La diferenciació dels precursors neuronals en cèl·lules especialitzades implica una restricció de la seva capacitat proliferativa i la sortida definitiva del cicle cel·lular. Entre les proteïnes HLH activadores de la diferenciació hi ha les proteïnes E (E47, E12, HEB, E2-2), les quals s’expressen a la majoria de teixits. Al nostre laboratori es va descriure que la proteïna E47 forma heterodímers amb la proteïna HLH específica de teixit NeuroD, i activa l’expressió del receptor del BDNF (TrkB) i l’inhibidor de cicle p21CIP en resposta a la senyal diferenciadora d’àcid retinoic (RA). La correcta expressió del receptor TrkB juga un paper clau en el desenvolupament del sistema nerviós en vertebrats i la seva alteració s’ha relacionat amb diferents malalties humanes importants. En aquest treball s’ha demostrat que la quinasa MLK2 interacciona amb la bHLH E47 en cèl·lules de neuroblastoma SHSY-5Y. Es proposa que la MLK2 controla l’activitat del factor bHLH E47 a través de la seva fosforilació, la qual redueix l’activació del promotor de trkB. A més, la inhibició de la MLK2 augmenta l’expressió de l’mRNA de trkB in vivo explicant perquè aquesta inhibició no només prevé l’activació dels processos de mort cel·lular sinó que també ajuda a les vies de supervivència. D’altra banda, estudis molt recents revelen la importància dels processos de localització d’mRNAs als axons i a les dendrites i la seva traducció localitzada. Conèixer com es regula la localització dels mRNAs i la seva traducció localitzada a nivell molecular ajuda a entendre aspectes fonamentals de la plasticitat i la diferenciació neuronal. Durant el transport dels mRNAs, la seva traducció està reprimida i aquesta s’activa a llocs concrets com a resposta a senyals sinàptics, i en conseqüència, s’activa la plasticitat neuronal. Prèviament, al nostre laboratori, es va demostrar que la proteïna KIS pot estimular la traducció localitzada d’mRNAs, afavorir el creixement neurític i la supervivència neuronal. En aquest treball demostrem que la KIS interacciona amb proteïnes i mRNAs implicats en activitat sinàptica, els quals són transportats a través de partícules mRNP. La nostra hipòtesi és que quan el grànul transportat per KIF3A arriba al seu destí, diversos estímuls sinàptics possiblement indueixin l’activació de la quinasa Src, la qual fosforila la KIS, activant la traducció dels mRNAs transportats. / La diferenciación de precursores neuronales en células especializadas implica la restricción de su capacidad proliferativa y la salida definitiva del ciclo celular. Entre las proteínas HLH activadoras de la diferenciación están las proteínas E (E47, E12, HEB, E2-2) las cuales se expresan en la mayoría de los tejidos. En nuestro laboratorio se describió que la proteína E47 forma heterodímeros con la proteína HLH especifica de tejido, NeuroD, y activa la expresión del receptor de BDNF (TrkB) y el inhibidor de ciclo p21CIP en respuesta a la señal diferenciadora del ácido retinoico (RA). La correcta expresión del receptor TrkB juega un papel clave en el desarrollo del sistema nervioso en vertebrados y su alteración se ha relacionado con diferentes enfermedades humanas importantes. En este trabajo se ha demostrado que la quinasa MLK2 interacciona con la bHLH E47 en células de neuroblastoma SHSY-5Y. Se propone que MLK2 controla la actividad del factor bHLH E47 a través de su fosforilación, la cual reduce la activación del promotor de trkB. Además la inhibición de MLK2 aumenta la expresión del mRNA de trkB in vivo explicando por qué esta inhibición no sólo previene la activación de los procesos de muerte celular sino que también ayuda a las vías de supervivencia. Por otro lado, estudios muy recientes revelan la importancia de los procesos de localización de mRNAs en axones y dendritas y de su traducción localizada. Conocer cómo se regula la localización de los mRNAs y su traducción localizada a nivel molecular ayuda a entender aspectos fundamentales de la plasticidad y la diferenciación neuronal. Durante el transporte de los mRNAs su traducción está reprimida y ésta se activa en lugares concretos en respuesta a señales sinápticas resultando en la activación de la plasticidad neuronal. Previamente, en nuestro laboratorio, se demostró que la proteína KIS puede estimular la traducción localizada de mRNAs, favorecer el crecimiento neurítico y la supervivencia neuronal. En este trabajo demostramos que KIS interacciona con proteínas y mRNAs implicados en actividad sináptica, los cuales son transportados a través de partículas mRNPs. Nuestra hipótesis es que cuando el gránulo transportado por KIF3A llega a su destino, varios estímulos sinápticos posiblemente induzcan la activación de la quinasa Src la cual fosforila KIS, activando la traducción de los mRNAs transportados. / The differentiation of neuronal precursors in specialized cells induces an increase of a restriction of their proliferative capacity and a complete exit of the cell cycle. Among the HLH protein activators of differentiation the E protein family (E47, E12, HEB, E2-2) is expressed in most of the tissues. In our laboratory it has been described that in response to the differentiating signal of retinoic acid (RA), E47 heterodimerizes with the HLH protein tissue specific NeuroD which activates the expression of the receptor BDNF (TrkB) and the cell cycle p21CIP inhibitor. TrkB expression plays a key role in the nervous system