ExoU production by infecting P. aeruginosa isolates may have prognostic implications for patients.

As fosfolipases A2 (PLA2s) catalisam a hidrólise de ácidos graxos na posição sn-2 das membranas fosfolipídicas e liberam, como subprodutos, ácidos graxos livres. As PLA2s do grupo IIA são encontradas em peçonhas de serpentes da família Viperidae e desempenham diversas atividades apresentando potencial miotóxico, neurotóxico, hemolítico, edematogênico, citotóxico, hipotensivo, anticoagulante, inibição/ativação da agregação plaquetária, bactericida e pró-inflamatório. Esse trabalho teve como objetivo o isolamento e a caracterização funcional de uma PLA2 isolada da peçonha de Bothrops jararaca. Para a purificação dessa proteína, denominada BJ-PLA2-I, foram necessários três passos cromatográficos consecutivos: cromatografia de exclusão molecular em Sephacryl S-200, cromatografia de troca iônica em Source TM 15Q/50mL e cromatografia de troca iônica em MonoQ TM 5/50 GL. A BJ-PLA2-I apresentou elevado grau de pureza por SDS-PAGE e por cromatografia de fase reversa C18, em HPLC. Apresentou ainda, características ácidas, com pI em torno de 4,4 e teve a sua massa molecular determinada por dois métodos, obtendo-se valores bem próximos de 14,8 kDa (SDS-PAGE) e 14,2 kDa (MALDI-TOF). Esse fato é comum considerando que a espectrometria de massas é um método mais preciso e determina de maneira mais exata a massa molecular. O sequenciamento N-terminal da BJ-PLA2-I resultou em 60 resíduos de aminoácidos. O alinhamento múltiplo com outras fosfolipases A2 de serpentes do mesmo gênero mostrou similaridade entre elas, mostrando identidade de 100% com a BJ-PLA2, fosfolipase A2 Asp-49, também isolada da Bothrops jararaca. Esse dado levanta a hipótese de que a BJ-PLA2-I purificada neste trabalho e a BJ-PLA2 se tratam da mesma proteína, entretanto essa hipótese só poderá ser confirmada quando a sequência completa da BJ-PLA2-I for obtida. Outros dados encontrados neste trabalho reforçam essa hipótese, isso porque, avaliando a atividade fosfolipásica, o efeito sobre as plaquetas e o pI, tanto a BJ-PLA2-I quanto a BJ-PLA2 apresentaram características semelhantes. A BJ-PLA2-I, sendo uma Asp-49, mostrou alta atividade catalítica e efeito inibidor da agregação plaquetária induzida por ADP (20,5 ?g/mL inibiu 50 % da agregação plaquetária). Ela também foi capaz de induzir a migração leucocitária após a administração de diferentes concentrações (5, 10 e 20 ?g/mL) da BJ-PLA2-I. Esse dado também foi encontrado no ensaio em que a concentração de 10 ?g/mL foi fixada e variou-se o tempo de 2, 4 e 24 horas, observando-se principalmente a migração de neutrófilos. Além disso, verificou-se a liberação das citocinas IL-6 e IL-1?, de proteínas totais e de prostaglandina E2 na reação inflamatória induzida pela BJ-PLA2-I. No entanto, não foi observado a produção de TNF-?, IL-10 e leucotrieno B4. A BJ-PLA2-I caracterizou-se como uma PLA2 pró-inflamatória, produzindo inflamação local aguda. A BJ-PLA2-I foi avaliada quanto ao seu potencial antitumoral em três linhagens celulares distintas (PBMC, HL-60 e HepG2). Observou-se que a enzima em questão possui baixo potencial antitumoral para a linhagem HL-60, reduzindo o número de células tumorais em apenas cerca de 20% nas concentrações testadas. Verificou-se pequena alteração na viabilidade celular das células de PMBC, nas maiores concentrações testadas (160 e 80 ?g/mL) e, na linhagem HepG2 não foi encontrada nenhuma alteração. Concluindo, as informações adquiridas neste trabalho são de suma importância para a melhor compreensão dos mecanismos envolvidos nas atividades biológicas desempenhadas pelas PLA2s. Além disso, a BJ-PLA2-I pode servir como modelo molecular para a formulação de fármacos mais eficazes a serem utilizados no tratamento de várias doenças. / Phospholipases A2 (PLA2s) catalyze the hydrolysis of fatty acids in the sn-2 position of membrane phospholipids, releasing free fatty acids as by-products. PLA2s of group IIA are found in snake venoms of the Viperidae family and perform various activities, including myotoxic, neurotoxic, hemolytic, edematogenic, cytotoxic, hypotensive, anticoagulant, inhibition/activation of platelet aggregation, bactericidal and proinflammatory effects. This work aimed at the isolation and functional characterization of a PLA2 isolated from Bothrops jararaca venom. For the purification of this protein, called BJ-PLA2-I, three consecutive chromatographic steps were used (size exclusion chromatography on Sephacryl S-200, ion exchange chromatography on Source 15Q/50 mL, ion exchange chromatography on MonoQ 5/50 GL). Confirmation of the purity of BJ-PLA2-I was evaluated by SDS-PAGE and reverse phase HPLC using a C18 column. BJ-PLA2-I has acidic characteristics, with pI around 4.4, and its molecular mass was determined by two