As peroxirredoxinas constituem uma família de tiol-proteínas, que reduzem peróxido de hidrogênio, peróxidos orgânicos e peroxinitrito a água, álcool e nitrito, respectivamente, utilizando equivalentes redutores fornecidos pela tiorredoxina, tiorredoxina redutase e NADPH. As peroxirredoxinas são enzimas abundantes (constituem aproximadamente 0,7 % do total de proteínas solúveis presentes em leveduras) e foram identificadas em diversas espécies de animais, plantas e bactérias, porém seu papel fisiológico ainda é discutido. Até recentemente, as peroxirredoxinas eram consideradas pouco eficientes para detoxificar peróxidos, em comparação às catalases e heme-peroxidases. De fato, as constantes de segunda ordem determinadas para as reações de peroxirredoxinas com peróxido de hidrogênio eram da ordem de 104-105 M-1 s-1, valores muito menores que os de hemeproteínas (~107 M-1 s-1). Neste trabalho, um método de cinética competitiva foi desenvolvido para re-determinar essas constantes de velocidade, utilizando a peroxidase de raiz forte como competidora das peroxirredoxinas de S. cerevisiae, Tsa1 e Tsa2. Este método foi validado e as constantes de velocidade determinadas para Tsa1 e Tsa2 foram da ordem de k~ 107 M-1 s-1 para a reação com peróxido de hidrogênio e da ordem de k~10105 M-1 s-1 para a reação com peroxinitrito. Utilizando a mesma metodologia, foi possível ainda determinar o pKa da cisteína peroxidásica da Tsa1 e Tsa2 (Cys47), como sendo 5,4 e 6,3, respectivamente. Paralelamente, o papel fisiológico das peroxirredoxinas foi examinado em linhagens de S. cerevisiae com deleção de Tsa1, Tsa2 ou de ambas isoformas. Os estudos foram realizados sob condições fermentativas e a linhagem tsa1Δtsa2Δ se mostrou mais resistente ao peróxido de hidrogênio (1 mM) e o consumiu mais rapidamente que a WT. Além disso, a linhagem tsa1Δtsa2Δ produziu quantidades mais altas do radical 1-hidroxietila, produto da oxidação do etanol, que é o principal metabólito da levedura em anaerobiose. O mecanismo de formação do radical 1-hidroxietila foi examinado e a quantificação da concentração de ferro quelatável, ferro total e cobre mostrou que a reação de Fenton não era sua principal fonte. Outro mecanismo investigado foi a formação do radical através da atividade peroxidásica da Sod1, cuja expressão e atividade se mostraram aumentadas cerca de 5 e 2 vezes, respectivamente, na linhagem tsa1Δtsa2Δ. Na linhagem mutante ainda foi observado que o tratamento com peróxido de hidrogênio aumentou a concentração de radicais derivados e adutos do DNA, detectados por imuno-spin trapping e incorporação de 14C derivado da glicose. Em conjunto, os resultados deste trabalho reforçam a importância das peroxirredoxinas na defesa antioxidante e mostram que as respostas compensatórias empregadas pela levedura para contornar as deleções de Tsa1 e Tsa2 podem ser deletérias longo prazo. / Peroxiredoxins constitute a family of cysteine-based peroxidases that are able to reduce hydrogen peroxide, organic peroxides and peroxinitrite to water, alcohol and nitrite, respectively, through the use of reducing equivalents provided by thioredoxin, thioredoxin reductase and NADPH. Peroxiredoxins are abundant enzymes (correspond to approximately 0.7% of total soluble protein in yeasts) and have been identified in several species ranging from animals, plants and bacteria, but their physiological role remains under scrutiny. Peoxiredoxins were regarded as less eficient enzymes in comparison with catalases and heme-peroxidases for detoxification of peroxides. Second-order rate constants determined for the reaction of peroxiredoxins with hydrogen peroxide were in the range of 104-105 M-1 s-1, which is quite low, as compared with those of heme-proteins (~107 M-1 s-1). In the present work, a competitive kinetic approach with horseradish peroxidase was developed in order to determine the second order rate constant of the reaction of peroxiredoxins with peroxynitrite and hydrogen peroxide. This method was validated and permitted for the determination of the second order rate constant value of the reaction of Tsa1 and Tsa2 with peroxynitrite (k~105 M-1 s-1) and hydrogen peroxide (k~ 107 M-1 s-1) at pH 7.4, 25 °C. It also permitted the determination of the pKa of the peroxidatic cysteine of Tsa1 and Tsa2 (Cys47) as 5.4 and 6.3, respectively. In parallel, the physiological role of peroxiredoxins was examined in S. cerevisiae strains with deletion of Tsa1, Tsa2 or of both isoforms. Under fermentative conditions, tsa1Δtsa2Δ cells were more resistant to 1 mM hydrogen peroxide than WT cells, and consumed it faster. In addition, tsa1tsa2 cells produced higher yields of the 1- hydroxyethyl radical from the oxidation of the glucose metabolite ethanol, as shown by spintrapping experiments. A major role for Fenton chemistry in radical formation was excluded by comparing WT and tsa1Δtsa2Δ cells with respect to their levels of chelatable iron ions, total iron and copper ions, and of 1-hydroxyethyl radical produced in the presence of metal ion chelators. The main route for 1-hydroxyethyl radical formation was ascribed to the peroxidase activity of Sod1, whose expression and activity increased about five- and twofold, respectively, in tsa1Δtsa2Δ compared to WT cells. Relevantly, tsa1Δtsa2Δ cells challenged with hydrogen peroxide contained higher levels of DNA-derived radicals and adducts as monitored by immuno-spin trapping and incorporation of 14C from glucose into DNA, respectively. Taken together, our results reinforce the importance of peroxiredoxins in the antioxidant defense show that the compensatory responses employed by yeast to counterbalance the deletions of Tsa1 and Tsa2 may be deleterious in the long time range.