development in vertebrates, and its alteration has been related with different types of important human diseases. In the present work we identified the kinase MLK2 as an E47-interaction protein in SHSY-5Y human neuroblastoma cells. We propose MLK2 as a controller of the BDNF receptor TrkB through the phosphorylation of bHLH transcription factor E47 which reduces the activation of trkB promoter. Furthermore, MLK2 inhibition increases trkB mRNA expression in vivo. These results could explain the reason why the inhibition of MLKs avoid the activation of cell death program and also increase the cell survival pathway being a key component of their neuroprotector potential. In the other hand, recent studies some recent work reveal the importance of mRNA localization in axons and dendrites and its local translation. Unraveling how mRNA localization and its translation are regulated at molecular level will help to understand basic processes of neuronal differentiation and plasticity. Translation is inhibited during mRNA transport, and is activated in specific synapses in response to synapse signals resulting from activation of neuronal plasticity. Previous work from our laboratory demonstrated that protein kinase KIS can stimulate the local translation of mRNAs, increase the neuritic outgrowth and the neural survival. In the present work we demonstrate that KIS can interact with transported granular proteins and mRNAs importants for the synaptic activity. Our hypothesis is that when the granule reaches his fate through KIF3A, some synaptic stimuli induce the activation of the kinase Src, which phosphorylates KIS, therefore activating the transported transcript.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-09-30. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:58Z : No. of bitstreams: 1 Publico-11857a.pdf: 776003 bytes, checksum: 706bab397cf90eafbc8d7328214672da (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:59Z : No. of bitstreams: 2 Publico-11857a.pdf: 776003 bytes, checksum: 706bab397cf90eafbc8d7328214672da (MD5) Publico-11857b.pdf: 2062339 bytes, checksum: 8d0ca9b3ac4476504ad8de27d8b090d1 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:59Z : No. of bitstreams: 3 Publico-11857a.pdf: 776003 bytes, checksum: 706bab397cf90eafbc8d7328214672da (MD5) Publico-11857b.pdf: 2062339 bytes, checksum: 8d0ca9b3ac4476504ad8de27d8b090d1 (MD5) Publico-11857c.pdf: 120525 bytes, checksum: 614bb713dcd2fcace0a691958c4f8ae7 (MD5) / Objetivos: C-kit é uma proteína tirosina–quinase transmembrana que possui importante papel na tumorogênese. Com o desenvolvimento de um novo composto, o mesilato de imatinibe, que inibe especificamente os receptores tirosina quinases, o C-kit passou a ser um importante alvo terapêutico. Nosso objetivo é estudar as características histopatológicas do retinoblastoma, a expressão imuno-histoquímica do C-kit neste tumor e correlacionar esta expressão com os principais fatores prognósticos do retinoblastoma. Material e Métodos: Oitenta e quatro blocos de parafina foram selecionados do arquivo do laboratório de patologia ocular Henry C. Witelson, Montreal, Canada. A imunohistoquímica do C-kit foi realizada de modo automatizado e os resultados foram correlacionados com a idade dos pacientes por ocasião do diagnóstico, grau de diferenciação tumoral e presença ou não de invasão de coróide e nervo óptico. O valor de p menor que 0.05 foi considerado estatisticamente significante. Resultados: A expressão imuno-histoquímica do C-Kit foi observada em 33/63 (52.38%) dos espécimes analisados. Apenas 2 dos 13 (15.4%) tumores que não apresentaram invasão de nervo óptico ou coróide foram positivos para C-kit. Por outro lado, a expressão do C-kit foi observada em 31 (62%) dos 50 tumores que apresentaram algum tipo de invasão seja para coróide ou nervo óptico , 26 dos 44 espécimes com envolvimento de coróide (59.9%), e 20 dos 29 com invasão de nervo óptico (68.96%). Quatorze dos 25 espécimes (56%) moderadamente ou bem diferenciados e 19 dos 38 (50%) pouco diferenciados apresentaram positividade para o C-kit. Dos 41 espécimes provenientes de pacientes com idade superior a 1 ano, e dos 14 (42.80%) com idade até 1 ano a expressão do C-kit foi observada em 21 (51,21%) e 6 (42.80%) espécimes respectivamente. Conclusões: Mais da metade dos retinoblastomas estudados expressaram o C-kit . A expressão do C-kit apresenta correlação estatisticamente significante com a a invasão de nervo óptico. / Purpose: C-kit is a transmembrane tyrosine kinase protein thought to play an important role in tumorigenesis. With the development of the compound Imatinib Mesylate which specifically inhibits tyrosine kinase receptors, C-kit has emerged as a potential therapeutic target. This study aims to determine the immunoexpression of C-kit in retinoblastoma and correlate this expression with histopathological prognostic features. Methods: Eighty-four paraffin-embedded enucleation globes of retinoblastoma were collected from the archives of the Henry C. Witelson Ocular Pathology Registry. C-kit immunostaining was used according to the protocol provided by Ventana Medical System Inc., Arizona. Immunoreactivity was correlated with the presence or absence of invasion into the choroid and optic nerve and the degree of tumour defferentiation. Odds ratios were calculated to quantify differences in C-kit expression between tumours with different patterns of invasion. Results: C-kit expression was identified in 33/63 specimens analysed (53.8%).Two of 13 tumours without choroidal or optic nerve invasio (15.4%) were positive for C-kit. C-kit expression was seen in 31 of the 50 tumours with extraretinal invasion (62%, p<0.01), 26 of 44 specimens with choroidal involvement (59.9%, p<0.02), and 20 of the 29 with optic nerve involvement (68.96%, p<0.02). Fourteen of 25 moderate or well-diferentiated specimens (56%) and 19 of 38 undifferentiated specimens (50%) displayed positivity for C-kit (p>0.5). Conclusions: More than half of Retinoblastomas in this study expressed C-kit. The expression of Ckit in these retinoblastomas strongly correlated with histopathological features of worse prognosis including optic nerve and choroidal invasion. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Decline cognitive related to neurodegenerative diseases are very commom in patients, probably in function of aging. Since there are few effectives therapeutics approaches to loss memory treatment, but studies about new therapeutics approaches are necessary regarding neuroprotective drugs. Thus, recent works have been showing the efficacy of some neuroprotective compounds like creatine (Cr) in treatment of patients and experimental models with memory defcit. Creatine is a guanidine compound synthesized from glycine, arginine and S-adenosylmethionine in the kidneys, liver and brain that have been presented neuroprotective and neuromodulatory effect in the central nervous systems. Some works suggest that guanidine compounds like Cr could enhance learning by modulation polyamines binding sites at the N-methyl-D-Aspartate (NMDA) receptor and act as energetic buffer intracellular. In these context, the propose of this work was investigate the involvement of Cr transporter (CreaT), cAMP-dependent protein kinase A (PKA) and Ca2+/ calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) signaling pathway in the spatial learning after intrahippocampal injection of Cr. After training on Barnes Maze, Cr and/or 3-GPA (inhibitor CreaT), Cr and/or H-89 (PKA inhibitor), Cr and/or STO-609, (inhibitor of CaMKII) bilateral intrahipocappus administration was performed. The results showed that intrahippocampal administration of 3-GPA, H-89 and STO-609 attenuated the facilitatory effect of Cr on spatial learnig performed on barnes Maze. Therefore, we decide investigate the involvement of the PKA (pPKA), CaMKII (pCaMKII) and CREB (pCREB) activation after intrahippocampus creatine administration in rats trained on Barnes Maze. The results showed that Cr enhanced pCREB levels and pCaMKII levels. Thirty minutes after creatine administration was observed pCREB an pCaMKII levels enhancement, on the other hand, pPKA levels enhancement was not observed. These data suggest that spatial learning enhancement elicited by Cr may be mediated by trans-cellular creatine transports, as well, CaMKII/CREB intracellular pathway in rat hippocampus / O declínio cognitivo associado a doenças neurodegenerativas é um sintoma cada vez mais comum encontrado em pacientes, provavelmente devido ao aumento da expectativa de vida da população. Dada a escassez de medidas terapêuticas efetivas para o déficit de memória apresentado por pacientes, evidencia-se a importância da busca de novos compostos e do estudo de seus mecanismos de ação. Nesse contexto, recentes estudos mostraram a eficácia de algumas substâncias com ação neuroprotetora, como a creatina (Cr), na terapia de pacientes com déficit de memória e em modelos experimentais. A Cr é um composto guanidínico sintetizado endogenamente nos rins, fígado, pâncreas e cérebro, que apresenta ação neuroprotetora e neuromoduladora no sistema nervoso central. Estudos mostram que a administração de compostos guanidínicos, como a Cr, podem estar relacionados com a melhora da memória devido à interação com o sítio das poliaminas no receptor N-metil-D-Aspartato (NMDA) e por atuar como tampão energético intracelular. Neste contexto, o objetivo deste estudo foi investigar o envolvimento do transportador de Cr (CreaT), das proteínas quinases dependente de AMPc (PKA) e dependente de Ca2+/calmodulina II (CaMKII) na melhora do aprendizado espacial induzido por Cr no hipocampo de ratos. Após o treino no labirinto de Barnes, os ratos foram injetados no hipocampo, bilateralmente, com Cr e/ou 3-ácido guanidinico propiônico (3-GPA, um inibidor do transportador de creatina); Cr e/ou [N-[2-(p-Bromocinnamylamino)ethyl]-5-isoquinoline sulfonamide, Di-HCl Salt] (H-89, um inibidor da PKA); Cr e/ou 1,8-Naphthoylene benzimidazole-3- carboxylic acid (STO-609, um inibidor da CaMKII). A administração de 3-GPA, H-89 e STO-609 diminuiu o efeito facilitatório da Cr na memória espacial de ratos, observado no teste do labirinto de Barnes. De acordo com esses resultados, decidimos investigar o envolvimento da ativação do elemento de ligação responsivo ao AMPc (pCREB), PKA (pPKA) e CaMKII (pCaMKII) após a administração de Cr no hipocampo de animais treinados no labirinto de Barnes. Trinta minutos após a injeção de Cr, foi observado um aumento nos níveis de pCREB e pCaMKII, mas não nos níveis de pPKA no hipocampo de ratos. Estes achados sugerem que a facilitação do aprendizado espacial induzido pela Cr depende do seu transporte para o meio intracelular, assim como, envolve a via de sinalização celular da CaMKII/CREB no hipocampo de ratos.