methods, obtaining values close to 14.8 kDa (SDS-PAGE) and 14.2 kDa (MALDI-TOF). The N-terminal sequencing of BJ-PLA2-I resulted in 60 amino acid residues. Multiple alignment with other phospholipases A2 of snakes of the same genus showed high similarity between them, showing 100% identity with BJ-PLA2, an Asp-49 phospholipase A2 previously isolated from Bothrops jararaca venom. This finding raises the possibility that the PLA2 purified in this work is the same protein previously described (BJ-PLA2), however, this assumption can only be confirmed when the complete sequence of BJ-PLA2-I is obtained. Other data obtained in this study support this hypothesis, considering that the phospholipase activity, the effect on platelets and pI of both BJ-PLA2-I and BJ-PLA2 showed to be similar. BJ-PLA2-I, being an Asp-49 PLA2, showed high catalytic activity and inhibitory effect on the platelet aggregation induced by ADP (20.5 ?g/mL inhibited 50% of the platelet aggregation). It was also able to induce leukocyte migration after the administration of different concentrations (5, 10 and 20 ?g/mL) of BJ-PLA2-I. This fact was also found when the concentration of 10 ?g/mL was fixed and response times were varied (2, 4 and 24 hours), observing especially neutrophil migration. Furthermore, there was a release of IL-6 and IL-1?, total proteins and prostaglandin E2 in the inflammatory reaction induced by BJ-PLA2-I, however, the production of TNF-?, IL-10 and leukotriene B4 was not observed. BJ-PLA2-I was characterized as a proinflammatory PLA2 producing acute local inflammation. BJ-PLA2-I was evaluated for its antitumor potential on three different cell lines (PBMC, HL-60 and HepG2). It was observed that this enzyme showed a low antitumor potential on HL-60 tumor cell line, reducing the number of tumor cells in only about 20% at the concentrations tested. There was little change in cell viability of PBMC cells in the higher concentrations tested (80 and 160 ?g/mL), but no change was found on HepG2 tumor cell line. In conclusion, the information obtained in this work are of utmost importance for better understanding the mechanisms involved in the biological activities induced by PLA2s. Furthermore, BJ-PLA2-I may serve as a molecular model for the formulation of more effective drugs to be used in the treatment of various diseases.

Distúrbios de hemostasia são uma das principais manifestações clínicas observadas nos acidentes por serpentes do gênero Bothrops. Tendo em vista a importância da ativação de fatores da cascata de coagulação no desenvolvimento da patologia no envenenamento, o presente trabalho descreve o isolamento e a caracterização bioquímica e funcional de uma metaloprotease capaz de induzir a ativação de fatores de coagulação, a partir da peçonha de Bothrops moojeni. A metaloprotease foi isolada por três etapas cromatográficas utilizando colunas de exclusão molecular (Sephacryl S-200), interação hidrofóbica (Phenyl Sepharose) e troca aniônica (ES 502N). A protease isolada, denominada moojenactivase, é uma glicoproteína com massa molecular de aproximadamente 89 kDa e ponto isoelétrico de 4,92, sendo composta por três cadeias com massas de 66; 17 e 14 kDa, ligadas por pontes dissulfeto. A determinação da sequência de aminoácidos por espectrometria de massas evidenciou grande identidade sequencial com outras metaloproteases, indicando a presença dos domínios metaloprotease, desintegrina-like e lectinas-like e classificando-a como uma protease da classe PIIId. Funcionalmente, a moojenactivase foi capaz de induzir a cogulação de plasma humano pela ativação dos fatores II (protrombina) e X da cascata de coagulação, gerando -trombina e fator X ativado, respectivamente. A protease apresentou atividade fibrinogenolítica, especialmente sobre a cadeia da molécula de fibrinogênio, porém não foi capaz de induzir a formação do coágulo de fibrina pela ativação deste. A moojenactivase foi parcialmente inibida quando incubada em condições de pH entre 3,5 e 5,0 e em pH 9,0, além de temperaturas acima de 60ºC, bem como na presença de ions Cu2+, além dos inibidores EDTA, SDS, DTT e soro anti-ofídico crotalico/botrópico. A protease induziu agregação plaquetária e não apresentou atividades fibrinolítica e hemorrágica. Células mononucleares de sangue periférico (PBMC) tratadas com a protease foram capazes de produzir TNF- assim como expressar fator tecidual (Fator III da coagulação) na forma ativa, fazendo com que essas células apresentassem caráter procoagulante. Com o objetivo avaliar os efeitos nos parâmetros hematológicos in vivo, a moojenactivase foi administrada em ratos (3g/Kg) onde foi observado que a protease foi capaz de prolongar o tempo de sangramento dos animais e induzir a diminuição do número de plaquetas sanguíneas, caracterizando um quadro de trombocitopenia. Ainda, o plasma dos