Made available in DSpace on 2016-01-07T13:36:22Z (GMT). No. of bitstreams: 2 ana_fonseca_ioc_mest_2014.pdf: 3492833 bytes, checksum: 633b4170768a3cc30468b07649be16d0 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A obesidade é um sério problema mundial de saúde e tem sido associada ao aumento de risco para doenças comuns como a diabetes mellitus tipo 2, cardiovasculares, hipertensão, certas formas de câncer e síndrome metabólica. Segundo dados da Organização Mundial da Saúde, existem mais de um bilhão de adultos com sobrepeso, e pelo menos 500 milhões de obesos, o que caracteriza a obesidade como um grave problema atual. O aumento de peso surge através de ações conjuntas dos fatores ambientais e genéticos, em particular naqueles indivíduos que já são geneticamente predispostos. Estudos têm investigado os fatores genéticos que predispõem à obesidade, embora tais fatores ainda sejam pouco compreendidos. Os genes candidatos à predisposição da obesidade estão relacionados com a regulação da fome, balanço energético, metabolismo de lipídeos e glicose; e diferenciação de adipócitos. Este trabalho teve como objetivo o estudo de polimorfismos nos genes ADIPOQ (rs17366568 e rs182052), RARRES2 (rs17173608 e rs4721), PGC1-\03B1 (rs8192678 e rs3736265) e FNDC5, no intuito de analisar uma possível associação ao desenvolvimento de obesidade e complicações metabólicas associadas. A genotipagem dos polimorfismos foi realizada em 244 indivíduos, sendo 136 pacientes com obesidade e 108 eutróficos Os polimorfismos estudados foram analisados por PCR em tempo real usando sondas TaqMan e sequenciamento automático. Nossos principais resultados mostraram os obesos exibindo altos níveis de IMC, circunferência abdominal, circunferência do quadril, pressão arterial, glicemia, triglicerídeos, VDL colesterol, proteína C reativa e hemoglobina glicada; e exibiram baixos níveis de HDL colesterol, quando comparados aos eutróficos. Além disso, estes obesos foram mais susceptíveis a diabetes mellitus tipo 2, síndrome metabólica e hipertensão. Em relação às análises moleculares, nós encontramos associações entre o polimorfismo rs3736265 e o haplótipo rs17366568/ rs182052 com a obesidade. Além disso, o polimorfismo rs182052 estava influenciando os traços de obesidade nos pacientes mórbidos, enquanto que o polimorfismo rs17173608 estava influenciando estes traços em ambos os indivíduos obesos e ix eutróficos; e o polimorfismo rs8192678 influenciou o peso nos controles. Com relação aos parâmetros pressóricos e bioquímicos, nós observamos que o polimorfismo rs17173608 estava associado com os altos níveis de glicose nos indivíduos com IMC normal. Já os SNP rs8192678 e rs113173936 tinham efeitos na pressão arterial de obesos. Além disso, os polimorfismos rs3736265 e rs72882318 apresentaram efeitos nos níveis de VDL colesterol e triglicerídeos também em obesos. Finalmente, nossos resultados mostraram que os polimorfismos rs3736265 e rs4721 estavam associados com a síndrome metabólica e a diabetes mellitus tipo 2, respectivamente. Nós concluímos que estes polimorfismos influenciam de diferentes formas a obesidade e as complicações metabólicas / Obesity is a serious health problem worldwide and h as been a major cause of morbidity and mortality associated with an increased risk for some common diseases such as type 2 diabetes mellitus, cardiovascular, hypertension, certain types of cancer and metabolic syndrome. According to the World Health Organi zation, there are more than one billion adults overweight and at least 500 million obese, which characterizes obesity as a serious problem today. Weight gain gives rise due to actions regarding environmental and genetic factors , in particular those who are already genetically predisposed. Studies have investigated the genetic factors that predispose to obesity, although these factors are still poorly understood . The candidate genes associated to obesity predisposition has been associated to the regulation o f hungry, the energy balance, lipid and glucose metabolism; and adipocyte differentiation. This project aims to study the polymorphism of ADIPOQ (rs17366568 and rs182052), RARRES2 (rs17173608 and rs4721), PGC1 - α (rs8192678 and rs3736265) and FNDC5 gene, in order to analyze a possible association with the development of obesity and metabolic complications associated with it. Genotyping of these polymorphisms was performed for 244 subjects, being136 patients with obesity and 108 non - obesity controls. The polymorphisms studied in this project were analyzed by real - time PCR using TaqMan probes and automated sequencing. Our main results showed that obese subjects exhibiting high levels of BMI, abdominal circumfe rence, hip circumference, blood pressure, fasting glucose, triglycerides, VDL - cholesterol, C - reactive protein and glycated haemoglobin, and exhibited lower levels of HDL - cholesterol when compared to controls . Furthermore, these obese subjects were more sus ceptible of type 2 diabetes, metabolic syndrome and hypertension. Regarding the molecular analysis, we found association of rs3736265 polymorphism and rs17366568/rs182052 haplotype with obesity. Moreover, rs182052 polymorphism was influencing traits of obe sity in morbid patients, while rs17173608 polymorphisms were influencing traits in both lean and obese subjects and rs8192678 SNP influenced only weight with control subjects only the weight of controls . Regarding to the blood pressure and biochemical para meters, we observed that rs17173608 polymorphism was associated with high levels of fasting glucose in normal BMI subjects. Already rs8192678 and rs113173936 SNP had effects of blood pressure in obese patients. Furthermore, rs3736265 and rs72882318 polymor phisms had effects of VDL - cholesterol and triglycerides levels in obese subjects. Finally, our results showed that rs3736265 and rs4721 polymorphisms were associated with metabolic syndrome and type 2 diabetes, respectively. We conclude that these polymorp hisms influence the obesity in different ways and metabolic complications as well .