Orientador: Willian Fernando Zambuzzi / Resumo: Modelos in vitro têm facilitado a análise da fisiologia celular sob condições experimentais diversas; trata-se de modelo alternativo ao uso de animais de experimentação, que vem sendo difundido e aceito amplamente em pesquisa científica. Além disso, estes modelos têm levado à avanços significativos na compreensão das interações mútuas e adaptativas entre células e substratos. Neste trabalho, nosso objetivo foi analisar eventos moleculares responsáveis pela adaptação de preosteoblastos em substrato orgânico composto por componentes da Matriz Extracelular (MEC), sob condição de diferenciação celular. Metodologicamente, pré-osteoblastos (MC3T3-E1 50x103 células/ml) foram semeados sobre uma fina camada de Matrigel® gelificada e mantidos por 10 dias (37oC, 5% de CO2 em ambiente úmido) sob condição de diferenciação (meio de cultivo contendo 50 µg de ácido ascórbico e 10 mM de ß- glicerofosfato), com renovação do meio de cultivo a cada 3 dias. Alterações morfológicas foram monitoradas em microscópio invertido e mecanismos moleculares acompanhados pela análise global da atividade de quinases, através de arranjo de peptídeos (Pepchip). Curiosamente, nossos resultados mostraram mudanças morfológicas significantes durante adaptação celular as quais foram acompanhadas pela atuação de vias de sinalização celular distintas, responsáveis pela sobrevivência (Eixo PI3K-Akt) e proliferação (Eixo Retinoblastoma-ciclinas) celulares, além de proteínas envolvidas com metabolismo energético e comun... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In vitro models have been proposed to analyze cellular physiology under various experimental conditions. It is an alternative model instead using experimental animals that have been widespread and widely accepted in scientific research. Moreover, it has led to significant advances in the understanding of mutual and adaptive interactions between cells and substrates. In this work, our aim was to analyze adaptive events of osteoblasts cultured on an organic substrate composed by components of the extracellular matrix (ECM) in the first 10 days of cultivation on differentiation condition. Methodologically, pre-osteoblasts (MC3T3-E1 pre-osteoblasts, 50x103 cells / ml) were seeded on a thin gelified Matrigel® layer and maintained for 10 days under standard cell culture conditions (37 ° C, 5% CO2 in a humid environment) under differentiation conditions (culture media containing 50 ug of ascorbic acid and 10 mM beta-glycerophosphate). The culture medium was changed every 3 days. Morphological changes were monitored using an inverted microscope and molecular mechanisms followed by comprehensive analysis of kinase activity by peptides arrangement (Pepchip). Interestingly, our results showed significant morphological changes during cell adaptation which were accompanied by distinct signaling pathways involving proteins responsible for survival (PI3K-Akt axis) and cell proliferation (Retinoblastoma-cyclins axis), in addition of proteins involved in energy metabolism and cellular communi... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by Caroline Falcao (caroline.rfalcao@ufpe.br) on 2017-04-10T16:16:48Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Dissertação-LarissaNascimento.pdf: 5009861 bytes, checksum: e41e4e6a4cc83034688c263b000766c1 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-10T16:16:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Dissertação-LarissaNascimento.pdf: 5009861 bytes, checksum: e41e4e6a4cc83034688c263b000766c1 (MD5) Previous issue date: 2012-03-13 / O gênero Leishmania compreende 30 espécies de protozoários flagelados pertencentes a famíla Trypanosomatidae, donde 20 são patogênicas ao homem. Esses organismos apresentam ciclos de vida complexos e peculiaridades moleculares frente à maioria dos eucariontes, como a ausência de regulação transcricional. Desse modo, a regulação da expressão gênica nesses parasitas é efetuada em etapas pós-transcricionais, dentre essas a mais importante é o processo de iniciação da tradução dos mRNAs, onde diferentes fatores denominados eIFs (eukariotic initiation factors) estão envolvidos. Dentre esses fatores se destaca o complexo eIF4F com função de promover o reconhecimento e ligação de RNAs maduros aos ribossomos. Tal complexo é composto de três sub-unidades: eIF4A (RNA helicase); eIF4E (proteína de ligação ao cap); e eIF4G (proteína multidomínio estruturadora do complexo eIF4F). Em tripanossomatídeos se sabe da existência de cinco homólogos da sub-unidade eIF4G distintos (EIF4G1 ao G5), contudo, pouco se sabe sobre a ocorrência e funções celulares desses homólogos. Portanto o objetio do presente trabalho foi avaliar a expressão dos diferentes homólogos do eIF4G durante o ciclo de vida de Leishmania amazonensis, caracterizando as possíveis modificações pós-traducionais por fosforilação que possam estar agindo sobre tais fatores, uma vez que em eucariotos superiores mecanismos de regulação global da tradução por fosforilação dos eIFs via MAP quinases já são conhecidos. Para tal, foram realizadas culturas de L. amazonensis nas formas promastigota e amastigota-axênicas, e os extratos protéicos provenientes de diferentes fases do crescimento foram analisados através de Western blot. Foi observado que os homólogos de eIF4G estão presentes durante todo o ciclo de vida de L. amazonensis. Podendo ser observado que os EIF4G1, G4 e G5 apresentaram mais de uma isoforma proteica sugestiva de possíveis modificações pós-traducionais desses homólogos. Em conseguinte, a expressão de EIF4G3 e EIF4G4 foi analisada em condições especiais de cultivo na presença de seis inibidores diferentes, contudo nenhuma dessas condições alterou a expressão desses fatores, revelando que essas proteínas são bastante estáveis e possuem tempo de meia-vida prolongado. Posteriormente, o mapeamento in silico de sítios de fosforilação por MAP quinases nos EIF4Gs de Leishmania spp. demonstra a existência de sítios de fosforilação específicos em