Para a transformação tradicional da levedura Saccharomyces cerevisiae são empregadas cepas hospedeiras que devem necessariamente conter um marcador de auxotrofia, de forma que as células transformadas possam ser selecionadas posteriormente por complementação gênica. Em nosso trabalho construímos um vetor, que dispensa a necessidade destas marcas de auxotrofia, permitindo transformar cepas de leveduras selvagens e, portanto, até mesmo algumas cepas de interesse industrial. Este vetor é composto por um cassete de expressão de interesse (promotor, gene estrutural e terminador) ladeado por dois fragmentos do gene CAN1 de S. cerevisiae. Uma vez que as extremidades deste fragmento, são homólogas às sequências do gene CAN1 da levedura a ser transformada, este irá causar a disrupção genética na região homóloga. Por sua vez, o gene CAN1, quando funcional, é responsável pela permease do aminoácido arginina. Este aminoácido é análogo à canavanina, que entra na célula pelo mesmo mecanismo da arginina, e é uma droga com efeito letal à S. cerevisiae. Após a introdução deste novo vetor, a célula torna-se resistente à canavanina, por impedir a entrada de arginina e, consequentemente de canavanina na célula, permitindo a seleção dos transformantes e mantendo a informação genética adicional clonada 100% estável. Em nosso trabalho, para analisar esta proposta, empregamos o cassete de expressão em que a sequência sinal e estrutural da glicoamilase encontram-se clonadas sob a regulação das sequências promotoras e terminadoras da PGK de S. cerevisiae. Obtivemos sucesso na transformação, tanto de uma cepa de laboratório com marcas auxotróficas, como de células de cepas selvagens, sem nenhuma marca de auxotrofia , utilizadas em processos industriais, FTPT e HTYM-81 que originalmente são sensíveis à canavanina. / Traditionally auxotrophic mutants of Saccharomyces cerevisiae are used as host cells for transformation since the selection of transformants is based on genetic complementation by a marker gene carried on the vector. In this work a vector was constructed which overcomes the need for auxotrophic mutants allowing selection of transformed wild-type strains, including some strains of industrial interest. The vector contains an expression cassette (promoter, structural gene and terminator) which is flanked by two fragments of the CAN 1 gene of S. cerevisiae. Since the ends of this fragment are homologous to the host <i.CAN 1 gene, it disrupts that gene upon transformation. The CAN 1 gene codes for the permease of the amino acid arginine which is analogous to canavanine and enters the cell by the same mechanism. Canavanine, however, is a lethal drug for S. cerevisiae. Since tranformants become resistant to canavanine, because no permease is synthesized, and thus canavanine cannot enter the cell, transformants are easily selected and the additional cloned genetic information is 100% stable. In this work, we employed the expression cassette containing the signal and the coding sequences of glucoamylase of Aspergillus awamori under the control of the promoter and the terminator of phophoglycerate kinase (PGK) of S. cerevisiae. We successfully transformed a laboratory yeast strain carrying auxotrophic markers, as well as two wild-type strains, employed in industrial processes, which originally were sensitive to cananvanine.

