Made available in DSpace on 2014-07-29T15:26:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Talissa de Morais Tavares.pdf: 2094396 bytes, checksum: cca589203914a2c676b55bcf55e62bbc (MD5) Previous issue date: 2008-04-28 / Group A rotaviruses are the major cause of gastroenteritis in children throughout the world. Epidemiological surveys and molecular analysis of rotavirus strains are required for gastroenteritis control and prevention. Studies using VP6, an important immunogenic structural protein, and NSP4, a transmembrane nonstructural glycoprotein which is critical to rotavirus morphogenesis and pathogenesis, have been performed. In this study, 330 rotavirus-positive fecal samples previously obtained from children with or without diarrhea, between 1987 and 2003, in three cities of Central West Region of Brazil (Goiânia, Brasília and Campo Grande), were characterized for VP6- and NSP4-encoding genes. The VP6 and NSP4 genes were amplified by reverse transcription- polymerase chain reaction followed by sequencing and phylogenetic analysis. Detection rates of 84.8% and 78.5% were observed for VP6 and NSP4 genes, respectively. Two distinct genotypes could be recognized for NSP4 (A and B). It was observed that the G9P[6] samples were associated with genotype A, whereas the G1P[6], G1P[8], G2P[8], G3P[8], G4P[8] and G9P[8] samples were associated with genotype B. The analysis of VP6 gene allowed genogrouping of samples in two clusters, genogroups I and II. The G2P[4], G3P[4] and G9P[6] samples were identified as genogroup I, whereas the G1P[6], G1P[8], G2P[8], G4P[6], G4P[8] and G9P[8] samples were identified as genogroup II. In addition, it was showed that samples identified as VP6 genogroup I were associated with NSP4 genotype A and samples identified as VP6 genogroup II were associated with NSP4 genotype B. This investigation described different genetic groups representing diversity of group A rotavirus samples circulating in the Central West Region of Brazil. / Os rotavírus do grupo A são considerados como os principais agentes de gastroenterite em crianças em todo o mundo. Investigações de vigilância epidemiológica e molecular são importantes para o controle e prevenção da doença. Nesse sentido, destacam-se os estudos utilizando VP6, proteína estrutural que se tem mostrado como a mais imunogênica, e NSP4, uma glicoproteína não estrutural transmembrana envolvida na morfogênese e patogênese viral. No presente estudo, 330 amostras de rotavírus coletadas de 1987 a 2003, provenientes de espécimes fecais de crianças com ou sem diarréia, em três cidades da Região Centro-Oeste do Brasil (Goiânia, Brasília e Campo Grande), foram caracterizadas em relação aos genes que codificam as proteínas VP6 e NSP4. Inicialmente, foi feita a amplificação dos genes de VP6 e NSP4 pela reação em cadeia pela polimerase pós-transcrição reversa, seguida do seqüenciamento genômico e de análise filogenética. Os genes de VP6 e NSP4 foram detectados em 84,8% e 78,5% das amostras, respectivamente. Dois genótipos de NSP4 foram identificados (A e B). Foi observado que as amostras G9P[6] associaram-se ao genótipo A e as amostras G1P[6], G1P[8], G2P[8], G3P[8], G4P[8] e G9P[8] associaram-se ao genótipo B. A análise do gene VP6 permitiu a identificação de dois genogrupos distintos (I e II). As amostras G2P[4], G3P[4] e G9P[6] foram caracterizadas como genogrupo I, enquanto as amostras G1P[6], G1P[8], G2P[8], G4P[6], G4P[8] e G9P[8] foram caracterizadas como genogrupo II. Ainda foi evidenciado que as amostras genogrupo I de VP6 estavam associadas com genótipo A de NSP4, e as amostras genogrupo II de VP6 estavam associadas com genótipo B de NSP4. A presente investigação identificou diferentes variantes genéticas, mostrando a diversidade dos rotavírus do grupo A circulantes na Região Centro-Oeste do Brasil.

