Les infections aiguës des voies respiratoires inférieures constituent la troisième cause de décès dans la population mondiale, avec 3,2 millions de décès. Parmi cette mortalité, au tour de 1 million c’était des enfants de moins de 5 ans, représentant la première cause de mortalité dans ce groupe d’âge, selon l'OMS en 2015. Le virus respiratoire syncytial (VRS) est considéré comme un agent étiologique important dans le millieux pediatric et les estimations sont que ce virus cause 3 million d’hospitalization par an. Un aspect important du pronostic des infections virales est le rôle de co-infection bactérienne. La combinaison d’agents viraux et bactériens a été signalée entre le VRS et les bactéries Streptococcus pneumoniae. En raison de l’importance clinique de cette co-infection et le taux élevé de circulation du VRS, il est important de comprendre comment le système immunitaire est affecté à l'infection de ces deux agents pathogènes. Notre étude identifie la réponse immunitaire dans les macrophages, ainsi comme les interactions entre le VRS et le facteur de transcription p53. Les résultats montrent un profil particulier a cette co-infection mixte dans le macrophages et des modifications dans la réponse immune innée que nous a permis de mieux comprendre les mécanismes de pathogenèse du VRS dans les cellules épithélial pulmonaires en regardant la régulation de p53. Dans la dernière partie, nous avons évalué l'impact direct de l’infection mixte chez les primates non-humain et ce modèle nous a montré les difficultés et complexités des établir une pneumonie sévère. / Respiratory viruses play a leading role in the etiology of respiratory infections. Currently, respiratory syncytial virus (RSV) is generally considered to be the etiologic agent of respiratory disease in pediatric importance, as children can develop bronchiolitis and pneumonia when infected with the virus. The first RSV infection occurs in the first two years of life in about 95% of children, with the peak incidence occurring in the first few months of life. An important aspect of the prognosis of viral infections is the role of bacterial co-infection. The combination of viral and bacterial agents has been reported between RSV and Streptococcus pneumoniae bacteria. Because of the clinical importance of this co-infection and the high rate of RSV circulation, it is important to understand how the immune system is affected by the infection of both pathogens. Our study was designed to evaluate the immune response in macrophages, in addition to interactions between RSV and p53 transcription factor. The results show a particular profile of this mixed co-infection in macrophages and p53 regulation that implies several modifications in the innate immune response and that allowed us to better understand the mechanisms of pathogenesis of RSV in pulmonary epithelial cells. In the last part, we evaluated the direct impact of mixed co-infection in non-human primates and this model showed us the difficulties and complexities of establishing severe pneumonia.

Streptococcus pneumoniae est un pathogène humain majeur causant des pneumonies, méningites et septicémies. Pour assurer sa survie et sa dissémination le pneumocoque déploie un ensemble de facteurs de virulence favorisant l'invasion des tissus et l'évasion du système immunitaire. Une classe particulière de protéines dites « moonlighting », ne sont associées à aucun système d'export connu et pourtant se trouvent localisées en surface du pneumocoque. Les protéines « moonlighting » sont des protéines cytoplasmiques conservées, localisées dans divers compartiments cellulaires et présentant des fonctions additionnelles. La glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) est retrouvée en surface de nombreuses cellules et exerce divers rôles dans les processus de virulence d'organismes pathogènes. La GAPDH de surface du pneumocoque agit comme un facteur de virulence en recrutant le plasminogène / la plasmine de l'hôte, ce qui facilite l'invasion bactérienne à travers la matrice extracellulaire et les barrières endothéliales et épithéliales. Cependant, les mécanismes permettant l'export et la fixation de la GAPDH à la surface de la bactérie n'avaient pas encore été découverts. Ce travail démontre que la GAPDH est relarguée par lyse cellulaire et s'associe au peptidoglycane. C1q, un composant clé de la voie classique du complément, est un acteur majeur dans la réponse aux infections microbiennes et peut également détecter des éléments nocifs du soi-altéré comme les cellules apoptotiques. L'usage d'approches expérimentales complémentaires a permis d'identifier la GAPDH comme un partenaire de C1q quand elle est exposée en surface de S. pneumoniae et de cellules apoptotiques humaines. Néanmoins et de manière plutôt inattendue, seule la GAPDH du pneumocoque active la cascade du complément à la différence de la protéine homologue humaine. Ces résultats encouragent la poursuite d'études afin de comprendre comment la reconnaissance par C1q de deux protéines très proches peut conduire à de telles différences sur ses propriétés d'activation du complément. / Streptococcus pneumoniae is a major human pathogen, which causes pneumonia, meningitis and septicemia. To insure its survival and dissemination, the pneumococcus deploys an array of virulence factors promoting invasion of tissues and evasion from the immune system. A particular class of proteins not associated with any known export system, the moonlighting proteins, is found at the pneumococcal surface. Moonlighting proteins are conserved cytoplasmic metabolic enzymes or molecular chaperones localized in various cellular compartments and exhibiting additional functions. The glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) is found at the surface of numerous eukaryotic and prokaryotic cells, and display diverse roles in the virulence processes of pathogenic organisms. The pneumococcal surface GAPDH acts as a virulence factor by binding to host plasminogen/plasmin, which facilitates the bacterial invasion through the extracellular matrix and the endothelial and epithelial cell barriers. However, the mechanisms leading to the GAPDH export and binding to the bacterial surface had not been deciphered yet. This work demonstrates that the GAPDH is released upon cell lysis and associates with the peptidoglycan. C1q, a key component of the classical complement pathway, is a major player in the response to microbial infection and has been shown to detect noxious altered-self substances such as apoptotic cells. The use of complementary experimental approaches allowed the identification of the GAPDH as a C1q partner when exposed at the surface of S. pneumoniae and human apoptotic cells. However, and rather unexpectedly, the pneumococcal GAPDH activates the complement cascade unlike the human one. Those results encourage further studies in order to understand how C1q recognition of two closely related proteins can lead to such striking differences on its complement activation properties.

