Este trabalho teve por objetivo dissecar o papel potencial de fosforilação/desfosforilação como efeitos da ativação de PfSR25, um candidato a receptor serpentina de P. falciparum. Como a sinalização é um evento celular complexo, não excluímos a possibilidade de que outros mecanismos moleculares ocorram além dos aqui descritos. Nossas conclusões são que potássio modula PfSR25, ativando quinases/fosfatases, levando à ativação de moléculas efetoras. Encontramos MSP1, proteína já caracterizada e Pf4-4-13 e o fator básico de transcrição 3B (PfBTF3B), que ainda não foram caracterizados em P. falciparum, como efetores. Estes dados sugerem que pelo menos em parte, o mecanismo pelo qual PfSR25 exerce seu papel no desenvolvimento de P. falciparum seja através da ativação de quinases/fosfatases. Isto não é surpreendente, pois a sinalização de PfSR25 ocorre através de K+/cálcio e o segundo mensageiro é um modulador destas classes de proteínas. No entanto, deve ser investigado se cálcio tem algum efeito direto sobre o processamento/ativação dos efetores aqui identificados. / This work aimed at dissecting the potential role of phosphorylation/dephosphorylation as downstream effect of PfSR25 activation. PfSR25 is a serpentine receptor candidate from P. falciparum. As signaling is a quite complex cellular event, we do not exclude the possibility that other molecular mechanisms, take place additionally to those here described. Our conclusions are that potassium modulates PfSR25 by activation of kinases/phosphatases, leading to activation of effector molecules. We found MSP1 already characterized protein and Pf4.4.13 and the basic transcription factor 3B (PfBTF3B), which have not yet been characterized in P. falciparum as effectors. These data suggest that, at least in part, the mechanism by which PfSR25 exerts its role in the P. falciparum development is through the activation of kinase/phosphatase. This is not surprising, since PfSR25 signaling occurs through K+/Calcium and the second messenger is a modulator of these classes of proteins. However, remains to be investigated rather calcium has a direct effect on processing/activation the effectors here identified.

O papel dos Zoológicos nos programas de conservação aumentou significantemente nas últimas décadas e a manutenção da saúde dos animais cativos é essencial para garantir o sucesso desses programas. Entretanto, aves mantidas em zoos sofrem de infecções por parasitas, principalmente hemosporídeos, e podem perecer em quase todo o mundo. Estudos para determinar a ocorrência e diversidade desses parasitas, com o objetivo de entender melhor sua influência na condição física das aves em cativeiro, são necessários. Em um estudo de quase quatro anos, nós investigamos a positividade de Plasmodium spp. e Haemoproteus spp. nas aves cativas do Parque Zoológico de São Paulo, o maior zoológico da América Latina e o quarto do mundo. Métodos moleculares e morfológicos foram usados para detectar e identificar esses parasitas. A positividade geral de hemosporídeos nos indivíduos examinados foi 12,6%. Os parasitas foram detectados, sobretudo, através do diagnóstico molecular, indicando que muitas espécies podem abrigar infecções subclínicas. Em um estudo amplo, nós testamos animais de 17 Ordens, 29 Famílias, e 122 espécies, detectando indivíduos positivos em 64,7%, 48,3% e 27%, respectivamente. Aves da Família Anatidae foram as mais frequentemente infectadas. As infecções com parasitas do gênero Plasmodium foram predominantes quando comparadas aquelas com parasitas do gênero Haemoproteus. No total, 14 linhagens de cytb de Plasmodium spp., incluindo P. nucleophilum e P. elongatum, e 2 linhagens de cytb de Haemoproteus spp., foram registradas. Dessas linhagens, 8 foram descritas pela primeira vez. Uma dessas linhagens foi notavelmente generalista quanto às espécies hospedeiras, enquanto outras se restringiram a parasitar espécies de uma mesma Família. Estes resultados mostram que entre os animais cativos dos zoos, além dos pinguins, existem várias espécies em risco de contrair malária. A presença de Haemosporida pode ser difícil de eliminar, mas é possível reduzir a taxa de infecção tratando os animais positivos, enquanto os mantêm em instalações livres de mosquitos. Protocolos de quarentena precisam ser utilizados se o animal for transferido entre instituições. O presente estudo é o primeiro inquérito de hemosporídeos realizado em aves cativas de diferentes Ordens, e enfatiza a necessidade de incluir, na gestão e criação desses animais no cativeiro, práticas para o controle desses parasitas. / The role of Zoos in conservation programs has increased significantly in last