As metalo-&#946;-lactamases (MBL) são capazes de hidrolisar os carbapenêmicos, a classe de antimicrobianos com maior potência para o tratamento de infecções graves e de maior uso clinico. Dentre as MBL, o grupo mais recentemente descrito e que apresentou rápida disseminação em todo o mundo é o da New-Delhi-Metalo- &#946;-lactamases (NDM). Nas enterobactérias, os genes que codificam essas enzimas estão mais frequentemente localizados em plasmídeos. O estudo da estabilidade de plasmídeos que albergam o gene blaNDM-1 é importante para entender a predominância de espécies que carregam esses plasmídeos, desvendar mecanismos moleculares envolvidos na sua persistência e para desenvolver novas drogas que possam diminuir a sua persistência. Estudos recentes sobre estabilidade plasmidial evidenciaram que a maprotilina é capaz de induzir perda plasmidial de até 90% em E. coli K12. Neste trabalho, foi estudado o efeito da maprotilina na indução de cura de plasmídeos, que albergam o gene blaNDM-1, em diferentes espécies da família Enterobacteriaceae. Nove isolados pertencentes a diferentes espécies foram incluídas no estudo. Os plasmídeos foram caracterizados quanto ao seu tamanho por eletroforese e por sequenciamento de DNA no sistema Illumina. A persistência plasmidial foi determinada pelo método de contagem em placa em LB ágar com e sem tratamento com maprotilina em concentrações sub-inibitórias (50mg/L). O experimento foi conduzido por 10 dias, representando aproximadamente 100 gerações. Neste estudo evidenciou-se que o grupo das enterobactérias estão envolvidas na disseminação de plasmídeos com blaNDM-1, sendo que plasmídeos do grupo IncF estão mais relacionados a essa dispersão. A maprotilina teve efeito de cura plasmidial em todos os isolados exceto em E. hormaechei \"subsp. oharae\" e C. freundii. O isolado P. rettgeri apresentou maior taxa de perda plasmidial e a análise comparativa da sequência nucleotídica do plasmídeo indicou que a presença da IS5 pode estar relacionada com a diminuição da persistência plasmidial. Diferenças na persistência plasmidial, quando tratados com maprotilina, entre E. hormaechei \"subsp. steigerwaltii\" e E. hormaechei \"subsp. oharae\" sugerem que E. hormaechei \"subsp. oharae\" pode ser um possível disseminador de plasmídeos albergando blaNDM-1, devido a processos de adaptação co-evolutivos. / Metallo- &#946;-lactamases (MBL) are able to hydrolase carbapenems, an antimicrobial class in clinical use with high potency in the treatment of severe infections. The most recently decribed group of MBL is the New-Delhi-Metallo-&#946;-lactamases (NDM). This group is mostly correlated to the spread of resistance mediated by plasmid in Enterobacteriaceae. Understanding the plasmid persistence pattern is important in order to understand the predominance of a given species related to antimicrobial resistance plasmids spread, to unveil molecular mechanisms involved in the increase of plasmid persistence and to develop new drugs which could decrease its persistence. Recent studies have associated maprotiline to a decrease in 90% of plasmid persistence in E. coli K12. In this work, we evaluated the effect of maprotiline in curing plasmids carrying blaNDM-1 in different species of Enterobacteriaceae. Nine isolates belonging to different species were evaluated. Plasmids were characterized by agarose gel electrophoresis and by DNA sequencing with Illumina platform. The plate counting method was used to determine plasmid persistence, with and without sub-inhibitory (50 mg/L) concentration of maprotiline during 10 days, representing approximately 100 generations. We found that Enterobacteriaceae are involved in the spread of NDM-1 plasmid-mediate resistance and the IncF group is the plasmid incompatibility group more frequently involved in this dissemination. Maprotiline showed a plasmid-curing effect in all isolates, except against plasmids of E. hormaechei \"subsp. oharae\" and C. freundii. The P. rettgeri isolate had the highest plasmid-curing rate. Sequencing analysis revealed an IS5 in the plasmid, which could be associated to a decrease in plasmid persistence. The difference between plasmid persistence pattern of plasmids isolated from E. hormaechei \"subsp. steigerwaltii\" and E. hormaechei \"subsp. oharae\", when treated with maprotiline, suggest that E. hormaechei \"subsp. oharae\", could be associated to the spread of plasmids carrying blaNDM-1 due to co-evolution adaptation.