Klebsiella pneumoniae carbapenemase producing Klebsiella pneumoniae (KPC-Kp) is an emerging pathogen with acquired resistance to several antimicrobial classes and produces infections associated with considerable mortality. This study aims to identify risk factors for acquisition of hospital infections caused by KPC-Kp and to identify the clinical outcomes of these patients. This is a case-control study performed at a tertiary teaching hospital with 365 beds. The cases with hospital infection caused by KPC-Kp were compared with controls admitted to the same hospital paired by gender, age group and admission entry in a proportion of 2:1. During the period from February 2013 to August 2014, 22 patients were included in the study as cases and 44 as controls. The following independent risk factors for acquisition of hospital infections caused by KPC-Kp were identified: presence of a central venous catheter (OR 21.89; 95% CI 3.7 129.0); admission in an intensive care unit (OR 8.05; 95% CI 1.5 43.2); use of beta-lactams associated with or without beta-lactamase inhibitors (OR 6.02; 95% CI 1.1 32.6); use of carbapenems (OR 11.01; 95% CI 2.1 58.0) and the use of polymyxin B (OR 15.74; 95% CI 1.3 194.2). The crude case mortality rate was 36.8% (P=0.004). Infections caused by KPC-Kp are severe with an elevated mortality. To avoid unnecessary usage of antimicrobials, mainly beta-lactams, carbapenems and polymyxin B appear to be an essential way to control these infections. / Klebsiella pneumoniae produtora de klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC-Kp) é um patógeno emergente, com resistência a várias classes de antibióticos, sendo que suas infecções são associadas a considerável mortalidade. Este estudo tem como objetivo identificar fatores de risco para aquisição de infecções hospitalares causadas por KPC-Kp e identificar o desfecho clínico dos pacientes que adquirem essas infecções. Este é um estudo de caso-controle realizado em um hospital-escola terciário de 365 leitos. Os casos com infecção hospitalar por KPC-Kp foram comparados com controles internados no mesmo hospital, pareados por sexo, faixa etária e data de internação, na proporção de 2:1. Durante o período de fevereiro de 2013 a agosto de 2014, 22 pacientes foram incluídos no estudo como casos e 44 como controles. Foram identificados, como fatores de risco independentes para infecções hospitalares causadas por KPC-Kp, o uso de cateter venoso central (OR 21.89; 95% CI 3.7 129.0); a internação em unidade de tratamento intensivo (OR 8.05; 95% CI 1.5 43.2); o uso de b-lactâmicos associados ou não a inibidores de b-lactamase (OR 6.02; 95% CI 1.1 32.6); o uso de carbapenêmicos (OR 11.01; 95% CI 2.1 58.0); e o uso de polimixina B (OR 15.74; 95% CI 1.3 194.2). A mortalidade por qualquer causa nos casos considerados foi de 36,8% (p=0,004). Infecções por KPC-Kp são infecções graves com elevada mortalidade. Evitar o uso desnecessário de antibióticos, principalmente de b-lactâmicos, carbapenêmicos e polimixina B, parece ser caminho essencial para que se atinja o controle dessas infecções.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Plasmídios são DNA extracromossômicos, com capacidade de se duplicarem de forma independente das células que os albergam, e são responsáveis pela expressão de uma variedade de características, como fatores de virulência. O material do presente estudo se constituiu da cepa receptora E. coli K12-R23, e de cepas de Klebsiella pneumoniae e de Escherichia coli, doadoras de plasmídios R e transconjugantes. O objetivo do presente estudo foi analisar os fenótipos conferidos em cepas transconjugantes de ambas bactérias pela transferência de plasmídios R de cepas doadoras para a receptora. Para a análise dos fenótipos, utilizaram-se, nas cepas do estudo, algumas variáveis: sensibilidade a antimicrobianos e a ERO, aderência a células HEp-2, e formação de slime e de biofilme. O marcador da presença de plasmídio, neste trabalho, foi a presença de resistênca à gentamicina nas cepas doadoras. Os resultados indicaram que houve transferência de plasmídio, pois as cepas transconjugantes de K. pneumoniae e de E. coli apesentaram este marcador (foram resistentes à gentamicina); além disso, as cepas transconjugantes mostraram perfis distintos da receptora em relação à sensibilidade aos antimicrobianos, às ERO, aos padrões de aderência às células HEp-2 e à formação de slime, apesar de a formação de biofilme nestas cepas não ter sofrido modificações. Observou-se, contudo, que várias características das cepas doadoras não foram encontradas nas cepas transconjugantes de E. coli e de K. pneumoniae. / Plasmids are extrachromosomal DNA that have the ability to duplicate independently of the host cells. Plasmids are responsible for the expression of a variety of characteristics of the cells, such as virulence factors. The present study utilized a receptor strain of E. Coli K12-R23 and strains of Klebsiella pneumoniae and E. coli which were R plasmids donor strains and transconjugant ones. The objective of this study was to analyze the attributed phenotypes of transconjugant strains in both bacteria caused by transference of R plasmids from the donor strains to the receptor ones. In order to analyze these phenotypes, the following variables were selected: sensitivity to antimicrobials and ROS, adherence to HEp-2 cells, and slime and biofilm structures. The marker of the presence of plasmids was gentamycin resistance in the donor strains. The observed results indicated that there was plasmid transfer; given that Klebsiella pneumoniae and E. coli strains presented the marker (e.g. they became resistant to gentamycin). Moreover, transconjugant strains have showed distinct profiles from the receptor strain concerning sensitivity to antimicrobials, ROS, adherence patterns to HEp-2 cells and slime structure. On the other hand, the biofilm structure of these strains did not present modifications. Yet, it was observed that several characteristics of the donor strains were not found in the transconjugant strains of E. coli and K. pneumoniae.