animais administrados com a moojenactivase apresentaram valores elevados do tempo de protrombina e tempo de tromboplastina parcialmente ativada, assim como redução na concentração de fibrinogênio. Na análise dos parâmetros da série branca, foi observado aumento leucocitário na circulação, com predominância de neutrófilos até 3h após a administração, indicando a instalação de um quadro inflamatório. Com relação à análise da série vermelha, a moojenactivase não foi capaz de alterar nenhum dos parâmetros estudados. Os resultados obtidos no presente trabalho mostram, pela primeira vez, o isolamento de uma metaloprotease da classe P-IIId da peçonha de Bothrops moojeni capaz de atuar sobre diferentes ii eventos do processo hemostático, sendo essa ação prócoagulante responsável pelo quadro de incoagulabilidade sanguínea em animais. Os dados gerados podem auxiliar no entendimento dos distúrbios de coagulação em pacientes envolvidos em acidentes por serpentes da espécie Bothrops moojeni, levando ao melhor direcionamento na terapia anti-ofídica. Ainda, a função da moojenactivase sobre componentes biológicos credencia a molécula para uma possível aplicação biotecnológica em processos que envolvem o sistema hemostático. / Haemostasis disorders are a major clinical manifestation induced by Bothrops snake envenomations. Considering the relevance of the activation of coagulation factors during the envenomation pathophysiology, the present work describes, for the first time, the isolation and functional and biochemical characterization of a coagulation factor activator metalloprotease from Bothrops moojeni snake venom. The protease was purified by three chromatographic procedures using size exclusion (Sephacryl S-200), hydrophobic interaction (Phenyl Sepharose) and anion exchange (ES 502N) chromatographies. The isolated protease, named moojenactivase, is a glycoprotein with molecular mass of approximately 89 kDa by SDS-PAGE, and composed of 66 kDa, 17 kDa and 14 kDa disulfide linked chains, with pI of 4,92. The amino acid sequence determination of tryptic peptides from moojenactivase by mass spectrometry presented fragments with high identity to snake venom metalloproteases, confirming the presence of the metalloprotease, disintegrin-like and lectin-like domains, which allowed its classification as a PIIId class snake venom metalloprotease. Regarding its functional properties, the protease was capable to induce human plasma coagulation by inducing activation of coagulation factors II and X, forming-thrombin and factor X activated, respectively. Also, moojenactivase presented fibrinogenolitic activity, by cleaving preferentially -chain of fibrinogen, however was not capable to induce the formation of fibrin clot from fibrinogen. The enzyme stability was assessed and showed that moojenactivase presented a reduced functional activity when preincubated in pH values ranging from 3,5 to 5,0 and at pH 9,0, and in temperature conditions over 60ºC. Cu2+ ions and inhibitors such as EDTA, SDS, DTT and crotalic/bothropic antiophidian serum reduced the protease activity. Moojenactivase induced platelet aggregation, but no fibrinolytic and haemorrhage activities. In order to evaluate the stimulation of peripheral blood mononuclear cells (PBMC), cells were treated with the protease and we observed the release of proinflammatory cytokine TNF- and expression of active Tissue Factor (coagulant factor III), inducing a procoagulant state on PBMC. In order to evaluate in vivo haematological effects, the protease (3 g/Kg) was administered in rat (i.v.) and was observed that moojenactivase induced a prolonged bleeding time and reduced platelet counting (indicating a thrombocytopenia state). Moreover, the evaluation of the hemostasis parameters was assessed by the the prothrombin time and activated partial thromboplastin time assays and showed a prolonged clot time on both tests, and also a decrease in fibrinogen plasma levels. The leukogram analysis showed an increase in the circulating leukocyte number up to 3 hours after moojenactivase administration, composed predominantly of neutrophils. However, parameters envolving red cells shows that the protease do not affect. The results obtained in the present work show, for the first time, the isolation of a PIIId class metalloprotease from Bothrops moojeni snake venom involved on the activation of several hemostatic events, inducing a pro coagulant activity and leading to blood unclottable state in experimental animals. These data can assit in understanding coagulation disturbs in iv patients involved in Bothrops moojeni envenomation and leading to a better anti ophidic therapy guidance. Moreover, moojenactivase functional activities accredits this protease as a possible molecular instrument applied on biotechnological prospect related to the hemostasis.

