Atualmente observa-se que a proporção de pessoas com 60 anos ou mais está crescendo mais rápido do que a de outras faixas etárias. Um dos resultados desta transição epidemiológica é o aumento das doenças cujo fator de risco é o envelhecimento, entre elas, a doença de Parkinson. Embora muitas regiões exibam os sinais neuropatológicos da doença de Parkinson, a degeneração dos neurônios, contendo neuromelanina, da substância negra é considerada como sendo uma característica importante, representando o critério cardinal para o diagnóstico. No entanto, ainda não está claro por que certas regiões do cérebro, como a substância negra, são vulneráveis em algumas doenças neurodegenerativas e alguns neurônios vizinhos, às vezes morfologicamente indistinguíveis, permanecem preservados. Análises moleculares de populações de neurônios podem conduzir a uma melhor compreensão sobre a fisiologia dos mesmos, bem como os mecanismos envolvidos nos processos de doença. Na era pós genômica, realizar análises proteômicas são de grande interesse científico, pois permitem avanços no conhecimento dos processos biológicos. A técnica de microdissecção e captura a laser tem sido uma ferramenta importante e cada vez mais utilizada para aquisição de populações puras de células a partir de secções histológicas, evitando que áreas não pertencentes ao tecido alvo sejam dissecadas. A união destes métodos pode contribuir de maneira relevante para o entendimento fisiopatológico dos neurônios contendo neuromelanina da substância negra. No entanto, para que a microdissecção e captura a laser e as análises proteômicas sejam eficazes, é imprescindível a aplicação de um protocolo bem estruturado. Dentro desse contexto, o presente trabalho tem como objetivo criar um protocolo de microdissecção a laser de neurônios contendo neuromelanina em indivíduos cognitivamente normais, para subsequente análise proteômica. Os casos utilizados neste estudo são provenientes do Banco de Encéfalos Humanos do Grupo de Estudos em Envelhecimento Cerebral. Para o desenvolvimento da nossa proposta, contamos com a colaboração do Centro de Proteômica Médica da Universidade de Bochum, Alemanha. O protocolo foi desenvolvido baseado em outros previamente descritos na literatura e otimizado de acordo com objetivos pretendidos. Analisamos o plano anatômico de amostragem do tecido, o método de congelamento, a espessura do corte para a microdissecção, a solução utilizada para a coleta do tecido durante a microdissecção e o método de digestão proteolítica para posteriores análises proteômicas. Através de ensaios comparativos, alcançamos os resultados desejados e os mesmos foram validados através de análises por espectrometria de massas. Consequentemente, também fomos capazes de reconhecer fatores técnicos que possivelmente impossibilitariam um efetivo estudo do proteoma / Currently the worldwide proportion of people aged 60 years and over is growing faster than any other age group. This strikingly epidemiological transition results in an increase of aging related diseases, including Parkinson\'s disease (PD). Although many brain areas exhibit the neuropathological signs of Parkinson\'s disease, the degeneration of neuromelanin containing cells in the substantia nigra is considered a hallmark feature, representing cardinal diagnostic criteria for PD. However, why certain brain regions -- such as the substantia nigra -- are vulnerable in some neurodegenerative diseases, while some neighboring morphologically indistinguishable neurons remain preserved, is still unclear. Molecular analysis of specific neuronal populations can lead us to a better understanding about the physiological role played by these neurons and mechanisms involved in disease\'s processes. In a post-genomic era, proteomic analyses are of great scientific interest since they allow a better understanding of the biological processes. The laser capture microdissection technique has also became an important tool in biological research, being increasingly used for acquisition of pure populations of cells from histological sections, preventing the dissection of areas outside the target tissue. The combination of these methods can significantly contribute to understand the pathophysiological role of the containing neuromelanin neurons of the substantia nigra. However, for an effective application of both techniques, laser capture microdissection and proteomic analysis, it is essential the application of an efficient protocol. In this context, this study aims to establish a protocol for laser microdissection of containing neuromelanin neurons in cognitively normal individuals for subsequent proteomic analyses. We selected cases from the Brain Bank of the Brazilian Aging Brain Study. A collaboration with the Medical Proteome Center, University of Bochum, Germany took part during the development of our proposal. Our protocol was developed based on previous published protocols and optimized according the intended aims. We analyzed anatomical planes for neuronal collection, freezing methods, thickness of tissue for microdissection sections, solution for tissue collection during laser microdissection and the proteolytic digestion methods. Through our comparative tests, we have achieved the desired results and validated them by mass spectrometry analyses. Consequently, we were also able to exclude technical factors that could possibly preclude one effective proteome analysis