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-08-03T15:17:06Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Breiner Gabriel Canedo Silva - 2016.pdf: 5933676 bytes, checksum: f71deace1dcdc99b7cbc79191cf1374d (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-08-03T15:18:38Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Breiner Gabriel Canedo Silva - 2016.pdf: 5933676 bytes, checksum: f71deace1dcdc99b7cbc79191cf1374d (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-03T15:18:38Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Breiner Gabriel Canedo Silva - 2016.pdf: 5933676 bytes, checksum: f71deace1dcdc99b7cbc79191cf1374d (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-07-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / In this work magnetic nanoparticles composed of maghemite coated with L-lysine or DL-Histidine (crystallite average diameter between 4.5 to 8.1 nm.) were synthesized via the Fe (II) and Fe (III) coprecipitation method. The synthesized solids were dispersed in water to obtain aqueous suspensions called magnetic fluids. The samples were characterized by X-ray diffraction, infrared spectroscopy, thermogravimetry, UV-Vis spectrophotometry, transmission electron microscopy, electrophoretic and dynamic light scattering. The suspended colloidal nanoparticles showed positive zeta potential at physiological pH, which enables the adsorption of negatively charged molecules of chromosomal and plasmid DNA on their surfaces. Their hydrodynamic radius were smaller than those reported in the literature (100nm) allowing phagocytosis of the nanostructure. A maghemite/L-Lysine sample was selected for DNA adsorption (chromosomal DNA of Humicola grisea fungus and shRNA and GFP encoding plasmids) and subsequent coating with dextran, for protection of its genetic information. Plasmids and dextran adsorption was evidenced by the increasing of the hydrodynamic radius of the samples, and the presence of DNA and dextran related bands in the infrared. / Neste trabalho, foram sintetizadas nanopartículas magnéticas constituídas de maghemita funcionalizada com L-Lisina ou DL-Histidina (cristalitos com diâmetro médio de 4,5 a 8,1 nm), pelo método da coprecipitação dos íons Fe (II) e (III). Os sólidos obtidos foram dispersos em água para obtenção de suspensões aquosas denominadas fluidos magnéticos. As amostras obtidas foram caracterizadas pelas técnicas de difração de raios X, espectroscopia de infravermelho, termogravimetria, espectrofotometria UV-Vis, microscopia eletrônica de transmissão e espalhamento de luz dinâmico e eletroforético. As nanopartículas em suspensão apresentaram potencial zeta positivo em pH fisiológico, possibilitando assim adsorção de moléculas de DNA (cromossômico e plasmidial) negativamente carregadas, além de um raio hidrodinâmico inferior ao relatado na literatura (100 nm) para que ocorra a fagocitose das nanoestruturas. Uma amostra maghemita/L-Lisina foi selecionada para adsorção de DNA (cromossômico de fungo Humícola grísea e de plasmídeos codificadores de shRNA e GFP) e posterior recobrimento com dextrana, para proteção de sua informação genética. A adsorção dos plasmídeos e da dextrana foi evidenciada pelo aumento do raio hidrodinâmico das amostras e pela presença das bandas relativas à dextrana e ao DNA nos espectros de infravermelho.

Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) é um dos principais agentes de diarréia em crianças nos países em desenvolvimento. Esse patótipo pode ser classificado em dois grupos: EPEC típica (t-EPEC) e EPEC atípica (a-EPEC). O objetivo principal deste estudo foi traçar o perfil plasmidial de 78 amostras de a-EPEC bem como investigar em 72 amostras a presença de genes de virulência descritos em outros patótipos de DEC para procura de um marcador de virulência específico deste grupo de amostras. Foi detectada a presença de alguns genes de virulência como: pet (5,5%), pic (2,7%), astA (18%), efa1/lifA, toxB (2,7%), ldaH (8,3%) e ehly1 (4,2%). Os perfis plasmidiais obtidos permitiram verificar que entre as 78 amostras analisadas, 12 não possuem plasmídio, 33 possuem plasmídios entre 50 a 90 kb e 38 possuem plasmídios entre 90 a 124 kb. A pesquisa dos grupos de incompatibilidade revelou que os grupos IncFIB e IncF são os mais freqüentes entre as amostras de a-EPEC. Os resultados de RFLP do DNA plasmidial das amostras do sorotipo O55:H7 sugeriu que existem seqüências de nucleotídeos comuns entre os plasmídios. Os dados obtidos também permitiram inferir a existência de fragmentos de DNA plasmidial comum entre amostras de EHEC O157:H7 e amostras de a-EPEC O55:H7. A função biológica dos plasmídios de a-EPEC e a relação com o plasmídio pO157 necessitam de estudos complementares. / Escherichia coli (EPEC) is one of the main agents of diarrhea in children in developing countries. This pathotype can be classified in two groups: typical EPEC (t-EPEC) and atypical EPEC (a-EPEC). The aim of this study was to determine the plasmid profile of 78 strains of a-EPEC and investigate 72 strains for the presence of virulence genes described in other DEC. It was detected the presence of some virulence genes: pet (5,5%), pic (2,7%), astA (18%), efa1/lifA, toxB (2,7%), ldaH (8,3%) e ehly1 (4,2%). The plasmid profiles obtained allowed us to verify that among the 78 samples analyzed, 12 did not have plasmids, 33 strains have plasmids ranging between 50 and 90 kb, and 38 have plasmids ranging between 90 to 124 kb. Incompatibility groups analysis revealed that IncFIB and IncF groups are the most frequent among the samples of a-EPEC. RFLP analysis of plasmid DNA of strains of serotype O55:H7 suggested that there are nucleotide sequences common to the plasmids. The data also allowed inferring the existence of fragments of plasmid DNA common to EHEC O157:H7 and a-EPEC O55:H7. The biological function of aEPEC plasmid and the relationship with pO157 requires further studies.

Bacillus subtilis é uma alternativa ao emprego de Escherichia coli para a produção de proteínas recombinantes. O principal entrave à utilização de B.subtilis para esse fim é a baixa disponibilidade de sistemas de expressão. Nesse trabalho, testamos diferentes plasmídeos e promotores com o objetivo de desenvolver sistemas de expressão heteróloga eficientes. Ao fim do trabalho, propomos dois novos sistemas de expressão baseados do arcabouço do plasmídeo pMTL500E e nos promotores dos genes cdd e gsiB, ambos de B.subtilis. Os dois plasmídeos construídos apresentam expressão constitutiva e demonstraram desempenho superior no tocante à produção de proteínas heterólogas quando comparados ao único sistema comercialmente disponível, conhecido como pHT01. Em uma segunda parte do trabalho, propomos a utilização de Listeria innocua como veículo de entrega para antígenos vacinais. Por meio de ensaios ex-vivo e in vivo, demonstramos que essa bactéria possui potencial promissor para aplicações vacinais, inclusive quando comparada ao bem estabelecido B.subtilis. / Bacillus subtilis is an alternative to the use of Escherichia coli for the production of recombinant proteins. The main bottleneck to the use of B. subtilis for this purpose is the low availability of expression systems. In this study, we evaluated different plasmids and promoters with the aim of developing efficient heterologous expression systems. At the end of this work, we propose two new expression systems based on plasmid pMTL500E and the promoters from cdd and gsiB genes, both of them from B.subtilis. The two plasmids constructed exhibit constitutive expression and demonstrated superior performance regarding the production of heterologous proteins compared to the unique commercially available system, which is known as pHT01. In a second part of the work, we propose the use of Listeria innocua as a delivery vehicle for vaccine antigens. After ex-vivo and in-vivo experiments, we demonstrated that this bacterium has a promising potential for vaccine applications, even when compared to well established B.subtilis.