As enterobactérias são importantes pátogenos comunitários e hospitalares e o aparecimento cada vez mais frequente de cepas multirresistentes tem sido motivo de preocupação em hospitais e instituições de saúde por todo o mundo, devido às opções terapêuticas restritas. Nas últimas décadas, o aumento global de cepas produtoras de β-lactamases plasmidiais induzíveis e β-lactamases de espectro estendido (ESBL), fizeram com que os carbapenêmicos fossem considerados a primeira opção para o tratamento de infecções graves. No entanto, a resistência aos carbapenêmicos já é considerada um problema de saúde pública em diversos países e a produção da enzima Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) tem sido descrita como o principal mecanismo de resistência a esta classe de antibióticos na família Enterobacteriaceae. Considerando que apenas relatos esporádicos de cepas produtoras de KPC têm sido reportados no Rio Grande do Sul (RS), em contraste à situação de muitos estados brasileiros, este estudo teve por objetivo estabelecer a prevalência de KPC entre isolados com reduzida sensibilidade aos carbapenêmicos provenientes de 11 hospitais do RS, promover a caracterização molecular destes isolados, bem como avaliar as principais metodologias fenotípicas utilizadas na sua detecção. Diferenças significativas foram observadas entre os perfis de sensibilidade a imipenem (IPM) e meropenem (MEM), quando comparados ao de ertapenem (ERT), sendo que para este último menos de 10% dos isolados foram considerados sensíveis em comparação a mais de 73% para os dois primeiros. Nossos resultados também demonstraram que a redução de sensibilidade aos carbapenêmicos esteve associada à produção de β-lactamases do tipo AmpC e ESBL, em detrimento de carbapenemases. Dentre as principais carbapenemases encontradas em enterobactérias, apenas cepas produtoras de KPC foram detectadas entre os isolados estudados, cuja prevalência foi de 4%. Entre os produtores de KPC, foram identificadas espécies de E. cloacae, K. pneumoniae, S. marcescens e K. georgiana, provenientes de quatro hospitais distintos. A análise por sequenciamento revelou que todos foram produtores da enzima KPC-2. Quanto ao perfil de sensibilidade, a maioria foi altamente resistente aos β-lactâmicos e às quinolonas, enquanto que, amicacina e polimixima foram os antibióticos mais efetivos contra os isolados in vitro. Dois grupos clonais foram evidenciados entre os isolados de E. cloacae e S. marcescens e quatro entre os isolados de K. pneumoniae, na análise por PFGE. Com relação ao contexto genético que envolve o blaKPC-2, apenas uma caracterização parcial foi possível, evidenciando uma plataforma alterada em relação ao ambiente genético clássico (Tn4401). A análise plasmidial dos produtores de KPC resultou em plasmídeos de tamanhos variáveis, evidenciando a maior prevalência de plasmídeos de ~20Kb no carreamento do gene. A análise também revelou que todos foram não- tipáveis pela técnica de PBRT. Com relação às metodologias fenotípicas utilizadas na detecção de KPC, o IPM apresentou melhor desempenho que o MEM na realização do teste de discos combinados com ácido borônico (AB), resultando em 100% de sensibilidade (SN) e 96.1% de especificidade (SP). A quantificação do Teste Modificado de Hodge (MHT), proposta neste trabalho, eliminou a subjetividade na sua interpretação e evidenciou um aumento considerável na SP do teste em relação à metodologia convencional. Em conclusão, nossos resultados confirmaramm a elevada plasticidade genética e os diversos fenótipos observados na família Enterobacteriaceae; contribuíram para o conhecimento da epidemiologia local de resistência aos carbapenêmicos e dos isolados produtores de KPC; bem como reforçaram o valor das metodologias fenotípicas como ferramenta capaz de discriminar os mecanismos envolvidos na resistência aos carbapenêmicos. / The Enterobacteriaceae family includes important community and nosocomial pathogens frequently associated to multirresistance. Multidrug-resistant strains represent an important concern among hospitals and healthcare institutions around the world, due to the limited therapeutic options. In recent decades, the overall increase of strains producing inducible β-lactamases and extended spectrum β-lactamases (ESBL) has lead to the use of carbapenems as the first option for the treatment of serious infections. However, the carbapenem resistance has been considered a public health problem in many countries and the production of the enzyme Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) has been described as the major resistance mechanism to carbapenems in this family. Whereas only sporadic reports of KPC-producing strains have been reported in Rio Grande do Sul (RS), in contrast to the situation in many Brazilian states, this study aimed to establish the prevalence of KPC among isolates with reduced susceptibility to carbapenems from 11 disctinct hospitals of RS, promote the molecular characterization of these isolates, as well as evaluate the main phenotypic methods used for KPC detection. Significant differences were observed among the susceptibility profiles of imipenem (IPM) and meropenem (MEM), when compared to