Made available in DSpace on 2016-01-07T13:39:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 nilceia_ramos_ioc_2014.pdf: 985413 bytes, checksum: d50610d797598fa42cb546cf07dafa32 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O gênero Klebsiella compreende bactérias em forma de bastonete, gram-negativas e imóveis que pertencem à família Enterobacteriaceae. As espécies Klebsiella pneumoniae e Klebsiella oxytoca, patógenos oportunistas, são as mais importantes, sob o ponto de vista da clínica. Estas espécies têm sido relacionadas a um número crescente de infecções hospitalares multirresistentes. K. pneumoniae é classificada em três grupos filogenéticos: KpI, KpII e KpIII e os genes que codificam as \03B2-lactamases de classe A cromossômicas SHV, OKP e LEN, estão relacionadas à estes grupos, respectivamente. Da mesma forma, o gene blaOXY codifica a \03B2\2013lactamase de classe A cromossômica que caracteriza a espécie K. oxytoca. blaSHV é um gene cromossômico e plasmidial que codifica \03B2\2013lactamases de espectro restrito (NSBLs) e estendido (ESBL). Até o momento, 183 alelos de blaSHV foram identificados, mas o espectro de atividade de vários destes alelos ainda não foi determinado. As \03B2-lactamases LEN são codificadas em cromossomos e são NSBLs. Recentemente a espécie K. variicola foi identificada. Esta espécie se caracteriza pela fixação de nitrogênio e nenhum gene constitutivo de \03B2-lactamase foi associado à esta espécie. Este estudo objetivou determinar o espectro de resistência de alelos de blaSHV identificados em K. pneumoniae e também identificar, em nível de espécie, isolados carreadores do gene blaLEN. Por PCR e sequenciamento, alelos de blaSHV e blaLEN foram definidos comparando suas sequências com bancos de dados usando as ferramentas blastN e blastP Estes genes foram clonados e expressos em sistema heterólogo, e o espectro de resistência dos transformantes foi avaliado. A taxonomia genômica dos isolados deste gênero foi realizada com base em sequências de genes recuperados de genomas de espécies de Klebsiella e aplicou-se as abordagens MLSA, rMLST e cgMLST. Identificamos blaSHV-28 (n=2), blaSHV-110 (n=1) e alelos novos de blaSHV (n=3). Os transformantes para estes genes apresentaram resistência à amoxicilina, ampicilina e piperacilina, o que corresponde a um espectro restrito de resistência. Quanto a blaLEN, foram identificados oito novos alelos em nove isolados. Dois deles eram idênticos aos encontrados no genoma de K. variicola AT-22 e todos estes alelos codificam NSBLs. A taxonomia genômica de Klebsiella definiu três grupos: K. variicola, K. pneumoniae e K.oxytoca. Curiosamente, alguns isolados de K. pneumoniae agruparam com o K. variicola AT-22, sugerindo pertencerem à esta espécie. Todos os isolados do grupo K. variicola albergavam o gene blaLEN indicando que esta seria a \03B2-lactamase constitutiva de K. variicola, e, por conseguinte, que o grupo KpIII é composto por isolados de K. variicola. Aqui nós determinamos que alelos de blaSHV cromossômicos, incluindo blaSHV-28 e blaSHV-110, previamente identificados como ESBLs, são NSBLs e concluímos que K. variicola pode estar sendo subestimada em infecções humanas / The genus Klebsiella comprises non - motile, g ra m - negative, rod - shaped bacteria, presenting a polysaccharide - based capsule, belonging to the Enterobacteriaceae family. The two most clinically i mport ant species from the genus are the opportunistic pathogens Klebsiella pneumoniae and Klebsiella oxytoca . These species have been related to an increasing number of multiresistant hospital - acquired infections. K. pneumoniae is classified into three phylogen etic groups: KpI, KpII and KpIII. Three chromosomal class A β - lactamase genes were recognized in K pneumoniae : bla SHV , bla OKP and bla LEN , which are related to KpI, KpII and KpIII groups, respectively. Similarly, the bla OXY gene is the chromosomal class A β - lactamase that characterizes the K. oxytoca species. The bla SHV is a chromosomal - and plasmid - borne gene encoding narrow (NSBLs) and extended spectrum β - lactamases (ESBLs). So far, 183 bla SHV alleles were identified but the activity spectrum of dozen of a lleles remain to be determined. LEN enzymes are chromosomal encoded with restrict activity against β - lactams and confers resistance only to penicillins. More recently, K. variicola species were identified and this species has the ability of fixing nitrogen . There are few studies concerning this species and no constitutive β - lactamase gene has been described in this species. This study aimed to determine the resistance spectrum of bla SHV alleles identified in K. pneumoniae strains and also to identify, at sp ecies level, strains carrying bla LEN chromosomal class A β - lactamase gene. PCR and sequencing were performed and bla SHV , and bla LEN alleles were determined by comparing their sequences with the database using blastN and blastP tools. These genes were clone d and expressed in a heterologous system, and the antibiotic resistance spectrum of the transformants was evaluated by susceptibility test. The genomic taxonomy of strains from this genus were performed based on genes from draft and complete genome sequenc es from Klebsiella species using MLSA, rMLST and cgMLST approaches. Strains harboring bla SHV - 28 (n=2), bla SHV - 110 (n=1) and new bla SHV alleles (n=3) were identified. All the transformants showed resistance to amoxicillin, ampicillin, piperacill in, ticarcil lin , which correspond to a restricted spectrum of resistance. Concerning bla LEN alleles, here were identified eight new alleles in nine strains. Two of them were identical to the one found in K. variicola AT - 22 genome. The antibiotic resistance profile pre sented by the transformants indicated that all these bla LEN alleles encode for NSBLs. The Klebsiella genomic taxonomy revealed three groups corresponding to K. variicola , K. pneumoniae and K. oxytoca species. Curiously, some K. pneumoniae grouped with the K. variicola AT - 22, suggesting that those strains, in fact, belong to K. variicola species and had been misidentified as K. pneumoniae . Moreover, it was observed that all strains from K. variicola cluster harbored the bla LEN gene. This finding indicated th at the bla LEN gene is a constitutive K. variicola β - lactamase, and therefore, the KpIII group is composed by K. variicola strains. Here we determined that different chromosomal bla SHV alleles, including bla SHV - 28 e bla SHV - 110 , previously labeled as ESBLs, and the new ones, are NSBLs. Also, we concluded th at K. variicola can play an underestimated role in human infections .

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-01-07T16:38:39Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_JeronimoMarteletoNunesRugani (1).pdf: 1205673 bytes, checksum: 9782a5cd43a0368938ad2c3c5d706db3 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-01-07T16:38:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_JeronimoMarteletoNunesRugani (1).pdf: 1205673 bytes, checksum: 9782a5cd43a0368938ad2c3c5d706db3 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-07T16:38:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_JeronimoMarteletoNunesRugani (1).pdf: 1205673 bytes, checksum: 9782a5cd43a0368938ad2c3c5d706db3 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Rene Rachou / No Brasil, de todas as espécies do gênero Leishmania, a mais frequentemente encontrada parasitando o homem é a Leishmania (Viannia) braziliensis. Esta espécie pode causar um amplo espectro de manifestações, desde lesões únicas ao envolvimento mucoso, sendo esta última a complicação mais séria. Análises que visam acessar a variabilidade genética de Leishmania (Viannia) braziliensis são essenciais para o estudo de possíveis correlações entre manifestações clínicas de leishmaniose tegumentar americana (LTA) com parasitos geneticamente variantes e sua origem geográfica. O objetivo do estudo é analisar a variabilidade genética de isolados de L. braziliensis provenientes de diversas regiões de Minas Gerais. Foi realizado o diagnóstico clínico e molecular de indivíduos portadores de manifestações típicas e atípicas de várias regiões endêmicas do estado e os isolados separados em dois grupos amostrais: o grupo 1 contendo amostras de variadas macrorregiões do estado; e grupo 2 composto por amostras isoladas na terra indígena Xakriabá, em São João das Missões. A identificação específica de todas as amostras como L. braziliensis foi confirmada utilizando a técnica de PCR-g6pd. A análise da variabilidade genética foi realizada para os marcadores genéticos hsp70, Cpb, ITS1, g6pd e 6pgd. Na PCR-RFLP do hsp70 foram observados dois perfis de restrição: todas as amostras do grupo 1 e as cepas MG15 e MG16 do grupo 2 tiveram perfil