A Bothrops atrox é uma serpente de amplia distribuição na Sul América e é responsável por um número importante de mortes de pessoas, principalmente na Amazônia. As alterações na composição do veneno desta espécie têm sido associados a fatores como a ontogenia, distribuição geográfica e alimentação. Assim, este projeto visa comparar e identificar a partir da diferença entre os sexos, as características bioquímicas e biológicas do veneno de irmãos de B. atrox, sob condições ambientais controladas, contribuindo no conhecimento das mudanças nas características do veneno da espécie e pudendo auxiliar no aprimoramento da produção de antissoros mais efetivos. Os venenos foram coletados de 5 fêmeas e 4 machos irmãos de B. atrox, nascidas em cativeiro. Os venenos foram analisados quanto individualmente como o pool de cada grupo. As análises consistiram em dosagem de proteína através de BCA, eletroforese mono e bidimensional, cromatografia liquida, espectrometria de massas, atividades caseinolítica, fosfolipásica A2, L-aminoácido oxidase, zimografias contendo gelatina e caseína como substrato, dose mínima coagulante sobre o plasma e fibrinogênio, dose leta 50% e dose mínima hemorrágica. A análise individual dos venenos mostrou que os machos apresentaram maior concentração de proteínas e atividade fosfolipásica A2. No quanto aos pools de veneno, o das fêmeas apresentou maior letalidade e capacidade coagulante sobre plasma e fibrinogênio e o dos machos apresentaram maior capacidade hemorrágica e atividade L-aminoácido oxidase. O perfil espectrométrico mostrou que o pool de veneno das fêmeas, teve um 29% a mais na quantidade de proteínas identificadas em relação aos machos. Em conclusão, a ação do veneno das fêmeas estaria relacionado a uma maior capacidade para gerar dano sistêmico na presa, entanto que os venenos dos machos poderiam ocasionar um maior dano local. Além, a variabilidade nas atividades biológicas dos venenos confirma que além dos fatores ambientais existem outros que poderiam influir na plasticidade da composição dos venenos. / Bothrops atrox snake is widespread in South America and causing a large number of human deaths, mainly in the Amazon. Changes in the composition of the venom of this species have been linked to factors such as ontogeny, geographical distribution and feeding. Thus, this study aims to compare and identify from the sex difference, the biochemical and biological characteristics of venom of B. atrox siblings, under controlled environmental conditions, contributing to the knowledge of changes in the characteristics of the venom of the species and can assist in improving the production of more effective antisera. Venoms were collected from 5 females and 4 males of B. atrox siblings, born in captivity. The venoms were analyzed both, individually and as a pool of each group. The assays consisted in protein quantification using BCA, one and two-dimensional electrophorese, liquid chromatography, mass spectrometry, caseinolytic, phospholipase A2, and L-amino acid oxidase activities, zimography containing gelatin and casein as substrate, minimum coagulant dose upon plasma and fibrinogen, lethal dose 50 % and minimum hemorrhagic dose. Individual analysis of venoms showed that males had higher proteins concentration and phospholipase A2 activity. Concerning the venoms pool, the female showed higher lethality and coagulant capacity upon plasma and fibrinogen and the male had higher L-amino acid oxidase activity and hemorrhagic capacity. Spectrometric profile showed that the venom pool of female snakes had a 29 % increase in the number of proteins identified in comparison to males. In conclusion, the action of the female venom would be related to a higher capacity to generate systemic damage in the prey and male venoms could lead to higher local damage. In addition, variability in the biological activities of venoms confirms that there are other factors that could would be influencing the plasticity of the composition of venoms, in addition to environmental.

Dental implants are designed to replace tooth loss, due to periodontal diseases, trauma or decay. Among the biomaterials used for this purpose, titanium and zirconia have been investigated for some years, with excellent mechanical properties and biocompatibility. Surface treatments such as anodizing, with the incorporation of Mg, Ca and P in the structure of the titanium oxide films, were used in order to increase tribocorrosion resistance and improve the osseointegration process. The cellular response to surfaces is mediated, among other factors, by the extracellular matrix (ECM) . However, very little is still known about the ECM proteomics during mineralization. Our objective was a longitudinal comparison of osteoblastic behavior on different materials, in terms of mineralization volume and actin cytoskeleton status, associated with the proteomic analysis of the extracellular matrix. The three types of biomaterial surfaces (pure titanium, anodized titanium and zirconia) were imaged by confocal 3D microscopy and analyzed in terms of roughness. MC3T3 cells were cultivated on the biomaterials for 7, 14 and 21 days, with osteogenic medium containing calcein. The cells were then fixed, stained with Rhodamine phalloidin and DAPI, and imaged by confocal laser scanning microscopy. The quantification of mineralization and actin cytoskeleton was performed by a novel technique, based on the acquired 3D images. For the proteomic analysis, the specimens were washed, decellularized and the ECM was collected in buffer solution. The anodized titanium surface is more porous when compared to that of cp-Ti and zirconia, and superior mineralization was obtained over it after 21 days of culture. The actin microtubular volume was increased on the three materials on the first 14 days, but on the 21th day there was a