O uso do ácido acetilsalicílico, universalmente aceito na prevenção e tratamento da doença aterosclerótica, pode resultar em respostas terapêuticas variáveis classificando os pacientes em respondedores (normais) ou baixo respondedores (resistentes). A dose de 100mg/dia pode inibir de forma insuficiente a agregação plaquetária. Por isso, doses maiores têm sido utilizadas ou, eventualmente, associadas a outros antiplaquetários visando à redução do número de baixo respondedores. O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos do ácido acetilsalicílico na redução da agregação plaquetária in vitro. Para tal, 152 indivíduos de ambos os sexos, não aparentados, de qualquer etnia, sem limite de faixa etária, portadores de doença arterial coronária crônica, atendidos no Ambulatório de Coronariopatias do Instituto Dante Pazzanese de Cardiologia, foram incluídos no estudo. Na primeira consulta, todos foram submetidos à anamnese e exame clínico completo e estavam em uso prévio de ácido acetilsalicílico 100mg/dia, por um período superior a 30 dias. Os pacientes selecionados foram divididos em dois grupos: grupo AAS 200, composto por aqueles que foram tratados com ácido acetilsalicílico na dose de 200mg/dia e grupo Ômega 3 composto por aqueles tratados com ácido acetilsalicílico 100mg/dia em associação a ácido graxo ômega 3 na dose de 1.000mg/dia. A agregação plaquetária foi mensurada, in vitro, pelo agregômetro Multiplate, na primeira e segunda consulta. Adicionalmente, amostras de sangue foram obtidas para análise bioquímica e identificação dos polimorfismos nos genes COX-1 (rs 384787; rs 3842798) relacionado com a atividade do ácido acetilsalicílico e ITGB 3 relacionado com a codificação da glicoproteína IIIa (GPIIIa-rs 5918), subunidade do receptor de fibrogênio. Análise da função plaquetária (Aspitest) foi realizada em ambos os grupos. Os valores de corte para o Aspitest, relativo à medida de inibição da ciclooxigenase 1 pelo ácido acetilsalicílico, foram: <= 30 AUC para os muito bons respondedores, > 30 e 40 AUC para os não respondedores. Para a dosagem plasmática de tromboxane, utilizou-se o kit Elisa e, para sua qualificação, a espectrofotometria. Para o DNA genômico, extraído do sangue total periférico, utilizou-se o sistema automatizado QIA cube seguido pela amplificação, pela PCR, da região do DNA que continha o polimorfismo. Os dados foram analisados pelo software SPSS-20 e o nível de significância adotado de 5% (p < 0,05). O teste paramétrico t Student foi utilizado para os dados com distribuição normal (teste Kolmogorov-Smirnov) e os testes não paramétricos Mann-Whitney ou Wilcoxon para os demais dados. A frequência das variáveis qualitativas foi determinada pelo teste do qui-quadrado. A redução dos níveis séricos de VLDL e triglicérides foram semelhantes nos dois grupos e a redução do número de monócidos foi estatisticamente maior no grupo ômega 3. Dos 152 pacientes incluídos no estudo, 38 (25,2%) não eram respondedores ao tratamento prévio com o ácido acetilsalicílico, na posologia de 100mg/dia. A frequência genotípica e alélica dos polimorfismos e a presença do alelo raro foram semelhantes nos grupos respondedor e não respondedor ao ácido acetilsalicílico. A função plaquetária e a produção de tromboxane foram semelhantes nos grupos AAS 200 e Ômega 3. A redução do Aspitest foi observada apenas no grupo não respondedor. A presença do alelo raro do polimorfismo rs 3842787 (gene PTGS1) associou-se à pior resposta do Aspitest e o alelo raro do polimorfismo rs 5918 (gene ITGB3) associou-se à pior resposta à concentração de tromboxane, após 30 dias de tratamento. Em conclusão, 1) os resultados desse estudo mostraram que a associação do ácido acetilsalicílico na dose de 100mg/dia e ômega3 na dose de 1.000mg/dia não reduziu a agregação plaquetária in vitro; 2) os pacientes não respondedores que fizeram uso de ácido acetilsalicílico na dose de 200mg/dia, após 30 dias, tiveram redução no Aspitest e passaram a ser considerados respondedores; 3) A presença dos alelos rs 384787 (COX1-PTGS1) foi responsável pela pior resposta ao Aspitest e a do alelo rs 5918 pela pior resposta ao tromboxane B2. A farmacogenética abre novas perspectivas para o tratamento clínico personalizado da antiagregação plaquetária. / The use of acetylsalicylic acid for the prevention and treatment of atherosclerotic disease may result in different therapeutic responses. Based on that, patients are classified in responders (normal) or low responders (resistant). In clinical practice, the use of 100mg/daily of acetylsalicylic acid may be insufficient for platelet aggregation inhibition, therefore either higher doses or combination with other antiplatelet agents have been used in order to reduce the rates of low responders. The aim of the present study was to evaluate the effects of acetylsalicylic acid in reducing platelet aggregation in vitro. One hundred, fifty-two subjects of both genders, unrelated, of any ethnicity, at any age, and with diagnosis of chronic coronary artery disease followed at the Coronary Artery Disease Section of Dante Pazzanese