Neste trabalho foram caracterizadas molecularmente e inferidas as relações filogenéticas de 14 isolados brasileiros de Acanthamoeba, provenientes de casos de ceratite, e 8 isolados da ATCC (4 de ceratite e 4 ambientais). Foram utilizados inicialmente os métodos de RAPD, RFLP de DNA genômico total e RFLP do SSU rDNA. Apesar de revelar a alta variabilidade genética em Acanthamoeba, estes métodos permitiram estabelecer grupos bem definidos de isolados mais similares geneticamente. O seqüenciamento do SSU rDNA permitiu a inferência da filogenia entre os isolados utilizados nesse estudo em relação àqueles presentes na literatura, que estão distribuídos em doze tipos de seqüência deste gene. Dentre os 17 isolados de ceratite presentes em nosso estudo, 16 apresentaram SSU rDNA tipo T4 (anteriormente já fortemente correlacionado à ceratite) e um deles constitui um novo tipo de seqüência. Dois dos 4 isolados ATCC (ambientais) cujas seqüências ainda não haviam sido determinadas também apresentaram novos tipos de SSU rDNA, enquanto outros 2 apresentaram o tipo T4. / In this work we performed the molecular phylogeny and characterization of 22 Acanthamoeba isolates, 14 Brazilian keratitis isolates and 8 from ATCC, 4 keratitis and 4 environmental isolates. In spite of the extensive genetic variability disclosed by RAPD, total genomic DNA RFLP and SSU rDNA RFLP techniques, these methods enabled us to group some isolates in well defined clusters of genetically more related organisms. Sequencing of SSU rDNA allowed inference of the phylogeny of our isolates with those present in the literature, which are distributed through 12 sequence types of this gene. Among the 17 keratitis isolates of our study, 16 presented SSU rDNA of type T4 (previously found to be strongly correlated to keratitis), and one was assigned to a new sequence type. Of the 4 isolates from ATCC whose sequences were previously undetermined, the two environmental isolates also constituted new sequence types, while the two keratitis isolates were assigned to type T4.

Orientador: Fausto Foresti / Resumo: Characidium é um grupo de peixes amplamente distribuídos pela região Neotropical, embora seja considerado o mais especioso dentro de Crenuchidae, do ponto de vista citogenético o número de espécies investigadas ainda é baixo, o que dificulta a caracterização quanto a organização cromossômica do gênero. Em relação ao número diploide, as espécies de Characidium conservaram um cariótipo com 2n = 50 cromossomos, do tipo metacêntricos e submetacêntricos (com exceções), o que resulta em uma macroestrutura homogênea para o grupo. Porém, investigações utilizando sequências repetitivas têm contribuído para ilustrar que a organização microestrutural cromossômica pode diferir entre as espécies, refletindo o hábito destes peixes constituírem populações pequenas e isoladas em cabeceiras de riachos. Adicionalmente, algumas espécies de Characidium também foram descritas portando cromossomos B em seus cariótipos, e a utilização de ferramentas citomoleculares têm contribuído para explorar quanto a origem e evolução destes componentes cariotípicos. Neste sentido, o objetivo do presente estudo foi agregar técnicas citomoleculares com resultados de sequenciamento massivo, para tentar compreender a ocorrência de cromossomos B no genoma de Characidium sp. aff. C. vidali. Os resultados obtidos mostraram que i) o mapeamento físico de diferentes sondas de DNA repetitivo contribuíram não apenas para caracterizar o cariótipo da espécie em estudo, como também adicionaram mais informações quanto a organi... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Characidium is a group of fish widely distributed in the Neotropical region, although it is considered the most specious within Crenuchidae, from the cytogenetic point of view the number of species investigated is still low, which makes it difficult to characterize the chromosomal organization of the genus. In relation to the diploid number, Characidium species retained a karyotype with 2n = 50 chromosomes, metacentric and submetacentric (with exceptions), resulting in a homogeneous macrostructure for the group. However, investigations using repetitive sequences have contributed to illustrate that the chromosomal microstructural organization may differ between species, reflecting the habit of these fish constituting small and isolated populations in headwaters of streams. In addition, some species of Characidium have also been described carrying B chromosomes in their karyotypes, and the use of cyto-molecular tools has contributed to explore the origin and evolution of these karyotype components. In this sense, the objective of the present study was to aggregate cyto-molecular techniques with massive sequencing results to try to understand the occurrence of B chromosomes in the genome of Characidium sp. aff. C. vidali. The results showed that i) the physical mapping of different repetitive DNA probes contributed not only to characterize the karyotype of the species under study, but also added more information about the organization and evolution of the chromosomal microstruct... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Submitted by ANA CAROLINA BORSANELLI null (carol_borsanelli@yahoo.com.br) on 2017-03-02T16:23:55Z No. of bitstreams: 1 Tese_Ana_Carolina_Borsanelli.pdf: 2945411 bytes, checksum: b939ed8b82baac2521b2690292efb967 (MD5) / Approved for entry into archive by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br) on 2017-03-08T14:03:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 borsanelli_ac_dr_jabo.pdf: 2945411 bytes, checksum: b939ed8b82baac2521b2690292efb967 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-08T14:03:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 borsanelli_ac_dr_jabo.pdf: 2945411 bytes, checksum: b939ed8b82baac2521b2690292efb967 (MD5) Previous issue date: 2017-02-07 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A periodontite bovina é um processo infeccioso purulento e progressivo associado com a presença de biofilme subgengival anaeróbio. De caráter sazonal e associada ao manejo do solo e à dieta, a doença tem variações na sua apresentação clínica, que inclui desde uma forma agressiva até manifestações crônicas. Os prejuízos econômicos são significativos e decorrem das dificuldades na preensão, mastigação e ruminação. O presente estudo teve como objetivo geral caracterizar a periodontite bovina e identificar por métodos moleculares os micro-organismos associados às lesões periodontais. Na avaliação da microbiota da bolsa periodontal (n=26) e do sulco subgengival (n=25) de bovinos, pela reação em cadeia da polimerase (PCR) e com o emprego de 35 iniciadores de espécies de patógenos potenciais, pôde-se associar a ocorrência de Actinobacillus naeslundii, Enterococcus faecium, Porphyromonas asaccharolytica, Porphyromonas endodontalis, Prevotella buccae, Prevotella intermedia, Prevotella melaninogenica, Prevotella nigrescens, Prevotella oralis, Treponema denticola e Treponema pectinovorum com a periodontite bovina. Em estudo complementar realizado na Escócia para verificar a ocorrência de lesões periodontais em animais abatidos, foram examinadas 200 arcadas dentárias, das quais 24 (12%) apresentaram lesões periodontais nos dentes incisivos ou mastigatórios. Este estudo inédito revela que a periodontite não é incomum em bovinos abatidos no oeste da Escócia e é claramente um problema sanitário negligenciado na produção e bem-estar animal. Na oportunidade, os fatores de risco associados à doença foram avaliados em um universo de 250 animais abatidos, dos quais 35 apresentavam lesões periodontais e 40 eram periodontalmente sadios. Pela análise de regressão logística foi avaliada a associação entre as variáveis independentes, sexo, idade e raça com periodontite. A idade dos animais foi significativamente associada à presença de lesões periodontais. Para cada ano de idade, um bovino tem 1,53 vezes chances de desenvolver periodontite (p<0,001). A variável sexo não se mostrou significativamente associada à periodontite (p=0,887), enquanto os animais de corte têm 0,36 a chance de desenvolver a doença quando comparados com os de aptidão leiteira. Na mesma ocasião, amostras de biofilme subgengival de 40 bovinos com periodontite e de 38 periodontalmente sadios foram coletadas e realizou-se o sequenciamento do gene 16S rRNA. No microbioma de animais sadios os gêneros mais prevalentes foram Gastranaerophilus, Planifilus, Burkholderia e Arcobacter. Já nos animais com periodontite, os filos mais prevalentes foram Elusimicrobia, Synergista e Fusobacteria e os gêneros Propionivibrio, Wolinella, Porphyromonas, Candidatus, Prevotella, Firmicutes (não cultivável), Bacteroides e Treponema. Em conclusão, os dois grupos de bovinos avaliados abrigaram perfis microbianos distintos, sendo que as amostras de bovinos com periodontite foram mais diversas em micro-organismos do que as de bovinos sadios. Nesse contexto inédito na microbiologia oral de bovinos, pode-se constatar os componentes principais na homeostase bacteriana do biofilme de sítios sadios e a disbiose nas lesões periodontais, fornecendo indicadores para e evolução do conhecimento sobre a periodontite bovina. / Bovine periodontitis is a progressive purulent infectious process