todos os homólogos E a purificação de fosfoproteínas confirma a existência de mecanismos de fosforilação agindo nos EIF4G3 e EIF4G4. Esses resultados auxiliam no esclarecimento dos mecanismos moleculares, até então obscuros, envolvidos na regulação da expressão gênica pós-transcricional característica desses organismos. / The genus Leishmania comprises 30 species of flagellated protozoa from the family Tripanosomatidae, of which 20 are pathogenic to humans. These organisms have complex life cycles and molecular particularities not observed in most eukaryotes, like absence of transcriptional regulation. Thus, the regulation of gene expression occurs in post-transcriptional steps, with the initiation of mRNA translation representing the most important event. Different factors called eIFs (eukariotic initiation factors) are involved, with emphasis in eIF4Fcomplex, which promotes mRNA recognition and its ribosome interaction. This eIF4F complex consists of three subunits: eIF4A (RNA helicase), eIF4E (cap binding protein) and eIF4G (scaffold protein, for eIF4F complex maintenance). In trypanosomatids, five eIF4G homologous (EIF4G1 to G5) was described, however, little is known about the specific cellular functions of these homologous. In this manner, we evaluated the expression and characterized post-translational modifications of the eIF4G homologous during the Leishmania amazonensis life cycle, especially phosphorylation, considering the translational regulation by phosphorylation of eIF ́s via MAP kinases observed in higher eukaryote. For this reason, cultures were performed with the L. amazonensis promastigote and amastigote axenic forms, and the protein extract, collected from different growth phases, were analyzed by Western blotting. These results demonstrated the detection of all eIF4G homologues during the life cycle of L. amazonensis, while more than one protein isoform were observed for the EIF4G1, G4 and G5 homologues, suggesting possible post-translational modifications. Posteriorly, the EIF4G3 and EIF4G4 gene expression were investigated under differential growth conditions using six distinct inhibitors, however no change was observed in the expression pattern, which suggests that these proteins are quite stable and have long half-life extending. Finally, In silico analysis shows specifics MAP kinase-dependent phosphorylation sites presents in all eIFG homologues and further analysis with EIF4G3 and EIF4G4 confirmed the existence of phosphorylation mechanisms acting on these factors.These present data help to clarify the molecular mechanisms involved in post-transcriptional regulation of gene expression characteristic of these organisms.

Orientador: Marcelo Menossi Teixeira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T17:06:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Baldacin_MariaGrazielaZagattoKrug_D.pdf: 4445527 bytes, checksum: 9730d155ac6ebf7d24d427feb43a2acb (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A toxidez por alumínio (Al3+) é o principal fator limitante da produção agrícola em grandes áreas do Brasil e do mundo. Sabe-se que a defesa das plantas a este elemento é controlada por múltiplos genes. A caracterização de genes cuja expressão é induzida pelo Al contribui para compreender as defesas ativadas pelas plantas. Neste trabalho identificou-se um cDNA de milho expresso em raízes através da técnica de mRNA differential display. Este cDNA codifica uma seqüência que contem dois domínios LIM, separados por um espaçador de 40-50 resíduos, sendo denominado Zmlim-1. O objetivo deste trabalho é a caracterização deste gene e o seu papel na tolerância ao Al em milho. Em estudos de expressão verificou-se que o gene Zmlim- 1 é induzido por Al e sua expressão é maior na linhagem tolerante, Cat100-6, quando comparado com a linhagem sensível S1587-17. O direcionamento da proteína ZMLIM-1 foi observado em epitélios de cebola bombardeados com a construção fusionada à proteína GFP (green fluorescent protein). A expressão transiente revelou que esta proteína está localizada no citoplasma e no núcleo. A hibridização in situ demonstrou que Zmlim-1 é expresso na maioria das células do ápice de raiz de milho. O sistema de duplo híbrido de levedura permitiu identificar três proteínas que interagem com a proteína ZMLIM-1: duas proteínas da subunidade ribossomal e uma proteína da família OMT envolvida na biossíntese de lignina. Plantas transgênicas silenciando este gene forneceram evidências de que o gene Zmlim-1 pode influenciar a anatomia da raiz e a quantidade de lignina. Este é o primeiro relato de interação OMT com proteínas de domínio LIM, sugerindo um envolvimento desta proteína com a biossíntese de lignina. Plantas transgênicas submetidas ao estresse por Al3+ não apresentaram diferenças com relação às plantas controle não transformadas / Abstract: Aluminum (Al) toxicity is the main factor limiting agricultural production in large areas in Brazil and in the world. It is known that plant defenses against this element are controlled by multiple genes. The characterization of genes whose expression is induced by Al contributes to the understanding of the defenses activated by plants. In this work we identified a cDNA expressed in maize roots using mRNA differential display. This cDNA encodes a sequence that contains two LIM domains separated by a spacer of 40-50 residues, being named Zmlim-1. The purpose of this study was the characterization of this gene and its involvement in Al tolerance in maize. In expression studies it was found that the Zmlim-1 gene was induced by Al and its expression was higher in the tolerant line, Cat100-6 when compared with the sensitive line S1587-17. The subcellular localization of the protein ZMLIM-1 was observed in onion epithelial cells bombarded with a ZMLIM-1::GFP (green fluorescent protein) fusion. The assay of transient expression revealed that this protein is localized in cytoplasm and nucleus. In situ hybridization showed that Zmlim-1 is expressed in most cells of the root apex of