Institute of Cardiology were included in the study. All patients underwent anamnesis and clinical examination at first consultation. All subjects were on aspirin use (100mg/daily) for at least 30 days before inclusion. Patients were divided into two groups: group ASA, composed by those treated with 200mg of acetylsalicylic acid only and group Omega 3, composed by those treated with 100mg of acetylsalicylic acid in addition to 1.000 mg of omega 3 fatty acid. Platelet aggregation was measured by Multiplate aggregometer at first and second visits. In each visit, blood samples were obtained for biochemical analysis and identification of gene polymorphisms of COX-1 (RS 384 787; rs 3842798) related to the activity of acetylsalicylic acid and of 3 ITGB related glycoprotein IIIa (GPIIIa RS-5918) coding. Platelet function was also analyzed. Cut-off values for Aspitest related to inhibition of cyclooxygenase 1 by acetylsalicylic acid were <= 30 AUC for very good responders, > 30 <= 40 AUC for good responders, and > 40 AUC for non-responders. Elisa test was used for thromboxane plasmatic dosage assessment whereas spectrophotometry was used for its quality evaluation. For genomic DNA extracted from peripheral whole blood, we used QIA cube automated system followed by the amplification by PCR of the region of DNA containing the polymorphism. Data was analyzed by SPSS-20 software. P values < 0.05 were considered statistically significant. Parametric Student t test was used for data with normal distribution (Kolmogorov-Smirnov test) and non-parametric Mann-Whitney or Wilcoxon for other data. The frequency of qualitative variables was analyzed using chi-square test. There was a reduction of VLDL and triglycerides serum levels in both groups, however, the reduction of monocytes was statistically higher in Omega 3 group. Out of 152 patients included in the study, 38 (25.2%) were non responders to prior treatment with acetylsalicylic acid (100mg/daily). Genotypic and allelic polymorphism frequencies and the presence of the rare allele were similar in the responder and non-responder groups. Platelet function and thromboxane production were similar between groups ASA and Ômega 3. Aspitest reduction was observed only in the non-responder group. The presence of rare allele of rs 3842787 polymorphism (PTGS1 gene) was associated with worse response to Aspitest whereas the presence of rare allele of rs 5918 polymorphism (ITGB3 gene) was associated with poor response to thromboxane concentration. In conclusion, 1) the combination of aspirin 100mg/daily and omega 3 1.000 mg/daily did not reduce platelet aggregation in vitro; 2) Non-responders who received aspirin 200mg/daily presented reduction in the Aspitest and were considered responsive after 30 days of treatment; 3) The presence of the alleles rs 384,787 (COX1-PTGS1) was associated with worse response to Aspitest and the presence of the allele rs 5918 was associated with worst response to thromboxane B2. More data is needed to confirm our results. The pharmacogenetics will be an important tool for clinicians in order to customize specific treatment for each patient in platelet aggregation.

Neste trabalho visamos otimizar o isolamento da BnP1, uma SVMP presente no veneno de B. neuwiedi, e isolar disintegrinas desse veneno, ambas originadas de precursores tipo P-II, analisando as seqüências de cDNA e a ação sobre plaquetas. A purificação da BnP1 foi por exclusão molecular e troca iônica; duas novas disintegrinas, D2 e D4, foram isoladas por cromatografia em fase reversa; e outra disintegrina, MS, foi caracterizada a partir do SDS-PAGE. As proteínas foram parcialmente seqüenciadas por espectrometria de massas. Diferentes cDNAs foram clonados a partir da glândula de veneno de B. neuwiedi e os precursores da BnP1 e MS se localizaram em um cluster que inclui SVMPs classe P-I e P-II. O precursor de D4 correspondeu a uma SVMP tipicamente P-II. A BnP1, ao contrário das disintegrinas, não inibiu a agregação plaquetária induzida por diferentes agonistas. Este trabalho indica ainda que a biossíntese de SVMPs da classe P-II pode envolver processamento de mRNA, um novo mecanismo de geração de diversidade das SVMPs. / The aim of this study was to optimize the isolation of BnP1, a SVMP from B. neuwiedi venom, and isolate new disintegrins from this venom, both originated from P-II class precursors, and analyze the sequence of their precursors and their action on platelets. BnP1 was isolated by size exclusion and anion-exchange chromatography; the disintegrins D2 and D4 by reverse-phase chromatography and MS was isolated from SDS-PAGE. These proteins were partially sequenced by mass spectrometry. Several SVMPs cDNAs were cloned from B. neuwiedi venom gland, and BnP1 and MS precursors localized in a cluster enclosing P-I and P-II SVMPs. MS cDNA was tipical of P-II class of SVMPs. BnP1, unlike the disintegrins, was not able to inhibit platelet aggregation induced by different agonists. This work suggested that the biosynthesis of class P-II SVMPs include mRNA processing as a further step to generate venom diversity.