reduction over anodized titanium and zirconia, related to mineralization phase.. Conclusion: The greater mineralization obtained over anodized titanium after 21 days demonstrated an improved response provided by the surface modification. The innovative volume quantification technique adopted was useful in providing information about the cellular status and biomaterial performance. Alpha-1_4 glucan phosphorylase and Glycogen phosphorylase brain form were down-regulated on zirconia after 7 and 14 days of culture, and up-regulated on Anod Ti on the 7th day, suggesting the influence of material surface roughness and chemical composition on energy metabolism. Proteins related to bone development, like TGF-3, were found exclusively on cp-Ti on the 21st day. The small number of identified proteins demonstrates that the chosen decellularization process was effective at reducing the proteome dataset. Altogether, our results reveal new insights regarding osseointegration and how material surfaces affect this process. / Implantes dentários são projetados para substituir a perda de dentes, que pode ser causada por doenças periodontais, traumas ou cáries. Entre os biomateriais utilizados para este fim, titânio e zircônia têm sido investigados durante alguns anos, com excelentes propriedades mecânicas e biocompatibilidade. Tratamentos de superfície como a anodização, com a incorporação de Mg, Ca e P na estrutura dos filmes de óxido de titânio, foram utilizados a fim de aumentar a resistência à tribocorrosão e melhorar o processo de osseointegração. A resposta celular às superfícies é mediada, entre outros fatores, pela matriz extracelular (ECM). No entanto, muito pouco ainda é conhecido sobre a proteômica da matriz óssea durante a mineralização. Nosso objetivo foi a comparação longitudinal do desempenho de osteoblastos em diferentes materiais em termos do volume da mineralização e do status do citoesqueleto de actina, associada à análise proteômica da matriz extracelular. Imagens dos três tipos de superfícies de biomateriais (titânio puro, titânio anodizado e zircônia) foram adquiridas por microscopia confocal 3D e analisadas em termos de rugosidade. Células MC3T3 foram cultivadas na superfície dos biomateriais durante 7, 14 e 21 dias, com meio osteogênico contendo calceína. As células foram então fixadas, coradas com faloidina-rodamina e DAPI, e levadas ao microscópio confocal de varredura a laser. A quantificação da mineralização e do citoesqueleto de actina foi feita por uma nova técnica, baseada em imagens 3D. Para a análise proteômica, os espécimes foram lavados, descelularizados e a matriz extracelular foi coletada em solução tampão. A superfície de titânio anodizado é mais porosa quando comparada com a de cp-Ti e zirconia e apresentou mineralização superior após 21 dias de cultura. O volume dos microtúbulos de actina foi aumentado sobre os três materiais nos primeiros 14 dias, mas no 21º dia houve uma redução relacionada ao aumento da mineralização sobre o titânio anodizado e zirconia. Conclusão: a mineralização superior obtida sobre o titânio anodizado após 21 dias de cultura demonstrou a melhoria provocada pela modificação de superfície. A nova técnica adotada para a quantificação do volume foi útil para fornecer informações sobre o status celular e o desempenho dos biomateriais. Alpha-1_4 glucano fosforilase e glicogênio fosforilase forma cerebral foram sub-expressas sobre a zircônia após 7 e 14 dias de cultura e sobre-expressas sobre o titânio anodizado no 7º dia, sugerindo a influência da rugosidade e composição química da superfície dos materiais no metabolismo de energia. Algumas proteínas relacionadas com o desenvolvimento ósseo, como a TGF- 3, foram encontradas exclusivamente sobre o cp-Ti no 21º dia. A pequena quantidade de proteínas identificadas demonstra que o processo de descelularização adotado foi eficiente em reduzir o conjunto de dados da análise proteômica. Em suma, nossos resultados revelam novos detalhes sobre a osseointegração e como a superfície dos materiais podem afetar esse processo.

Tem sido demonstrado que fatores genéticos influenciam a resposta do osso e esmalte ao fluoreto (F), mas os mecanismos moleculares envolvidos não estão bem definidos. No presente estudo, foi empregada uma abordagem proteômica livre de marcadores para identificar e avaliar alterações na expressão de proteínas ósseas em duas linhagens de camundongos com diferentes susceptibilidades à fluorose (A/J susceptível e 129P3/J resistente). Camundongos machos das linhagens 129P3/J e A/J foram distribuídos em três grupos para cada linhagem, que receberam ração com baixa concentração de F e água de beber contendo 0, 10 e 50 ppm F por 8 semanas. A concentração de F foi analisada no plasma e fêmur. A atividade da fosfatase alcalina foi dosada no plasma. Fêmur, tíbia e vértebra lombar foram submetidos à análise por micro-CT. A taxa de aposição mineral (MAR) também foi avaliada no osso cortical dos camundongos. Em adição, eletroforese unidimensional e cromatografia líquida - espectrometria de massas sequencial (LC-ESI-MS/MS) foram utilizadas para identificar e caracterizar as proteínas de fêmur da linhagem 129P3/J. Para análise proteômica quantitativa, proteínas ósseas foram extraídas para cada grupo empregando quatro diferentes etapas: (a) tampão PBS (pH 7,4) por 24h, (b) tampão de Guanidina HCl 4 M / Tris HCl 50 mM (pH 7,4) por 96 h, (c) tampão EDTA 0,5 M / Tris HCl 50 mM (pH 7,4) por 96 h, e por último (d) tampão de Guanidina HCl 4 M / Tris HCl 50 mM (pH 7,4) por 96 h. As proteínas ósseas extraídas para cada grupo foram separadamente submetidas ao LC-ESI-MS/MS, seguido da análise