maize. The yeast two hybrid system identified three proteins that interact with ZMLIM-1 protein: tworibosomal subunit proteins and a protein from the OMT family involved in lignin biosynthesis. Transgenic plants silenced for this gene have provided evidence that Zmlim-1 gene can influence the anatomy of the root and the amount of lignin in the plants. This is the first report of OMT interaction with LIM domain proteins, suggesting an involvement of this protein with lignin biosynthesis. Transgenic plants subjected to Al3+ stress did not show differences when compared to control, untransformed plants / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Kleber Gomes Franchini / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T19:53:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_AlineMarados_D.pdf: 7023687 bytes, checksum: ccd063ea57be631b6b555f86e24af597 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A tirosino-quinase de adesão focal (FAK) tem papel crítico na mediação da migração, sobrevivência e proliferação celular. Estudos anteriores de nosso laboratório demonstraram que a FAK é ativada pelo estresse mecânico em miócitos cardíacos e que ela se coimunoprecipita com a miosina sarcomérica. No presente trabalho foi demonstrado que o domínio FERM da FAK medeia à interação com a miosina sarcomérica, sendo que esta interação leva a inibição da autofosforilação da FAK, enquanto que a ativação prévia da FAK reduz sua interação com a miosina in vitro. Ensaios de cross linking acoplado a espectrometria de massas e espalhamento de raios X a baixos ângulos demonstraram que a miosina interage em uma fenda localizada entre os subdomínios do domínio FERM. Experimentos de microscopia confocal demonstraram que estas proteínas estão colocalizadas em miócitos cardíacos de ratos neonatos e adultos. Ensaios de imunoprecipitação revelaram que aproximadamente 40% da FAK está basalmente associada à miosina sarcomérica enquanto que, após o estiramento celular esta associação reduziu paralelamente à ativação da FAK. A porcentagem de FAK associada à miosina não se alterou com a ativação da FAK após tratamento com fenilefrina, diferente da ativação pelo estresse mecânico. A interferência na interação FAK/miosina pelo silenciamento gênico da miosina culminou com a ativação da FAK e o tratamento dos miócitos cardíacos com o peptídeo FP-1, derivado do subdomínio F2 do domínio FERM, levou a uma diminuição na interação FAK/miosina e ao aumento na fosforilação/ativação da FAK. O tratamento prolongado com FP-1 resultou em hipertrofia dos miócitos cardíacos de ratos neonatos, efeito concomitante à ativação da via de sinalização Akt, TSC2 e S6Kinase. Tanto o silenciamento da FAK quanto o tratamento com rapamicina bloquearam a hipertrofia decorrente do tratamento com FP-1. Os dados deste trabalho indicam que a interação da FAK com a miosina sarcomérica é sensível ao estresse mecânico e que possui papel regulatório na manutenção da quiescência basal da FAK e no controle das vias de sinalização mediadas por esta quinase, como a via de crescimento celular AKT/mTOR/S6Kinase, em miócitos cardíacos em cultura / Abstract: The Focal Adhesion Kinase (FAK) plays a critical role in mediating the migration, survival and cell proliferation. Previous studies from our laboratory demonstrated that FAK is activated by mechanical stress in cardiac myocytes and it co-immunoprecipitate with sarcomeric myosin. Here, we demonstrated that the FAK FERM domain mediates the interaction with sarcomeric myosin, and that this interaction leads to inhibition of FAK autophosphorylation in vitro, whereas the previous activation of FAK reduces its affinity to myosin. A model based on small angle X-ray scattering analyses and crosslinking technology coupled with mass spectrometry indicated that a cleft in FERM domain is critical to the interaction of FAK to myosin. Confocal microscopy experiments showed that these proteins are colocalized in cardiomyocytes of neonatal and adult rats. Immunoprecipitation assays revealed that approximately 40% of FAK is basally associated with sarcomeric myosin while cardiomyocyte stretching reduced this association in parallel with FAK activation. The percentage of FAK associated with myosin was not change in response to FAK activation by treatment with phenylephrine, unlike in response to FAK by mechanical stress. The interference in the FAK/Myosin interaction by myosin silencing approach culminated with the activation of FAK. The treatment of cells with the FP-1 peptide, derived from the FAK FERM domain, lead to a decrease in the interaction with sarcomeric myosin and an increase in FAK activation. Prolonged treatment with FP-1 resulted in morphological hypertrophy of neonatal rat cardiomyocytes which was an effect concomitant with activation of the Akt, TSC2 and S6Kinase signaling pathway. Both FAK silencing and the rapamycin treatment blocked the morphological hypertrophy resulting of the treatment with FP-1. This study indicated that the interaction of FAK with sarcomeric myosin is sensitive to mechanical stress and it has regulatory role in maintaining of FAK quiescence and control of signaling pathways mediated by this kinase, such as cell growth via AKT/mTOR/S6Kinase in cardiac myocytes in culture / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Ciências