ertapenem (ERT): less than 10% of the isolates were classified as susceptible to ERT compared to over 73% to IPM and MEM. Our results demonstrated that the reduced susceptibility to carbapenems, was mainly due to the production of AmpC β-lactamases and ESBL, instead of true carbapenemases. Regarding the major carbapenemases found in Enterobacteriaceae, only KPC was detected among the isolates studied, at a prevalence of 4%. KPC producers included the species E. cloacae, K. pneumoniae, S. marcescens and K. georgiana, from four different hospitals. The sequencing analysis demonstrated that all of them were KPC-2 producers. According to the susceptibility profile, most were highly resistant to β-lactams and quinolones, whereas polymyxin and amikacin were the most effective drugs in vitro. Two clonal groups were detected among isolates of E. cloacae and S. marcescens and four among isolates of K. pneumoniae, by PFGE analysis. Only a partial characterization of the genetic context that involves the blaKPC-2 gene was possible for these isolates, indicating an altered platform compared to the classic genetic environment (Tn4401). The plasmid analysis indicated plasmids of variable sizes, with a higher prevalence of those of ~ 20Kb involved with the blaKPC-2 gene. The analysis also showed that all of them were non-typable by PBRT technique. With respect to the phenotypic methods used for KPC detection, IPM proved to present a better performance than MEM in the combined-disc test with boronic acid (AB), resulting in 100% of sensitivity (SN) and 96.1% of specificity (SP). The quantification of Modified Hodge Test (MHT), proposed in this study, eliminated the subjectivity of this test leading to a considerable increase in the SP of the test compared to the conventional methodology. In conclusion, our results confirmed the high genetic plasticity and the distinct phenotypes observed in the Enterobacteriaceae family; contributed to the knowledge of the local epidemiology of carbapenem resistance and for KPC-producing isolates; as well as reinforced the use of phenotypic methods as an useful tool able to discriminate the mechanisms involved in carbapenem resistance.

KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemases) são -lactamases da classe A de Ambler globalmente disseminadas, com 10 variantes, sendo predominates KPC-2 e KPC-3. O objetivo deste trabalho foi estudar a genética e epidemiologia molecular de enterobactérias resistentes aos carbapenêmicos isoladas no Brasil. Sessenta e quatro enterobactérias resistentes aos carbapenêmicos foram analisadas: 57 Klebsiella pneumoniae (Kp), 5 Enterobacter cloacae (Ecl), 1 Serratia marcescens (Sm) e 1 Citrobacter freundii (Cf), de diferentes pacientes, em seis hospitais e em duas distintas regiões do Brasil. Identificação e testes de sensibilidade antimicrobiana foram realizados por sistemas semi-automáticos e métodos padronizados. A relação clonal foi estabelecido por Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) e também por tipagem por sequenciamento de multilocus no caso de K. pneumoniae. A presença de genes que codificam carbapenemases e -lactamases de espectro estendido foi pesquisada. A caracterização de blaKPC-2, do ambiente genético e de plasmídeos incluiu PCR e sequenciamento, análises de RFLP, S1-PFGE e hibridação. Os isolados Kp corresponderam a 5 pulsotipos, por PFGE, ligados a 6 tipos de sequência (ST): KPA-ST258 (n = 51 com 6 subtipos), KpA6-ST11 (n = 1), KPB-ST327 (n = 1), KPC-ST44 (n = 2), KPD-ST437 (n = 1) e KPE-ST48 (n = 1). Ecl foram agrupados em clones e e, Sm e Cf representam um clone cada. Todos os isolados foram resistentes aos -lactâmicos, sensíveis à colistina e tigeciclina e mostraram fenótipos variáveis contra aminoglicosídeos, quinolonas, nitrofurantoína e sulfametoxazol-trimetoprim. Heterorresistência a carbapenêmicos foi observada para isolados de Kp e Cf, conforme relatado anteriormente com produtores de KPC-2 e VIM. Esse estudo relata a disseminação do gene blaKPC-2 nos estados de São Paulo e Rio de Janeiro facilitada por clones de K. pneumoniae pertencentes ao globalmente disseminado Complexo Clonal CC258 (ST258, ST437 e ST11) e uma diversidade de plasmídeos (IncFII-KpA, IncN-Kp e Ecl, IncL/M-Sm e Cf e, dois plasmídeos não-tipáveis carreando Tn4401a ou Tn4401b) disseminados com sucesso entre as enterobactérias. Constitui também a primeira descrição do ST258 no Brasil associada a um surto em um hospital universitário da cidade de Ribeirao Preto. Este trabalho apontou a alta diversidade de elementos genéticos disponíveis abrigando blaKPC-2. Isso poderia ampliar enormemente a disseminação desse gene no Brasil como também no continente. / KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemases) are globally spread -lactamases of the Ambler class A comprising 10 variants, KPC-2 and KPC-3 being predominant. The objective of this work was study the genetic and molecular epidemiology of carbapenem resistant-enterobacterial isolates in Brazil. Sixty-four carbapenem resistant isolates were analyzed: 57 Klebsiella pneumoniae (Kp), 5 Enterobacter cloacae (Ecl), 1 Serratia marcescens (Sm) and 1 Citrobacter freundii (Cf) from different patients at six