semi-quantitativa de diferença de expressão proteica livre de marcadores. Foram identificadas várias proteínas ósseas com alteração na abundância entre os 3 tratamentos com F para cada linhagem e entre as duas linhagens para cada tratamento com F (razão 1,5 or 0,5, respectivamente). O F promoveu alterações na expressão de proteínas envolvidas na osteogênese e osteoclastogênese de maneira distinta para cada linhagem. Embora não tenha sido observada diferença significativa nos valores de BMD e parâmetros histomorfométricos entre os grupos tratados com F para ambas as linhagens, a taxa de aposição mineral (MAR) foi maior no grupo 129P3/J tratado com 50 ppm F comparado com os grupos controle e 10 ppm F, demonstrando que o F aumentou a formação óssea nesse grupo. Em conclusão, o tratamento com F em baixa e alta dose apresentou um efeito específico para cada linhagem, confirmando uma influência genética na resposta do osso à exposição ao F. / Genetic factors have been shown to influence bone and enamel responses to fluoride (F), but the molecular mechanisms involved remain unclear. In this study, a label-free proteomics approach was employed to identify and evaluate changes in bone protein expression of two mouse strains with different susceptibilities to fluorosis (A/J a susceptible strain, 129P3/J a resistant strain). Male 129P3/J and A/J mice were assigned to three groups given low-F food and water containing 0, 10 or 50 ppmF for 8 weeks. Plasma and femur were analyzed for F levels. Plasma was also evaluated for alkaline phosphatase activity. Femurs, tibiae and lumbar vertebrae were subjected to micro-CT analysis. Mineral apposition rate (MAR) was also measured in mice cortical bone. In addition, unidimensional electrophoresis and liquid chromatography/Tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS) was used to identify and characterize the femur protein profile from 129P3/J mouse strain. For quantitative proteomic analysis, bone proteins were extracted using four different steps: (a) PBS buffer (pH 7.4) for 24h, (b) 4 M Guanidine HCl/50 mM Tris HCl buffer (pH 7.4) for 96 h, (c) 0.5 M EDTA/50 mM Tris HCl buffer (pH 7.4) for 96 h, followed by (d) 4 M Guanidine HCl/50 mM Tris HCl buffer (pH 7.4) for 96 h. Bone proteins extracted from each group were separately subjected to LC-ESI-MS/MS, followed by label-free semi-quantitative differential expression analysis. Changes in many bone proteins abundance were found among the F treatment groups for each mouse strain and between the strains for each F treatment group (ratio 1.5 or 0.5, respectively). F led to alterations in expression of proteins involved in osteogenesis and osteoclatogenesis in a different way for each strain. Although F treatment had no significant effects on BMD and histomorphometric measurements for both strains, mineral apposition rate (MAR) was higher in 129P3/J mice treated with 50 ppm F compared to control and 10 ppm F groups, showing that F increased bone formation for this group. In conclusion, F treatment at low and high levels had strain specific effects in mice, confirming a genetic influence in bone response to F exposure.

A leptospirose é uma zoonose disseminada mundialmente, causada por bactérias do gênero Leptospira. A melhor maneira de contornar o problema é por de medidas preventivas, já que a contenção da proliferação de roedores é inviável e não há vacina eficaz disponível. Estratégias de genômica funcional têm identificado um grande número de proteínas a serem estudadas. Esse fato aliado a dados da literatura, que identificaram proteínas envolvidas na patogenicidade e que são expressas somente em condição de virulência, levou à proposição da utilização da proteômica para canalizar os estudos. A metodologia envolveu obtenção de extratos protéicos de leptospiras retiradas de animais infectados, sua separação por gel bidimensional, e identificação dos spots por espectrometria de massas. O objetivo central foi a identificação de proteínas expressas em bactérias virulentas e ausentes nas não-virulentas. A identificação dessas proteínas pode facilitar a busca de proteínas envolvidas na virulência e infecção da leptospirose. Adicionalmente, é um avanço no esclarecimento da biologia e patogenicidade das leptospiras, bem como para o reconhecimento de candidatos potenciais para a composição de vacinas e/ou métodos diagnósticos mais eficientes. / Leptospirosis, one of the most spread zoonosis worldwide, is caused by bacteria of the genus Leptospira. Preventive measures are the best way to control the disease due to the difficulty to impair the proliferation of rodents and because no efficient vaccine is currently available. Functional genomics strategies have pointed a large number of proteins that could be important immunogens. This fact allied to published data reporting the identification of proteins involved in pathogenesis that are expressed only in virulent strains, led us to propose the use of proteomics as a tool to narrow down these studies. The methodology involved the preparation of protein extracts from tissuederived leptospires, separation by two-dimensional gel and identification of the spots by mass spectrometry. The central objective was to identify proteins expressed only in virulent bacteria. The identification of these proteins could help the search for proteins involved in virulence with a role during infection. Additionally, the data presented here represent a large step to clarify the biology and pathogenicity of leptospires, as well as the identification of potentially important vaccine candidates and/or proteins to compose more efficient diagnostic methods.