de restrição indistinguível ao da cepa L. braziliensis referência, enquanto a maioria as amostras do grupo 2 exibiram perfil de restrição variante. O fragmento obtido pela PCR do hsp70 foi sequenciado e foram observados polimorfismos inclusive no sítio de restrição da enzima HaeIII. Na PCR-RFLP do Cpb, as amostras do grupo 1 e as cepas MG15 e MG16 do grupo 2 tiveram perfil de restrição indistinguível ao da cepa referência, enquanto a maioria das amostras do grupo 2 apresentaram perfil de restrição correspondente às demais espécies do subgênero Viannia. O sequenciamento do fragmento revelou polimorfismos inclusive no sítio de restrição da enzima TaqI. Na PCR-RFLP do ITS1 foi observado que as amostras do grupo 1 e as cepas MG15 e MG16 exibiram perfil de restrição semelhante a L. guyanensis, enquanto as amostras do grupo 2 perfil de L. braziliensis. As cepas MG19 e MG27 (grupo 2) exibiram perfis de restrição diferentes das cepas referência utilizadas. O sequenciamento do fragmento da PCR-6pgd exibiu polimorfismos que diferenciam entre as espécies L. braziliensis e L. guyanensis nas amostras estudadas. Os perfis de restrição e as sequências foram utilizadas em análises estatísticas de classificação por similaridade por partição e hierárquico. A análise de partição corroborou a divisão das amostras em dois grupos, sugerindo uma maior variabilidade genética entre as amostras do grupo 2. As análises aglomerativas suportaram a de partição onde foi observada associação do grupo 2 com a origem geográfica e presença de manifestações atípicas de LTA não sendo observada associação com número de lesões. As sequências foram utilizadas em análises filogenéticas onde foi observado que tanto utilizando somente L. guyanensis quanto outras espécies filogeneticamente mais distantes de L. braziliensis como outgroup, a divisão em grupos proposta foi suportada. A partir do painel de amostras de L. braziliensis estudado conclui-se que em Minas Gerais observamos a presença de um grupo de amostras geneticamente variantes, associadas ao perfil atípico de lesões e provenientes da região norte do estado. / Leishmania (Viannia) braziliensis is the most common species of Leishmania genus which parasites humans in Brazil. This species may present a huge spectrum of clinical symptoms, from single wounds to serious mucosal involvement, which is the most severe complication. Analyzes that assess the genetic variability of L. braziliensis are essential to clarify a possible correlation between atypical clinical manifestations of LTA with parasites genetically variants and their geographical distribution, and contribute to population structure studies of this species in Minas Gerais state. The aim of this study was to analyze the genetic variability of Leishmania (V.) braziliensis isolates from different regions of Minas Gerais State. Clinical and molecular diagnosis of patients with typical and atypical lesions from various endemic areas of Minas Gerais were carried out and the isolates were separeted into two sample groups: group 1 containing samples from various geographical regions of the state; and group 2 composed b isolates from Xakriabá Indigenous Reserve localized in São João das Missões district. The specific identification of samples was performed with PCR-G6PD method and L. braziliensis was confirmed in all of them. The analysis of genetic variability was carried out using genetic markers hsp70, Cpb, ITS1, G6PD and 6PGD. In PCR-RFLP of hsp70 two restriction patterns were observed: all samples from group 1 and MG15 and MG16 isolates of group 2 showed indistinguishable restriction profile to L. braziliensis reference strain, while most of the Group 2 samples exhibited a variant restriction profile. The hsp70 amplicon was sequenced and polymorphisms were observed even at the HaeIII restriction enzyme’s site. In PCR-RFLP of Cpb, samples of group 1 and MG15 and MG16 strains of group 2 restriction profile were indistinguishable to the reference strain L. braziliensis, while most of the group 2 samples showed restriction profiles identical to other species of the subgenus L . (Viannia). The sequenced fragment showed polymorphisms including one at restriction site of TaqI enzyme. Results of ITS1 PCR-RFLP from group 1 and MG15 and MG16 strains were a restriction profile similar to L. guyanensis specie, while Group 2 samples presented L. braziliensis profile. The MG19 and MG27 strains (group 2) exhibited different patterns of those reference strains. The sequencing of the PCR-6pgd showed inter-species polymorphisms. Restriction profiles and sequences were used in hierarchical, partition and similarity statistical analyzes. The partition analysis confirmed the division of samples into two groups, suggesting greater genetic variability between samples of group 2. The clustering analysis supported the partition where was observed an association of group to the geographical origin and presence of atypical manifestations of LTA, but no association was observed with number of wounds. The sequences were used in phylogenetic analyzes and was observed that both using only L. guyanensis as other more phylogenetically distant species L. braziliensis as outgroup, the division into two groups proposal was supported. Considering the L. braziliensis samples panel studied in this project it is possible to conclud that there is a group of samples genetically variants associated with atypical profile of wounds from the northern region of Minas Gerais state.

Made available in DSpace on 2016-03-04T13:59:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 joselio_araujo_ioc_dout_2009.pdf: 11696830 bytes, checksum: 45f6a57d0a27af32727404bbd7154585 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Dengue é uma importante arbovrirose (arthropod-bone virus) e contitui um grave problema de saúde pública não só no Brasil, mas também nos países de clima tropical. A Aedes aegypti é o principal vetor dos vírus dengue (DENV) e está presente na maioria dos países entre as latitudes 35ºN e 35ºS. Neste trabalho, apresentamos quatro estudos. No primeiro estudo, analisamos os níveis de RNA viral do DENV-3 e sua correlação com o tipo de infecção (primária ou secundária) em casos fatais e não fatais por dengue, ocorridos no estado do Rio de Janeiro, 2002. O grupo de casos fatais apresentou uma média de título viral significativamente mais elevada do que o grupo de casos não fatais. Considerando que infecções primárias foram confirmadas entre os casos fatais (52,1%), a teoria da infecção seqüencial por si só não explica todos os casos graves da doença. Estes resultados sugerem que altos níveis de DENV-3 podem ter contribuído para a forma grave do dengue no Rio de Janeiro, 2002.No segundo estudo, diferentes métodos de diagnóstico foram aplicados para investigar a presença dos DENV em amostras de tecidos humanos obtidos a partir de casos fatais (n = 29), ocorridos durante e grande epidemia em 2002 no estado do Rio de Janeiro, Brasil. A combinação de quatro métodos permitiu a confirmação da infecção por DENV-3 em 26 (89,6%) dos 29 casos suspeitos. . O isolamento viral foi obtido em 2,7% (2/74) das amostras, a partir da inoculação em cultura de células C6/36. A técnica de nested RT-PCR permitiu a identificação do DENV-3 em 30,5% (22/72) das analisadas. O método de RT-PCR em tempo real possuiu maior sensibilidade, detectando o RNA viral em 58,4% (45/77) dos espécimes clínicos, incluindo fígado (n=18), pulmão (n=8), cérebro (n=6), rim (n=3), medula óssea (n=1) e coração (n=1). A técnica de imunohistoquímica detectou o antígeno viral em 44% (26/59) das amostras analisadas A precisão e eficácia do RT-PCR em tempo real fez desta técnica uma ferramenta importante no diagnóstico rápido das infecções por dengue. No terceira estudo, revisamos a filogeografia dos três principais genótipos do DENV-3 e estimamos sua taxa de evolução, como base na análise do gene do envelope (E) de 200 isolados, provenientes de 31 países ao redor do mundo, durante um período de 50 anos (1956 \2013 2006). Nossa análise filogenética revelou uma subdivisão geográfica da população dos DENV-3, com grupamentos específicos em vários países. Os padrões migratórios dos principais genótipos dos DENV-3 mostraram que genótipo I circula principalmente na porção marítima do Sudeste Asiático do Sul do Pacífico, o genótipo II permaneceu dentro das zonas continentais do Sudeste Asiático, enquanto o genótipo III foi disseminado na Ásia, Leste da África e Américas. Não foi observada co-circulação de diferentes genótipos em uma única localidade, sugerindo que alguns fatores, além da distância geográfica podem limitar a contínua dispersão e re-introdução de novas variantes de DENV-3. As estimativas das taxas evolutivas não revelaram diferenças significativas entre os principais