INTRODUÇÃO: A doença diarreica aguda é a segunda causa de morte em crianças abaixo de 5 anos de idade. No Brasil, entre 2003 e 2009, a diarreia aguda foi responsável por cerca de 100.000 internações por ano, e por 4% das mortes em crianças abaixo de 5 anos de idade. O rotavírus é a principal etiologia de diarreia aguda grave no mundo todo, sendo responsável por 40% das internações por diarreia aguda, e 29% de todas as mortes por diarreia aguda. A vacina monovalente (RV1) contra o rotavírus foi introduzida no Programa Nacional de Imunizações em 2006. OBJETIVOS: Verificar o impacto da vacina monovalente contra rotavírus nas consultas de pronto-socorro e internações por doença diarreica aguda em crianças menores de 5 anos de idade, verificar a positividade do exame \"pesquisa de rotavírus nas fezes\", e verificar a presença ao ausência de imunidade de rebanho. METODOLOGIA: Foi realizado um estudo ecológico retrospectivo no Hospital Universitário da Universidade de São Paulo. O período foi dividido em pré-vacina (2003 a 2005) e pós-vacina (2007 a 2009). Foram incluídas todas as crianças abaixo de 5 anos que passaram em consulta no pronto-socorro e verificado o diagnóstico do atendimento e internação através de registro eletrônico. Foram obtidas as taxas de consultas no pronto-socorro e internações por doença diarreica aguda, foram selecionadas as crianças não vacinadas para cálculo da imunidade de rebanho, e verificado se houve coleta do exame pesquisa de rotavírus nas fezes. A redução nas taxas foi obtida através da fórmula: redução (%) = (1 - odds ratio) x 100. RESULTADOS: No período pré-vacina a taxa de consultas por diarreia aguda foi de 85,8 consultas por 1.000 consultas gerais, no período pós vacina a taxa de consultas por diarreia aguda foi 80,9 por 1.000, e a redução foi 6% (IC 95%, 4% a 9%, p < 0,001), chegando a 40% (IC 95%, 36% a 44%, p<0,001) nos meses de maio e junho. A taxa de internação por diarreia aguda era 40,8 internações por 1.000 e caiu para 24,9 por 1.000, redução de 40% (IC 95%, 22% a 54%, p < 0,001), chegando a 82% (IC 95%, 62% a 92%, p < 0,001) nos meses de maio e junho. Nas crianças não vacinadas não houve redução na taxa de consultas de pronto-socorro (IC 95%, -4% a 5%, p=0,903), e não se pode afirmar se houve redução ou aumento das internações por diarreia aguda (IC 95%, -212% a 35%, p=0,381). Houve queda da positividade do exame pesquisa de rotavírus em 2009 (redução de 70%, IC 95%, 26% a 88%, p=0,007). CONCLUSÕES: Após a introdução da vacina contra rotavírus (RV1) houve uma redução de 6% nas consultas por diarreia aguda no pronto-socorro, de 40% nas internações por diarreia aguda e de 70% na positividade do exame pesquisa de rotavírus nas fezes. Não foi detectada imunidade de rebanho / INTRODUCTION: Acute diarrheal disease is the second cause of death in children under five years. In Brazil, from 2003 to 2009, acute diarrhea was responsible for nearly 100,000 deaths per year and 4% of the deaths in children under five years. Rotavirus is the leading cause of severe acute diarrhea worldwide, accounting for 40% of hospital admissions and 29% of all the acute diarrhea-related deaths. In 2006, the rotavirus monovalent vaccine (RV1) was added to the Brazilian National Immunization Program. OBJECTIVES: To analyze the impact of the RV1 on Emergency Department (ED) visits and hospital admissions for acute diarrhea, the rates of positivity of the stool rotavirus tests and the presence or absence of herd immunity. METHODS: A retrospective ecologic study at the University Hospital, University of Sao Paulo. The study analyzed two periods: the pre-vaccine (2003-2005) and the post-vaccine (2007-2009) periods. We screened the main diagnosis of all ED attendances and hospital admissions of children under five years in an electronic registry system database and calculated the rates of ED visits, hospital admissions and positivity of the stool rotavirus test in patients with acute diarrhea. Herd immunization was evaluated in non-vaccinated children. The reduction rate was analyzed according to the formula: reduction (%) = (1- odds ratio) x 100. RESULTS: The rates of ED visits for acute diarrhea was 85.8 and and 80.9 per 1,000 total ED visits in the pre and post vaccination periods, respectively, resulting in 6% reduction (95% CI, 4% to 9%, p< 0.001) in the overall period and reaching 40% reduction on May and June. The rates of hospital admissions for acute diarrhea was 40.8 per 1,000 in the pre-vaccine period and dropped to 24.9 per 1,000 hospitalizations, resulting in 40% reduction (95% CI, 22% to 54%, p < 0.001) in the overall period and 82% (95% CI, 62% to 92%, p < 0.001) on May and June. Among non-vaccinated children, no reduction on ED visits was observed (95% CI, -4% to 5%, p=0.903), while an increase or reduction in the hospitalization rates could not be determined (95% CI, -212% to 35%, p=0.381). There was a decrease in the positivity of the stool rotavirus tests in 2009 (70% reduction, 95% CI, 26% to 88%, p=0.007). CONCLUSIONS: The introduction of the RV1 vaccine resulted in 6% reduction in the ED visits and 40% reduction in hospital admissions for acute diarrhea, and 70% reduction in the rates of positive stool rotavirus tests. No herd immunity was observed