decades and maintenance of the health of captive animals is essential to guarantee the success of these programs. However, birds kept in zoos suffer from infections by parasites, mainly haemosporidians, and can perish almost everywhere in the world. Studies to determine the occurrence and diversity of these parasites, aiming to better understand its influence in the fitness of the captive birds, are necessary. In a study over four years, we investigated the positivity of Plasmodium spp. and Haemoproteus spp. in the captive birds from the São Paulo Zoo, the largest zoo in Latin America and the fourth in the world. Molecular and morphological methods were used for detecting and identifying these parasites. The overall positivity of haemosporidians in the examined birds was 12.6%. Parasites were mostly detected by the molecular diagnosis, indicating that many bird species may harbour subclinical infections. In a very wide study, we tested animals from 17 Orders, 29 Families, and 122 different species, detecting positive individuals in 64.7%, 48.3% and 27%, respectively. Birds from the Anatidae Family were the most commonly infected animals. Infections with parasites of the genus Plasmodium were predominant when compared to those of the genus Haemoproteus. In total, 14 cytb lineages of Plasmodium spp., including P. nucleophilum and P. elongatum, and 2 cytb lineages of Haemoproteus spp., were recorded in this study. From these lineages, 8 were described for the first time. One of these lineages was markedly generalist regarding the host species while others infected just species within the same Family. These results show that among the captive animals in the zoos, besides the penguins, there are many species at risk of acquiring malaria. The presence of Haemosporida could be difficult to eliminate, but it is possible to reduce the infection rate by treating the positive animals, while keeping them in facilities free from mosquitoes. Protocols of quarantine must be implemented whenever an animal is transferred between institutions. The present study is the first survey of haemosporidians carried out with captive birds from different Orders, and emphasizes the necessity of applying, in management and husbandry of animals in captivity, practices to control these parasites.

Plasmodium falciparum e Toxoplasma gondii são protozoários parasitas pertencentes ao filo Apicomplexa. Apirases são enzimas metabolizadoras de nucleotídeos extracelulares. Nesta tese mostramos pela primeira vez a presença de um membro desta família de enzimas em P. falciparum, o qual foi capaz de degradar ATP extracelular. Análises por RT-qPCR revelaram a expressão da apirase durante todo o ciclo intraeritrocítico. A adição de inibidores desta classe de enzimas foi capaz de prejudicar o desenvolvimento dos parasitas e a invasão de novas hemácias pelos merozoitos, sugerindo assim um papel da apirase nestes processos. A via de sinalização por Ca2+ é universal e vital para todas as células. Para melhor entender a fisiologia celular de P. falciparum construímos uma nova linhagem de parasitas transgênicos, PfGCaMP3, que nos tornam capazes de monitorar a dinâmica de Ca2+ sem o uso de protocolos invasivos de marcação. De modo semelhante utilizamos uma nova linhagem de T. gondii expressando de forma estável o indicador de Ca2+ GCaMP3 para estudar o papel deste íon na saída da célula. T. gondii possui o Ca2+ necessário para promover este processo, entretanto Ca2+ extracelular age como um fator intensificador neste passo essencial do ciclo lítico. / Plasmodium falciparum and Toxoplasma gondii are protozoan parasites that belong to phylum Apicomplexa. Apirases are metabolizing enzymes of extracellular nucleotides. In this work we show for the first time the presence of an apyrase in P. falciparum, which was able to degrade extracellular ATP. RTqPCR analysis revealed the expression of apyrase throughout the intraerythrocytic cycle. Addition of apyrase inhibitors was able to impair the development of the parasites and the invasion of new erythrocytes by merozoites, thus suggesting a role of apyrase in these processes. Calcium signaling is universal and vital to all cells. To better understand the cellular physiology of P. falciparum we construct a new strain of transgenic parasites, PfGCaMP3, which enable us to monitor the Ca2+ dynamics without using invasive protocols. Similarly we use a new strain of T. gondii that stably express the Ca2+ indicator GCaMP3 to study the role Ca2+ in parasite egress. T. gondii has the Ca2+ required to promote this process, however extracellular Ca2+ acts as an enhancer factor in this crucial step of the lytic cycle.