genótipos do DENV-3. A média da taxa de evolução em regiões que sofreram epidemias de dengue desde a década de 70 (por exemplo, Indonésia e Tailândia) foi semelhante ao observado em regiões que presenciam estas epidemias desde a década de 90 (por exemplo, Américas). Neste estudo, estimamos o ano de origem das atuais linhagens do DENV-3 em torno de 1890, e o surgimento da atual diversidade dos seus principais genótipos entre meados de 1960-1970, coincidindo com o crescimento da população humana, urbanização, movimento humano e descrição dos primeiros casos de febre hemorrágica por DENV-3 na Ásia No quarto estudo, examinamos a atual classificação filogenética dos DENV-3 circulantes no Globo, com destaque para o novo genótipo (GV) descrito no Brasil. A circulação de um novo genótipo de DENV-3 foi recentemente descrito no Brasil e na Colômbia, porém, sua classificação exata tem sido controversa. Análises de distância nucleotídica do gene E apóia a subdivisão do DENV-3 em cinco linhagens distintas, denominadas genótipos (GI-GV), e confirma a classificação deste novo genótipo na América do Sul como pertencente ao GV. Distâncias genéticas extremamente baixas entre isolados brasileiros pertencentes ao GV e a amostra protótipo Philippines/L11423 isolada em 1956 levantam questões impor tantes sobre a origem deste genótipos na América do Sul / Dengue is an important arbovirus (arthropod-borne virus) and constitutes a serious problem of public health not only in Brazil but also in the major tropical countries. Aedes aegypti is the main vector of dengue virus (DENV) and is present in most countries between latitudes 35ºN and 35ºS. In this manuscript, we present four distinct studies. In study 1, we examined levels of dengue virus type 3 RNA in association with the type of infection (primary or secondary) in patients with fatal and nonfatal outcomes in Rio de Janeiro State, 2002. Subjects with fatal outcomes had mean virus titers significantly higher than those who survived. Because primary infections were confirmed among the fatal cases (52.1%), antibody-dependent enhancement alone did not explain all the cases of severe disease in this study population. These findings suggest that high levels of DENV-3 may have contributed to the severe form of dengue in Rio de Janeiro, 2002. In the second study, we investigate by different diagnostic methods dengue virus in human tissue specimens obtained from fatal cases (n=29) during a large-scale dengue fever epidemic in 2002 in the State of Rio de Janeiro, Brazil. The combination of four procedures provided diagnostic confirmation of DENV-3 infection in 26 (89.6%) out of the 29 suspected fatal cases. Dengue virus (DENV) was isolated from 2/74 (2.7%) tissue samples, inoculated into C6/36 cells and identified as DENV-3, nested RT-PCR accusing 22/72 (30.5%) samples as DENV-3. Real-time RT-PCR yielded the highest positivity rate, detecting viral RNA in 45/77 (58.4%) clinical specimens, including the liver (n=18), lung (n=8), spleen (n=8), brain (n=6), kidney (n=3), bone marrow (n=1) and heart (n=1). Immunohistochemical tests recognized the DENV antigen in 26/59 (44%) specimens. Given the accuracy and effectiveness of real-time RTPCR in this investigation, this approach may play an important role for rapid diagnosis of dengue infections. In the third study, we revisited the phylogeography of the three of major DENV-3 genotypes and estimated its rate of evolution, based on the analysis of the envelope (E) gene of 200 strains isolated from 31 different countries around the world over a time period of 50 years (1956 to 2006). Our phylogenetic analysis revealed a geographical subdivision of DENV-3 population in several country-specific clades. Migration patterns of the main DENV-3 genotypes showed that genotype I was mainly circumspect to the maritime portion of Southeast-Asia and South Pacific, genotype II stayed within continental areas in South-East Asia, while genotype III spread across Asia, East Africa and into the Americas. No evidence for rampant co-circulation of distinct genotypes in a single locality was found, suggesting that some factors, other than geographic proximity, may limit the continual dispersion and reintroduction of new DENV-3 variants. Estimates of the evolutionary rate revealed no significant differences among major DENV-3 genotypes. The mean evolutionary rate of DENV-3 in areas with long-term endemic transmissions (i.e., Indonesia and Thailand) was similar to that observed in the Americas, which have been experiencing a more recent dengue spread. We estimated the origin of DENV-3 virus around 1890, and the emergence of current diversity of main DENV-3 genotypes between the middle 1960s and the middle 1970s, coinciding with human population growth, urbanization, and massive human movement, and with the description of the first cases of DENV-3 hemorrhagic fever in Asia. In the fourth study, we re-examined the current phylogenetic classification of DENV-3 strains, with emphasis on the new genotype (GV) described in Brazil. Circulation of a new DENV-3 genotype was recently described in Brazil and Colombia, but the precise classification has been controversial. Phylogenetic and nucleotide distance analyses of the envelope (E) gene support the subdivision of DENV-3 strains into five distinct genotypes (GI to GV), confirming the classification of this new genotype in South America as GV. The extremely low genetic distances of Brazilian GV strains to the prototype Philippines/L11423 strain isolated in the 1956 GV sample raise important questions regarding the origin of this genotype in South America.

Made available in DSpace on 2016-03-28T12:47:36Z (GMT). No. of bitstreams: 2 andrea_cabral_ioc_mest_2013.pdf: 830806 bytes, checksum: f948411de69b8059eee07de1790cd7c0 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / As bartoneloses são doenças mundialmente dispersas causadas por bactérias gram negativas do gênero Bartonella. Com mais de 24 espécies reconhecidas, B. bacilliformis, B. henselae e B. quintana são os principais e mais comuns agentes causadores de doença em humanos. Na literatura existem relatos de casos isolados e alguns estudos de prevalência sorológica sobre a doença, a maioria realizados em pacientes adultos, com escassa informação sobre a sua apresentação e a epidemiologia nas crianças. A proposta desse estudo retrospectivo foi analisar uma série casos de bartonelose em pacientes abaixo de 16 anos, no estado do Rio de Janeiro, durante o período de 2006 a 2012, a partir dos dados secundários obtidos no banco de dados do Laboratório de Referência Nacional para Rickettsioses, Laboratório de Hantavirose e Rickettsioses do Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro. Dos 36 confirmados por análise sorológica utilizando teste de imunofluorescência comercial, com títulos de corte de 64, e/ ou por reação em cadeia da polimerase, 19 casos (52,7%) foram do sexo feminino, com uma variação por faixa etária de zero a 16 anos, 19 (52,7%) tinham entre 11 e 16 anos de idade A maioria dos casos - 22 casos (61,1%) -, foi procedente do município do Rio de Janeiro, com mais cinco (13,8%) e três (8,3%) em pacientes residentes nos municípios de Duque de Caxias e Nova Iguaçu. A informação sobre contato com gato estava disponível em apenas sete (19,4%). As manifestações clínicas observadas neste estudo foram semelhantes às descritas na literatura, na qual foi possível identificar doença da arranhadura do gato (DAG), febre de origem prolongada e forma hepatoesplênica. Assim, das fichas com dados disponíveis, foi possível verificar que 30 de 32 (94%) e 25 de 29 (90%) dos pacientes apresentaram febre e linfadenopatia, respectivamente. Hepatoesplenomegalia foi identificada em quatro dos 16 pacientes, cujas fichas tinham a informação disponível. Dor abdominal, observada em 33% dos pacientes, associada com náuseas, vômitos, hepatoesplenomegalia e diarreia, em concordância com relatos de casos descritos na literatura, apontam para a dificuldade do diagnóstico diferencial com doenças comuns nas faixas etárias mais baixas, chamando a atenção para as gastroenterites Apesar da restrição de um estudo retrospectivo e da inexistência de uma ficha epidemiológica específica para bartoneloses - as informações foram obtidas da ficha epidemiológica para febre maculosa-, os resultados deste estudo confirmam a necessidade de inclusão das bartoneloses no diagnóstico diferencial de doenças febris associadas com adenomegalia e do estabelecimento desta zoonose como doença de notificação compulsória no Brasil / Bartonelloses are globally dispersed diseases caused by gram-negative bacteria from Bartonella genus. With over 24 recognized species, B. bacilliformis, B. henselae and B. Quintana are the main and most common disease-causing agents in