O gênero Bothrops apresenta ampla distribuição pelo território brasileiro, sendo a espécie B. jararaca seu representante de maior importância médica na região sudeste. Análises genéticas e filogeográficas descrevem a existência de um grupo monofilético, denominado grupo Jararaca, que inclui, além da espécie B. jararaca, as espécies insulares B. alcatraz e B. insularis. A proximidade evolutiva entre estas espécies, cujo desenvolvimento se iniciou no Pleistoceno, e suas diferenças quanto à dieta, levantam subsídios para o entendimento de seus venenos e suas atividades biológicas. O objetivo deste estudo foi a caracterização dos componentes do veneno de B. alcatraz por diferentes metodologias analíticas com a finalidade de aprofundar o conhecimento sobre os venenos do gênero Bothrops e sobre a evolução dos venenos das espécies do grupo Jararaca. As abordagens analíticas utilizadas foram a avaliação do proteoma dos venenos do grupo Jararaca por eletroforese e identificação de proteínas por digestão com tripsina e análise por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS), análise do N-terminoma e do peptidoma do veneno de B. alcatraz por LC-MS/MS e análise da glicosilação dos venenos do grupo Jararaca pelo tratamento com glicosidases, cromatografia de afinidade à lectinas (concanavalin A, ConA; wheat germ agglutinin, WGA; peanut agglutininin, PNA) e caracterização do N-glicoma por MSn. Os perfis eletroforéticos unidimensionais, obtidos com e sem redução das proteínas, mostraram que o veneno de B. alcatraz difere dos venenos de B. jararaca (adultos e filhotes) e do veneno de B. insularis (adultos). O perfil eletroforético bidimensional do veneno de B. alcatraz corroborou estas diferenças e revelou que a coleta do veneno na presença ou ausência de inibidores de proteinases tem influência no número de spots visualizados. Os resultados da análise dos proteomas dos venenos do grupo Jararaca mostraram que não há diferenças qualitativas significantes entre eles, e que os três apresentam um padrão similar de distribuição das classes de toxinas. A análise quantitativa label free dos proteomas revelou algumas diferenças, indicando que o veneno de B. alcatraz apresenta maior conteúdo de metaloproteinses e fosfolipases A2, que os venenos de B. jararaca e B. insularis. A identificação do peptidoma do veneno de B. alcatraz mostrou diversas formas de peptídeos potenciadores de bradicinina, além de produtos de degradação de diferentes classes de toxinas. A avaliação da glicosilação das proteínas dos três venenos revelou que após a remoção das cadeias de N-glicanos e O-glicanos os perfis eletroforéticos se mostram mais parecidos. A identificação das proteínas do veneno de B. alcatraz que mostraram afinidade pelas lectinas revelou que a ConA interagiu com um número maior de componentes, seguida por WGA e PNA. As análises qualitativa e quantitativa do N-glicoma dos venenos do grupo Jararaca mostrou que os três venenos compartilham as mesmas estruturas de N-glicanos e em abundância relativa similar. Em conjunto, os resultados deste estudo indicaram que no grupo Jararaca, os proteomas dos venenos das espécies B. jararaca e B. insularis apresentam similaridade entre si, e se diferem do veneno de B. alcatraz, principalmente com relação ao grau de glicosilação de suas proteínas. / The Brothrops genus is largely distributed on the Brazilian territory, and B. jararaca is the species of most medical importance in the Southeastern region. Genetic and phylogeographic analyses describe the existence of a monophyletic group, named Jararaca group, which is composed of B. jararaca and of the insular species B. alcatraz and B. insularis. The close evolutionary relationship between these species, which started in the Pleistocene era, and their diet-related differences, are important aspects for the understanding of their venoms and biological activities. The aim of this study was to characterize the venom of B. alcatraz by different analytical methodologies, in order to advance the knowledge on the venoms of Bothrops genus and on the evolution of the venoms of species of the Jararaca group. The analytical approaches used in this study included the charactrization of the proteomes of the venoms of the Jararaca group by electrophoresis and protein identification by trypsin digestion and analysis by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS/MS), N-terminomic and peptidomic analyses of the venom of B. alcatraz by LC-MS/MS and glycosylation analyses of the venoms of the Jararaca group by treatment with glycosidases, affinity chromatography to lectins (concanavalin A, Con A; wheat germ agglutinin, WGA; peanut agglutininin, PNA) and characterization of the N-glicomes by MSn. The one-dimensional electrophoretic profiles were evaluated under reducing and non-reducing conditions and showed that the venom of B. alcatraz differs from B. jararaca (newborn and adult) and B. insularis (adult) venoms. The two-dimensional electrophoretic profile of B. alcatraz venom corroborated these differences and revealed that the milking of the venom in the presence or in the absence of proteinase inhibitors influences the number of spots visualized on the gel. The results of the analysis of venom proteomes of the Jararaca group showed no significant qualitative differences between them; moreover, the three venoms showed a similar pattern of distribution of toxins classes. However, the label free quantitative analysis of these proteomes revealed some differences, and indicated that the venom of B. alcatraz has a higher content metaloproteinses and phospholipase A2 than B. jararaca and B. insularis venoms. The identification of B. alcatraz venom peptidome showed various forms of bradykinin-potentiating peptides, as well as products of the degradation of different toxins classes. The assessment of the glycosylation level of proteins of the three venoms showed that after removal of N-glycan and O-glycan chains their electrophoretic profiles become more similar. The identification of B. alcatraz venom proteins that showed affinity for lectins indicated that ConA interacted with a larger number of components, followed by WGA and PNA. The qualitative and quantitative analysis of the N-glicome of the venoms of the Jararaca group showed that they share the same N-glycan structures, which were also found in similar relative abundance. Taken together, the results of this study indicate that in the Jararaca group, the venom proteomes of B. jararaca and B. insularis show similarity to each other and differ from the venom of B. alcatraz, especially with respect to the degree of protein glycosylation.