hospitals in two different Brazilian regions. Identification and antimicrobial susceptibility testing were accomplished by using semiautomatic systems and standard methods. Clonal relatedness was established by Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE) and also by multilocus sequence typing in the case K. pneumoniae isolates. The presence of genes encoding carbapenemases and extended spectrum -lactamases was searched. Characterization of blaKPC-2, genetic environment and plasmids included PCR and further sequencing, RFLP analyses, S1-PFGE and hybridization. The Kp isolates corresponded to 5 PFGE types linked to 6 sequence types (ST): KpA-ST258 (n=51 comprising 6 subtypes), KpA6-ST11 (n=1), KpB-ST327 (n=1), KpC-ST44 (n=2), KpD-ST437 (n=1) and KpE-ST48 (n=1). Ecl isolates were grouped in and clones and, Sm and Cf represent one clone each. All isolates were resistant to -lactams, susceptible to colistin and tigecycline and showed variable phenotype against aminoglycosides, quinolones, nitrofurantoin and trimethoprim-sulfamethoxazole. Heteroresistance to carbapenems was observed for Kp and Cf isolates, as previously reported to KPC-2 and VIM producers. This study reports the spread of blaKPC-2 in Sao Paulo and Rio de Janeiro states facilitated by globally spread CC258-K. pneumoniae clones (ST258, ST11, ST437) and a diversity of plasmids (IncFII-KpA, IncN-Kp and Ecl, IncL/M-Sm and Cf and, two untypeable plasmids carrying Tn4401a or Tn4401b) successfully disseminated among Enterobacteriaceae species. It also constitutes the first description of ST258 in Brazil which was associated with a hospital outbreak in Ribeirao Preto city. This work pointed out the high diversity of available genetic elements harboring blaKPC-2. This might greatly amplify the dissemination of KPC genetic in Brazil and within of the South America continent.

As enterobactérias são importantes pátogenos comunitários e hospitalares e o aparecimento cada vez mais frequente de cepas multirresistentes tem sido motivo de preocupação em hospitais e instituições de saúde por todo o mundo, devido às opções terapêuticas restritas. Nas últimas décadas, o aumento global de cepas produtoras de β-lactamases plasmidiais induzíveis e β-lactamases de espectro estendido (ESBL), fizeram com que os carbapenêmicos fossem considerados a primeira opção para o tratamento de infecções graves. No entanto, a resistência aos carbapenêmicos já é considerada um problema de saúde pública em diversos países e a produção da enzima Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) tem sido descrita como o principal mecanismo de resistência a esta classe de antibióticos na família Enterobacteriaceae. Considerando que apenas relatos esporádicos de cepas produtoras de KPC têm sido reportados no Rio Grande do Sul (RS), em contraste à situação de muitos estados brasileiros, este estudo teve por objetivo estabelecer a prevalência de KPC entre isolados com reduzida sensibilidade aos carbapenêmicos provenientes de 11 hospitais do RS, promover a caracterização molecular destes isolados, bem como avaliar as principais metodologias fenotípicas utilizadas na sua detecção. Diferenças significativas foram observadas entre os perfis de sensibilidade a imipenem (IPM) e meropenem (MEM), quando comparados ao de ertapenem (ERT), sendo que para este último menos de 10% dos isolados foram considerados sensíveis em comparação a mais de 73% para os dois primeiros. Nossos resultados também demonstraram que a redução de sensibilidade aos carbapenêmicos esteve associada à produção de β-lactamases do tipo AmpC e ESBL, em detrimento de carbapenemases. Dentre as principais carbapenemases encontradas em enterobactérias, apenas cepas produtoras de KPC foram detectadas entre os isolados estudados, cuja prevalência foi de 4%. Entre os produtores de KPC, foram identificadas espécies de E. cloacae, K. pneumoniae, S. marcescens e K. georgiana, provenientes de quatro hospitais distintos. A análise por sequenciamento revelou que todos foram produtores da enzima KPC-2. Quanto ao perfil de sensibilidade, a maioria foi altamente resistente aos β-lactâmicos e às quinolonas, enquanto que, amicacina e polimixima foram os antibióticos mais efetivos contra os isolados in vitro. Dois grupos clonais foram evidenciados entre os isolados de E. cloacae e S. marcescens e quatro entre os isolados de K. pneumoniae, na análise por PFGE. Com relação ao contexto genético que envolve o blaKPC-2, apenas uma caracterização parcial foi possível, evidenciando uma plataforma alterada em relação ao ambiente genético clássico (Tn4401). A análise plasmidial dos produtores de KPC resultou em plasmídeos de tamanhos variáveis, evidenciando a maior prevalência de plasmídeos de ~20Kb no carreamento do gene. A análise também revelou que todos foram não- tipáveis pela técnica de PBRT. Com relação às metodologias fenotípicas utilizadas na detecção de KPC, o IPM apresentou melhor desempenho que o MEM na realização do teste de discos combinados com ácido borônico (AB), resultando em 100% de sensibilidade (SN) e 96.1% de especificidade (SP). A quantificação do Teste Modificado de Hodge (MHT), proposta neste trabalho, eliminou a subjetividade na sua