Orientador: Fernanda da Cruz Landim / Resumo: As pesquisas envolvendo a biologia das células-tronco abordam um amplo espectro de fenômenos, que vão desde o nível tecidual e celular, até o seu uso em terapias celulares. Esta crescente atenção sugere que é necessário estudar conceitos básicos da biologia das células-tronco para compreender completamente os processos de diferenciação funcional. Desta forma, o instrumento da reprogramação celular por meio da manipulação gênica fornece subsídios para melhor compreender os processos de renovação e diferenciação que constituem as características fundamentais das células-tronco. A obtenção dessas células em medicina veterinária visa validar diversos modelos experimentais domésticos, como o equino, na busca de novos fármacos e terapias alternativas para reabilitação. Uma série de estudos, porém, ainda são necessários para que tais aplicações sejam viáveis, uma vez que os mecanismos fundamentais das técnicas empregadas ainda não estão totalmente elucidados. Embora a reprogramação celular por meio de vetores virais tenha sido relatada com sucesso em diversas espécies animais, outras técnicas também podem ser empregadas, como o uso de transposons, sequências de DNAs capazes de se movimentar de uma região para outra no genoma de uma célula. Não se tem conhecimento de qual o melhor tipo celular a ser utilizado, e nem tão pouco qual a metodologia de reprogramação mais eficiente. Sabe-se que o cordão umbilical possui uma reserva rica em células-tronco mesenquimais, as quais por serem mu... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Researches on the biology of stem cells cover a broad spectrum of phenomena, ranging from tissue and cellular level, to their use in cell therapy. This growing attention suggests that is necessary to study basic concepts of stem cells organization in order to fully understand the functional differentiation processes. Thus, the cell reprogramming through gene manipulation provides grants to better understand the processes of renewal and differentiation which are the essential characteristics of stem cells. Obtaining these cells in veterinary medicine aims to validate various household experimental models, such as horses, on the search for new drugs and alternative therapies for rehabilitation. However, a number of studies is still necessary for such applications to be feasible, since the fundamental mechanisms of techniques employed are not fully elucidated yet. Although cell reprogramming using viral plasmid has been reported with success in several animal species, other techniques may also be employed, such use transposons, this is, DNAs sequences capable of moving from one region to another in the cell genome. The unawereness of what the best cell type to be used, and nor what is the most efficient reprogramming methodology. It is known that the cord has rich reserves mesenchymal stem cells, which are multipotent and can improve the efficiency of obtaining the induced Pluripotent Stem Cells (iPS) compared to the use of fibroblast, inefficient to be reprogrammed. The aim of this study was to obtain iPS through viral transfection and nonviral adult fibroblasts and equine cord cells, aiming to observe which transfection and cell type is more efficient for cell reprogramming. Both cell types was infected with viral vectors and transposons containing the genes OCT-4, SOX-2, c-MYC, and KLF-4; transformed cells were evaluated for morphology, immunocytochemistry... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Este projeto teve como objetivo a construção de biosensores para a detecção de compostos monoaromáticos do grupo BTEX a partir dos componentes da via de degradação de compostos monoaromáticos codificada no plasmídeo TOL de Pseudomonas putida, mais precisamente: o promotor Pu e a proteína reguladora XylR, que ativa o promotor Pu após a ligação ao efetor monoaromático. Um objetivo secundário foi a verificação da existência de sequências reguladoras desconhecidas a montante do promotor Pu, construindo três variantes com fragmentos de Pu que se estendem por diferentes comprimentos a montante do promotor (Pu202 pb, Pu396 pb e Pu802 pb), cuja existência foi sugerida em trabalho anterior do laboratório. O promotor Pu foi ligado ao gene indicador para fosfatase alcalina isolado de E. coli. Todos os componentes das três variantes de biossensores foram clonados com sucesso. A construção de um dos plasmídeos de biossensoramento com a variante mais curta de Pu (Pu202) foi concluída. / Monoaromatic compounds are mainly responsible for the contamination of areas, this is because they are components of gas and the fuel stations most of accidents sites. Such compounds are highly toxic and, in between non-polar compounds, present high solubility and vapor pressure which assists them in dispersion at groundwaters and soil. This work aim to develop a biosensor based on alkaline phosphatase indicator gene under the regulation of the Pu promoter and its regulatory protein, XylR, that is activated by monoaromatic. Moreover, this work will continue a previous project of the research group that indicated a possible regulatory region not described for Pu, that hypothesis will be tested by producing different plasmids biosensors with varying sizes of Pu (202 bp, 396 bp and 802 bp). All biosensor fragments were purified and cloned on pGem T Easy and biosensor with Pu 202 pb was produced. Next goals are finishing others biosensors assemble and perform induction tests.