As doenças cardiovasculares (DCV) são responsáveis pela maioria das mortes ocorridas em todo o mundo. Os riscos para o desenvolvimento destas patologias podem ser amenizados, em parte, por meio de uma dieta rica em alimentos de origem vegetal. Neste sentido, os frutos nativos brasileiros, como os pertencentes à família Myrtaceae, podem contribuir para melhorar a qualidade da alimentação, pois apresentam altos teores de compostos bioativos, entre eles, os fenólicos (CBF). Pouco se sabe sobre os efeitos dos polifenóis destes frutos para redução do risco de desenvolvimento das DCV. Sendo assim, este trabalho buscou avaliar a bioacessibilidade dos CBF presentes em polpas de cambuci e jabuticaba e seus efeitos in vitro sobre mecanismos de ação relacionados às DCV. Para tanto, extratos ricos em polifenóis foram obtidos a partir de extrações em fase sólida (C18 e PA) das polpas de ambos os frutos, submetidas ou não à simulação da digestão gastrointestinal. Estes extratos tiveram seus efeitos inibitórios sobre a atividade da Enzima Conversora de Angiotensina I (ECA) e a agregação plaquetária induzida por adenosina difosfato avaliados in vitro. De acordo com os resultados obtidos, a digestão in vitro foi capaz de liberar os CBF da matriz alimentar. Tal bioacessibilidade parece ter sido importante apenas para a inibição da agregação plaquetária, uma vez que a capacidade inibitória destes compostos sobre a atividade da ECA não melhorou depois da digestão in vitro. Quanto aos resultados obtidos pelos extratos provenientes das colunas PA e C18, observa-se que as maiores concentrações de taninos nestes últimos não foram suficientes para melhorar a capacidade antiagregante, mas foram importantes para aumentar a inibição da atividade da ECA. Comparando-se as respostas apresentadas pelos dois frutos, os CBF presentes no cambuci exibiram, predominantemente, potenciais anti-hipertensivo e antiagregantedo maiores do que os da jabuticaba. Neste contexto, o consumo de cambuci e jabuticaba, bem como a utilização de seus polifenóis purificados, podem ser adjuvantes para a redução dos riscos relacionados ao desenvolvimento das DCV. / The cardiovascular diseases (CVD) are the leading cause of death worldwide. The risk of development of these disorders can be reduced, partially, by a vegetal-based diet. In this way, the Brazilian native fruits from Myrtaceae family may contribute to improve the diet quality, once they have high quantity of bioactive compounds, such as the phenolic (PC). The knowledge about the cardioprotective effects of consuming these fruit polyphenols is limited, so this study aimed to evaluate the bioaccessibility of the cambuci and jaboticaba PC and their in vitro potential on CVD-related mechanisms. First, gastrointestinal digestion simulation of each fruit pulp was done, and then the polyphenols rich extracts were obtained by solid phase extractions, before and after the pulps digestion. The polyphenols rich extracts had their phenolic concentrations determined and were used to evaluate the capacity of PC in inhibit the Angiotensin Converting Enzyme (ACE) activity and the platelet aggregation induced by ADP. The results were expressed as IC50, considering the total phenolic content per milliliter of reaction. According to the results, the in vitro digestion process was able to release the polyphenols from the food matrix. Therefore, the bioaccessibility had no significant effect on ACE activity, but decreased the IC50 values of platelet aggregation. In relation to the extracts from PA and C18 columns, the higher tannin concentration In comparison to the IC50 values presented by PA extracts, the higher concentrations of tannins in the last one were not enough to improve the antiaggregant effect, but were important to increase the inhibition of ACE activity. Cambuci polyphenols presented higher antihypertensive and antiaggregant potentials than the jaboticaba compounds. In this respect, the ingestion of cambuci and jaboticaba and the use of their purified polyphenols can be of particular importance in reducing the risk for the CVD development.

Introdução: O antecedente de AVCI e/ou AIT está presente em 5% dos pacientes com coronariopatia aguda e em até 17% dos pacientes com coronariopatia crônica. Esta população apresenta elevado risco para eventos cardiovasculares, assim como para desfechos hemorrágicos maiores (principalmente quando em uso de tratamento antitrombótico). A agregabilidade plaquetária apresenta papel fundamental no balanço isquêmico/hemorrágico; entretanto, esse mecanismo é pouco estudado em pacientes com evento cérebro vascular isquêmico prévio. O principal objetivo desse estudo é avaliar se pacientes com DAC e AVCI/ AIT prévio exibem alterações na agregabilidade plaquetária que justifiquem o risco aumentado para sangramento nesses indivíduos. Casuística e Métodos: Entre janeiro de 2013 e abril de 2015, 140 pacientes foram selecionados nos bancos de dados da unidade coronária e do serviço de cirurgia cardíaca do InCor- HCFMUSP. Critérios de inclusão: coronariopatia aguda prévia (há mais de 12 meses), antecedente de AVCI/AIT (anterior ao episódio de coronariopatia aguda), uso crônico de AAS e assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. Critérios de exclusão: AVCH prévio, uso de antiagregação plaquetária dupla ou anti-inflamatórios não esteroidais, trombofilia ou coagulopatia conhecida, trombocitopenia ou trombocitose, angioplastia ou cirurgia cardíaca nos últimos 6 meses, disfunção renal grave ou qualquer doença terminal. Desenho do estudo: Estudo de caso e controle (1:1), com