interpretação e evidenciou um aumento considerável na SP do teste em relação à metodologia convencional. Em conclusão, nossos resultados confirmaramm a elevada plasticidade genética e os diversos fenótipos observados na família Enterobacteriaceae; contribuíram para o conhecimento da epidemiologia local de resistência aos carbapenêmicos e dos isolados produtores de KPC; bem como reforçaram o valor das metodologias fenotípicas como ferramenta capaz de discriminar os mecanismos envolvidos na resistência aos carbapenêmicos. / The Enterobacteriaceae family includes important community and nosocomial pathogens frequently associated to multirresistance. Multidrug-resistant strains represent an important concern among hospitals and healthcare institutions around the world, due to the limited therapeutic options. In recent decades, the overall increase of strains producing inducible β-lactamases and extended spectrum β-lactamases (ESBL) has lead to the use of carbapenems as the first option for the treatment of serious infections. However, the carbapenem resistance has been considered a public health problem in many countries and the production of the enzyme Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) has been described as the major resistance mechanism to carbapenems in this family. Whereas only sporadic reports of KPC-producing strains have been reported in Rio Grande do Sul (RS), in contrast to the situation in many Brazilian states, this study aimed to establish the prevalence of KPC among isolates with reduced susceptibility to carbapenems from 11 disctinct hospitals of RS, promote the molecular characterization of these isolates, as well as evaluate the main phenotypic methods used for KPC detection. Significant differences were observed among the susceptibility profiles of imipenem (IPM) and meropenem (MEM), when compared to ertapenem (ERT): less than 10% of the isolates were classified as susceptible to ERT compared to over 73% to IPM and MEM. Our results demonstrated that the reduced susceptibility to carbapenems, was mainly due to the production of AmpC β-lactamases and ESBL, instead of true carbapenemases. Regarding the major carbapenemases found in Enterobacteriaceae, only KPC was detected among the isolates studied, at a prevalence of 4%. KPC producers included the species E. cloacae, K. pneumoniae, S. marcescens and K. georgiana, from four different hospitals. The sequencing analysis demonstrated that all of them were KPC-2 producers. According to the susceptibility profile, most were highly resistant to β-lactams and quinolones, whereas polymyxin and amikacin were the most effective drugs in vitro. Two clonal groups were detected among isolates of E. cloacae and S. marcescens and four among isolates of K. pneumoniae, by PFGE analysis. Only a partial characterization of the genetic context that involves the blaKPC-2 gene was possible for these isolates, indicating an altered platform compared to the classic genetic environment (Tn4401). The plasmid analysis indicated plasmids of variable sizes, with a higher prevalence of those of ~ 20Kb involved with the blaKPC-2 gene. The analysis also showed that all of them were non-typable by PBRT technique. With respect to the phenotypic methods used for KPC detection, IPM proved to present a better performance than MEM in the combined-disc test with boronic acid (AB), resulting in 100% of sensitivity (SN) and 96.1% of specificity (SP). The quantification of Modified Hodge Test (MHT), proposed in this study, eliminated the subjectivity of this test leading to a considerable increase in the SP of the test compared to the conventional methodology. In conclusion, our results confirmed the high genetic plasticity and the distinct phenotypes observed in the Enterobacteriaceae family; contributed to the knowledge of the local epidemiology of carbapenem resistance and for KPC-producing isolates; as well as reinforced the use of phenotypic methods as an useful tool able to discriminate the mechanisms involved in carbapenem resistance.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-01-27T13:46:56Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Tese - Yves Mauro Fernandes Ternes - 2014.pdf: 5561765 bytes, checksum: 46838b1cfdd58678c8db3a46e445ce06 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-01-28T11:32:01Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Tese - Yves Mauro Fernandes Ternes - 2014.pdf: 5561765 bytes, checksum: 46838b1cfdd58678c8db3a46e445ce06 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-28T11:32:01Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Tese - Yves Mauro Fernandes Ternes - 2014.pdf: 5561765 bytes, checksum: 46838b1cfdd58678c8db3a46e445ce06 (MD5) Previous issue date: 2014-04-28 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Fundação de Apoio à Pesquisa - FUNAPE / 10-valent conjugate pneumococcal vaccine (PCV10) was introduced in the routine immunization at Goiania in June, 2010. The aims of this study were: (i) to evaluate the direct effect of PCV10 in preventing vaccine types nasopharyngeal/NP pneumococcal carriage in younger children according to different schedules; (ii) to investigate possible genetic changes