O Plasmodium vivax é a espécie causadora de malária de maior distribuição mundial e maior prevalência nas Américas. A complexidade do ciclo de vida do parasito e sua extensa diversidade antigênica têm dificultado a obtenção de uma vacina eficaz e inferem que seja pouco provável que este objetivo seja alcançado utilizando um único antígeno. Neste contexto, a combinação de regiões imunodominantes de antígenos de um ou mais estágios do ciclo de vida do Plasmodium pode ser uma estratégia com melhor prognóstico na indução de resposta imune protetora e duradoura contra a atividade parasitária. Este trabalho avaliou a imunogenicidade, em camundongos, de uma formulação vacinal composta pela mistura dos antígenos CSP, pré-eritrocítico e AMA-1, o qual é expresso em ambos os estágios, préeritrocítico e eritrocítico assexuado. A proteína quimérica yPvCSAllFL, que contém epítopos para células B da região central (repeats) das 3 variantes alélicas PvCSP-VK210, PvCSP-VK247 e PvCSP-P. vivax-like fusionados, e a yPvAMA-1 foram expressas com sucesso em leveduras Pichia pastoris e purificadas por métodos cromatográficos para a imunização de camundongos BALB/c e C57BL/6, na presença do adjuvante Poly(I:C), agonista de TLR3. Por ELISA, foram determinados os títulos de anticorpos, as subclasses de IgG e a avidez destes pelas proteínas indutoras, administradas isoladamente ou em combinação. A resposta de anticorpos anti-yPvCSAllFL mostrou ser linhagem dependente, tendo sido observado altos títulos de anticorpos IgG (106) em C57BL/6, os quais se mantiveram elevados por até 6 meses após a última dose. Os anticorpos anti-yPvCSAllFL, predominantemente IgG1, foram capazes de reconhecer proteínas representando as 3 variantes alélicas. No geral, a coadministração dos antígenos yPvCSAllFL e yPvAMA-1 não comprometeu a resposta de anticorpos individual. Utilizando este protocolo de vacinação não foi possível detectar resposta proliferativa de células TCD3+TCD4+ ou TCD3+TCD8+ específicas após a estimulação com yPvCSAllFL. Os índices de proliferação (8,31%) e o padrão de secreção das citocinas IFN-γ, IL-2, TNF-α e IL-10, associados à yPvAMA-1, sofreram redução com a coadministração de antígenos (6,33%) e alteração, com elevação de IL-2 em detrimento das demais citocinas. Os dados gerados no estudo das formulações vacinais apresentadas neste trabalho podem ser úteis para o desenvolvimento de uma vacina anti-P. vivax, principalmente por explorarem estratégias de combinação e fusão de antígenos. / Plasmodium vivax is the species of malaria more widely distributed worldwide and with higher prevalence in the Americas. The complexity of the parasite life cycle and its extensive antigenic diversity have hampered the achievement of an effective vaccine and infer that it is unlikely that this goal will be achieved using a single antigen. In this context, the combination of immunodominant regions of antigens of one or more stages of the Plasmodium life cycle can be a strategy with better prognosis at inducing protective and durable immune responses against this parasite. Our study assessed the immunogenicity of vaccine formulations consisting of mixture of antigens CSP, pre-erythrocytic and AMA-1, which is expressed in the both stages, pre-erythrocytic and erythrocytic asexual, in mice. The chimeric protein yPvCSAllFL, which contains B-cell epitopes of the central region (repeats) of the 3 allelic variants PvCSP-VK210, PvCSP-VK247 and PvCSP-P. vivax-like fused, and the yPvAMA-1 were successfully expressed in the yeast Pichia pastoris and purified by chromatographic methods for immunization of BALB/c and C57BL/6 mice in the presence of the adjuvant Poly(I:C), a TLR3 agonist. By ELISA, we determined the titles, IgG subclasses and the avidity of the antibodies to these proteins, administered alone or in combination. The immune response to yPvCSAllFL proved to be dependent on mouse strain, having been observed high titers of IgG antibodies (106) in C57BL/6, which remained high for up to 6 months after the last dose. Anti-yPvCSAllFL antibodies, predominantly IgG1, were able to recognize proteins representing the 3 allelic variants. In general, the co-administration of yPvCSAllFL and yPvAMA-1 antigens did not compromise the individual antibodies response. Using this vaccination protocol, we could not detect cell specific proliferative responses of TCD3+TCD4+ or TCD3+TCD8+ after stimulation with yPvCSAllFL. The proliferation (8.31%) and the pattern of secretion of cytokines IFN-γ, IL-2, TNF-α and IL-10, associated with the yPvAMA-1, were reduced during the co-administration (6.33%) and compensated by the elevation of IL-2. The data generated on the study of vaccine formulations presented in this thesis may be useful for the development of a vaccine anti-P. vivax, mainly by exploiting strategies of combination and fusion of antigens.