humans. In the literature, there are reports of isolated cases and some seroprevalence studies about the disease, most performed in adult patients, with limited information about its presentation and epidemiology in children. The purpose of this retrospective study was to analyze a case series of bartonellosis in patients aged less than 16 years, in the State of Rio de Janeiro, during the period 2006-2012. We assessed secondary data from the National Reference Laboratory for Rickettsiosis, Laboratory of Hantaviroses and Rickettsioses of Oswaldo Cruz Institute, Rio de Janeiro. Nineteen cases (52,7%), from 36 confirmed by serological analysis using commercial immunofluorescence test, with antibody cut off titers of 64 , and / or polymerase chain reaction, were female, with an age variation from zero to 16 years old, 19 (52.7%) were between 11 and 16 years old. Most of cases - 22 (61.1%) – were found in the city of Rio de Janeiro, with another five (13.8%) and three (8.3%) in patients residing in the cities of Duque de Caxias and Nova Iguaçu. Information about contact with cats was available in just seven (19,4%). Clinical manifestations observed in this study were similar to those described in the literature, in which it was possible to identify cat scratch disease (CSD), fever of unknown origin, and hepatosplenic form. Thus, from the records with available data, it was possible to find that 30 of 32 (94%) and 25 of 29 (90%) of the patients had fever and lymphadenopathy, respectively. Hepatosplenomegaly was identified in four of the 16 patients whose records had information available. Abdominal pain, occurring in 33% of patients, associated with nausea, vomiting, diarrhea and hepatosplenomegaly, in accordance with reported cases in the literature point to the difficulty of the differential diagnosis of common diseases in the lower age groups, drawing attention to gastroenteritis. Despite the restrictions of a retrospective study and the absence of a specific epidemiological record for bartonella - Information has been obtained from epidemiological record for spotted fever -, the results of this study confirm the need for inclusion of bartonellosis in the differential diagnosis of febrile illnesses associated with lymph node enlargement and the establishment of this zoonosis as a reportable disease in Brazil

Made available in DSpace on 2016-04-04T12:35:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 juliana_silva_ioc_mest_2015.pdf: 9301991 bytes, checksum: 154a53db0411f9dac834feb27f65b697 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A dengue constitui um sério problema de saúde pública, principalmente em regiões tropicais e subtropicais do mundo. Uma grande dificuldade para se estudar essa doença é a falta de um modelo animal que reproduza os efeitos da infecção observados em humanos. Apesar disso, um dos modelos mais utilizados para testes de vacinas contra a dengue se baseia na inoculação em camundongos por via intracerebral (i.c.) de vírus neuroadaptado. No entanto, poucos estudos avaliaram o efeito da infecção i.c. e/ou proteção gerada por protótipos vacinais em diferentes órgãos, tais como fígado, um dos órgãos comprometidos pela dengue em humanos. O nosso grupo construiu a vacina de DNA, pcTPANS1, que induziu altos níveis de sobrevivência em camundongos desafiados por via i.c. com vírus da dengue 2 (DENV2). Diante disso, o presente trabalho se propõe avaliar aspectos da patogênese no cérebro, cerebelo, fígado e pulmão, no modelo de camundongos BALB/c inoculados pela via i.c. com uma dose letal de DENV2, em diferentes dias após infecção (d.p.i.). Adicionalmente, tais análises foram estendidas para animais imunizados com a vacina pcTPANS1 e desafiados com DENV2. Detectamos alterações histopatológicas no cérebro/cerebelo (edema, hemorragia, gliose reacional, microglia hiperplásica e hipertrofiada e infiltrado mononuclear na pia-máter, no neurópilo e perivasculares), no fígado (edema, hemorragia, balonização hepatocitária, infiltrado mononuclear, hiperplasia e hipertrofia de células de Kupffer) e no pulmão (edema, hemorragia, infiltrados mononucleares peribronquiolares, aumento do número de macrófagos alveolares e espessamento de septo interalveolar) Alguns destes danos foram quantificados, utilizando uma escala subjetiva com atribuição de diferentes graus, revelando diferenças significativas. Os animais inoculados com DENV2 também apresentaram um aumento dos níveis séricos das enzimas hepáticas ALT e AST, principalmente de AST ao final da infecção, com diferenças significativas em relação aos controles. Por outro lado, em todos os tecidos dos camundongos vacinados com pcTPANS1 observamos uma melhora progressiva dos danos, quando comparados com os animais somente infectados. Também detectamos a presença do DENV2 no cérebro/cerebelo, no sangue e no pulmão dos animais em ensaios in vitro de infecção de células Vero e/ou por RT-PCR em tempo real. Nos animais somente infectados, observamos no cérebro/cerebelo altos títulos de partículas virais infecciosas e cópias de RNA viral. Já no soro, o maior percentual de animais com a presença de DENV2 foi entre o 90 e 110 d.p.i.. Por outro lado, não foi possível a detecção do vírus no fígado, e no pulmão a detecção foi muito baixa. Entretanto, verificamos a presença do antígeno NS3 de DENV2 não só no tecido nervoso, mas também no hepático, através de ensaios de imunohistoquímica. Em contrapartida, os animais vacinados com pcTPANS1 e desafiados com o vírus apresentaram uma redução drástica na viremia com DENV2. De um modo geral, os nossos estudos podem contribuir para uma melhor compreensão da patogênese da dengue, assim como servir de parâmetro para a avaliação da proteção induzida pela vacina pcTPANS1, bem como de outras vacinas / The dengue is a serious public health problem, mainly in tropical and subtropical regions of the world. One of the great difficulty to study this disease is the lack of an animal model that mimics the infection effects observed in humans. Nevertheless, one of the most widely used model for vaccine tests against dengue is based on the inoculation of mice by the intracerebral route (i.c.) with neuroadapted virus. However, few studies have evaluated the effects of i.c. infection and/or protection generated by vaccine prototypes in different organs, such as the liver, one of the compromised organ in dengue in humans. Our group have constructed a DNA vaccine, pcTPANS1, which induced high survival rates in mice challenged by the i.c. inoculation with dengue virus 2 (DENV2). Therefore, the present work aim to evaluate aspects of the pathogenesis in the brain, cerebellum, liver and lung in the BALB/c mouse model intracerebrally inoculated with a lethal dose of DENV2, at different days post infection (d.p.i.). In addition, these analyzes were extended to pcTPANS1-immunized animals challenged with DENV2. We detect histopathological changes in the brain/cerebellum (hemorrhage, edema, reactive gliosis, hyperplasic and hypertrophied microglia and mononuclear infiltrate in the pia-mater, neuropile and perivascular), the liver (hemorrhage, edema, hepatocyte ballooning, mononuclear infiltrate, hyperplasia and hypertrophy of Kupffer cells) and the lung (hemorrhage, edema, peribronchial mononuclear infiltrates, increased number of alveolar macrophages and thickening of interalveolar septa). Some of these damages were quantified using a subjective scale with different degrees and revealing significant differences. Animals inoculated with DENV2 also showed increased serum levels of the liver enzymes AST and ALT, mainly AST on the end of infection, with significant differences compared to controls. On the other hand, in all the tissues of pcTPANS1-vaccinated mice, we observed a progressive improvement of damages when compared with only infected animals. We also detected the presence of DENV2 in the brain/cerebellum, blood and lung of animals by in vitro assays of infected Vero cells and/or by real time RT-PCR. In only infected animals, we observed high titers of infectious viral particles and viral RNA copies in brain/cerebellum. In serum, the highest percentage of animals with infeccious DENV2 particles was found between 90 and 110 d.p.i.. However, it was not possible to detect the virus in the liver, and the detection in lung was very low. Despite of this, we verified the presence of DENV2 antigen, NS3, not only in nervous tissue but also in liver, by immunohistochemistry assays. In contrast, pcTPANS1-vaccinated animals challenged with the virus showed a drastic reduction of viremia with DENV2. In general, our studies may contribute to a better understanding of dengue pathogenesis, and also serve as a parameter for evaluation of the vaccine-induced protection with pcTPANS1, as well as with other vaccines.