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Haloperidol-induced orofacial dyskinesia (OD) is a putative animal model of tardive dyskinesia (TD) whose pathophysiology has been related to an increase in dopamine turnover, reduction in gabaergic neurotransmission and oxidative stress. Schizophrenic patients have been reported to eat a diet higher in fat than the general population and dietary fat intake can lead to an increase in oxidative stress in animal models. Thus, the first objective of this study was to determine if the association of high fat diet ingestion with prolonged haloperidol treatment could alter the OD and lead to oxidative stress in the rat brain (article 1). Haloperidol decanoate administration (38 mg/kg, which is equivalent 1mg/kg/day) monthly for a period of 6 months to rats fed previously with a HF diet caused an increase in OD. Furthermore, haloperidol caused an increase in the levels of lipid peroxidation in striatum and substantia nigra only in rats fed with the HF diet. Another objective of this work was to evaluate the effects of V. officinalis (1% administered in the drink water) in the animal model of OD induced by long-term treatment with haloperidol (article 2). V. officinalis has been widely used to treat insomnia since it posses GABAmimetic and antioxidant properties. Concomitant treatment with V. officinalis did not modify the intensity or prevalence of OD. We did not find any statistical differences among the groups when oxidative stress parameters were evaluated. On the other hand, haloperidol treatment significantly decreased [3H]-dopamine uptake in slices from striatum of rats, an effect unaltered by V. officinalis. The treatment with V. officinalis reduced the locomotor activity in the open field and increased the time spent on open arm in the plus maze test, confirming the anxiolitic effect of V. fficinalis. Taken together, these results indicate that a high fat diet caused a transitory increase in haloperidol-induced OD in rats and this, at least in part, can be related to the haloperidol-induced oxidative stress in brain structures. Our data also suggest that the reduction in dopamine transport can be a possible mechanism related to the maintenance of chronic OD in rats feeding NF diet. Finally, V. officinalis seems not to be efficacious in the reduction of OD in rats. / A discinesia orofacial (DO) induzida por haloperidol consiste num modelo de discinesia tardia (DT) cuja patofisiologia tem sido relacionada a um aumento na renovação de dopamina, à redução na neurotransmissão gabaérgica e ao estresse oxidativo. Existem relatos de que pacientes esquizofrênicos ingerem uma maior quantidade de gordura na dieta do que a população em geral e o aumento da ingestão de gordura pode levar a um aumento do estresse oxidativo em modelos animais. Assim, um primeiro objetivo deste estudo foi determinar se a associação de ingestão de dieta rica em gordura concomitante ao tratamento prolongado com haloperidol poderia alterar a DO e levar ao estresse oxidativo em cérebro de ratos (artigo 1). A administração de decanoato de haloperidol (38 mg/kg, equivalente a 1mg/kg/dia) mensalmente, por um período de 6 meses, a ratos previamente alimentados com dietas normolipídica (NL) e hiperlipídica (HL) causou um aumento na DO. Além disso, o haloperidol causou um aumento nos níveis de peroxidação lipídica em estriado e substantia nigra somente em ratos ingerindo dieta HL. Um outro objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da V. officinalis (administrada na água de beber na proporção de 1mL de tintura de raíz para 100mL de água) no modelo animal de DO induzido por tratamento prolongado com haloperidol (artigo 2). A V. officinalis tem sido largamente utilizada para o tratamento de insônia possuindo propriedades GABA-miméticas e antioxidantes. O tratamento concomitante com V. officinalis não modificou a intensidade ou a prevalência da DO. Além disto, não encontramos nenhuma diferença estatística entre os grupos quando os parâmetros de estresse oxidativo foram avaliados. Por outro lado, o tratamento com haloperidol reduziu significativamente a captação de [3H]-dopamina em fatias de estriado de ratos, um efeito inalterado pela V. officinalis. O tratamento com V. officinalis reduziu a atividade locomotora no campo aberto e aumentou o tempo de permanência no braço aberto do labirinto em cruz elevado, o que confirma o efeito ansiolítico da V. officinalis. Em conjunto, estes resultados indicam que a dieta rica em gordura causou um aumento transitório da DO induzida por haloperidol em ratos o que pode, em parte, ser relacionado ao estresse oxidativo induzido por haloperidol em estruturas do cérebro envolvidas com a DO. Nossos dados também sugerem que a redução no transporte de dopamina pode ser um possível mecanismo relacionado à manutenção da DO crônica em ratos ingerindo dieta NL. Além disso, a V. officinalis parece não ser eficaz na redução da DO em ratos.

Há, no Brasil, uma enorme diversidade de espécies vegetais, e um conhecimento popular de várias propriedades medicinais das mesmas. Dentre os estudos realizados com extratos de plantas, há um interesse especial na atividade antioxidante. Este trabalho, focado em atividade antioxidante, é dividido em duas partes: a primeira, utiliza a técnica de RPE para estudar a ação dos antioxidantes neutralizando os radicais livres, enquanto que a segunda utiliza a TFD para, em simulação computacional, ajudar a entender os resultados obtidos na primeira parte. Foram analisados 10 extratos vegetais: Swartzia langsdorffii, Machaerium villosum, Pterogyne nitens, Maytenus ilicifolia (casca de raiz), Pera glabrata, Aegiphyla sellowiana, Copaifera langsdorffii, Chrysophyllum inornatum, Iryanthera juruensis (folhas e sementes), Didymopanax vinosum. O estudo da atividade antioxidante com RPE utiliza dois métodos diferentes: o primeiro método mede a atividade antioxidante por meio do controle da quantidade de radicais livres, TEMPOL e DPPH, em contato com o extrato vegetal, enquanto que o segundo método utiliza o spin trap DMPO em conjunto com a reação de Fenton (Fe2+ + H2O2 => Fe3+ + HO- + HO) para analisar a ação dos extratos vegetais contra o radical hidroxila (OH?). A simulação computacional dos compostos TEMPOL, DPPH e DMPO é realizada em um método de primeiros princípios na Teoria do Funcional da Densidade, com uso de pseudopotenciais. O código utilizado é o SIESTA. As conclusões indicam que o extrato de Iryanthera juruensis, tanto de folhas quanto de sementes, exibe atividades antioxidantes bastante acentuadas, em todos os métodos utilizados. A simulação computacional aponta o TEMPOL menos reativo