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-07-25T14:03:16Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_AnaliseMolecularRotavirus.pdf: 10923869 bytes, checksum: da8e1b57dee11ef6c88b67fcac9da851 (MD5) / Approved for entry into archive by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br) on 2017-07-27T14:11:32Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_AnaliseMolecularRotavirus.pdf: 10923869 bytes, checksum: da8e1b57dee11ef6c88b67fcac9da851 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-27T14:11:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_AnaliseMolecularRotavirus.pdf: 10923869 bytes, checksum: da8e1b57dee11ef6c88b67fcac9da851 (MD5) Previous issue date: 2016-10-31 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O rotavírus do grupo A (RVA) é o principal agente viral associado às gastrenterites agudas, ocasionando cerca de 200 mil óbitos entre crianças menores de cinco anos de idade anualmente. Pertencem à família Reoviridae, gênero Rotavirus, possui RNA de dupla fita (dsRNA) com 11 segmentos codificando 12 proteínas, sendo seis estruturais (VPs) e seis não estruturais (NSPs). Cada proteína designa um genótipo específico de RVA, sendo a proteína VP7 responsável pelo genótipo G, existindo, atualmente, 32 variantes genéticas. O genótipo G9 emergiu em escala global na década de 90, período este anterior a introdução da vacina de RVA no Brasil em 2006, sendo continuamente detectado até os dias atuais. Este estudo objetivou descrever a frequência e a constelação genética associada ao genótipo G9 circulantes na região Norte do Brasil. Foram selecionadas 50 amostras coletadas de 1999 a 2013, sendo 45 G9P[8], 2 G9P[4] e 3 G9P[6], nas quais se procedeu a suspensão e extração do dsRNA para posterior amplificação e sequenciamento de nucleotídeos. Foi observado que no período pré-introdução da vacina a frequência de G9 alcançou frequência de 43%, enquanto que após a introdução da vacina, a maior frequência obtida foi 12,5% (2008 a 2010). A análise filogenética do gene VP7 demonstrou que todas as amostras agruparam na linhagem III de G9, observandose modificações aminoacídicas em sítios antigênicos quando comparadas às cepas vacinais. Tal fato foi observado também na análise do gene VP4-P[8], os quais agruparam na linhagem III de P[8], enquanto que VP4-P[4] agrupou na linhagem V e VP4-P[6] na linhagem I. Todas as amostras G9P[6] e G9P[4] foram associadas à constelação DS-1, genogrupo 2, enquanto que as amostras G9P[8] apresentaram a constelação Wa, genogrupo 1, com exceção de uma amostra que apresentou o gene NSP3 com perfil DS-1. As amostras G9 da região Norte analisadas associaram-se às constelações esperadas e descritas em outras partes do mundo, com exceção de uma amostra G9P[8] que apresentou uma reestruturação genética na proteína NSP3. O genótipo G9 pode ser considerado um tipo usual de RVA na região Norte e apesar de terem sido detectadas as mesmas linhagens circulantes no período antes e após a implantação da vacina, observou-se modificações em regiões antigênicas relevantes assim como reestruturação genetica, enfatizando a necessidade de contínua monitorização das variantes genéticas circulantes de RVA. / Group A rotavirus (RVA) is the most viral agent associated with acute gastroenteritis, responsible for about 200,000 deaths among children aged under five years annually. RVA belongs to Reoviridae family, Rotavirus genus, its genome is composed by double-stranded RNA (dsRNA) with 11 segments encoding 12 proteins, six structural (VPs) and six non-structural (NSPs). Each protein designating a specific RVA genotype, being VP7 protein responsible for G genotype and currently there are 32 genetic variants. G9 genotype emerged on a global scale in the 90s, a period before RVA vaccine introduction in Brazil that occurred in 2006, and is continuously detected until present day. This study aimed to describe the frequency and genetic constellation associated with the current G9 genotype in Northern Brazil. It was selected 50 samples collected between 1999 and 2013, being 45 G9P[8], 2 G9P[4] and 3G9P[6], for fecal suspension preparation and dsRNA extraction for further genome amplification and sequencing of nucleotides. It was observed that during pre-RVA vaccine introduction period G9 frequency rate was 43%, while after RVA vaccine introduction the most frequece obtained was 12.5% (2008 to 2010). Phylogenetic analysis of VP7 gene showed that all strains belong to lineage III of G9, observing aminoacidic substitutions in antigenic sites when compared with vaccine strains. It was demonstrated in VP4 gene that P[8] strains gathered in lineage III, whereas P[4] grouped into lineage V and P[6] strains into lineage I. All G9P[6] and G9P[4] samples were associated with DS-1 constellation, genogroup 2, while G9P[8] samples showed Wa constellation, genogroup 1, except for one sample showing NSP3 gene with DS-1 profile. G9 samples from Northern region analyzed were associated with the expected constellations described in other parts of the world, except for one G9P[8] sample that showed a genetic restructuration in NSP3 protein. In the present study the same G9 lineages have circulated during pre and post RVA vaccine introduction periods, and it was described aminoacidic substitutions in relevant antigenic regions, such as it was reported genetic restructuration phenomenon in one sample of this genotype, emphasizing the continuous monitoring of current genetic variants of RVA.