os grupos caso (AVCI/AIT prévio) e controle (sem AVCI/AIT prévio) pareados por sexo, idade, tipo de coronariopatia aguda e tempo entre a coronariopatia aguda e a inclusão no estudo. A agregabilidade plaquetária foi mensurada pelo VerifyNow Aspirin®, VerifyNow P2Y12®, Agregometria óptica com agonista ADP, Agregometria óptica com agonista adrenalina e tromboelastrografia (Reorox®). Resultados: Os grupos controle (n=70) e caso (n=70), estavam bem pareados em relação à maioria das variáveis analisadas. A idade média da população global foi de 66 anos, 73% apresentavam IAM prévio, e o tempo médio entre o episódio de coronariopatia aguda e a inclusão no presente estudo foi de 5,31 anos. No momento da avaliação os pacientes do grupo caso apresentavam valores mais elevados de pressão arterial sistólica (135,84 ± 16,09 vs 123,68 ± 16,11mmHg, p < 0,001), embora esse grupo utilizasse maior número de antihipertensivos (2,37 ± 1,09 vs 3,0 ± 1,23, p=0,006). Em relação a variáveis metabólicas, o perfil lipídico não presentou diferença significativa entre os grupos, entretanto o grupo caso apresentou maiores valores de creatinina (1,24 ± 0,35 vs 1,11 ± 0,27 mg/dL, p=0,037) e também de glicemia de jejum (116,16 ± 32,03 vs 134,88 ± 57,58 mg/dL, p=0,031). No que se refere à meta principal do estudo, a agregabilidade plaquetária foi similar nos dois grupos por todos os métodos utilizados: VerifyNow Aspirin® (525,00 ± 79,78 vs 530,35 ± 83,81 ARU nos grupos caso e controle, respectivamente, p=0,7), VerifyNow P2Y12® (262,14 ± 43,03 vs 251,74 ± 43,72 PRU, p=0,21), Agregometria óptica com agonista ADP (78,34 ± 9,02 vs 77,55 ± 9,70%, p=0,82), Agregometria óptica com agonista adrenalina (49,01± 23,93% vs 49,34 ± 21,7, p=0,77), e tromboelastografia (Firmeza máxima do coágulo: 2,136,00 ± 569,97 vs 2.001,27 ± 635,68 Pa, p=0,19). Conclusão: Em pacientes com doença arterial coronária crônica a agregabilidade plaquetária foi similar nos indivíduos com ou sem AVCI/AIT. Esses resultados apontam para que outros mecanismos sejam responsáveis pelo elevado risco hemorrágico dessa população / Background: Ischemic stroke (IS) or transient ischemic attack (TIA) history is present in 5% of patients with acute coronary syndrome (ACS) and in 17% of patients with stable atherosclerotic disease (CAD). This population has a higher risk for major cardiovascular events and an increased incidence of major hemorrhagic outcomes when subjected to modern antithrombotic regimens, Platelet aggregability have key role in \"ischemic-hemorrhagic\" balance, however, these factors are little known in the population with prior cerebrovascular event. The aim of this study is to evaluate whether patients with coronary artery disease and previous IS/ TIA exhibit alterations in platelet aggregation, justifying the increased bleeding risk of these individuals. Methods: Between January 2013 and April 2015, 140 participants were selected in the coronary care unit and cardiac surgery service databank. Inclusion criteria: prior ACS (over 12 months), history of IS/ TIA previous to ACS, chronic use of aspirin since ACS and agreement to the consent form. Exclusion criteria: prior hemorrhagic stroke, current dual antiplatelet therapy or anti-inflammatory non-steroidal, any thrombophilia or coagulopathy, thrombocytopenia, thrombocytosis, PCI or CABG in the last 6 months, severe renal impairment and any terminal illness. Study design: Case-control study (1:1), case group (previous IS/TIA) and control group (without previous IS/TIA) matched for sex, age, type of previous ACS, time between ACS and inclusion in the study. Platelet aggregation was assessed by VerifyNow Aspirin®, VerifyNow P2Y12®, Light transmission aggregometry aggonist with agonists adrenaline, Light transmission aggregometry aggonist with ADP, and thromboelastography (Reorox®). Results: The control group (n=70) and case group (n=70), were well matched. The mean age was 63 years, about 73% presented previous AMI and the index ACS occurred 5,31 years before study inclusion. At the evaluation day patients in the case group presented higher SBP levels (135.84 ± 16.09 vs 123.68 ± 16.11 mmHg, p < 0,001), although this group were using more antihypertensive medications (2.37 ± 1.09 vs 3.0 ± 1.23, p=0,006). In relation to metabolic profile, lipid profile did not presented diferences, however, case group presented higher values for creatinine (1.24 ± 0.35 vs 1.11 ± 0.27 mg/dL, p=0.037) and also presented higher values for fasting glucose.(116.16 ± 32.03 vs 134.88 ± 57.58 mg/dL, p=0.031) Platelet aggregation was statistically similar in both groups: VerifyNow Aspirin® (525.00 ± 79.78 vs 530.35 ± 83.81 ARU, p=0.7), VerifyNow P2Y12® (262.14 ± 43.03 vs 251.74 ± 43.72 PRU, p=0.21), Light transmission aggregometry aggonist with agonists ADP (78,34 ± 9,02 vs 77,55 ± 9,70%, p=0,82), Light transmission aggregometry aggonist with adrenaline (49,01 ± 23,93% vs 49,34 ± 21,7, p=0,77) and thromboelastography (maximum clot firmness: 2.136,00 ± 569,97 vs 2.001,27 ± 635,68 Pa, p=0,19). Conclusion: Platlet aggregability is similar in CAD patients with or without previous IS/TIA and this results point at other reasons to justify the high risk for bleeding in this patients