que o DPPH, devido a menor energia liberada em sua reação de redução. Sabendo que algumas destas espécies já são usadas popularmente por propriedades medicinais, estudos futuros para a correta identificação do agente antioxidante e seu possível uso, tanto na indústria alimentícia quanto na farmacêutica, deverão ser realizados. / There is, in Brazil, a great diversity of vegetable species, and a popular knowledge of several medicinal properties of the some of them. In studies carried out with plants? extracts, there is special interest in antioxidant activities. This work, focused in antioxidant activity, is divided in two parts: the first uses EPR technique to study the antioxidant activities neutralizing free radicals, while the second one uses DFT, in computational simulation, to understand the results obtained from the first part. Ten vegetable extracts were analyzed: Swartzia langsdorffii, Machaerium villosum, Pterogyne nitens, Maytenus ilicifolia (bark root extracts), Pera glabrata, Aegiphyla sellowiana, Copaifera langsdorffii, Chrysophyllum inornatum, Iryanthera juruensis (leaves and seeds), Didymopanax vinosum. The study with EPR uses two different methods: the first method measures the antioxidant activity by monitoring the amount of free radicals, DPPH and TEMPOL, that are in contact with the plant extract, the second method uses spin trap DMPO with Fenton reaction (Fe2+ + H2O2 => Fe3+ + HO- + HO) for the study of the plant extract antioxidant activity against the hydroxyl radical (OH?). The computational simulation of TEMPOL, DPPH and DMPO is carried out using a method of first principles within the Density Functional Theory and pseudopotentials. The code is SIESTA. The conclusions indicate that the Iryanthera juruensis extract, as of leaves as of seeds, exhibits accentuated antioxidants activities, in all of the used methods. The computational simulation indicated that the TEMPOL is less reactive than the DPPH, because the lower energy in its reduction reaction. As some of these species are already used popularly by medicinal properties, future studies for correct identification of the antioxidant compounds and its possible use, as in the food industry as in the pharmaceutical industry, should be realized.

A redução univalente de oxigênio molecular nas células produz intermediários altamente reativos tais como o íon radical Superóxido (O-•2), o radical hidroxil (HO•) e o peróxido de hidrogênio (H2O2). Níveis muito altos ou baixos de tais espécies representam séria ameaça ao metabolismo celular. Diferentes estados patológicos têm sido relacionados com níveis anormais destas espécies em eritrócitos e plaquetas. A proteção biológica contra efeitos tóxicos associados com níveis excessivos de espécies ativadas de oxigênio, tem sido atribuída a três enzimas principais presentes em eritrócitos e outras células: superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase. Neste trabalho, foram feitas dosagens dessas enzimas protetoras em eritrócitos de indivíduos portadores de porfiria aguda intermitente. Esta doença caracteriza-se por um defeito na biossíntese de heme e clinicamente manifesta-se por dor abdominal intensa, paralisia e distúrbios neuropsíquicos. Foram encontrados nos pacientes em crise aguda atividades elevadas de superóxido dismutase e de glutationa peroxidase enquanto que a atividade de catalase permaneceu normal. Tais resultados apontam a possibilidade de que as manifestações clínicas de IAP relacionadas com toxicidade por oxigênio. Estejam Comparou-se também a atividade destas três enzimas em eritrócitos de residentes na cidade de são Paulo com o de moradores de Vila Parisi, conhecida pelo seu altíssimo nível de poluiçao atmosférica. Os níveis de superóxido dismutase e de glutationa peroxidase são bem mais elevados (cerca de 1,5 vezes) nos indivíduos residentes em Vila Parisi. A elevação da concentração intracelular destas enzimas pode ser sua resposta ao aumento da taxa de oxidação da oxihemoglobina, a qual é conhecida fonte de íons superóxido. Estes dados demonstram profundas diferenças no metabolismo de 02 entre esses dois grupos e talvez uma possível adaptação metabólica dos moradores de Vila Parisi aos altos níveis de poluição a que estão expostos. / The univalent reduction of molecular oxygen in cells produces very reactive species such as the superoxide anion (O-•2), the hydroxyl radical (HO•) and hydrogen peroxide (H2O2). Abnormally high or low concentrations of such species may represent a serious threat to the cellular metabolism. Indeed, several disorders have been associated with abnormal levels of these species in erythrocytes and platelets.The biological protection against toxic effects due to excessive levels of activated species of molecular oxygen has been attributed mainly to three enzymes occurring in erythrocytes and other cells: superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px) and catalase. In the present work, we report the activities of SOD, GSH-Px and catalase in the erythrocytes of patients with intermittent acute porphyria (IAP), an inborn error in the heme biosynthetic pathway. The clinical manifestations of IAP include abdominal pain and neuropsychiatric symptons. In patients undergoing acute attack, we found increased levels of SOD and GSH-Px, while that of catalase remains unchanged. These results point to the possibility that the clinical manifestations of IAP are related to oxygen toxicity. We have also compared the activities of these enzymes in residents of the city of são Paulo (Brazil) and in subjects living in Vila Parisi (Cubatão, SP, Brazil), a village submitted to high levels of atmospheric pollution. The erythrocyte SOD and GSH-Px levels were found to be ca. 1.5 fold higher in residents of Vila Parisi. These high intracellular enzyme concentrations may reflect a biological defense against an increase in the rate of oxyhemoglobin oxidation, known to be a source of superoxide species. Our results point to important differences between the two populations with respect to the metabolism of oxygen and, perhaps, a metabolic adaptation in the residents of Vila Parisi to the dramatically high levels of atmospheric pollution.