that could interfere in the pneumococcal capsular typing. Methods: A cross-sectional population-based household survey was conducted in Goiania, Brazil, from December/2010-February/2011, targeting children aged 7-18 months. To evaluate PPCV10 effectiveness/VE, NP swabs, clinical and demographic data, and vaccination dates were collected from 1,287 children during home visits. Main outcome and exposure of interest were PCV10 vaccine-type (VT) carriage and dosing schedules (3p+0, 2p+0, and one catch-up dose), respectively. Pneumococcal carriage was defined by positivity in culture after of NP secretions in enrichment broth and isolates serotyping was performed by Quellung reaction. The nontypeable isolates were processed by conventional multiplex PCR (cmPCR). Rate ratio/RR was calculated as the ratio between the prevalence of VTs carriage in children vaccinated with different schedules (exposed) and not vaccinated to PCV10 (non-exposed). Adjusted RR was estimated using Poisson regression. VE on VT carriage was calculated as 1-RR*100. Results: The prevalence of pneumococcal carriage in a total of 1,287 children was 41.0% (95%CI: 38.4%-43.7%). Serotypes covered by PCV10 and PCV13 were 35.2% and 53.0%, respectively. Serotypes 6B (11.6%), 6A (9,8%), 23F (7.8%), 14 (6.8%), 19F (6.6%), and 19A (6,3%) were the most frequently observed. After adjusted for confounders, children who had received 2p+0 or 3p+0 dosing schedule presented a significant reduction on pneumococcal VT carriage, with PCV10 VE equal to 35.9% (95%CI: 4.2%-57.1%; p=0.030) and 44.0% (95%CI: 14.2%-63.5%; p=0.008), respectively, when compared with unvaccinated children. For children who received one catch-up dose, no significant VE was detected (p=0.905). We identified 13 samples with a genetic variation that underestimated the capsular typing for 19F by cmPCR. Conclusion: PCV10 was associated with high protection against vaccine-type carriage for children vaccinated before the second year of life, for 2p+0 and 3p+0 schedules. The identification of genetic variations (19Fv) allowed adapt the molecular technique (cmPCR) for capsular typing samples from Latin America. The continuous evaluation of carriage serotype is mandatory to evaluate the long-term effectiveness and impact of pneumococcal vaccine on serotypes reduction. / A vacina pneumocócica conjugada 10-valente (PCV10) foi introduzida no calendário básico de imunização em Goiânia em junho de 2010. Este estudo teve como objetivos: (i) Avaliar o efeito direto da PCV10 na redução de sorotipos vacinais de Streptococcus pneumoniae (pneumococo) na nasofaringe (NP) de crianças, de acordo com diferentes esquemas vacinais; (ii) investigar possíveis alterações genéticas que possam interferir na tipagem capsular dos pneumococos isolados. Métodos: Um estudo de corte transversal aninhado a um inquérito domiciliar de base populacional foi conduzido em Goiânia, de dezembro/2010 a fevereiro/2011, em crianças de 7-18 meses. Para avaliar a efetividade da PCV10 (VE), swabs de NP, dados clínicos e demográficos e datas da administração da vacina foram obtidos de 1.287 crianças durante as visitas domiciliares. As variáveis de desfecho e de exposição foram portador (colonização) por tipos vacinais (VTs) da PCV10 e esquemas vacinais (3p+0, 2p+0 e dose única – catch-up), respectivamente. A colonização pelo pneumococo foi definida pela positividade à cultura das secreções de NP em caldo enriquecido, e a sorotipagem dos isolados foi realizada pela reação de Quellung. Os isolados não tipáveis foram submetidos à PCR multiplex convencional (cmPCR). A razão de prevalência (rate ratio/RR) foi calculada como a razão entre a prevalência de VTs em crianças vacinadas com diferentes esquemas vacinais (expostas) e não vacinadas pela PCV10 (não expostas). A RR ajustada foi estimada utilizando a regressão de Poisson. A VE no estado de portador por VTs foi calculada como (1-RR) x 100. Resultados: A prevalência de portador pelo pneumococo no total de 1.287 crianças foi 41,0% (IC95%; 38,4-43,7). Os sorotipos presentes na PCV10 e PCV13 foram 35,2% e 53,0%, respectivamente. Os sorotipos mais frequentes foram 6B (11,6%), 6A (9,8%), 23F (7,8%), 14 (6,8%), 19F (6,6%) e 19A (6,3%). Após ajustar pelas variáveis de confusão, crianças que receberam os esquemas 2p+0 ou 3p+0 apresentaram uma redução significativa dos VTs, com VE igual a 35,9% (IC95%: 4,2-57,1; p=0,030) e 44,0% (IC95%: 14,2-63,5; p=0,008), respectivamente, quando comparado com crianças não vacinadas. Crianças que receberam dose única catch-up não apresentaram VE significante (p=0.905). Foram identificadas 13 amostras que apresentaram uma variação gênica que subestimava a tipagem capsular do 19F pela técnica cmPCR. Conclusões: a PCV10 foi associada a uma proteção significativa contra colonização nasofaringeana de VTs crianças menores de um ano, quando utilizados os esquemas vacinais 3p+0 ou 2p+0. A identificação de variações genéticas do sorogrupo 19 (19Fv) permitiu adequar a técnica de cmPCR para tipagem de amostras da América Latina. O monitoramento contínuo de sorotipos no portador é fundamental na avaliação da efetividade a longo prazo e o impacto da vacinação na redução dos sorotipos vacinais.