A malária é uma das principais doenças parasitárias no mundo, e o aumento da resistência aos antimaláricos atualmente utilizados dificulta o controle dessa parasitose. Assim, é de interesse a descoberta de novas vias metabólicas que sirvam de alvos para o desenvolvimento de drogas para combater essa doença. Nosso laboratório, nos últimos anos, tem investido na caracterização de intermediários e produtos finais da via de isoprenóides. Baseando-se na presença das vias 2-C-metil-D-eritritol 4-fosfato e do chiquimato, decidimos verificar se ocorriam as biossínteses de retinóides e vitamina K no ciclo intraeritrocitário do P. falciparum, através da análise de produtos metabolicamente marcados com [1(n)-3H]-pirofosfato de geranilgranila por análises cromatográficas (HPLC e TLC), além da espectrometria de massas. Não identificamos a presença de retinal, retinol e ácido retinóico no ciclo intraeritrocitário do P. falciparum. Já a biossíntese de vitamina K precisa ser estudada com mais profundidade, pois há indícios de biossíntese, em especial da menaquinona-4. / Malaria is one of the most important parasitic diseases in the world. The spread of resistance to the antimalarials impairs the parasite\'s control. Therefore, is necessary the discovery of new metabolic routes to allow new antimalarials development. Our group has been studying the isoprenoid pathway, characterizing the intermediate and secondary products of this pathway. Based on the presence of 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate and shikimate pathways, we decided to investigate the occurrence of retinoids and vitamin K biosynthesis in P. falciparum, through the chromatography of [1(n)-3H]Geranylgeranylpyrophosphate labeled products of intraerythrocytic stages of P. falciparum, and mass espectometry analysis. The retinal, retinol and retinoic acid were not identified in P. falciparum. The results indicate the menaquinone-4 biosynthesis, although deeper investigation is necessary.

A resposta imune ao P. chabaudi se caracteriza pela ativação policlonal de linfócitos B na fase aguda da doença, que resulta em uma intensa produção de anticorpos IgM e IgG de baixa afinidade e autoanticorpos. Apesar de esses anticorpos contribuírem para o controle da infecção, pode retardar a geração de anticorpos de alta afinidade que garantem a destruição dos parasitas e a proteção contra infecções subseqüentes. O nosso objetivo foi caracterizar os mecanismos envolvidos na ativação policlonal dos linfócitos B na infecção pelo P. chabaudi AS. Os nossos resultados mostraram que a cooperação T-B e importante nessa fase da infecção. Os ensaios in vitro mostraram que os linfócitos T da fase aguda da infecção são capazes de estimular linfócitos B naives, aumentando a expressão do CD69 e induzindo proliferação e produção de anticorpos. A molécula de classe II do MHC é importante na ativação policlonal dos linfócitos B, aumentando a expressão do CD69 e induzindo a proliferação de anticorpos, devido ao seu envolvimento na ativação dos linfócitos T. Assim, moléculas como CD28, CD40L e ICOS são importantes na ativação, proliferação e produção de anticorpos. / Polyclonal B cell activation is a feature of the early spleen B cell response to human and murine malaria, which results in intense production of parasite low-affinity IgM and IgG and autoantibodies. Although this response may contribute for the initial parasite control, it may also hinder the generation of high-affinity IgG that guarantees parasite elimination and protection against secondary infections. To characterize the mechanism involved in the polyclonal B cell response to P. chabaudi AS, we have analyzed in vivo and in vitro the role of several molecules known to be involved in antibody production. According to our in vivo results, this response depends on the cooperation of CD4+ T cells with B cells. The in vitro assays shows that the expression of MHC class II molecules is crucial for B cell activation in terms of CD69 expression, proliferation and antibody production, apparently due to their requirement for T cell activation. Signaling pathways mediated by the co-stimulatory receptor CD28, CD40L and ICOS has a central role for B cell proliferative response and antibody production. This study may help to clarify the molecular basis of polyclonal B cell activation induced during acute malaria.