Estudos envolvendo o oxigênio molecular singlete (1O2) tem uma relevância biológica, uma vez que esta espécie, devido ao caráter eletrofílico, reage com moléculas ricas em elétrons como proteínas, lipídeos e DNA provocando danos que resultam em perdas de função e integridade celular. Em sistemas biológicos, a presença de outras espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, dificultam a identificação de lesões específicas causadas por 1O2 .Neste contexto, este trabalho foi desenvolvido objetivando a síntese de endoperóxidos isotopicamente marcados com 17O para serem utilizados como fonte geradora limpa de 17[1O2] em estudos mecanísticos. A capacidade de geração de 17[1O2] pelo endoperóxido N,N\'-di(2,3-dihidroxipropil)-3,3\'-(1,4 naftilideno) dipropanamida 17O (DHPN17O2) foi confirmada utilizando o captador químico sulfato mono-{2-[10-(2-sulfoxi-etil)-antracen-9-il]-etil}éster de sódio e o nucleosídeo 2\'- desoxiguanosina. Os produtos isotopicamente marcados com 17O formados foram analisados por espectrometria de ressonância magnética nuclear e cromatografia líquida de alta eficiência acoplado ao espectrômetro de massa. Os lipídeos, em especial o colesterol ao reagir com o 1O2 geram hidroperóxidos de colesterol como produtos de oxidação primária e na presença de metais resulta em compostos de maior reatividade e toxicidade, como os radicais peroxila, que contribuem para a propagação da peroxidação lipídica. Neste trabalho, demonstramos que os hidroperóxidos de colesterol são capazes de gerar 1O2 na presença de metal através de medidas de luminescência, utilização de supressores e captador químico de 1O2. Os mecanismos de reação envolvidos foram estudados e determinados por espectrometria de massa acoplada a cromatografia líquida de alta eficiência. Por fim, a caracterização detalhada dos produtos formados por espectrometria de ressonância magnética nuclear e massa na reação do colesterol com 1O2 mostrou que além dos hidroperóxidos a reação também produz um aldeído, o 3&#946; -hidroxi-5&#946;-hidroxi-B-norcolestano-6&#946;-carboxialdeído. Até o momento, este composto havia sido identificado como um produto específico da ozonização do colesterol. Neste estudo, baseado nos estudos por reações de quimiluminescência, é proposto o mecanismo de formação deste aldeído em reações de oxidação de colesterol por 1O2 envolvendo intermediário dioxetano. / Studies involving singlet molecular oxygen (1O2) has biological relevance, once this species, due to its eletrophylic character, reacts with rich electron molecules such as proteins, lipids and DNA causing damages that result in loss of function and cellular integrity. In biological system, the presence of other reactive species of oxygen and nitrogen impair the identification of lesions caused by 1O2. In this context, this work was developed with the aim of synthesizing <SUP17O-labeleded endoperoxides to be used as a clean source of (1O2) in mechanistic studies. The ability of 17[1O2]generation by N,N\'-di(2,4-dihydroxypropyl)-1,4-naphthalene-dipropanamide labeled with 17O(DHNP17O2) was observed using the disodium salt of anthracene-9,10-diyldiethyl disulfate as a chemical trap and the nucleoside 2\'-deoxyguanosine. The products isotopically labeled with 17O were analyzed by nuclear magnetic resonance spectroscopy and high performance liquid chromatography coupled to a mass spectrometer. Lipds, in special the cholesterol, when reacting with singlet molecular oxygen generate cholesterol hydroperoxides as primary products and in the presence of metals result in compounds of higher reactivity and toxicity, such as peroxyl radicals which contribute to the propagation of lipid peroxidation. In this work, we demonstrated that cholesterol hydroperoxides are able to generate singlet molecular oxygen in the presence of metal by chemiluminescence measurements by testing the effect of singlet molecular oxygen quencher and by chemical trap. The involved reaction mechanisms were studied and determined by mass spectrometry coupled to the high performance liquid chromatography. Finally, we detailed characterization of the products formed in the reaction of cholesterol with 1O2 by nuclear magnetic resonance and mass spectroscopy showed that besides cholesterol hydroperoxides, the reaction also produces an aldehyde, 3&#946;hydroxy-5&#946;-hydroxy-B-norcholestan-6&#946;-carboxyaldehyde which had been identified as a specific product of cholesterol ozonization. In this study, based on the studies of chemiluminescence reactions, the mechanism of formation of this aldehyde in reaction of oxidation of cholesterol by 1O2 involving a dioxetane intermediate has been proposed.

A esclerose lateral amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa que afeta os neurônios motores levando a atrofia muscular e morte por insuficiência respiratória. Esta patologia se manifesta de forma esporádica ou familiar, que são indistinguíveis clinicamente. Mutações na enzima antioxidante superóxido dismutase 1 (hSod1) respondem por aproximadamente 20% dos casos familiares de ELA. Além disso, o caráter autossômico dominante destas mutações revela que a hSod1 adquire propriedades tóxicas aos neurônios motores. Atualmente, duas hipóteses não mutuamente excludentes existem para explicar o caráter tóxico das mutantes da hSod1 relacionadas à ELA. A primeira refere-se à produção de oxidantes pela atividade peroxidásica exacerbada das mutantes contribuindo para o estresse oxidativo observado em ELA. A segunda refere-se à agregação de proteínas como ocorre em outras doenças neurodegenerativas. Digno de nota, o radical carbonato produzido na atividade peroxidásica da hSod1 causa a formação de um dímero covalente da proteína análogo a uma espécie de hSod1 frequentemente detectada em modelos experimentais e pacientes da doença e associada à propriedade tóxica das mutantes. Desta forma, o presente trabalho buscou esclarecer o mecanismo de produção do radical carbonato pela hSod1, bem como caracterizar o dímero covalente da proteína para posterior estudo de sua formação em um modelo de ELA em ratos que superexpressam a mutante G93A da hSod1. Os estudos cinéticos da variação do pH sobre os efeitos de bicarbonato/CO2, nitrito e formato na atividade peroxidásica da hSod1, medidos pelo