Realizamos um estudo de corte transversal para investigar os fatores de risco para colonização de recém-nascidos por Klebsiella pneumoniae produtora de betalactamase de espectro estendido durante surto em unidade neonatal de risco intermediário. O surto se deveu à colonização crônica de profissional de saúde portadora de onicomicose. Cento e vinte recém-nascidos internados na unidade neonatal durante um período de três meses foram rastreados para colonização por Klebsiella pneumoniae produtora de ESBL através de cultura de swab retal, sendo detectados 27 colonizados. A análise multivariada mostrou que a colonização se associou de forma independente ao uso prévio de antimicrobianos e à ausência de aleitamento materno. Os antimicrobianos mais utilizados foram penicilina e amicacina. Uso prévio de antimicrobianos apresentou odds ratio (OR) igual a 12,3 [intervalo de 95% de confiança (IC): 3,66-41,2, P<0,001]. Aleitamento materno foi associado à redução do risco de colonização (OR: 0,22; IC95%: 0,05-0,99; P=0,049). Nove isolados recuperados no primeiro estágio do surto e 27 isolados de culturas de rastreamento foram posteriormente tipadas por eletroforese em gel de campo pulsado, revelando seis apresentações distintas (A a F). No primeiro estágio do surto ocorreram os clones A, C e E, enquanto entre os 27 isolados das culturas de rastreamento os seis clones foram identificados. O clone A também foi identificado nas mãos de técnica de enfermagem portadora de onicomicose. Pudemos concluir que uso prévio de antimicrobianos predispôs à colonização. O possível efeito do aleitamento materno como fator protetor deve ser mais bem investigado. A detecção de diferentes genótipos de K. pneumoniae sugere que a disseminação de elementos móveis portando o gene ESBL tenha se superposto à simples disseminação de um clone durante o surto / We describe a cross-sectional survey to identify risk factors for colonisation of neonates by extended-spectrum beta-lactamase producing Klebsiella pneumoniae. This occurred following exposure to a colonised healthcare worker during an outbreak in an intermediate-risk neonatal unit. In total, 120 neonates admitted consecutively during a three-month period were screened for ESBL-producing K. pneumoniae by rectal swabbing and 27 were identified as colonised. Multivariate analysis showed colonisation to be independently associated with use of antibiotics and absence of breastfeeding. Previous use of antibiotics presented an odds ratio (OR) of 12,3 [95% confidence interval (CI): 3,66-41,2, P<0,001]. The most commonly used antibiotics were penicillin and amikacin. Breastfeeding was associated with reduced risk for colonisation (OR: 0,22; 95% CI: 0,05-0,99; P=0,049). Nine isolates recovered during the first stage of the outbreak and 27 isolates from surveillance cultures were typed thereafter by pulsed-field gel electrophoresis, revealing six different profiles (A - F). Clones A, C, and E were implicated in the first stage of the outbreak, whereas among the 27 strains recovered from surveillance cultures, all six clones were identified. Clone A was also found on the hand of a nursing auxiliary with onychomycosis. We concluded that prior antimicrobial use predisposed to colonisation. The possible role of breastfeeding as a protective factor needs to be further elucidated. Detection of different genotypes of ESBL-producing K. pneumoniae suggests that dissemination of mobile genetic elements bearing the ESBL gene may have been superimposed on the simple dissemination of a clone during the outbreak

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-03-29T19:34:49Z No. of bitstreams: 1 brunofariafernandes.pdf: 1082641 bytes, checksum: 63a37643d4eb9ed5cb93b5bbfdfe5f62 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-03-30T11:25:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 brunofariafernandes.pdf: 1082641 bytes, checksum: 63a37643d4eb9ed5cb93b5bbfdfe5f62 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-30T11:25:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 brunofariafernandes.pdf: 1082641 bytes, checksum: 63a37643d4eb9ed5cb93b5bbfdfe5f62 (MD5) Previous issue date: 2009-08-31 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / A importância da preservação esplênica pela técnica do implante autógeno de tecido esplênico ou autotransplante esplênico é justificada pela alta incidência de infecção fulminante após esplenectomia (IFPE). Aproximadamente 80% dos casos relatados de IFPE, são causados pelo Streptococcus pneumoniae, também denominado pneumococo, é um coco Gram-positivo que tem como habitat a nasofaringe de seres humanos e é considerado o principal causador de otites media, meningite e pneumonia. Neste estudo buscamos investigar a capacidade de animais submetidos a esplenectomia e ao implante autógeno de baço em responder à infecção por S. pneumoniae. Foi avaliado a imunidade humoral e celular em camundongos BALB/c divididos em três grupos: Autotransplantado (AT), Esplenectomizado (SP) e Controle Sham (CT). A contagem do número de unidades formadoras de colônia (UFC) no fígado e nos pulmões mostrou que os camundongos do grupo SP apresentaram maior número de bactérias em ambos os órgãos além de uma resposta imune humoral insatisfatória, sendo identificado os menores níveis séricos de IgM, IgG1 e IgG2a anti- S. pneumoniae nesse grupo. A presença do fragmento esplênico induz a produção de IL-17A e o recrutamento de neutrófilos no fígado e nos pulmões dos camundongos autotransplantados, porém os camundongos esplenectomizados apresentavam os menores níveis de IL-17 A. Esses dados podem ser relacionados o UFC nos pulmões e fígado dos animais. Os resultados obtidos sugerem que o implante autógeno de baço restaura a capacidade de camundongos esplenectomizados de combater a infecção por S. pneumoniae. / The importance of the technique of autogenous implant of splenic tissue or splenic autotransplant is justified by the high incidence of overwhelming postsplenectomy infection (OPSI). Approximately 80 % of the reported cases of OPSI, are caused by Streptococcus pneumoniae, also called pneumococcus, which is a Gram-positive coccus having the human nasopharynx as habitat and considered the principal cause of otitis media, meningitis and pneumonia. In this study we investigate the capacity of animals having undergone splenectomy and autogenous implant of spleen for responding to infection by S. pneumoniae. Humoral and cellular immunity were evaluated in BALB/c mice divided into three groups: Autotransplanted (AT), Splenectomized (SP) and Sham (CT). The count of the number of colony forming units (CFU) in the liver and in the lungs showed that the mice of the SP group presented a greater number of bacteria in both organs aside from lower serum levels of IgM, IgG1 and IgG2a anti - S. pneumoniae. The presence of splenic fragment induces the production of IL-17A and the recruitment of neutrophils to the liver and lungs of the autotransplanted mice, however the splenectomized mice presented the lowest levels of IL-17A. These data can be related to the CFU in the lungs and liver of the animals. The results obtained suggest that the autogenous implant of spleen restores the splenectomized mouse's capacity for fighting infection with S. pneumoniae.