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-09-11T18:15:57Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_AvaliacaoTemporalGenetica.pdf: 12773081 bytes, checksum: d6313444b94475055b4e68f388c61e25 (MD5) / Approved for entry into archive by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br) on 2017-09-15T16:07:23Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_AvaliacaoTemporalGenetica.pdf: 12773081 bytes, checksum: d6313444b94475055b4e68f388c61e25 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-15T16:07:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_AvaliacaoTemporalGenetica.pdf: 12773081 bytes, checksum: d6313444b94475055b4e68f388c61e25 (MD5) Previous issue date: 2016-10-31 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O rotavírus do grupo A (RVA) é a causa mais importante de diarreia, sendo responsável por cerca de 40% da morbidade e mortalidade relacionada a esta doença em crianças de todo o mundo antes da introdução da vacina. Após a introdução da vacina contra o RVA no Brasil no ano de 2006 o genótipo G2 de RVA ressurgiu, sendo detectado em até 82% das crianças menores de cinco anos de idade em estudos realizados pós vacinação, levando a questionamentos quanto à proteção conferida pela vacina frente ao tipo G2, bem como a ocorrência de uma pressão seletiva da vacina. Pouco se conhece sobre a evolução e a diversidade do genótipo G2 e a possível influência da vacina sobre este. Para proporcionar um maior conhecimento sobre a circulação e diversidade genética dos RVA genótipo G2, realizamos a análise temporal da circulação deste genótipo ao longo de 31 anos e a análise dos genes estruturais e não estruturais de amostras que circularam ao longo de 20 anos na região norte do Brasil. A avaliação temporal da circulação de diferentes genótipo que circularam nesta região permitiu observar que o tipo G2 de RVA apresentou ao longo desses anos um padrão cíclico de ocorrência que o fez emergir em um cenário de pós implantação da vacina, sugerindo uma flutuação natural devido a variações naturais ocorridas ao longo do tempo. Análises filogenéticas mostraram que para as linhagens de VP7 G2 existe uma continua evolução, responsável por uma rotatividade na circulação de linhagens, sendo detectada duas linhagens e três sublinhagens ao longo de 20 anos. Três substituições importantes nas regiões antigênicas de VP7 (A87T, D96N e S213D) foram identificadas em amostras que circularam a partir dos anos 90. Estas modificações podem ter aumentado a capacidade das cepas de circular em ambientes onde há cobertura vacinal para RVA. Todas as cepas G2P[4] para as quais foram analisados os 11 segmentos gênicos apresentaram uma constelação gênica DS-1-like: I2-R2-C2-M2-A2-N2-T2-E2-H2, apesar de que diversas variantes virais circularam no período estudado. Não foram observadas diferenças nos sítios antigênicos das proteínas VP8* e VP7 entre amostras que circularam no período anterior e posterior à introdução da vacina. Para os genes VP2 e VP3 foi evidenciado em algumas amostras uma forte correlação com genes de origem animal. Este estudo fornece evidências da diversidade genética existente no genótipo G2 de RVA, sugerindo que este tipo apresenta características naturais de flutuação e que sua emergência após o período de implantação da vacina está mais diretamente associado a características ecológicas do vírus do que a uma pressão vacinal. / Rotavirus group A (RVA) is the most important cause of diarrhea, accounting for about 40% of morbidity and mortality related to this disease in children around the world before the introduction of the vaccine. After the introduction of the vaccine against the RVA in Brazil in 2006 genotype G2RVA he rose again, being detected in up to 82% of children under five years of age performed post vaccination studies, leading to questions about the protection afforded by the vaccine facing the G2 type, as well as the occurrence of a selective pressure vaccine. Little is known about the evolution and diversity of G2 genotype and the possible influence of the vaccine on this. To provide a better understanding of the flow and genetic diversity of RVA genotype G2, we perform the time of circulation analysis of genotype over 31 years and analysis of structural and non-structural genes from samples that have circulated over 20 years in northern region of Brazil. The temporal assessment of movement of different genotype circulating in this region has observed that the G2 type RVA presented over the years a cyclical pattern of occurrence that did emerge in a post deployment of the vaccine scenario, suggesting a natural fluctuation due to variations natural occurring over time. Phylogenetic analyzes showed that for VP7 lines G2 there is a continuous, responsible for a movement of rotation in the lines being detected two lines and three sublineages over 20 years. Three important substitutions in antigenic regions of VP7 (A87T, D96N and S213D) were identified in samples that circulated from the 90. These changes may have increased the capacity of the circulating strains in environments where there is vaccine coverage for RVA. All G2P[4] strains analyzed revealed a DS-1-like genome constellation: I2-R2-C2-M2-A2-N2-T2-E2-H2. However, several viral variants circulated during the study period. No differences were observed in the antigenic sites of the VP8 * and VP7 proteins between samples that circulated in the period before and after the introduction of the vaccine. For VP2 and VP3 genes was evident in some samples a strong correlation with animal genes. This study provides evidence of genetic diversity in G2 genotype RVA, suggesting that this type has natural characteristics fluctuation and its emergence after the implementation period of the vaccine is more directly associated with ecological characteristics of the virus than a vaccine pressure.