Em aplicações biotecnológicas, a estabilização de informações e a expressão gênica em bactérias Gram-negativas são fundamentais. Neste trabalho, analisou-se o efeito de estabilização plasmidial promovido pelo lócus parB (hok/sok) nas bactérias E. coli, C. metallidurans e C. necator transformadas com os plasmídeos pCM2, pBBR1MCS e seus respectivos derivados contendo o lócus parB, pCM3 e pBBPAR. As bactérias transformadas com pCM2 exibiram perda plamidial acentuada após 50 gerações, e as bactérias transformadas com pCM3 e pBBPAR exibiram estabilidade próxima a 100%, após 100 gerações. Também foi avaliada a força relativa de expressão dos promotores hok e sok em relação ao promotor lac, inseridos no plasmídeo pBBEGFP. Por microscopia de fluorescência, foi observado que regulado pelos promotores sok e hok, os transformantes expressaram EGFP. Utilizando citometria de fluxo, foi observado que o promotor hok apresentou maior força de expressão nas bactérias transformantes de E. coli e C. metalliduras; já o promotor sok apresentou maior força de expressão em C. necator. / In biotechnological applications, stabilization of information and gene expression in Gram-negative bacteria are important. In this work, we analyzed the effect of plasmid stabilization promoted by locus parB (hok/sok) in the bacteria E. coli, C. metallidurans and C. necator transformed with the plasmids pCM2, pBBR1MCS, and their derivatives containing the parB locus, pCM3 and pBBPAR. The Bacteria transformed with pCM2 showed a pronounced plasmidial loss after 50 generations, and bacteria transformed with pCM3 and pBBPAR exhibited stability close to 100 % after 100 generations. We also evaluated the relative expression strength of hok and sok promoters relative to the lac promoter, inserted into plasmid pBBEGFP. For fluorescence microscopy, it was observed that regulated by hok and sok promoter, transformants expressed EGFP. Using flow cytometry, it was observed that the hok promoter showed higher expression levels in E. coli and C. metallidurans transformants; as sok promoter showed higher expression level in C. necator.

Os tratamentos convencionais para carcinoma medular de tireóide (CMT) metastático são insatisfatórios. Tanto a quimioterapia quanto a radioterapia são pouco eficazes para a doença avançada. Portanto, a terapia gênica é uma promissora opção. Trabalhos de construção de vetores plasmidiais ou adenovirais específicos para cultura de células de carcinoma medular de tireóide e/ou animais têm demonstrado resultados encorajadores, conseguindo significativa redução do tumor. O objetivo deste trabalho foi construir e avaliar a eficácia do plasmídio pTCPtkevIL-12 contendo o gene da timidina quinase (HSV-tk) e da interleucina 12 otimizada/evolved (evIL-12), ambos sob controle do promotor da calcitonina modificado (TCP), visando terapia gênica do CMT. A associação entre um gene ?suicida? (TK) e um gene imunomodulador (IL12) é sabidamente sinérgica, o que motivou o emprego destes dois genes no vetor terapêutico. Por melhoramento genético, obteve-se recentemente a IL-12 otimizada/evolved, com elevada capacidade em induzir resposta imune. O promotor TCP é mais forte e mais específico que o promotor de calcitonina natural , e já foi usado em diversos trabalhos em CMT. Para determinar a atividade biológica das interleucinas 12 (evIL-12 e mIL-12), os sobrenadantes das culturas de células TT transfectadas foram utilizados para avaliar proliferação linfocitária e estimulação de células dendríticas (DCs). As células TT (carcinoma medular humano de tireóide) foram transfectadas com o plasmídio pTCPtkevIL-12 ou pTCPmIL-12 (plasmídio com o gene da IL-12 murina, sob controle do promotor TCP). A proliferação linfocitária foi quantificada por citometria de fluxo e a diferenciação de linfócitos T para um padrão Th1 foi verificada através da dosagem de IFN-? e IL-4 por ELISA. A avaliação do perfil fenotípico das DCs, cultivadas com sobrenadante contendo mIL-12 ou evIL-12 durante a diferenciação, foi feita através de marcação com anticorpos das moléculas de membrana marcadoras de maturação CD80, CD83, CD86 e CD40, com