Quinases dependentes de ciclinas (CDKs) compreendem uma família de proteínas que podem ser subdivididas em dois grupos funcionais majoritários baseados na sua função no ciclo celular e/ou controle transcricional. Já foram identificadas mais de 30 CDKs humanas. A CDK10 é uma proteína quinase dependente de ciclina pertencente ao grupo de quinases relacionadas à Cdc2. CDK10 é essencial na fase G2/M do ciclo celular, possivelmente no progresso dessa fase, monitorando a replicação completa do DNA e permitindo que as células passem desse ponto de restrição. Essa proteína é um importante determinante de resistência à terapia endócrina para câncer de mama. Portanto, é um alvo potencial para o desenvolvimento de inibidores, uma vez que está presente em células cancerosas. O estudo da estrutura e função da CDK10 deverá ser realizado após sua clonagem, expressão e purificação. O cDNA da CDK10 foi amplificado por reação em cadeia da polimerase (PCR), e posteriormente, o produto foi aplicado em gel de agarose para análise e purificação. O vetor de clonagem recombinante foi obtido, o qual foi clonado em células competentes e sequenciado. A obtenção do plasmídeo recombinante para expressão deu-se pela inserção do DNA nos vetores de expressão pET28a(+) e pET23a(+) (Novagen). A proteína foi expressa em células competentes e analisada por eletroforese em gel de poliacrilamida. Em seguida, a proteína obtida foi purificada em coluna de afinidade por níquel e em coluna de afinidade por ATP. Com a otimização dos resultados obtidos, será possível, futuramente, caracterizar bioquimicamente a CDK10 e elucidar suas estruturas secundária e terciária. O estudo da CDK10 irá contribuir para o entendimento da sua relação estrutura-função e sua relação com oncogenes e supressores de tumor, e o estudo estrutural para o desenvolvimento de inibidores químicos de baixo peso molecular que possa inibir especificamente a CDK10. / Cyclin-dependent kinases (CDKs) comprise a family of proteins that can be subdivided into two major groups based on their functional role in cell cycle and / or transcriptional control. Over 30 human CDKs have been identifies. CDK10 is a cyclin-dependent kinase protein that belongs to the cdc2-related kinases group. CDK10 is essential in phase G2 / M of the cell cycle, possibly in the progress of this phase, monitoring the complete DNA replication and allowing the cells to pass through this restriction point. This protein is an important determinant of resistance to endocrine therapy for breast cancer. Therefore, it is a potential target for the development of inhibitors, since it is present in cancerous cells. The study of the structure and function of CDK10 must be performed after its cloning, expression and purification. cDNA of CDK10 was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and then the product was applied into agarose gel for analysis and purification The cloning vector was obtained, which was cloned into competent cells and sequenced. The obtaining of the recombinant plasmid for expression was due to the insertion of DNA into expression vectors pET28a(+) and pET23a(+) (Novagen). The protein was expressed in competent cells and analyzed by electrophoresis on polyacrylamide gel. Then, the obtained protein was purified by nickel affinity column and ATP affinity column. With the optimization of the results obtained, it will be possible, in the future, to biochemically characterize CDK10 and elucidate its secondary and tertiary structures. The study of CDK10 will contribute to the understanding of its structure-function relationship and its relationship with oncogenes and tumor suppressors, and the structural study for the development of low molecular weight chemical inhibitors that can specifically inhibit CDK10. The structural studies will contribute to the development of chemical inhibitors of low molecular weight that may this and other CDKs.

Orientador: Kleber Gomes Franchini / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T14:22:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cordeiro_IsabelleBezerra_D.pdf: 17466566 bytes, checksum: de71f83d2b4d3c8e0f0269f5d61d332d (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A proteína Focal Adhesion Kinase (FAK; PTK2) participa de vários processos celulares. A identificação das proteínas parceiras de FAK tem contribuído para o entendimento de suas múltiplas funções celulares. Utilizando um sistema de indução de FAK fusionada a uma cauda de FLAG, combinada com análises por espectrometria de massas (MS), identificamos proteínas associadas à FAK em células HEK293. Um total de 153 proteínas foram repetidamente identificadas com alta resolução por experimentos de MS. Além de confirmar interações já previamente descritas como Paxillin (PXN), Heat shock protein Hsp90 (HSP90) e Transforming growth factor beta-1-induced transcript 1 protein (TGF?1I1), as análises por MS revelaram um novo conjunto de proteínas associadas à FAK, incluindo proteínas envolvidas nas vias de síntese de proteínas, expressão gênica, crescimento celular, proliferação, morte e sobrevivência celular. Além disso, análises de bioinformática das vias indicaram que a FAK se associa com um conjunto de 30 proteínas envolvidas com a via de modificação pós-transcricional do RNA, incluindo a proteína Serine/arginine-rich splicing factor 2 (SC-35; SRSF2), que é um marcador de speckles nucleares. Esse conjunto de proteínas está associado ao spliceossomo e um conjunto similar de proteínas também foi identificado com os experimentos que utilizaram somente o domínio FERM da FAK. Validações por Western Blotting e imunocitoquímica demonstraram que FAK se associa e co-localiza com a proteína SC-35 no núcleo celular. Ainda identificamos um papel funcional da FAK no splicing do mRNA. Demonstramos que FAK pode modificar o padrão de splicing de um gene repórter E1A ao ser superexpressa em células HEK. Nosso trabalho propõe novas funções da FAK no núcleo, indicando que esta pode estar envolvida em eventos relacionados à função do RNA, como a regulação do splicing do mRNA / Abstract: Focal adhesion kinase (FAK; PTK2) has roles in many cellular processes. The identification of protein partners for FAK has greatly contributed to our understanding of its multiple function. Using inducible FLAG-tagged FAK combined with affinity/purification mass spectrometry (MS) approach, we identified proteins associated with FAK in HEK293 cells. A total of 153 proteins were repeatedly detected in high-resolution MS measurements. Beyond the well characterized partnering with Paxillin (PXN), Heat Shock protein 90 (HSP90) and Transforming growth factor beta-1-induced transcript 1 protein (TGFB1I1), analysis of MS data uncovered novel sets of proteins that