Made available in DSpace on 2016-04-04T12:35:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 karina_rebello_ioc_mest_2008.pdf: 6872283 bytes, checksum: a0cb112c96e6862c0ff341afeb28dbf5 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / No presente trabalho foram detectadas cisteína-proteinases (CPs) em promastigotas infectivas de Leishmania (Viannia). braziliensis. A estratégia de purificação consistiu na associação do método de extração por Triton X-114 com cromatografia em coluna de Concanavalina A-Sepharose, seguida por outra de DEAE-Sephacel. No ensaio das cromatografias, observamos um pico majoritário de atividade enzimática na presença do substrato pEFLpNan (165 x 10³² \03BCM de pNan/minuto) para cerca de 10¹0 parasitas, coincidentes com o pico majoritário da proteína eluído da coluna de troca iônica. A análise por SDS-PAGE do material eluído da coluna de troca iônica mostrou quatro principais bandas de proteínas com massas moleculares relativas de 63, 43, 30 e 27 kDa. Os ensaios da atividade enzimática após eletroforese mostraram que as bandas de 63 kDa e 43 kDa, hidrolisam substratos como gelatina em pH 7,0 e são sensíveis à presença de E-64. Além disso, as duas enzimas são capazes de hidrolisar o substrato pEFLpNan: 63 kDa (2,2 ± 0,3 \03BCM de pNan/minuto) e 43 kDa (0,05 ± 0,2 \03BCM de pNan/minuto), e são inibidas por 10\03BCM E-64 (47 % e 36 % respectivamente). Os ensaios de reconhecimento imunológico utilizando um anti-soro policlonal específico contra cisteína-proteinase B [anti-CPB de L. (L.) mexicana] revelaram que as enzimas de 63 kDa são reconhecidas por este anti-soro. Os experimentos de aglutinação, citometria de fluxo e imunocitoquímica utilizando esse mesmo antisoro revelaram que homólogos de CPBs estão localizados na superfície da membrana de promastigotas. Além disso, a incubação dos promastigotas com fosfolipase C (PLC) reduziu o número de células positivas pra os homólogos de CPB. Os anti-soros anti-CRD (cross reactive determinat) e anti-CPB reconhecem bandas de 63kDa e 43 kDa do sobrenadante das células tratadas com PLC em ensaios de immunoblotting sugerindo que isoformas destas proteínas são ancoradas por glicosilfostatidilinositol (GP (GPI) à membrana plasmática. Também observamos que os homólogos de CPBs são presos a membrana por âncora GPI e se concentram em plataformas lipídicas. Nós observamos que as proteínas homólogas a CPB não permanecem estáveis na superfície da membrana quando os parasitas são mantidos em culturas sucessivas, assim como a atividade enzimática total sobre o substrato pEFLpNan é alterada. Mostramos ainda através da técnica RT-PCR em tempo real um aumento da transcrição de cpb de L. (V.) braziliensis quando os parasitas foram submetidos a culturas sucessivas. De uma forma geral os dados apresentados suportam a hipótese de que o parasita estudado apresentam CPs de membrana ativas, além de homólogos de CPB intracelulares. / It was detected cysteine-pro teinases (CPs) in infective Leishmania (Viannia) braziliensis promastigotes . The purification strategy c onsisted of an association of Triton X-114 extraction method with chromatography in Concanavalin A-Sepharose column, followed by chromatography in DEAE-Sephacell column. In the assay pf chromatographic fractions, we observed a peak of enzymatic activity against the pEFLpNan substrate (165 x 10 -32 μM of pNan/minute) in over 10 10 parasites, coincident with the ma jor protein peak eluted from the column. SDS-PAGE analysis of the material eluted from the ionic exchange column showed four main protein bands with relative molecular mass of 63 , 43, 30 and 27 kDa. Gelatin-SDS-PAGE assays indicated that the 43kDa and the 63kDa bands can hydrolyze gelatin at neutral pH and are sensitive to E-64. Also, both enzymes can hydrolyze pEFLpNan substrate: 63 kDa (2,2 ± 0,3 μM of pNan/minute) and 43 kDa (0,05 ± 0,2 μM of pNan/minute) bei ng both inhibited by E-64 (47 % and 36 % inhibition, respectively) . Immunological recognition assays , with a specific polyclonal antibody against CPB from L. (L.) mexicana , showed that bands of 63 kDa and 43 kDa are recognized in the fractions of the ionic exchange column. Aggl utination, flow cytometry and immunocytochemistry assays performed with an ti-CPB antiserum revealed that homologous of CPB are located on the promastigote membrane surface. Moreover, the incubation of promastigotes with phospholipase C reduced th e number of CPBs homologues-positive cells. Both anti-cross-reacting determinant (CRD) a nd anti-CPB antisera recognized 63kDa and 43kDa bands in the supernatant of phospholipase C-treat ed cells, suggesting that isoforms of these proteins are attached to the plasma membra ne by glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchors. Also, our data suggest that GPI-anchored CPBs are present in the detergent - resistant lipid rafts. We observed that the CPB homologues do not remain stable on the membrane surface when the parasites are maintained under successive cultur es; also, the total enzymatic activity over the substrate pEFLpNan is altered. We add itionally showed by real-time RT-PCR that L. (V). braziliensis cpb genes are active and their relative expression is increased throughout the successive cultures. Thus, the presented data support the hypothesis of that studied parasite presents CPs of membrane active, beyond homologous of intracellular CPB.