Que o envenenamento pela serpente Bothrops jararaca causa distúrbios hemorrágicos sistêmicos, com alteração da coagulação e fibrinólise sangüíneas, é notório. Contudo, pouco se sabe sobre a ação in vivo desse veneno sobre as plaquetas. Em estudos recentes, demonstrou-se que esse veneno causa trombocitopenia, distúrbios da agregação e diminuição do número de corpos densos plaquetários, que, dessarte, sugeriam a ativação das plaquetas circulantes. Com o escopo de comprovar esta hipótese e melhor caracterizar as ações in vivo desse veneno sobre as plaquetas, serviu-se de um modelo experimental que empregava coelhos para o envenenamento pela B. jararaca. No grupo experimental, os animais foram injetados i.v. com o veneno da B. jararaca (60 µg/kg) e no grupo controle com salina. Previamente à administração de salina ou veneno, os coelhos tiveram suas plaquetas marcadas ex vivo com NHS-biotina. Para a avaliação das alterações plaquetárias, amostras de sangue foram coletadas seqüencialmente, em intervalos de tempo que variaram de 1 a 144 horas após a administração do veneno ou salina. Durante o envenenamento, houve trombocitopenia, hipofibrinogenemia, elevação dos níveis plasmáticos do fator de von Willebrand, diminuição da função plaquetária no sangue total induzida pela botrocetina e pelo colágeno e diminuição da secreção de ATP. Não obstante, os níveis plasmáticos de fator plaquetário 4, um marcador específico da ativação plaquetária in vivo, e os níveis intraplaquetários de serotonina se mantiveram constantes. Pela citometria de fluxo, observou-se um decréscimo significativo da expressão do epítopo da GPIIb-IIIa reconhecido pelo anticorpo monoclonal P2, porém isso não foi observado ao utilizar-se anticorpos policlonais. A expressão de fibrinogênio ou dos produtos de degradação do fibrinogênio/fibrina (PDF) na membrana plaquetária também não sofreu alteração significativa ao longo do tempo. Houve, todavia, elevações significativas da P-selectina plaquetária, um receptor cuja expressão é indicativa de ativação plaquetária, e do epítopo induzido por ligantes (LIBS1) da GPIIIa. A porcentagem de plaquetas reticuladas na circulação, assim como os tempos de sobrevivência plaquetária, não foram estatisticamente diferentes entre os dois grupos. As análises histológicas e imuno-histoquímicas dos órgãos dos coelhos mostraram que as plaquetas circulantes são retidas entre redes de fibrina nos capilares pulmonares. Os resultados obtidos sugerem que a trombina engendrada pelos componentes pró-coagulantes deste veneno desempenha uma função essencial na patogenia dos distúrbios da coagulação e plaquetários observados neste modelo de envenenamento. O aumento da expressão de P-selectina no grupo experimental comprovou a hipótese inicial de que as plaquetas dos coelhos envenenados são verdadeiramente ativadas na circulação. Os dados ora apresentados demonstram definitivamente que a diminuição do fibrinogênio ou o aumento dos PDF não são a causa fundamental da disfunção plaquetária observada no envenenamento botrópico e que outro(s) composto(s) parece(m) estar envolvido(s) com estes distúrbios plaquetários. / In spite of being well established that Bothrops jararaca snake venom causes blood coagulation and fibrinolysis disturbances in patients, scant information about blood platelet disorders during envenomation is available. In recent investigations, thrombocytopenia, platelet aggregation disturbances and decreased numbers of platelet dense bodies were observed following venom administration, suggesting that circulating platelets had been activated. In order to prove this hypothesis and to gain a better characterization of the in vivo role of this venom on platelets, an experimental model of B. jararaca envenomation was utilized. Rabbits were injected i.v. either with B. jararaca venom (60 µg/kg) (experimental group) or saline (control group). Previously to saline or venom administration, rabbit platelets were labeled ex vivo with NHS-biotin. To evaluate platelet disturbances, blood samples were collected consecutively, at time intervals that varied from 1 to 144 hours after venom or saline administration. During envenomation, there were thrombocytopenia, hypofibrinogenemia, elevation of von Willebrand factor plasma levels, reduced botrocetin- and collagen-induced platelet aggregation in whole blood, and decreased ATP secretion. However, plasma levels of platelet factor 4, a specific marker of in vivo platelet activation, and intraplatelet serotonin levels remained constant. By flow cytometry, a significant decrease on the expression of GPIIb-IIIa epitope recognized by P2 monoclonal antibody was observed; however, this was not observed when polyclonal antibodies were employed. Fibrinogen or fibrin(ogen) degradation product (FDP) expression on platelet surface showed no significant alteration. Nonetheless, significant elevations of platelet P-selectin, a receptor whose expression is indicative of platelet activation, and of ligand-induced binding sites (LIBS1) of GPIIIa were noted. The percentage of circulating reticulated platelets, as well as platelet survival times, were not statistically different between the two groups. Histopathological and immunohistochemical analyses of rabbit organs demonstrated that circulating platelets were sequestered among fibrin deposits in pulmonary capillaries. These results suggest that thrombin generated by procoagulating components of B. jararaca venom has an essential role in the pathogenesis of platelet and coagulation disorders in this experimental model. Increased expression of P-selectin in the experimental group proves the initial hypothesis that platelets of envenomed rabbits are indeed activated in the circulation. The data presented herein demonstrate definitively that decreased fibrinogen or increased FDP levels are not the primary cause of the platelet dysfunction observed in bothropic envenomation, but other substances seem to be responsible for it.