associate with FAK, playing a role in protein synthesis, gene expression, cellular growth, proliferation, death and survival. In addition, the network analysis established the unexpected finding that a module of 30 proteins linked to RNA post-transcriptional modifications are recruited by FAK, including Serine/arginine-rich splicing factor 2 (SC-35; SRSF2), which is a marker of the nuclear speckles. Indeed, this module is found to be enriched by proteins associated with spliceosome. Remarkably, a similar set of proteins was also recruited by FAK N-terminal FERM domain. Biochemical and imunofluorescence validations established that FAK associates and co-localizes with SC-35 protein at the cell nuclei. We further pinpoint a functional role of FAK in mRNA splicing. We showed that FAK can modify the splicing site selection of the adenoviral E1A minigene in a dose-dependent manner. Our work provides new insights into the molecular function of FAK in the nucleus, indicating that it may be involved in events related to RNA function, such as pre-mRNA splicing / Doutorado / Bioquimica / Doutora em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Gabriel Forato Anhê / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-25T19:01:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Araujo_ThiagoMatosFerreirade_D.pdf: 1239554 bytes, checksum: 87d5fc958173ca83a217021c9d866455 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A obesidade é caracterizada pela deposição ectópica de gordura no fígado. Este acúmulo de gordura hepática (NAFLD) pode gerar consequências graves, como a hepatite não alcoólica (NASH), fator de ricos para carcino hepatocelular (HCC). A morte de hepatócitos, evento chave na evolução da NAFLD para NASH, é causada pelo excesso de nutrientes e é dependente do estresse de retículo endoplasmático (RE). O estresse no RE resulta no acúmulo de proteínas não processadas desencadeia a "unfolded protein response" (UPR), podendo gerar apoptose. A mTOR é formada basicamente por dois complexos: mTOR1 e mTOR2; ambos são sensíveis a nutrientes, a insulina e a rapamicina. O complexo mTOR2/Rictor catalisa a fosforilação da AKT, aumentando a sinalização da insulina. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi avaliar a relação entre ativação da mTOR, do estresse de RE e da apoptose em hepatócito expostos a ácidos graxos livres. Observamos que a apoptose causada pelo palmitato ativa o estresse de RE de maneira tempo dependente. Não observamos alterações na fosforilação de proteínas alvo específicas para o complexo mTOR1. No entanto, a fosforilação geral da mTOR foi estimulada pelo palmitato. Altas doses de rapamicina inibiram a apoptose e do estresse de RE causado pelo palmitato, sugerindo a participação do complexo mTOR2. Estes resultados ainda foram confirmados pelo silenciamento gênico da Rictor. A fosforilação em serina 473 da AKT apresenta um caráter transitório, elevando-se em tempos que precedem morte e o estresse de RE, e diminuindo em tempos prolongados concomitantemente à apoptose. A inibição da AKT pelo "AKT inhibitor" gerou diminuição da apoptose, do estresse de RE e da incorporação lipídica na linhagem de hepatoma. Estes dados sugerem que a AKT, como alvo preferencial da mTOR2 é necessária para geração de morte e da UPR. A glicose (33.3mM) gera morte as células HepG2 e esta é inibida com baixas doses de rapamicina, mostrando possível atividade via mTOR1 nesta resposta. De outro modo, a frutose (4.5mM) que também desencadeia apoptose das células de hepatoma, tem seu efeito inibido por doses maiores de rapamicina, indicando atividade mTOR2 neste processo. No entanto, a possibilidade de diferentes monossacarídeos recrutarem complexos diferentes de mTOR para desencadear apoptose ainda precisa ser melhor explorada / Abstract: Obesity is characterized by fat ectopic deposition in liver. This hepatic fat accumulation our non-alcoholic fat liver disease (NAFLD) can have serious consequences such as non-alcoholic hepatitis (NASH), that is a factor to liver cancer. The cell death of hepatocytes is an important event in the development to NAFLD to NASH, all that are caused by excess nutrients and dependent of endoplasmic reticulum (ER) stress. The ER stress is caused by accumulation of unfolded proteins triggers the unfolded protein response (UPR), which mau cause apoptosis. mTOR is basically formed by two complexes: mTOR1 and mTOR2, both are sensitive to nutrients, insulin and rapamycin. The mTOR2/Rictor complex catalyse AKT phosphorylation increasing the insulin pathway. All together, the aim of this study was evaluate the relationship between mTOR, ER stress and apoptosis in liver cells exposed to free fatty acids. We observed that apoptosis caused by palmitate activates ER stress in a manner dependent on time. We din¿t observed changes in phosphorylation of specific target proteins to mTOR1 complex. However, a general phosphorylation of mTOR was stimulated by palmitate. High doses of rapamycin inhibited apoptosis and ER stress caused by palmitate, suggesting the participation of the mTOR2 complex. These results were further confirmed by gene silencing of Rictor. The AKT phospholylation in serine 473 has a transitional character, rising in times that preceding cell death and ER stress, and decreasing concomitantly apoptosis in prolonged times. Inhibition of AKT by AKT inhibitor caused a decrease in apoptosis, ER stress and lipid incorporation in hepatoma cell line. These data suggest that AKT, preferential targets of mTOR2 is required for generation death and UPR. Glucose (33.3mM) generates HepG2 cell death and this is inhibited by low doses on rapamycin, showing possible mTOR1 activity. Otherwise, fructose (4.5mM) also triggers apoptosis of hepatoma cells; its effect is inhibited by higher doses of rapamycin, indicating mTOR2 activity in this process. However, the possibility of different monosaccharide recruit different complexes of mTOR to trigger apoptosis should be further explored / Doutorado / Farmacologia / Doutor em Farmacologia