consumo de peróxido de hidrogênio e produção de radical, permitiram excluir o mecanismo de Fenton para explicar o ciclo peroxidativo da enzima em tampão bicarbonato em favor de outros intermediários reativos. Já, os experimentos de 13C RMN, modelagem molecular e cinética de fluxo interrompido com mistura assimétrica demonstraram que o ânion peroxomonocarbonato constitui o precursor do radical carbonato produzido pela hSod1. A caracterização do dímero covalente da hSod1 por proteólise com tripsina seguida de análise por HPLC/UV-vis e HPLC/ESI-MS identificou um peptídeo característico do dímero covalente da hSod1. A digestão enzimática em H2 18O demonstrou de forma inequívoca a natureza dímerica deste peptídeo pela marcação da extremidade C-terminal. Ainda, o sequenciamento do peptídeo dimérico por MS/MS revelou a estrutura primária ESNGPVKVW(ESNGPVKVWGSIK)GSIK, na qual as cadeias polipeptídicas estão ligadas através de um aduto de ditriptofano composto por resíduos Trp32 da proteína. Por fim, este peptídeo dimérico pode ser empregado como marcador bioquímico específico para o estudo do dímero covalente da hSod1 in vivo. A análise do extrato de proteínas das medulas dos ratos modelo de ELA identificou quinze candidatos a dímero covalente da hSod1 por Western-blot, sendo que dois deles foram excluídos por espectrometria de massa, pois tiveram o resíduo Trp32 identificado. O peptídeo ESNGPVKVW(ESNGPVKVWGSIK)GSIK não foi observado, porém as treze espécies restantes permanecem candidatas e deverão ser reexaminadas em trabalhos que darão sequência a esta tese de doutorado. Em suma, o peroxomonocarbonato constitui o intermediário na produção do radical carbonato pela hSod1 e o peptídeo ESNGPVKVW(ESNGPVKVWGSIK)GSIK uma ferramenta importante no estudo da agregação covalente da hSod1 em ELA. / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disease of motors neurons that causes muscle atrophy, weakness, and death by respiratory failure. This pathology occurs in both sporadic and familiar forms that are clinically indistinguishable. Mutations in the antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (hSod1) respond to about 20% of the familiar cases of ALS. Besides, the autosomal dominant nature of these hSod1-associated ALS suggests that the mutants gain toxic properties to motor neurons. Currently, two hypotheses exist to explain the toxicity of hSod1 mutants but they do not exclude each other. The first one is related to the production of oxidants by the increased peroxidase activity of the ALS-linked mutants that could contribute to the oxidative stress reported in ALS. The second refers to protein aggregation as proposed in other neurodegenerative diseases. Noteworthy, the carbonate radical produced during hSod1 peroxidase activity leads to the formation of a covalent dimer of the protein similar to a hSod1 species often detected in experimental models and patients of the disease and implicated in the toxic properties of hSod1 mutants. Thus, the present work aimed to determine the mechanism of carbonate radical production by hSod1 and to characterize the covalent dimer of the protein in vitro followed by the study of covalent aggregates of hSod1 in a rat model of ALS that overexpresses the G93A mutant of the protein. The kinetic studies of the effect of bicarbonate/CO2, nitrite and formate in the peroxidase activity of hSod1 at various pH, measured by hydrogen peroxide consumption and radical production, permitted to exclude the Fenton mechanism to explain the enzyme peroxidative cycle in bicarbonate buffer in favor of other reactive intermediates. Furthermore, 13C NMR, molecular docking and stopped-flow experiments with asymmetric mixing demonstrated that the anion peroxomonocarbonate is the precursor of the carbonate radical produced by hSod1. The characterization of hSod1 covalent dimer by proteolysis with trypsin followed by HPLC/UV-vis and HPLC/ESI-MS analysis identified a peptide characteristic of the covalent dimer of the protein. The enzymatic digestion in H2 18 O irrefutably demonstrated the dimeric nature of this peptide because of the C-terminal labeling with oxygen-18 isotopes. In addition, sequencing of the dimeric peptide by MS/MS determined the primary structure ESNGPVKVW(ESNGPVKVWGSIK)GSIK, in which the polipeptide chains are crosslinked through a ditryptophan adduct formed by a covalent bond between the Trp32 residues of each subunit. So, this dimeric peptide can be employed as a biochemical marker for studying the hSod1 covalent dimer in vivo. The analysis of protein extracts from the spinal cord of the rat model of ALS by Western-blot identified fifteen candidates to hSod1 covalent dimer, but two of them were excluded by mass spectrometry analysis that identified unmodified Trp32 residues. Moreover, neither the dimeric peptide nor the Trp32 residue were observed in the remaining species. Therefore, these thirteen candidates must be reexamined in subsequent studies. In conclusion, the anion peroxomonocarbonate is the key intermediate in the production of the carbonate radical by hSod1 and the dimeric peptide constitutes a specific tool to study hSod1 covalent aggregation in ALS

O comportamento eletroquímico do Nitrofural (NFZ) foi estudado em eletrodos de pasta de carbono, carbono vítreo e diamante altamente dopado com boro (EDADB) em tampão Britton-Robinson (BR) usando a voltametria cíclica. Os melhores resultados foram obtidos em EDADB, no qual foi possível estabilizar o radical aniônico (R-NO2&#8226;&#8254) em meio predominantemente aquoso, como também estudar a interação entre o R-NO2&#8226;&#8254; a glutationa (GSH), a L-cisteína (Cis) e o O2. Somente na superfície do EDADB, o NFZ foi diretamente reduzido à amina derivada (R-NH2) no intervalo de 2,02 &#8804; pH &#8804; 4,03 num processo envolvendo seis (6,0 ± 0,4) elétrons e seis prótons. Na faixa de 7,04 &#8804 pH &#8804; 12 e meio predominantemente aquoso, a etapa de redução desmembrou-se em seus dois componentes: a redução do NFZ ao nitro radical aniônico (R-NO2&#8226;&#8254;) e posterior redução deste ao derivado hidroxilamínico (R-NHOH) em processos envolvendo um e três (3,1 ± 0,1) elétrons respectivamente. No sentido anódico da varredura dos voltamogramas cíclicos registrados em pH 8,06, observou-se a