Submitted by Maria Creuza Silva (mariakreuza@yahoo.com.br) on 2014-10-03T17:40:16Z No. of bitstreams: 1 Tese Maria Yury Ichihara. 2014.pdf: 2248119 bytes, checksum: 821a02dd8be59ca78df05111c9fdd559 (MD5) / Approved for entry into archive by Maria Creuza Silva (mariakreuza@yahoo.com.br) on 2014-10-07T13:52:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese Maria Yury Ichihara. 2014.pdf: 2248119 bytes, checksum: 821a02dd8be59ca78df05111c9fdd559 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-07T13:52:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Maria Yury Ichihara. 2014.pdf: 2248119 bytes, checksum: 821a02dd8be59ca78df05111c9fdd559 (MD5) / A diarréia é uma das causas mais freqüentes de atendimentos ambulatoriais e de hospitalização em menores de 5 anos. Bactérias e o rotavírus são os principais agentes etiológicos envolvidos nas diarréias graves, sendo o rotavírus responsável por 22% a 38% das admissões hospitalares. Para abordar o tema sobre a internação de crianças brasileiras menores de 2 anos devido a diarréia foram realizados três estudos casos-controles com base hospitalar. Inicialmente, foi estimada a associação dos fatores de risco e a internação por diarréia aguda (exceto àquela causada por rotavírus) de acordo com as rotas de transmissão dos agentes etiológicos, as várias fontes de infecção e as condições de vida das populações. Foi demonstrado que os principais fatores de risco associados à internação por diarréia foram a falta de esgotamento sanitário e de água de boa qualidade e ter uma ou mais internações prévias devido à diarréia. Em relação à diarréia aguda causada por rotavírus, a OMS recomenda o uso de duas vacinas licenciadas no mundo (Rotarix® e RotaTeq®). A vacina oral monovalente contra rotavirus (G1P[8], Rotarix®) foi introduzida no Programa Nacional de Imunização do Brasil em 2006. A eficácia e efetividade da vacina variam entre países com renda alta e baixa, embora exista forte evidência de proteção cruzada para os genótipos G1-G4 e G9. Avaliamos a efetividade global e genótipo-específica da vacina oral monovalente na prevenção de internação de crianças brasileiras com diarréia causada por rotavirus. Além disso, estimamos a efetividade da vacina global e genótipo-específica por tempo de vacinação após a segunda dose da vacina (até dois anos) e EV para as Regiões brasileiras. Elevadas efetividades geral e genótipo-específica da vacina foram observadas, mesmo num contexto de grande diversidade genotípica e com predominância do genótipo G2P[4]. A duração da proteção global e genótipo-específica da vacina permaneceu até dois anos e foi maior para G1P[8] do que para G2P[4]. Por outro lado, consideramos plausível que a EV poderia variar em diferentes populações e em diferentes períodos de tempo, mediante a grande diversidade genotípica, a ocorrência de genótipos incomuns, de combinações mistas de G e P e de emergência de novas cepas advindas de combinações inter-espécies (homem e animal). Analisamos a EV estratificada por Regiões brasileiras e ficou demonstrado que a EV para a Região Norte foi similar à EV global. Porém a EV para as outras Regiões foi menor, talvez devido ao pequeno número de casos. Baseado nos resultados dos estudos nós recomendamos: 1) implementar ações voltadas para o domínio público (ambiente, saneamento, higiene na comunidade e acesso a serviços de saúde) para reduzir a morbidade por diarréia; 2) a continuidade do uso da vacina oral monovalente no Programa Nacional de Imunização; e 3) o monitoramento de genótipos para detecção precoce de cepas novas e incomuns. Além disso, novos estudos precisam ser conduzidos para avaliar variações da efetividade da vacina entre as Regiões, as sub-regiões e as áreas mais vulneráveis do Brasil. Será importante realizar estudos de custo-efetividade para subsidiar a política nacional de imunização. / Diarrhea has been a frequent reason of visits to the health services and hospitalization among children under five. Bacteria and rotavirus are the main agents involved in severe diarrhea, in which rotavirus is responsible from 22% to 38% of children hospital admissions. To address the issue of hospitalization of Brazilian children under 2 years due to diarrhea, we conducted three hospital based case-control study. Initially, we aimed to estimate the association of risk factors and acute diarrhea hospitalization (except those caused by rotavirus) according to the routes of transmission of etiologic agents, the various sources of infection and the living conditions of populations. It was demonstrated that the main risk factors were lack of sewage and water of good quality, and already having one or more hospitalizations due to diarrhea. In relation to the rotavirus acute diarrhea, the World Health Organization has been recommended the use of two licensed vaccines worldwide (Rotarix ® and RotaTeq ®). The oral monovalent rotavirus vaccine (G1[P8] strain, Rotarix®) was introduced in Brazilian National Immunization Program in 2006. The vaccine efficacy and effectiveness vary between high and low income countries, although there is strong evidence of cross-protection for G1-G4 and G9 genotypes. We evaluated overall and genotype-specific oral monovalent rotavirus VE in preventing RV-A diarrhea hospital admission of Brazilian children. Also, we estimated overall and genotype-specific VE by time since second dose vaccination (up to two years) and VE according to Brazilian Regions. High overall and genotype-specific VE were observed, even though there was a great diversity of rotavirus genotypes circulating in Brazil and a predominance of G2P[4] genotype. The overall and genotype-specific VE lasted for two years after second dose vaccination and it was higher for G1P[8] than G2P[4]. Besides, we considered that it was plausible that RV-A VE could vary in different populations (Regions) and in different periods of time, since there was a great genotype diversity, an occurrence of unusual genotypes, mixed combinations of G and P and emergence of new strains from combinations of inter-species (human and animal). We analyzed the VE for Brazilian Regions and we demonstrated that the VE for Northern Region was similar to the overall VE. However, the VE for other Regions was lower than VE for Northern Region, maybe because of the small number of the cases. Based on the findings of the studies we recommend: 1) to implement actions of the public domain (environment, sanitation, hygiene in the community and access to health services) to reduce the diarrhea morbidity; 2) the continued use of oral monovalent rotavirus vaccine in the National Immunization Program; and 3) the monitoring for early detection of unusual and novel rotavirus genotypes. In addition, new studies should be conducted to evaluate the variations of rotavirus VE in different Regions, sub-Regions and vulnerable areas in Brazil. It might be useful to conduct cost-effectiveness studies to inform national immunization policy.