A malária é uma das principais e a mais disseminada das parasitoses humanas. A falta de uma vacina eficaz e o problema da resistência aos fármacos tem contribuído para o adiamento da solução do controle desta infecção. A busca de novos alvos biológicos tem se concentrado, em parte, na compreensão de vias metabólicas. Em P. falciparum, identificamos a biossíntese das duas formas da vitamina K (filoquinona e menaquinona). Na via MEP foram caracterizadas duas importantes enzimas bifuncionais, a farnesil difosfato sintase/geranilgeranil difosfato sintase (FPPS/GGPPS) capaz de formar farnesil difosfato e geranilgeranil difosfato e octaprenil pirofosfato sintase/fitoeno sintase (OPP/PSY) responsável pela biossíntese da cadeia isoprênica que se liga ao anel da via de ubiquinona, como também forma o primeiro caroteno na via de carotenóides. Este projeto tem como objetivo caracterizar o gene MenA da biossíntese de MQ, determinar a localização de FPPS/GGPPS em P. falciparum e investigar a importância de OPP/PSY e de FPPS/GGPPS no ciclo intraeritrocítico de P. falciparum. / Malaria is one of the main widespread human parasites. The lack of an effective vaccine and the problem of drug resistance haves contributed to the delay of the control solution of this infection. The search for new biological targets has focused in part on the understanding of metabolic pathways. In P. falciparum, identified the biosynthesis of the two forms of vitamin K (phylloquinone and menaquinone). In the MEP pathway were characterized two important bifunctional enzyme, farnesyl diphosphate synthase/geranylgeranyl diphosphate synthase (FPPS/GGPPS) able to form farnesyl diphosphate and geranylgeranyl diphosphate and octaprenyl pyrophosphate synthase/phytoene synthase (OPP/PSY) responsible for the biosynthesis of isoprenic side chains attached to the benzoquinone ring of ubiquinones, but also forms the first carotene in the carotenoid pathway. This project aims to characterize the MenA gene from the MQ biosynthesis, determine the localization of FPPS/GGPPS and investigate the importance of OPP/PSY and FPPS/GGPPS in intra-erythrocytic cycle of P. falciparum.

O desenvolvimento de antimaláricos é necessario pois, há linhagens de Plasmodium resistentes às drogas em uso e um alvo importante é a via de isoprenoides. Importantes alvos derivados desta via são: heme O já que, há antimaláricos relacionados ao heme; e a giberilina pois, há inibidores desta que não são prejudiciais ao homem. Inabenfide (INA) e uniconazol-P (UNP) inibem a biossíntese de giberilina em plantas e o crescimento de P. falciparum. Inicialmente, identificamos no parasita genes homólogos para a síntese de heme O e A, cox10 e 15, que codificam as enzimas HOS e HAS. Parasitas transgênicos com HOS e HAS marcados com GFP permitiram identificar a localização de cox10 no núcleo e de cox15 na mitocôndria. Identificamos heme O por marcações metabólicas e espectrometria de massa. Entretanto, não identificamos heme A e giberelina. INA e UNP diminuem a biossíntese de heme O e a parasitemia, observado por oxido-redução e marcação metabólica, o que torna a sintese de heme O um interessante alvo para antimaláricos. / The development of antimalarials is necessary because there are Plasmodium strains resistant to the drugs in use and an important target is the isoprenoid pathway. Targets derived from the isoprenoid pathway are: heme O as there are antimalarial drugs related to heme; And gibberillin, because there are inhibitors which are not harmful to man. Inabenfide (INA) and uniconazole-P (UNP) inhibit biosynthesis of gibberillin in plants and of growth the P. falciparum. Initially, we identified in P. falciparum genes homologous to cox10 and 15 encoding the enzymes (HOS and HAS) for synthesis of heme O and A. We created transgenic parasite lines which had HOS and HAS tagged to GFP. These revealed that the subcellular location of cox10 is in the nucleus and of cox15 in mitochondria. We identified heme O by metabolic labeling and mass spectrometry. However, no heme A or gibberellin was detected. INA and UNP decreased heme O biosynthesis and parasitemia as observed by oxido-reduction and metabolic labeling. Our data point to heme O as an important target for antimalarials.