oxidação da hidroxilamina ao derivado nitroso (R-NO), num processo envolvendo 2 (1,7 ± 0,2) elétrons e 2 prótons. Além disto, um novo pico de oxidação não relatado na literatura em qualquer material de eletrodo foi detectado em pH &#8804; 8,06, que foi observado não importando se o NFZ havia sido previamente reduzido ou não. O cálculo do número de elétrons, n, envolvido em cada etapa eletroquímica foi satisfatoriamente estimado usando-se a equação de Randles-Sevcik. Na presença de [Tiol] &#8804; 3,7 x 10-2 mol L-1, o NFZ é reduzido ao aduto R-NO-Tiol em um processo eletroquímico envolvendo dois elétrons e dois prótons. Por outro lado, o O2 atua como um aceptor de R-NO2&#8226;&#8254; e a constante de equilíbrio para a transferência monoeletrônica do R-NO2&#8226;&#8254; para o oxigênio, kO2, é 60. O processo é catalítico e pode ser utilizado para a determinação analítica de NFZ na faixa de 9,9 x 10-7 &#8804; [NFZ] &#8804; 1,1 x 10-5 mol L-1 em pH 8,06, com sensibilidade amperométrica de 2,2 x 104 µA L mol-1 cm-2 e limite de detecção de 3,4 x 10-7 mol L-1. Os parâmetros analíticos foram similares aqueles obtidos em pH 4,0 usando a redução direta do NFZ à respectiva amina derivada em um processo envolvendo seis elétrons e seis prótons. A caracterização do processo de redução total do NFZ em meio aquoso e velocidades de varredura relativamente baixas, 100 mV s-1, somente foi possível devido às características superficiais intrínsecas do EDADB, o qual estabiliza o radical livre, R-NO2&#8226;&#8254;, permitindo trabalhar numa ampla janela de potencial, sem haver perda do sinal de oxidação do R-NO2&#8226;&#8254;. / The electrochemical behaviour of nitrofural (NFZ) at carbon paste, glassy carbon and highly boron doped diamond (HBDD) electrodes was studied in Britton- Robinson (BR) buffer using cyclic voltammetry. The best results were obtained at HBDD electrodes, in which it was possible to stabilize the radical anion (R-NO2&#8226;&#8254;) in predominantly aqueous medium as well as to study the interaction between the radical anion and glutathione (GSH), L-cysteine (Cys), and O2. Only at HBDD surface, NFZ was directly reduced to the amine derivative (R-NH2) in the pH range of 2.02 to 4.03 in a process involving six (6.0 ± 0.4) electrons and six protons. In the range of pH 7.04 to 12 and, predominantly aqueous medium, the reduction step split into its two components: the reduction of NFZ to the nitro radical anion (R-NO2&#8226;&#8254;) and reduction of R-NO2&#8226;&#8254; to hydroxylamine derivative (R--NHOH) in processes involving one and three (3.1 ± 0.1) electrons respectively. On the anodic scan of the cyclic voltammograms and at pH 8.06, it was observed the oxidation of the hydroxylamine to the nitroso derivative (R-NO), in a process involving 2 (1.7 ± 0.2) electrons and 2 protons. In addition and unreported in the literature on any electrode material, was the detection of a new oxidation peak at pH > 8.06, which was observed regardless of whether NFZ had been previously reduced or not. The calculation of n, number of electrons, involved in each electrochemical step was satisfactorily accomplished using the Randles-Sevcik equation. In presence of [Thiol] &#8804; 3.7 x 10-2 mol L-1 NFZ is directly reduced to R-NO---Thiol adducts in an electrochemical process involving two electrons and two protons. On the other side, O2 acts as a R-NO2&#8226;&#8254; scavenger and the equilibrium constant for the electron transfer from nitro radical to oxygen, kO2, is 60. The process is catalytic and can be used to the analytical determination of NFZ in the range of 9.9 x 10-7 &#8804; [NFZ] &#8804; 1.1 x 10-5 mol L-1 at pH 8.0, with amperometric sensitivity of 2.2 x 104 µA L mol-1 cm-2 and detection limit of 3.4 x 10-7 mol L-1. The analytical parameters were similar to those obtained at pH 4.03 using the direct reduction of NFZ to the respective amine derivative in a process involving six electrons and six protons. The characterization of NFZ global reduction process in aqueous medium and at relative low scan rate, 100 mVs-1, was only possible due the intrinsic superficial characteristics of the HBDD electrode, which stabilize the R-NO2&#8226;&#8254; free radical, allowing to work in a large potential window, without losing the R-NO2&#8226;&#8254; oxidation signal.

Os mecanismos fisiopatológicos associados aos efeitos benéficos da reanimação guiada pela saturação venosa mista de oxigênio (SvO2) durante a sepse não são claros. Nosso objetivo foi avaliar os efeitos de um algoritmo de reanimação guiado pela SvO2 incluindo fluidos, noradrenalina e dobutamina na hemodinâmica, resposta inflamatória e estresse oxidativo cardiovascular durante um modelo experimental que se assemelha clinicamente ao choque séptico. Dezoito porcos anestesiados e cateterizados (35-45 kg) foram submetidos à peritonite por inoculação fecal (0,75 g/Kg). Depois de permanecerem hipotensos, antibióticos foram administrados e os animais foram randomizados em dois grupos: controle (n=9), com suporte hemodinâmico visando pressão venosa central de 8-12 mmHg, débito urinário de 0,5 ml/kg por hora, e pressão arterial média acima de 65 mmHg; e grupo SvO2 (n=9), com os objetivos acima referidos, além de SvO2 acima de 65%. As intervenções duraram 12 hs e incluíram Ringer Lactato e norepinefrina (ambos os grupos) e dobutamina (grupo SvO2). A resposta inflamatória foi avaliada pela concentração plasmática de citocinas, expressão de CD14 de neutrófilos, geração de espécies reativas de oxigênio e apoptose. O estresse oxidativo foi avaliado pelas concentrações de nitratos no miocárdio e no plasma, a atividade miocárdica e vascular de NAD(P)H oxidase, conteúdo de glutationa do miocárdio e expressão de nitrotirosina. A reanimação guiada por SvO2 foi associada com melhor índice sistólico, oferta de oxigênio e diurese. A sepse induziu em ambos os grupos um aumento significativo na concentração de IL-6, nas concentrações de nitrato de plasma e diminuição persistente na expressão de CD14 em neutrófilos. A apoptose e a geração de espécies reativas de oxigênio por neutrófilos não foram diferentes entre os grupos. As estratégias de tratamento não alteraram significativamente os parâmetros de estresse oxidativo. Assim, uma abordagem destinada a otimizar a SvO2 durante