Made available in DSpace on 2016-12-23T13:56:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Saick Genotipos Rotavirus.pdf: 1758385 bytes, checksum: 51837cea2c3389401234f70c01e946ff (MD5) Previous issue date: 2007-09-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os rotavirus do grupo A (RVA) são uma das principais causas de diarréia aguda em crianças até cinco anos tanto em países desenvolvidos como em desenvolvimento. O virion possui genoma constituído por 11 segmentos de RNAdf, contido por um triplo capsídeo concêntrico, cujo padrão de migração após eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA) permite a classificação em grupos (A-G) e em perfis longo, curto e super-curto. O capsídeo externo é formado pelas proteínas VP4 e VP7, cujos genes formam a base do sistema de classificação em genótipos P e G, respectivamente. O conhecimento dos genótipos de RVA em uma determinada área geográfica é essencial para o estabelecimento e o monitoramento de estratégias preventivas. Considerando a carência de estudo de genotipagem no Espírito Santo, esta pesquisa se propôs: i) determinar os genótipos de RVA obtidos de crianças com diarréia aguda, residentes na Região Metropolitana de Vitória - ES, provenientes do Pronto Socorro do Hospital Infantil Nossa Senhora da Glória (PS-HINSG) (80/253), entre fevereiro de 2003 e junho de 2004 e; ii) determinar a freqüência e os genótipos de RVA em crianças atendidas na emergência (n=5) ou hospitalizadas (n=63) na pediatria do Hospital CIAS-UNIMED, entre julho de 2004 e novembro de 2006. RNAdf viral foi extraído a partir de suspensão fecal, através do método de guanidina-sílica. EGPA foi realizado nas amostras do CIAS/UNIMED para detecção de RVs e determinação do perfil eletroforético. DNA complementar foi sintetizado por transcrição reversa utilizando o iniciador randômico pdN6 TM. PCR foi realizado utilizando um par de iniciadores consenso para VP4 (4con2/4con3) ou para VP7 (9con1/9con2) e os produtos foram utilizados na Multiplex semi-nested PCR com iniciadores específicos para G e P (G1-G5, G9, P[4], P[6], P[8], P[9]). Das cepas de RVA do PS-HINSG, observou-se os genótipos G1P[8] (83,6%), G9P[8] (7,5%), G1P[4] (2,5%), G1P[6] (1,3%), G4P[6] (1,3%) e G?P[8] (3,8%). Das amostras obtidas no CIAS/UNIMED, 20,6% (14/68) foram positivas para RVA, quatro e dez com perfis curto e longo, respectivamente. Destas cepas, foram observados os genótipos G9P[8] (50%), G2P[4] (28,7%), G2P[8], G1P[8] e G?P[8] (7,1%, cada). Nenhuma infecção mista foi observada em ambos hospitais. Estes dados revelam: i) G1P[8] e G9P[8], genótipos prevalentes no PS-HINSG e no CIAS/UNIMED, espectivamente; ii) G9P[8], detectado no final do período de coleta das amostras do PS-HINSG, sugere flutuação temporal na circulação; iii) G2P[4], encontrado somente em 2006 nas crianças hospitalizadas. Os resultados obtidos sugerem que a vacina Rotarix® utilizada no Brasil poderá ser eficiente em reduzir o número de casos e a gravidade da doença na região do estudo. Entretanto, destaca-se o surgimento do genótipo G2 para o qual a vacina apresenta menor proteção, reforçando a necessidade de vigilância contínua dos genótipos circulantes como monitoramento da eficácia da vacina. / Group A rotaviruses (RVA) are a major cause of acute diarrhea in children up to 5 years in both developing and developed countries. The virion consists of 11 double-stranded RNA (dsRNA) genome enclosed in a triple-shelled capsid, which migration pattern in polyacrilamide gel eletrophoresis (PAGE) permit the classification in groups (A-G) and in long, short and super-short profiles. The outer shell is composed by VP4 and VP7 proteins which genes form the basis of the classification system in P and G genotypes, respectively. The knowledge about RVA genotypes distribution is essential for the establishment and the monitoring of preventive strategies. Considering the lack of these studies in Espírito Santo State, this investigation proposed: i) to determine RVA genotypes obtained from children with acute diarrhea, resident in Metropolitan region of Vitória - ES, from the Emergency Room at Hospital Infantil Nossa Senhora da Glória (HINSG) (80/253), collected between February 2003 and June 2004 and; ii) to determine the frequency and RVA genotypes in children attended at Emergency (n=5) or hospitalized (n=63) from Pediatric Setor of CIAS/UNIMED hospital, between July 2004 and November 2006. dsRNA were extracted from fecal suspensions by guanidine-silica procedure. PAGE was performed in CIAS/UNIMED samples for rotaviruses detection and eletropherotype determination. Complementary DNA was obtained by reverse transcription with pdN6 TM random primer. PCR were done with a pair of consensus primers for VP4 (4con2/4con3) or VP7 (9con1/9con2) and the products were submitted to Multiplex semi-nested PCR with specific primers for the G and P types (G1-G5, G9, P[4], P[6], P[8], P[9]). RVA genotypes observed from HINSG were G1P[8] (83.6%), G9P[8] (7.5%), G1P[4] (2.5%), G1[6] (1.3%), G4P[6] (1.3%) and G?P[8] (3.8%). Among samples stools from CIAS/UNIMED, 20.6% (14/68) were RVA positive, four and ten with short and long eletropherotypes, respectively. The following genotypes were observed: G9P[8] (50%), G2P[4] (28.7%), G2P[8], G1P[8] and G?P[8] (7%, each). No mixed infection was observed in both hospitals. These data reveal: i) G1P[8] and G9P[8] were the most common genotypes from HISNG and CIAS/UNIMED, respectively; ii) G9P[8] was detected in the end of the samples obtainment, suggesting temporal fluctuation on genotype circulation; iii) G2P[4] was found only in 2006 from hospitalized children. The results suggest that RotarixTM vaccine used in Brazil may efficiently reduce the severity and the number of RVA cases in the region studied. However, it must be emphasize the emergence of G2 type for which the vaccine shows lower protection, reforcing the need of continuous surveillance of RVA genotypes as vaccine efficacy monitoring.