Made available in DSpace on 2016-04-04T12:40:38Z (GMT). No. of bitstreams: 2 michelle_machado_ioc_mest_2014.pdf: 6230482 bytes, checksum: fd56019db1296559466fdb14552694e1 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / As leishmanioses são um grupo de doenças causadas por diversas espécies de protozoários do gênero Leishmania, clinicamente classificadas como leishmaniose tegumentar e leishmaniose visceral. As leishmanioses representam um grave problema de saúde pública no Brasil, onde já foram registradas em todos os estados. Considerando que os mecanismos pelos quais as diferentes espécies de Leishmania causam diferentes patologias ainda são amplamente desconhecidos, pretendeu-se caracterizar diferenças no perfil de citocinas e quimiocinas produzido por macrófagos murinos infectados com L. (Leishmania) amazonensis e L. (Viannia) braziliensis, espécies causadoras de leishmaniose tegumentar americana no Brasil e investigar uma possível relação entre os resultados deste trabalho e as características imunopatológicas das infecções com as espécies em estudo. Macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c foram infectados com diferentes cepas de L. (L.) amazonensis e de L. (V.) braziliensis. A carga parasitária e a taxa de infecção de macrófagos foram determinadas através de microscopia ótica. As cepas de L. (L.) amazonensis apresentaram uma maior variabilidade intraespecífica do que as de L. (V.) braziliensis, porém sem diferença estatisticamente significante A produção de NO foi avaliada por meio da reação de Griess. Todas as cepas de L. (L.) amazonensis induziram a produção de NO, enquanto que apenas na infecção por uma cepa de L. (V.) braziliensis observaram-se níveis detectáveis de NO. Entretanto, esta aparente diferença também não foi estatisticamente significante. A produção de ureia foi determinada através da ocorrência da reação de hidrólise de L-arginina pela enzima arginase. Observou-se que a produção de ureia nas culturas infectadas por L. (V.) braziliensis foi mais heterogênea do que nas infectadas por L. (L.) amazonensis. Observou-se também uma correlação inversa forte e significativa (Spearman r = -0,8051; p = 0,0218) entre os níveis de nitrito e de uréia caracterizando as duas vias de ativação macrofágica: clássica e alternativa, respectivamente. Citocinas e quimiocinas foram dosados nos sobrenadantes dos macrófagos infectados através da técnica de Luminex e a avaliação da expressão gênica destas citocinas e quimiocinas foi realizada por meio do PCR Multiplex em tempo real. Observaram-se importantes diferenças entre o perfil de citocinas e quimiocinas caracterizados através de Luminex e de PCR Multiplex em tempo real Apesar disso, ambos os métodos mostraram níveis mais altos de citocinas e quimiocinas nas culturas infectadas com L. (V.) braziliensis em comparação às infectadas com L. (L.) amazonensis. Os resultados do Multiplex mostraram ausência de diferença estatística entre os macrófagos infectados por L. (L.) amazonensis e o controle de macrófagos não infectados. Por outro lado, nas culturas infectadas por L. (V.) braziliensis houve um aumento significativo (p < 0,05) da expressão gênica das citocinas IL-1\03B1, IL-6, G-CSF e da enzima NOS, além do aumento sugestivo (p<0,1) da expressão da citocina IL-10, da quimiocina CCL3 e dos receptores de quimiocinas CCR2 e CCR5. Concluiu-se, portanto, que a infecção por L. (V.) braziliensis modulou uma resposta predominantemente pró-inflamatória nos macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c, enquanto que não foi observada alteração na expressão de qualquer dos genes alvos do estudo na infecção com a espécie L. (L.) amazonensis em relação às culturas controle não infectadas / Leishmaniasis is a group of diseases caused by vari ous species of protozoa of the genus Leishmania , clinically classified as cutaneous leishmaniasis and visceral leishmaniasis. Leishmaniasis represents a serious p ublic health problem in Brazil, where the desease has been registered in all states . Whereas the mechanisms by which the different species of Leishmania cause different diseases are still largely unknown, we sought to characterize differences in t he profile of cytokines and chemokines produced by murine macrophages infected with L. (Leishmania) amazonensis and L. (Viannia) braziliensis species, both of them causing American cutaneous leishmaniasis in Brazil, and to investiga te a possible relationship between the results of this work and the immunopathological characteristics of the infections with these species. Peritoneal macrophages from BAL B/c mice were infected with different L. (L.) amazonensis and L. (V.) braziliensis strains. The parasite load and the infection rate of macrophages were determined b y optical microscopy. The L. (L.) amazonensis strains apparently showed greater intraspecific va riability than those of L. (V.) braziliensis , although no statistically significant difference was found. NO production was assessed by the Griess reaction. All strains of L. (L.) amazonensis induced NO production while detectable NO levels we re observed only in the infection by one strain of L. (V.) braziliensis . However, this apparent difference was not statistically significant. The urea production was determined by the occurrence of the hydrolysis reaction of L-arginine by the enzyme arginase. It was observed that urea production in cultures infected by L. (V.) braziliensis was more heterogeneous than in those infected by L. (L.) amazonensis . We also observed a strong and significant inverse correlation (Spearman r = -0.80 51, p = 0.0218) between the levels of nitrite and urea featuring the two routes of mac rophage activation: classical and alternative, respectively. Cytokines and chemokines were measured in the supernatants of infected macrophages through the Lu minex technique and the assessment of gene expression of these cytokines an d chemokines was performed using real-time PCR Multiplex. Important difference s were observed between the profile of cytokines and chemokines revealed by Lum inex and real-time PCR Multiplex. Nevertheless, both methods showed higher levels of cytokines and chemokines in cultures infected with L. (V.) braziliensis as compared to those infected with L. (L.) amazonensis . The Multiplex results showed no statistical difference between macrophages infected with L. (L.) amazonensis and uninfected macrophages control. On the other hand, in cultures infected with L. (V.) braziliensis xii there was a significant increase (p<0.05) of gene e xpression of IL-1 α , IL-6, G-CSF cytokines and NOS enzyme, and also a suggestive inc rease (p < 0.1) of the expression of the cytokine IL-10, the chemokine CCL 3 and CCR2 and the chemokine receptors CCR5. Therefore, it was concluded that in fection with L. (V.) braziliensis modulated a response predominantly proinflammatory in peritoneal macrophages from BALB/c mice, whereas no change was observed in the expression of any target gene in infections with L. (L.) amazonensis when compared to uninfected control cultures

Made available in DSpace on 2016-04-04T12:40:39Z (GMT). No. of bitstreams: 2 brunna_marques_ioc_mest_2013.pdf: 2715065 bytes, checksum: aaa9be9dc694a52d7bf82b8c0cd65be7 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O diagnóstico da infecção pelo vírus da hepatite C (HCV) é feito pela detecção de marcadores sorológicos e moleculares, porém o custo destas metodologias é bastante elevado e a coleta de sangue para a realização destes ensaios além de requerer pessoal treinado, é difícil em áreas remotas ou com poucos recursos. O objetivo deste estudo foi otimizar protocolos e padronizar métodos de diagnóstico molecular para infecção pelo HCV em amostras de sangue coletado em papel de filtro (SPF) para facilitar o acesso ao diagnóstico em áreas remotas ou com recursos limitados. Para isto, 99 indivíduos forneceram amostras pareadas de soro e SPF, dentre os quais 59 eram anti-HCV reagente e 40 eram não reagentes em suas amostras de soro. As amostras anti-HCV reagentes foram submetidas à técnica de quantificação comercial. Para o desenvolvimento da RT-PCR quantitativa (RT-qPCR) in house, uma curva padrão interna foi construída utilizando um plasmídeo contendo o inserto do HCV e iniciadores e sonda foram desenhados para a região 5´NC do HCV. Para otimização da técnica, a concentração de cDNA, transcriptase reversa e números de ciclos de reação foram avaliados. Para a extração de RNA de HCV em amostras de SPF, sete métodos foram avaliados. A sensibilidade, especificidade, correlação, reprodutibilidade e presença de inibidores da RT-PCR quantitativa também foram determinados. O conjunto de QIAamp DNA Mini Kit foi o método mais eficiente para extração do RNA do HCV em SPF. A RT-qPCR in house desenvolvida foi capaz de quantificar o HCV no soro de 44 