O câncer de ovário (OvCa) se destaca dentre as neoplasias ginecológicas por ser um dos mais letais e de difícil diagnóstico. O OvCa ocorre devido ao acúmulo de alterações celulares progressivas promovidas por mutações no genoma de uma célula que, consequentemente, alteram as complexas vias de regulação celular que respondem a fatores internos, como reprogramação genética, ou externos, como a resposta a fatores de crescimento, que juntamente com outras alterações moleculares favorecem a progressão e a metástase. Uma importante etapa da cascata metastática é a transição epitélio-mesenquimal (EMT), um processo bem orquestrado que resulta na perda do fenótipo epitelial e aquisição do fenótipo mesenquimal pelas células tumorais, que adquirem um caráter mais invasivo e migratório, além de se tornarem mais resistentes às drogas. A desregulação de fatores de transcrição como ZEB1, TWIST e SNAI1, vias de sinalização, microRNAs e fatores de crescimento incluindo EGF, TGF? e HGF podem desencadear a EMT. Após a eficiente indução da EMT com EGF na linhagem epitelial de adenocarcinoma de ovário humano Caov-3, foi realizada a análise proteômica quantitativa detalhada, baseada na análise de frações subcelulares enriquecidas em proteínas de membrana, citosol e núcleo, obtidas por centrifugação diferencial e subsequente fracionamento de proteínas por SDS-PAGE, a fim de compreender mais profundamente os mecanismos moleculares modulados pela EMT no OvCa. A partir da análise dos dados coletados em um sistema de espectrometria de massas de alta resolução acoplados a cromatografia líquida (LCMS/MS) e com o auxílio da bioinformática foram identificadas redes de interação proteína-proteína diferencialmente expressas, relacionadas principalmente com a regulação do ciclo celular e do metabolismo. A indução da EMT por EGF resultou na ativação de importantes vias de sinalização, tais como PI3K/Akt/mTOR e Ras/MAPK Erk, além da parada do ciclo celular na fase G1 regulada pelo aumento dos níveis de p21Waf1/Cip1, independentemente de p53, e diminuição de proteínas checkpoint. Através da proteômica dirigida, o monitoramento de reações múltiplas (MRM) revelou que, após a indução da EMT por EGF, o metabolismo das células Caov-3 foi alterado de uma maneira bastante peculiar. O estudo proteômico descrito permitiu a correlação entre processo da EMT induzido por EGF com o controle translacional, a regulação do ciclo celular e a alteração do metabolismo energético. / Ovarian cancer (OvCa) stands out among gynecological malignancies for being one of the most lethal and difficult to diagnose. OvCa occurs due to the accumulation of progressive cell changes promoted by mutations in the cell genome which, consequently, alter the complex cellular regulation pathways that respond to internal factors, such as genetic reprogramming, or external, such as response to growth factors, which together with other molecular changes favor the progression and metastasis. An important step of the metastatic cascade is the epithelial-mesenchymal transition (EMT), a well-orchestrated process that results in the loss of epithelial phenotype and acquisition of mesenchymal phenotype by tumor cells that acquire a more invasive and migratory character, and become more resistant to drugs. Deregulation of transcription factors such as ZEB1, TWIST and SNAI1, signaling pathways, microRNAs and growth factors including EGF, TGF? and HGF can trigger EMT. After an efficient EMT induction by EGF in the epithelial cell line of human adenocarcinoma ovarian Caov-3, detailed quantitative proteomic analysis was performed based on analysis of subcellular fractions enriched in proteins from membrane, cytosol and nucleus, obtained by differential centrifugation and subsequent fractionation of proteins by SDS-PAGE, in order to understand deeply the molecular mechanisms modulated by EMT in OvCa. From the analysis of data collected in a highresolution mass spectrometry system coupled to liquid chromatography (LC-MS/MS) and with the aid of bioinformatics were identified protein-protein interaction networks differentially expressed, mainly related to regulation cell cycle and metabolism. EGF induced-EMT resulted in the activation of major signaling pathways such as PI3K/Akt/mTOR and Ras/MAPK Erk, in addition to G1 phase cell cycle arrest regulated by increased levels of p21Waf1/Cip1, regardless of p53, and reduction of checkpoint proteins. Through the targeted proteomics, multiple reaction monitoring (MRM) showed that after EGF induced-EMT, Caov-3 cells metabolism was changed in a very particular way. The proteomic study described allowed the correlation between EMT process induced by EGF with translational control, regulation of cell cycle and the change in the energy metabolism.