leitura também por citometria de fluxo. Também foi avaliada e comprovada a capacidade do plasmídio pTCPevIL-12 de promover apoptose induzida pelo sistema suicida timidina quinase/ganciclovir, nas células TT transfectadas. Os experimentos de proliferação linfocitária verificaram que ambas IL-12 promoveram intensa proliferação linfocitária, em similar magnitude. A principal função da IL12, todavia, não é estimular proliferação linfocitária, mas sim, induzir fortemente diferenciação para Th1, fundamental para uma eficiente resposta anti-tumoral. Foi observado que ambas IL-12 proporcionaram forte resposta Th1. Porém, a evIL-12 mostrou-se superior à mIL-12 na diferenciação dos linfócitos T para o padrão Th1. Os experimentos que avaliaram a capacidade da IL-12 maturar DCs diferenciadas, mostraram um aumento na expressão de CD40 nas DCs sob estímulo de ambas IL-12, porém a expressão foi discretamente maior com evIL-12 que com mIL-12 . Não foi observada alteração na expressão das outras proteínas marcadoras de maturação (CD80, CD83, CD86). Comparando-se o sobrenadante das células TT transfectadas com o plasmídio pTCPtkevIL-12 antes e após adição de GCV, verificou-se que ele se tornou mais eficiente para induzir expressão de CD40 nas células dendríticas após a adição do GCV. O incremento de expressão de CD40 nas DCs após tratamento com GCV poderia explicar, ao menos em parte, o efeito anti-tumoral sinérgico observado com a expressão simultânea dos genes timidina quinase e IL-12, já descritos em estudos in vivo, na literatura. Considerando-se que a evIL-12 mostrou-se mais eficiente em promover diferenciação dos linfócitos T para padrão Th1 e em promover uma maturação/ativação de melhor qualidade das células dendríticas diferenciadas (maior expressão de CD40), poderia-se afirmar que esta IL- 12 é extremamente imunogênica, superior inclusive à IL-12 murina , a única utilizada até o momento em terapia gênica de CMT. Os resultados satisfatórios alcançados neste trabalho oferecem perspectivas de aplicação futura ao plasmídio terapêutico pTCPtkevIL-12 para uso em terapia gênica em CMT. O plasmídio poderia ser utilizado em aplicação intra-tumoral e em estimulação de células dendríticas. A vacinoterapia com células dendríticas estimuladas com sobrenadante de células TT transfectadas com pTCPtkevIL-12 e tratadas com ganciclovir, devido a elevada expressão de CD40, pode ser uma esperança de um tratamento mais eficaz das metástases do CMT. Diversos estudos afirmam haver uma correlação direta entre maior expressão de CD40 e maior regressão do tumor primário e das metástases. / Present treatments of advanced and metastatic medullary thyroid carcinoma (MTC) are unsatisfactory. Tissue-specific cancer gene therapy is a promising alternative approach. IL-12 gene is a good citokyne to be used in gene therapy because it appears to be the most effective immunomodulatory gene. Literature data shows synergism in the association of two antitumor methods: suicide gene thymidine kinase (HSV-tk) and interleukin genes; therefore, they should ideally be together in the vector. The evolved interleukin12, obtained by DNA shuffling, is believed to elicit more antitumoral immune response than the human IL-12. None of them has been tested in MTC, only the murine IL-12 has been employed in MTC gene therapy. To explore a more efficient multi-gene antitumor treatment, development and evaluation of a plasmid expressing both herpes simplex virus thymidine kinase type 1 (HSVtk) and evolved interleukin-12 (evIL-12) under the control of modified calcitonin promoter (TCP) were done in this study. TCP promoter is more specific and efficient than the natural calcitonin promoter CT/CGRP, and has already been used in several studies. To verify IL-12 biological activity, lymphocyte proliferation and dendritic cell stimulation after IL-12 were studied. TT cells (human MTC) were transfected by pTCPtkevIL-12 plasmid or by pTCPmIL-12 (plasmid containing murine IL-12 gene, under control of TCP promoter). Lymphocyte proliferation was analysed by flow cytometry, and Th1 response was assessed by IFN-? and IL-4 ELISA