Um total de 8.961 amostras fecais coletadas de pacientes com diarréia aguda, no período de 1996 a 2006, no Estado de São Paulo foi testado para rotavírus por EIE. Destas, 20,0% foram positivas e posteriormente realizadas a caracterização dos rotavírus em genótipos G e P por nested RT-PCR. O genótipo G1 de rotavírus foi o mais freqüente, detectado em 35,2% das amostras, seguidos dos tipos G9, G2, G3, G4, infecção mista e G12. A associação mais freqüente foi a P[8]G1 e P[8]G9. Foi realizada a sequencia nucleotídica do gene 9 (VP7) de 38 rotavirus genótipo G1. Duas cepas foram analisadas dos anos de 1997, 1998, 2001 e 2002, três cepas dos anos 1996, 1999 e 2003, quatro cepas em 2000, sete cepas em 2004 e 2005, e cinco em 2006. Os 38 rotavírus G1 foram classificados em duas linhagens distintas, linhagem G1-I e linhagem G1-II. A linhagem G1-I foi detectada durante seis anos, 1996-1997, 2001-2002 e 2004-2006, e a linhagem G1-II foi detectada durante os anos de 1998-2001, e 2003-2005. Análises preliminares mostraram que Rotarix ® foi eficiente contra estas linhagens G1. / Rotavirus (RV) infections are recognized as a major cause of severe gastroenteritis in children worldwide. In March 2006, a monovalente P[8]G1, human RV vaccine (Rotarix® GlaxoSmithKline Biologicals) was introduced in Brazil into the routine childhood immunization schedule. Therefore, the study of genetic diversity among rotavirus strains before and after the introduction of this vaccine may be important for the development of vaccination strategies. A total of 8,961 fecal samples collected from patients with acute diarrhea, during the 11-year period surveillance in São Paulo State (1996 to 2006) were tested for rotavirus by ELISA. One thousand seven hundred eighty- four (1,784, 20.0%) were positive, and the characterization of the G and P genotypes was performed on 1,300 rotavirus samples by nested RT-PCR. The G1 type was the most prevalent rotavirus strain (35.2%). The second most prevalente was the G9 type (31.2%), followed by G2 (4.0%), G3 (3.5%), G4 (2.2%), mix infection (1.8%) and G12 (0.5%). The more frequent association was P[8]G1 and P[8]G9. We performed a sequence analysis of 38 P[8]G1 rotavirus strains, selected from a total of 341 P[8]G1.Two strains from 1997, 1998, 2001, and 2002 were analyzed; three strains from 1996, 1999, and 2003; four strains from 2000; seven strains from 2004, and 2005; and five strains from 2006. All 38 rotavirus G1 sequence in this study were found to be classified into two distinct lineages, lineage I with 44.7% (17/38) and lineage II with 55.3% (21/38). The G1I lineages were detected during six rotavirus seasons 1996-1997, 2001- 2002, and 2004-2006 whereas and lineage G1- II was detected during 1998-2001, and 2003-2005. Preliminary analyses 4 demonstrated that Rotarix® has been efficacious against these G1 lineages.

Os rotavírus são um dos principais agentes causadores de doenças entéricas em várias espécies animais, com ocorrência generalizada na suinocultura do Brasil. O seu diagnóstico é um componente essencial para estudos epidemiológicos e delimitação de medidas profiláticas visando o controle da doença. Apesar da relevância, não existem testes, tais como PCR em tempo real desenvolvido para detectar a diversidade genética de rotavírus suíno do grupo A (RVA). Este trabalho descreve o desenvolvimento de uma PCR em tempo real com SYBR® Green, para a detecção de rotavírus suíno e os seus resultados comparados com a PCR convencional e ELISA. Foram desenhados primers visando o segmento codificador da proteína NSP5 (137pb) e também foram utilizados primers visando o mRNA do gene mitocondrial bovino NADH5 (191pb) para o controle interno exógeno. Amostras de fezes de suínos de até 60 dias de idade de suínos do estado de São Paulo foram usadas para compor um painel de teste. Foram utilizadas como amostras de referencia o isolado 32/00 (controle positivo de rotavírus suíno do grupo A), concentrado de células MDBK (controle positivo do controle interno exógeno) e água tratada com DEPC (controle negativo). A extração do RNA total foi realizado com Trizol a partir de suspensões fecais contendo MDBK e o cDNA foi sintetizado utilizando primers aleatórios e M-MLV. Para as reações de PCR em tempo real utilizou-se o reagente MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix (Fermentas Life Science). Durante a padronização da PCR convencional, a temperatura de 54°C foi definida como a Tm ótima para a reação. O desempenho do ensaio foi validado em sete amostras positivas inicialmente testadas pelos métodos ELISA e PAGE. O isolado viral RV8209 foi utilizado para determinar o limiar de detecção da PCR em tempo real através de diluições seriadas sendo defino como ponto de corte Ct=33,5 (10-12,28TCID50%). O segmento codificador da NSP5 foi clonado no vetor pTZ57R/T submetido a restrição enzimática e usado como alvo para gerar uma curva padrão, onde obteve-se uma eficiência de 93,39%, slope de -3,49 e R2 de 0,993. A detecção do controle interno exógeno mostrou 82,9% de positividade para PCR convencional e 76,31% para a PCR em tempo real, com correlação significativa (0,718). O ensaio de ELISA para RVA apresentou 10,5% (8/78) de positividade, enquanto que as taxas de detecção da PCR em tempo real e PCR convencional foram de 50% (29/58) e 30,1% (24/63), respectivamente. Foi encontrada uma correlação moderada (0,546) entre PCR convencional e