A proteômica é uma técnica muito importante e amplamente utilizada na elucidação de diversos mecanismos biológicos. Essa técnica pode ser usada, por exemplo, na avaliação da resposta celular a estímulos ou na determinação de modificações proteicas resultantes de um tratamento. Neste trabalho, a abordagem proteômica foi utilizada em dois sistemas diferentes: (1) na elucidação da resposta à luz no fungo Metarhizium acridum e (2) na determinação dos danos proteicos causados pelo tratamento fotodinâmico da levedura Candida albicans. (1) O fungo entomopatogênico M. acridum, quando crescido na presença de luz, produz conídios com elevada tolerância à radiação ultravioleta-B (290-315 nm). Essa elevada resistência é altamente desejada para aplicação de M. acridum no controle biológico de pragas na agricultura. É possível que esse fenômeno seja decorrente do acúmulo diferencial de proteínas nos conídios produzidos na presença de luz em comparação com aqueles produzidos no escuro. Assim, foi utilizada uma abordagem proteômica para determinar quais proteínas poderiam estar diferencialmente acumuladas nos conídios. Os resultados mostraram que, de um total de 501 proteínas identificadas, somente quatro estavam diferencialmente acumuladas. Apesar de não ser possível estabelecer uma relação clara entre o acúmulo dessas proteínas e a elevada tolerância à radiação ultravioleta-B, dados de proteínas homólogas em Aspergillus fumigatus obtidos da literatura mostraram que essas proteínas são reguladas em condições de estresse. Adicionalmente, experimentos foram conduzidos para expandir o conhecimento sobre a fotobiologia de M. acridum. Estabeleceu-se que, dentro do espectro da luz visível, a luz azul é responsável por induzir o aumento da tolerância à radiação ultravioleta-B, enquanto a luz vermelha não produz o mesmo resultado. Conclui-se que o estudo da resposta à luz através da proteômica de conídios requer o uso de técnicas que resultem na identificação de uma fração maior do proteoma, já que o acúmulo diferencial de proteínas aparentemente não envolve as proteínas mais abundantes. (2) Candida albicans é um importante patógeno humano responsável por micoses superficiais e sistêmicas, principalmente em indivíduos imunocomprometidos. O uso contínuo dos fungicidas tradicionais vem resultando na seleção de linhagens tolerantes. Nesse cenário, o tratamento fotodinâmico antimicrobiano surgiu como importante alternativa no tratamento das micoses causadas por C. albicans. Apesar da efetividade desse tratamento ter sido observada em diversos trabalhos, um estudo no nível proteico ainda não havia sido realizado. A abordagem proteômica por eletroforese bidimensional revelou que, após o tratamento das células, muitos spots nos géis sofreram um desvio ácido, ou seja, um deslocamento para regiões de menor ponto isoelétrico. Por outro lado, foram observados spots resistentes a essa modificação. Proteínas pertencentes a ambos os grupos foram identificadas por espectrometria de massas. A análise de aminoácidos mostrou que o conteúdo de histidina nas células de C. albicans foi reduzido em aproximadamente 60% após o tratamento, o que é uma possível explicação para o desvio ácido observado. Conclui-se, após extensa revisão e discussão da literatura, que os danos em proteínas dependem da interação entre proteína e fotossensibilizador e também da presença de aminoácidos fotooxidáveis nas proximidades dos sítios de interação. / Proteomics is a very important and largely employed technique for the elucidation of a series of biological mechanisms. This technique can be used, for instance, on the evaluation of cellular responses to stimulus or in determining protein modification resulting from a treatment. In the present work, a proteomic approach was used in two distinct biological systems: (1) to evaluate the light response in the fungus Metarhizium acridum, and (2) to determine the protein damage resulting from photodynamic treatment of the yeast Candida albicans. (1) The entomopathogenic fungus M. acridum, when grown in the presence of light, produces conidia with increased tolerance to ultraviolet-B radiation (290-315 nm). This increased resistance is desired for the application of this fungus on the biological control of agricultural pests. It is possible that this phenomenon results from the differential accumulation of proteins in conidia produced in the presence of light as compared to those produced in the dark. Therefore, a proteomic approach was used to determine which proteins could be differentially accumulated in conidia. The results showed that, out of a total of 501 identified proteins, only four were found to be differentially accumulated. Even though establishing a direct relationship between the observed accumulation and the increased tolerance to ultraviolet-B radiation was not possible, data from the literature on homolog proteins in Aspergillus fumigatus have shown that these proteins are regulated under stress conditions. Additionally, experiments were performed to gain further insight on the photobiology of M. acridum. It was stablished that, within visible light spectrum, blue light is responsible for inducing the increased tolerance to ultraviolet-B, while red light does not produce the same effect. It is concluded that a light-response study employing proteomics should rely on techniques yielding a higher number of identified proteins, as the differential accumulation does not seem to affect high abundance proteins. (2) Candida albicans is an important human pathogen responsible for superficial and systemic mycoses mainly in immunocompromised patients. The continuous use of the traditional fungicides has resulted in the selection of tolerant strains. In this scenario, antimicrobial photodynamic treatment became an important alternative on the treatment of C. albicans infections. Although the effectiveness of this treatment has been observed in multiple studies, an evaluation at the protein level had not been performed. A proteomic approach by two-dimensional electrophoresis revealed that, after cell treatment, many spots underwent an acidic shift, that is, a shift towards lower isoelectric point. On the other hand, protein spots resistant to modification were also observed. Proteins belonging to both groups were identified by mass spectrometry. Amino acid analysis revealed that the histidine content in C. albicans cells decreased by up to 60% after the treatment, which is a possible explanation to the observed acidic shift. It is concluded, after extensive literature review and discussion, that protein damage depends on protein-photosensitizer interaction and also on the presence of photooxidazible amino acids in the proximity of the interaction site.