measurement. The phenothypic analysis of dendritic cells (DCs) by flow cytometry was based on the expression of the maturative surface markers CD80, CD83, CD86 and CD40. Also, plasmid pTCPtkevIL-12 ability to promote TT transfected cells apoptosis, through the suicide system HSV-tk/ganciclovir, was evaluated and confirmed. Both IL-12 elicited similar intense lymphocyte proliferation. Nevertheless, the main IL-12 function is not to stimulate lymphocyte proliferation but induce Th1 immune response, which is essential for efficient anti-tumour response. Both IL-12, showed great Th1 response; however fortunately, ev-IL12 was superior to mIL-12 in promoting T cell Th1 response. Flow cytometry analysis of DCs revealed significant higher expression of CD40 surface molecule after differentiated DCs were exposed to TT transfected cells, either with pTCPtkevIL-12 or pTCPmIL-12, supernatants. DCs stimulated with supernatants containing evIL-12 were 36.91% CD40+, whereas when stimulated by supernatants containing mIL-12 were 14.74% CD40+. The other maturative markers (CD80, CD83, CD86) remained with the same expression level. Moreover, TT pTCPtkevIL-12- transfected cells supernatants, showed a even higher ability of increasing CD40 expression in DCs after treatment with GCV. At least partially, this increase in dendritic cells CD40 expression could explain the synergism observed with the simultaneous expression of thymidine kinase and interleukin genes. Outstanding lymphocyte proliferation and dendritic cell stimulation were achieved by the evIL-12 secreted in the supernatants, confirming that this interleukin 12 is really very potent. The good results achieved by the present study justify further experiments with this therapeutic plasmid. It could be used intra-tumorally and to stimulate/mature dendritic cells. Vaccine with DCs stimulated by TT pTCPtkevIL-12-transfected cells after GCV treatment supernatants, due to higher CD40 expression, could be very suitable for the treatment of MTC metastasis. Several studies show better primary tumor and metastasis regression in the presence of high levels of CD40 expression.

A proposta deste trabalho é a padronização do método de eletroporação direta (utilizando eletrodos) em músculo sóleo de ratos wistar. Deste processo físico, pudemos variar a voltagem, o número de pulsos e duração do pulso. O objetivo principal foi à busca de um parâmetro ideal onde deveria haver a menor lesão tecidual com a maior quantidade de expressão do GFP. Métodos de análise (fluorescência e histologia) foram utilizados para a determinação da eficiência de transferência de genes, onde se considerou a razão entre as fibras musculares sadias emissoras fluorescência e o número total de fibras sadias. Como resultado, atingimos a taxa de eficiência de (50,3 ± 20%) em transferência de genes, utilizando a voltagem de 25 V, trem de 8 pulsos com duração de 20ms e freqüência de 1Hz. A possibilidade de interferir na função deste músculo abre a perspectiva de se estudar o papel de certos genes na plasticidade muscular esquelética, especialmente no crescimento muscular longitudinal. / The use of electrical pulses for gene transfer has been successfully used to reach significant levels of gene expression in vitro and in vivo. Therefore electroporation can be considered an important device to get further insight on biological mechanisms and also to treatment. The aim of the present work is to achieve a high level of gene transfer throughout electroporation in the soleus muscle of Wistar rats. The muscle was surgically accessed, injected with Hyaluronidase and subsequently injected with a plasmid expressing GFP (Green Fluorescence Protein). Observation of fluorescence produced in situ and also HE (Hematoxilin-eosin) preparations revealed that the best gene transfer efficiency (50, 3 ± 20%) was achieved with 25 V and 8 pulses (1Hz) lasting 20ms. These results point to a potential use of electroporation as a tool for investigating cellular and molecular aspects of skeletal muscle plasticity, especially those that can be approached only in soleus muscle, such as longitudinal growth.