Nosso grupo tem caracterizando diversos produtos da via de isoprenóides em Plasmodium falciparum que é promissora para o desenvolvimento de novas drogas. Dentre os compostos isoprenicos identificados estão as vitaminas K1 e E que apresentam uma cadeia isoprenica fitil. Em plantas o fitol é originado da degradação da clorofila. mas, como ainda não existem evidências da presença de clorofila no parasito, sugerimos que este possa ser formado pela degradação dessas vitaminas. Parte do fitol seria ligado a ácidos graxos utilizado como constituinte de membrana, e parte sofreria fosforilações, formando as vitaminas E e K1 como uma segunda via de biossíntese desse composto, assim como ocorre em Arabidopsis thaliana. Analises por HPLC e TLC utilizando o marcador [3H]GGPP, confirmaram a presença de fitol nos estágios intraeritrocíticos. Além disso, mostramos que o [3H]-fitol pode ser convertido em fitil-P e fitil-PP por uma atividade fitol quinase utilizando nucleotídeos como doador fosfato. / Our group has characterized differents products from isoprenoid pathway in Plasmodium falciparum which is promising for the development of new drugs. Among the isoprenics compounds identified there are the vitamins K1 and E which have a isoprenic phytyl side chain . In plants the phytol is obtained from the chlorophyll degradation. Until now theres no evidence that support its presence in the paraste. Our hypothesis that is phytol can be produced by the degradation of these vitamins E and K1. In the parasite phytol would fulfill to functions: used as a constituent of membrane, bounded to fatty acids and; be converted through phosphorylations vitamins E and K1 as a second biosynthetic pathway as well as in Arabidopsis thaliana. Analisys through and HPLC and TLC with radioactive [3H]GGPP confirmed the presence of phytol in intraerythrocytic stages. In addition, we showed that [3H]-phytol is converted into phytyl-P and phytyl-PP through a phytol kinasey using nucleotides as Phosphate donor.

Nesta dissertação, foi caracterizada a via de biossíntese de tiamina (Vitamina B1) nas três formas intraeritrocitárias de P. falciparum. Foram realizadas marcações metabólicas, utilizando diferentes precursores radioativos envolvidos na biossíntese de tiamina, já descritos para outros organismos. A utilização do precursor [1-14C] acetato de sódio demonstrou que a via de biossíntese de tiamina encontra-se ativa em todos os estágios intraeritrocitários de P. falciparum. Investigamos os precursores que poderiam estar envolvidos na biossíntese do intermediário tiazol, e nossos dados sugerem que a cistéina é a doadora do enxofre presente na molécula de tiamina; que o aminoácido tirosina pode ser o precursor da biossíntese de tiamina, e nicotinamida não é utilizada como precursor em P. falciparum. Também se avaliou o efeito da fosmidomicina e 3ClDHP e foi demonstrado que ambos propiciaram uma inibição no crescimento dos parasitas. Estes dados sugerem que a via de biossíntese de tiamina, pode ser explorada como alvo para drogas antimaláricas, devido ausência em humanos. / In the present work we have demonstrated the biosynthesis of thiamin (vitamin B1) in the intraerytrocytic stages of P. falciparum. We have demonstrated active biosynthesis of thiamine in the three parasite stages metabolically labeled with [1-14C] sodium acetate. We also investigated which precursors could be involved in the biosynthesis of the thiazole intermediate, by metabolic labelling with different precursors. Our data suggest that the sulphur present in the thiamine molecule is formed from cysteine white that tyrosine can be the precursor of thiamine biosynthesis. Nicotinamide is not utilized as a precursor in P.falciparum. We also investigated the effect of fosmidomycin (an inhibitor of the DOXP reductoisomerase in the MEP pathway) and 3CIDHP (an analogue of bacimethrin) in vitro cultures and both showed an inhibitory effect on parasite growth. These data suggest that the biosynthesis of thiamine can be an attractive target for the development of antimalarial drugs since this pathway is absent in humans.