O câncer colorretal (CCR) é a segunda de causa morte relacionada ao câncer, com aproximadamente 500.000 mortes por ano em países desenvolvidos. Os pacientes com doença localmente avançada ou metastática possuem um prognóstico ruim e, desta forma, a detecção precoce é necessária para reduzir a alta mortalidade associada à essa doença. Ainda, os métodos de rastreamento utilizados no momento apresentam boa exatidão, porém são de alto custo, consomem muito tempo e são incômodos para os pacientes. A colonoscopia é o método mais comumente utilizado para a detecção de CCR. Entretanto, apresentam duas limitações importantes: i) necessidade da luz intestinal estar limpa, sem resíduos fecais, o que só é conseguido após um preparo rigoroso, com dieta e laxativos, nos dias que antecedem a realização do exame, e, ii) é examinador-dependente, ou seja, dependem da experiência do profissional em localizar as alterações anatômicas, e ainda da habilidade em selecionar o melhor local para a realização da biópsia. Portanto, o desenvolvimento de um método rápido e sensível para o diagnóstico do câncer colorretal é extremamente importante.<br /> A proposta desta dissertação foi desenvolver um método eficaz para o preparo dos tecidos parafinizados e extração de proteínas para experimentos em eletroforese bidimensional (2DE). Tecidos fixados em formaldeído e embebidos em parafina apresentam como vantagens a preservação da qualidade morfológica, abundância e facilidade de armazenamento, o que permite estudos futuros. Entretanto, para análises proteômicas, a recuperação do material biológico é ineficiente. A partir deste estudo, 156 proteínas foram obtidas de tecidos parafinizados, sendo possível identificar por espectrometria de massas, levando a estudos posteriores para identificação de possíveis biomarcadores relacionados ao CCR. / Colorectal cancer (CRC) is the second cause of cancer-related death, with approximately 500,000 deaths per year in developed countries. Patients with locally advanced or metastatic disease have a poor prognosis and, thus, early detection is needed to reduce the high mortality associated with this disease. Yet, the screening methods used at the time have good accuracy, but are expensive, time consuming and are uncomfortable for patients. Colonoscopy is the most commonly used method for the detection of CRC. However, present two major limitations: i) the need to be clean intestinal lumen without fecal waste, which is achieved only after rigorous preparation with laxatives and diet, in the days before the exam, and ii) it is examiner-dependent, i.e., depends on the professional\'s experience in locating anatomical changes, and even the ability to select the best site for biopsy. Therefore, the development of a rapid and sensitive method for the diagnosis of colorectal cancer is extremely important. The purpose of this dissertation was to develop an effective method for the preparation of tissues and protein extraction experiments for two-dimensional electrophoresis (2DE). Tissues fixed in formaldehyde and embedded in paraffin have the advantage of preserving the morphological quality, abundance and storage facility, which allows for further studies. However, for proteomic analysis, the recovery of biological material is inefficient. From this study, 156 proteins were obtained from paraffinized tissues, and can be identified by mass spectrometry, leading to further studies to identify potential biomarkers related to CCR.

Este trabalho teve como objetivo caracterizar a diversidade bacteriana presente em uma área de mineração. Os resultados mostraram que o filo mais abundante das bactérias classificadas foi o proteobacteria e 66% deste filo pertencem a classe betaproteobacteria. A diversidade de bactérias encontradas no solo de fora da mina mostrou-se diferente daquele encontrado dentro da mina, mostrando que a ação da mineração poderia ter modificado a comunidade microbiana nativa do local. Na tentativa de elucidar o mecanismo de resistência ao cobre presente nos isolados, foram escolhidas 2 cepas resistentes a altas concentrações de cobre: Acinetobacter sp. e Enterobacter sp. Os resultados de proteômica mostraram que as duas cepas possuem mecanismos diferentes de resistência. Acinetobacter teve a expressão de duas proteínas CopA e CopB em diferentes condições de cultivos (200 ppm de cobre 6h de cultivo; 24h e 72h de cultivo em 450 ppm de cobre). Com esses resultados foi possível elucidar que esta cepa tem o mesmo mecanismo de resistência encontrado em Enterococcus hirae, onde a proteína CopA tem como função o influxo de cobre e a proteína CopB o efluxo do excesso de cobre intracelular. Já a bactéria Enterobacter teve expressão apenas de proteínas de membranas e nenhuma proteína propriamente conhecida como de resistência à cobre. Este resultado foi corroborado por técnica de PCR, no qual não houve expressão para esse gene. Possivelmente as proteínas de membrana externa estão responsáveis pela homeostase do cobre realizada por esta cepa. / This work aimed to characterize the bacterial diversity present in a mining area. Results showed the most abundant phylum of the classified bacteria are proteobacteria and 66% of this phylum are class betaproteobacteria. The diversity of bacteria found in the soil outside the mine differed from those found within the mine, showing that the mining action may have modified the local microbial community. In an attempt to elucidate the mechanism of resistance to copper present in the isolates, two strains resistant to high concentrations of copper were chosen: Acinetobacter sp. and Enterobacter sp. Proteomics results showed these two strains have different mechanisms of resistance. Acinetobacter had the expression of two CopA and CopB proteins under different cultivation conditions (200 ppm of copper 6h of culture and 24h and also in 450 ppm of copper and 72h of culture). With these results it was possible to elucidate, this strain has the same mechanism of resistance found in Enterococcus hirae, which the CopA protein functions as the copper influx and the CopB protein the efflux of excess intracellular copper. On the other hand, Enterobacter bacterium had only membrane proteins, and no proteins known as copper resistance. This result was corroborated with PCR, where there was no expression for this gene. Possibly the outer membrane proteins are responsible for the copper homeostasis performed by this strain.