PCR em tempo real; baixa (0,056) entre a PCR convencional e ELISA; ausente (0,0) entre a PCR em tempo real e ELISA. Os resultados obtidos sugerem que a detecção por PCR em tempo real para a detecção do rotavírus suíno do grupo A em amostras fecais possa ser utilizada como diagnostico rápido e eficiente aumentando o repertório dos testes já estabelecidos, de modo a proporcionar uma maior sensibilidade para o diagnóstico clínico e epidemiológico. / Rotavirus is one of the main causative agents of enteric diseases in several animal species with widespread occurrence in Brazilian pig farm. Diagnosis is an essential component for epidemiological studies and delineation of prophylactic measures aiming disease control. Despite the relevance, there are no assays such as real-time PCR developed to detect the genetic diversity of porcine rotavirus from group A (RVA). This work describes the development of SYBR Green real-time PCR assay for the detection of porcine rotavirus and the results were compared with conventional PCR and ELISA. Primers were designed targeting the coding segment of the protein NSP5 (137pb) and also primers targeting the bovine mitochondrial gene mRNA NAD5 (191pb) were used for the exogenous internal control. Fecal samples from pigs up to 60 days of age from São Paulo state were used to compose a panel test. The reference sample was the isolate 32/00 (positive control for porcine rotavirus group A), concentrated MDBK cells (Exogenous Internal Positive Control) and DEPC-treated water (negative control). Total RNA extraction from supernatants of fecal samples containing MDBK cells were carried out with TRIzol reagent and cDNA was synthesized using random primers and M-MLV Reverse Transcriptase. For real-time PCR reactions were used MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix (Fermentas Life Science). For conventional PCR optimization, 54oC was defined as the optimum reaction temperature (Tm). The performance of the assay was validated on seven samples initially tested positive by ELISA and PAGE methods. The limit of detection of the developed real-time-PCR assay was determined using serial dilutions of the isolated RV8209 with Ct=33,5 (10-12,28TCID50%). The NSP5 gene segment was cloned into vector pTZ57R/T submitted to enzymatic restriction and used as template to generate a standard curve which Efficiency of 93.39%, slope of -3.49 and R2 &#9633; 0.993. The Exogenous internal control showed 82.9% positivity for conventional PCR and 76.31% for real-time PCR with substantial correlation (0.718). The ELISA assay detected porcine RVA in 10,5% (8/78) of fecal samples, whereas the detection rates of both SYBR Green real-time PCR and conventional PCR assays were 50% (29 of 58) and 30.1% (24 of 63), respectively. A moderate correlation (0.546) was found between conventional PCR and real-time PCR; low (0.056) between the conventional PCR and ELISA; absent (0.0) between the real-time PCR and ELISA. Our findings suggest that detection of Group A porcine rotavirus in fecal samples by use of the real-time PCR assay may be fast and efficient increasing the repertoire of tests established to improve sensitivity for epidemiology and clinical diagnosis.

O objetivo deste estudo foi avaliar a qualidade virológica da água de reúso produzida em uma das estações de tratamento de esgoto da cidade de São Paulo. Para tanto, foram coletadas concomitantemente 177 amostras de esgoto tratado (100L) e bruto (15L) e os vírus concentrados utilizando método Viradel-ultracentrifugação. Em seguida as amostras foram tratadas com Vertrel XF e os ácidos nucléicos extraídos para a detecção de adenovírus (HAdV), rotavírus (RV-A), norovírus e vírus da hepatite A (VHA). A detecção por PCR e/ou RT-PCR evidenciou RV-A (G1-G5), VHA e HAdV incluindo os da espécie F tanto no esgoto bruto quanto no tratado, no entanto norovírus não foram detectados em ambos os efluentes. A infectividade de RV-A e HAdV foi avaliada por cultivo celular e os rotavírus RV-A foram também quantificados por reação de imunoperoxidase direta. PCR em tempo real foi padronizada para quantificação de vírus não cultiváveis ou de difícil cultivo como os VHA. Com base nos resultados obtidos foi verificada a ocorrência e a distribuição anual de cada vírus nas águas de reúso. / The aim of the study was to evaluate the virological quality from one Sewage Treatment Plant in the state of São Paulo. From January/2005 to November/2006, 177 samples (15L) of raw sewage were collected at the entrance and another 177 (100L) at the end of treatment, twice a week. Viruses were concentrated by filtration through positively charged microporous filters, followed by ultracentrifugation. Virus concentrates were treated by using Vertrel-XF and the viral genomes extracted for detection of adenovirus (HAdV), rotavirus (RV-A), norovirus and hepatitis A virus (HAV). PCR and RT-PCR revealed RV-A (G1-G5), HAV and HAdV, including the enteric ones (species F) in sewage and treated wastewater samples. Norovirus was not detected in any samples. The infectivity of HAdV and RV-A was assayed by inoculating onto suitable cell line. Immunoperoxidase assay was used to calculate the rotavirus FFU/L in the samples. Real time-PCR was standardized for enumeration of non-cultivable virus. The occurrence and annual distribution of each virus in reuse water were analyzed.

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