a sepse melhora a hemodinâmica, porém sem qualquer efeito significativo sobre a resposta inflamatória e estresse oxidativo. Os efeitos benéficos associados a esta estratégia podem estar relacionados a outros mecanismos. / The pathogenetic mechanisms associated to the beneficial effects of mixed venous oxygen saturation (SvO2)-guided resuscitation during sepsis are unclear. Our purpose was to evaluate the effects of an algorithm of SvO2-driven resuscitation including fluids, norepinephrine and dobutamine on hemodynamics, inflammatory response and cardiovascular oxidative stress during a clinically resembling experimental model of septic shock. Eighteen anesthetized and catheterized pigs (35-45 Kg) were submitted to peritonitis by fecal inoculation (0.75 g/Kg). After hypotension, antibiotics were administered, and the animals were randomized to two groups: control (n=9), with hemodynamic support aiming central venous pressure 8 to 12 mmHg, urinary output 0.5 ml/Kg per hour, and mean arterial pressure greater than 65 mmHg; and group SvO2 (n =9), with the goals above, plus SvO2 greater than 65%. The interventions lasted 12 h, and lactated Ringer\'s and norepinephrine (both groups) and dobutamine (SvO2 group) were administered. Inflammatory response was evaluated by plasma concentration of cytokines, neutrophil CD14 expression, oxidant generation, and apoptosis. Oxidative stress was evaluated by plasma and myocardial nitrate concentrations, myocardial and vascular NAD(P)H oxidase activity, myocardial glutathione content, and nitrotyrosine expression. Mixed venous oxygen saturation-driven resuscitation was associated with improved systolic index, oxygen delivery, and diuresis. Sepsis induced in both groups a significant increase on IL-6 concentrations and plasma nitrate concentrations and persistent decrease in neutrophil CD14 expression. Apoptosis rate and neutrophil oxidant generation were not different between groups. Treatment strategies did not significantly modify oxidative stress parameters. Thus, an approach aiming SvO2 during sepsis improves hemoynamics, without any significant effect on inflammatory response and oxidative stress. The beneficial effects associated with this strategy may be related to other mechanisms

As peroxirredoxinas constituem uma família de tiol-proteínas, que reduzem peróxido de hidrogênio, peróxidos orgânicos e peroxinitrito a água, álcool e nitrito, respectivamente, utilizando equivalentes redutores fornecidos pela tiorredoxina, tiorredoxina redutase e NADPH. As peroxirredoxinas são enzimas abundantes (constituem aproximadamente 0,7 % do total de proteínas solúveis presentes em leveduras) e foram identificadas em diversas espécies de animais, plantas e bactérias, porém seu papel fisiológico ainda é discutido. Até recentemente, as peroxirredoxinas eram consideradas pouco eficientes para detoxificar peróxidos, em comparação às catalases e heme-peroxidases. De fato, as constantes de segunda ordem determinadas para as reações de peroxirredoxinas com peróxido de hidrogênio eram da ordem de 104-105 M-1 s-1, valores muito menores que os de hemeproteínas (~107 M-1 s-1). Neste trabalho, um método de cinética competitiva foi desenvolvido para re-determinar essas constantes de velocidade, utilizando a peroxidase de raiz forte como competidora das peroxirredoxinas de S. cerevisiae, Tsa1 e Tsa2. Este método foi validado e as constantes de velocidade determinadas para Tsa1 e Tsa2 foram da ordem de k~ 107 M-1 s-1 para a reação com peróxido de hidrogênio e da ordem de k~10105 M-1 s-1 para a reação com peroxinitrito. Utilizando a mesma metodologia, foi possível ainda determinar o pKa da cisteína peroxidásica da Tsa1 e Tsa2 (Cys47), como sendo 5,4 e 6,3, respectivamente. Paralelamente, o papel fisiológico das peroxirredoxinas foi examinado em linhagens de S. cerevisiae com deleção de Tsa1, Tsa2 ou de ambas isoformas. Os estudos foram realizados sob condições fermentativas e a linhagem tsa1&#916;tsa2&#916; se mostrou mais resistente ao peróxido de hidrogênio (1 mM) e o consumiu mais rapidamente que a WT. Além disso, a linhagem tsa1&#916;tsa2&#916; produziu quantidades mais altas do radical 1-hidroxietila, produto da oxidação do etanol, que é o principal metabólito da levedura em anaerobiose. O mecanismo de formação do radical 1-hidroxietila foi examinado e a quantificação da concentração de ferro quelatável, ferro total e cobre mostrou que a reação de Fenton não era sua principal fonte. Outro mecanismo investigado foi a formação do radical através da atividade peroxidásica da Sod1, cuja expressão e atividade se mostraram aumentadas cerca de 5 e 2 vezes, respectivamente, na linhagem tsa1&#916;tsa2&#916;. Na linhagem mutante ainda foi observado que o tratamento com peróxido de hidrogênio aumentou a concentração de radicais derivados e adutos do DNA, detectados por imuno-spin trapping e incorporação de 14C derivado da glicose. Em conjunto, os resultados deste trabalho reforçam a importância das peroxirredoxinas na defesa antioxidante e mostram que as respostas compensatórias empregadas pela levedura para contornar as deleções de Tsa1 e Tsa2 podem ser deletérias longo prazo. / Peroxiredoxins constitute a family of cysteine-based peroxidases that are able to reduce hydrogen peroxide, organic peroxides and peroxinitrite to water, alcohol and nitrite, respectively, through the use of reducing equivalents provided by thioredoxin, thioredoxin reductase and NADPH. Peroxiredoxins are abundant enzymes (correspond to approximately 0.7% of total soluble protein in yeasts) and have been identified in several species ranging from animals, plants and bacteria, but their physiological role remains under scrutiny. Peoxiredoxins were regarded as less eficient enzymes in comparison with catalases and heme-peroxidases for detoxification of peroxides. Second-order rate constants determined for the reaction of peroxiredoxins with hydrogen peroxide were in the range of 104-105 M-1 s-1, which is quite low, as compared with those of heme-proteins (~107 M-1 s-1). In the present work, a competitive kinetic approach with horseradish peroxidase was developed in order to determine the second order rate constant of the reaction of peroxiredoxins with peroxynitrite and hydrogen peroxide. This method was validated