amostras onde a mediana de carga viral foi inferior aquela observada na técnica comercial (log10 4,94 e log10 6 cópias de HCV/mL, respectivamente). A faixa de detecção do método in house foi de 10 a 109 cópias de HCV por reação Para a detecção de HCV em SPF foi necessário o aumento da transcriptase reversa e de cDNA, permitindo que 35 amostras fossem detectadas com um limite mínimo de detecção igual a 58,5 cópias/mL e a mediana de carga viral foi semelhante à observada nas respectivas amostras de soro avaliadas pela técnica comercial (log10 5,38 e log10 5,89 cópias de HCV/mL, respectivamente). Obteve-se boa reprodutibilidade da RT-qPCR in house através da análise da curva padrão e de amostras de soro e SPF. Não foi observada a presença de inibidores de reação utilizando o GAPDH como controle interno. Quando comparado com a metodologia comercial, a RT-qPCR apresentou sensibilidade de 74,58% (IC95% 61,5-85,0) em soro e 59,3% (IC95% 45,7-71,9) em SPF, e a especificidade foi igual a 100% para ambos espécimes. Quando a RT-qPCR foi avaliada entre os dois espécimes clínicos, a sensibilidade da técnica em SPF foi igual a 65,9% (IC95% 50,0-79,5) e a especificidade foi igual a 100%. Quarenta e cinco amostras de soro e quinze amostras de SPF foram amplificadas na RT-PCR qualitativa, onde 43 amostras de soro e 11 amostras de SPF foram sequenciadas. Entre as amostras de soro, 29 foram classificadas como subgenótipo 1b, 13 como subgenótipo 1a, 1 como genótipo 3. Entre as amostras de SPF, 9 foram classificadas como subgenótipo 1b e 2 como subgenótipo 1a. Foi observada alta homologia nucleotídica entre as sequencias de HCV das amostras pareadas de soro e SPF onde todas foram classificadas como genótipo 1. Conclui-se que o sangue em papel de filtro pode ser utilizado para detecção, quantificação e análise filogenética do HCV, sendo uma ferramenta promissora para estudos de epidemiologia da hepatite C / The d iagnosis of hepatitis C virus (HCV) infection is made by detection of molecular and serologic al markers, but the cost of these methodologies is quite high and blood sample collection requires trained personnel what it is difficult in remote areas or prese nting few resources. The aim of this study was to optimize protocols and standardize molecular diagnostic methods for HCV infection in dried blood samples (DBS) to facilitate access to diagnosis in remote areas or with limited resources. For this, 99 indiv iduals provided paired serum and DBS samples , where 59 of them were anti - HCV rea ctive and 40 were non - reactive in their serum samples. A nti - HCV positive samples were subjected to commercial quantification technique. For the development of quantitative RT - P CR (RT - qPCR) in house, an internal standard curve was constructed using a plasmid containing the insert and HCV primers and probe designed for the 5' non coding ( NC ) region of HCV. For optimization of these technique s , the concentration of cDNA, reverse tr anscriptase and numbers of cycles of reaction were evaluated. For the extraction of HCV RNA in DBS samples, seven methods were evaluated. The sensitivity, specificity, correlation, reproducibility and presence of inhibitors in quantitative RT - PCR were also determined. Q IAamp DNA Mini Kit was the most efficient method for HCV RNA extraction among DBS samples . The in house RT - qPCR was able to quantify HCV among 44 serum samples where the median viral load was lower than that observed in commercial technique ( 4.94 log 10 and 6 log 10 copies of HCV / mL, respectively). The range of HCV detection using in house RT - qPCR was 10 - 10 9 copies of HCV per reaction. For HCV detection in DBS , it was necessary to increase reverse transcriptase and cDNA concentration giving 35 HCV RNA reactive samples with a limit of detection equal to 58.5 copies of HCV / m L and the median viral load was similar to that observed in their sera evaluated by commercial technique (5.38 log 10 and 5.89 log 10 copies of HCV / mL, respectively). In hous e RT - qPCR presented good reproducibility using standard curve and paired DBS and sera samples . It was not observed the presence of inhibitors of the reaction using GAPDH as internal control. In house RT - qPCR showed a sensitivity of 74.58% (95% CI 61.5 to 8 5.0) in serum and 59.3% (95% CI 45.7 to 71.9) in DBS, and the specificity was 100% for both specimens compared to the commercial methodology . When the RT - qPCR was evaluated in two clinical specimens, the sensitivity of the technique in DBS was equal to 65. 9% (95% CI 50.0 to 79.5) and specificity was 100%. Forty - five serum samples and 15 DBS samples were amplified in qualitative RT - PCR, where 43 serum samples and 11 DBS samples were sequenced. Among the serum samples, 29 were classified as HCV subgenotype 1b , 1 3 as subgenotype 1a, genotype 1 and 3. Among DBS samples, 9 were 9 classified as HCV subgenotype 1b and 2 as HCV subgenotype 1a. HCV nucleotide sequences presented high homology between paired DBS and sera samples and all of them were classified as geno type 1. It is conclude that dried blood spot may be used for detection, quantification and phylogenetic analysis of HCV and it is a promising tool for studying the epidemiology of hepatitis C

Made available in DSpace on 2016-04-04T12:45:13Z (GMT). No. of bitstreams: 2 luana_lourenco_ioc_mest_2015.pdf: 2708180 bytes, checksum: 1ba7e6b26d3cc94cbe2e47f016f3d912 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Estudos prévios sobre os aspectos histopatológicos da leishmaniose tegumentar americana (LTA) causada por Leishmania (Viannia) braziliensis indicam que a carga parasitária, apesar de baixa, variava de acordo não só com a forma clínica, mas também com o tempo de evolução da doença. O insucesso do tratamento e a evolução para formas mais graves dependem de características do parasita e de aspectos da resposta imune do paciente, dentre outros. Os pacientes com a forma cutânea tendem a responder de forma satisfatória, mesmo com protocolo em que se usa baixa dose de antimoniato de meglumina. Entretanto, alguns desses casos demoram mais tempo para atingir a cura clínica ou recidivam ou ainda desenvolvem a forma mucosa. Este projeto teve como meta avaliar a carga parasitária inicial e fatores de virulência em lesões de pacientes com LTA, correlacionando com a forma clínica e resposta à terapêutica. Foram selecionados 82 pacientes com diagnóstico confirmado de LTA. A carga parasitária foi avaliada por PCR quantitativo (qPCR), utilizando-se como alvo genes de subunidade menor de RNA ribossomal (SSR). A análise da expressão gênica de GP63 deu-se pelo uso de RT-PCR e a imunolocalização de GP63 e LPG nas lesões foi conduzida por ensaios de imunoperoxidase. Os dados de quantificação da carga parasitária mostraram parasitismo maior nas lesões que evoluíram com boa resposta ao tratamento, enquanto que a expressão gênica de GP63 e a produção \201Cin situ\201D de GP63 e LPG foram mais significativas nos casos que evoluíram de forma desfavorável ao tratamento. Com isso podemos concluir que mais que a carga parasitária, a regulação de fatores de virulência no infiltrado inflamatório pode influenciar na evolução clínica da LTA causada por L.(V.) braziliensis / Previous studies on the histopathological aspects o f american cutaneous leishmaniasis (ACL) caused by Leishmania (V.) braziliensis indicate that the parasite load, although low, varied according not only to th e clinical form, but also with the disease progression. Treatment failure and progress ion to more severe forms depend on parasite characteristics and the aspects of pati ent immune response, among other factors. Patients with cutaneous form tend to respo nd satisfactorily, even with protocols that use low-dose meglumine antimoniate. However, some of these cases either take longer to reach clinical cure, relapse or even develop to mucosal form. This project aims to assess the initial parasite load an d virulence factors in patients with ACL injuries, correlating with the clinical present ation and response to therapy. We selected 82 patients with confirmed diagnosis of LT A. The parasitic load was measured by quantitative PCR (qPCR), using small su bunit ribosomal RNA (SSR) genes as targets. Analysis of GP63 gene expression was done by RT-PCR and immunolocalization of GP63 and LPG lesions was cond ucted by immunoperoxidase assays. The quantification of the parasite load dat a showed higher parasitism in lesions that evolved with good response to treatmen t, whereas gene expression of GP63 and "in situ" production of GP63 and LPG were more significant in cases that evolved unfavorably to treatment. Thus, we conclude d that rather than the parasite load, the regulation of virulence factors in the in flammatory infiltrate may be influencing the clinical course of ACL caused by L. (V.) braziliensis .