and permitted for the determination of the second order rate constant value of the reaction of Tsa1 and Tsa2 with peroxynitrite (k~105 M-1 s-1) and hydrogen peroxide (k~ 107 M-1 s-1) at pH 7.4, 25 &#176;C. It also permitted the determination of the pKa of the peroxidatic cysteine of Tsa1 and Tsa2 (Cys47) as 5.4 and 6.3, respectively. In parallel, the physiological role of peroxiredoxins was examined in S. cerevisiae strains with deletion of Tsa1, Tsa2 or of both isoforms. Under fermentative conditions, tsa1&#916;tsa2&#916; cells were more resistant to 1 mM hydrogen peroxide than WT cells, and consumed it faster. In addition, tsa1tsa2 cells produced higher yields of the 1- hydroxyethyl radical from the oxidation of the glucose metabolite ethanol, as shown by spintrapping experiments. A major role for Fenton chemistry in radical formation was excluded by comparing WT and tsa1&#916;tsa2&#916; cells with respect to their levels of chelatable iron ions, total iron and copper ions, and of 1-hydroxyethyl radical produced in the presence of metal ion chelators. The main route for 1-hydroxyethyl radical formation was ascribed to the peroxidase activity of Sod1, whose expression and activity increased about five- and twofold, respectively, in tsa1&#916;tsa2&#916; compared to WT cells. Relevantly, tsa1&#916;tsa2&#916; cells challenged with hydrogen peroxide contained higher levels of DNA-derived radicals and adducts as monitored by immuno-spin trapping and incorporation of 14C from glucose into DNA, respectively. Taken together, our results reinforce the importance of peroxiredoxins in the antioxidant defense show that the compensatory responses employed by yeast to counterbalance the deletions of Tsa1 and Tsa2 may be deleterious in the long time range.

Estudos experimentais e clínicos amparam a participação do estresse oxidativo na progressão da doença renal na doença renal policística autossômica dominante (DRPAD). A administração do agente antioxidante N-acetilcisteína (NAC), por sua vez, apresenta efeitos benéficos em vários modelos animais de injúria renal. Neste estudo, utilizamos um camundongo cístico gerado por meio do cruzamento de uma linhagem portadora de um alelo floxed Pkd1 com outra que expressa nestin-Cre para avaliar os efeitos da NAC sobre um modelo ortólogo à DRPAD humana. O tratamento de longo prazo com NAC foi iniciado na concepção, nascimento, desmame ou oito semanas de idade, de modo a permitir a avaliação de seus efeitos em diferentes fases da vida. Nossas análises revelaram que a administração de NAC reduziu o nível de substâncias reativas com ácido tiobarbitúrico e aumentou o de glutationa nos rins de camundongos císticos tratados com NAC desde a concepção (Ci-NAC-Conc) comparados a animais císticos não tratados (Ci-Co). A excreção urinária de óxido nítrico também foi maior em camundongos císticos tratados com NAC. Animais Ci-NAC-Conc apresentaram ureia sérica, número de cistos renais, índice cístico e fibrose intersticial renal mais baixos que os camundongos Ci-Co. Animais Ci-NAC-Conc apresentaram, além disso, fração de ejeção e fração de encurtamento de ventrículo esquerdo maiores que camundongos Ci-Co, assim como menor fibrose cardíaca. O tratamento com NAC iniciado na concepção aumentou a sobrevida dos animais císticos. Notavelmente, o peso corpóreo mostrou-se significantemente menor em camundongos Ci-NAC-Conc que nos animais Ci-Co em todas as idades avaliadas, uma diferença não observada entre animais não císticos tratados e não tratados com NAC. Ainda é incerto se todas as ações observadas da NAC são causadas por suas propriedades antioxidantes. Esses resultados apóiam efeitos benéficos de tratamento precoce com NAC em camundongos císticos deficientes em Pkd1, determinados pela melhora de seus fenótipos renal, cardíaco e sistêmico. Nossos achados também revelam uma redução não deletéria no crescimento corpóreo, induzida pela administração de longo prazo de NAC no background deficiente em Pkd1 avaliado. Nossos dados abrem uma linha de pesquisa significativa e provavelmente robusta para se intervir nos fenótipos renal, cardíaco e sistêmico da DRPAD / Oxidative stress has been postulated to participate in the progression of renal disease in autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD). The antioxidant N-acetylcysteine (NAC), in turn, has been shown to determined beneficial effects on several animal models of renal injury. In the current study, a cystic mouse generated by breeding a Pkd1 floxed allele with a nestin Cre expressing line was used to evaluate the potential therapeutic effects of NAC on a model orthologous to human ADPKD. Long-term NAC treatment was initiated at conception, birth, weaning or 8 weeks of life, to allow the evaluation of its effects on different phases of life. Our analyses revealed that NAC decreased thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and increased glutathione levels in the kidneys of mice treated with NAC since conception (CY-NAC-Con) compared with non-treated cystic animals (CY-Ctl). Nitric oxide urinary excretion was also higher in NAC-treated cystic mice. These animals showed lower serum urea nitrogen (SUN), number of renal cysts, cystic index and renal interstitial fibrosis than CY-Ctl mice. CY-NAC-Con animals displayed, in addition, higher left ventricle ejection fraction and fractional shortening compared with CY-Ctl mice, as well as decreased cardiac fibrosis. NAC treatment started at conception increased the survival of cystic mice, demonstrating beneficial systemic effects. Interestingly, body weight was significantly lower in CY-NAC-Con than CY-Ctl mice at all evaluated times, a difference not observed between non-cystic animals treated and not treated with NAC Whether all observed NAC actions are caused by its antioxidant properties is yet not clear. These results support beneficial effects of early treatment with NAC on Pkd1-deficient cystic mice, by determining improvement in their renal, heart and systemic phenotypes. Our findings also reveal a non-deleterious reduction in body growth induced by long-term NAC administration in the evaluated Pkd1-deficient background. Our data open a likely significant and robust research track to intervene in renal, extra-renal and systemic ADPKD phenotypes