associated with the presence of strict anaerobic subgingival biofilm. Seasonal and associated to soil and dietary management, the disease has variations in its clinical presentation, which includes since an aggressive form until chronic manifestations. The economic losses are significant and result from difficulties in gripping, chewing and rumination. The present study aimed to identify and characterize bovine periodontitis and identify the microorganisms associated with periodontal lesions by molecular methods. In the evaluation of the microbiota of the periodontal pocket (n=26) and gingival sulcus (n=25) of cattle, by polymerase chain reaction (PCR) and with the use of 35 primers of species of potential pathogens, it can be associate the occurrence of Actinobacillus naeslundii, Enterococcus faecium, Porphyromonas asaccharolytica, Porphyromonas endodontalis, Prevotella buccae, Prevotella intermedia, Prevotella melaninogenica, Prevotella nigrescens, Prevotella oralis, Treponema denticola and Treponema pectinovorum with bovine periodontitis. In a study carried out in Scotland to verify the occurrence of periodontal lesions in slaughtered animals, 200 dental arches were examined, of which 24 (12%) presented periodontal lesions in the incisors or masticatory teeth. This unpublished study reveals that periodontitis is not uncommon in cattle slaughtered in West of Scotland and is clearly a neglected health problem in animal production and welfare. At the opportunity, the risk factors associated with the disease were evaluated in a universe of 250 slaughtered animals, of which 35 had periodontal lesions and 40 were periodontally healthy. By the logistic regression analysis was evaluated the association between the independent variables, sex, age and race with periodontitis. The age of the animals was significantly associated with the presence of periodontal lesions. For each extra year in age, a cow is 1.53 times more likely to develop periodontitis (p<0.001). Gender was not significantly associated with periodontitis (p=0.887). Regarding the variable breed type, beef cattle were 0.36 times as likely to have periodontitis compared to dairy cattle. At the same occasion, samples of subgengival biofilm of 40 bovines with periodontitis and 38 periodontally healthy were submitted to high- throughput sequencing. In the bovine microbiome the most discriminative taxa in the samples of healthy animals were Gastranaerophilus, Planifilus, Burkholderia and Arcobacter. In animals with periodontitis, the most prevalent microorganisms were Elusimicrobia, Synergista, Propionivibrio, Fusobacteria, Wolinella, Porphyromonas, Candidatus, Prevotella, Firmicutes (uncultivable), Bacteroides and Treponema. In conclusion, the two groups of bovines evaluated harboured distinct microbial profiles, and the samples of bovines with periodontitis were more diverse in microorganisms than those of healthy cattle. In this unprecedented context, in the oral microbiology of bovines we can verify the main components in the bacterial homeostasis of the biofilm of healthy sites and the dysbiosis in the periodontal lesions, providing indicators for and evolution of the knowledge on bovine periodontitis. / FAPESP: 2015/06917-9 / FAPESP: 2013/13701-7

A tuberculose é uma doença infectocontagiosa causada por bactérias do complexo Mycobacterium tuberculosis (MTBC) que afeta humanos e/ou animais. Membros desse complexo evoluíram clonalmente e possuem grande similaridade genômica, diferenciando-se por polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) e regiões de diferença (RDs). Dentre os patógenos da tuberculose em animais, Mycobacterium bovis, causador da tuberculose bovina, é o membro do MTBC de maior importância global. Desta maneira, o presente estudo tem por objetivo o sequenciamento, a anotação e a análise da estirpe brasileira SP38 de M. bovis, seguido da genômica comparativa desse com outros genomas de M. bovis depositados no GenBank. Mycobacterium bovis SP38 apresenta um genoma tradicional de micobactéria tuberculosa, sendo esse único, circular com 4.347.646 pb, alto conteúdo de GC (65,6%) e 4.216 genes, incluindo 154 pseudogenes, 3 genes de rRNA (RNA ribossomal), 45 de tRNA (RNA transportador), 2 de ncRNA (RNA não codificante), 1 tmRNA (RNA transferência-mensageiro) e 4.011 sequências de DNA codificante (CDSs) (NZ_CP015773.1). Dentre as CDSs, a maioria (2.805 - 69,93%) foi anotado com função e 1.206 (30,07%) como hipotéticos. Para a genômica comparativa, os 31 genomas completos ou em drafts de M. bovis depositados no GenBank, 32 genomas de Mycobacterium bovis BCG e 23 genomas de Mycobacterium tuberculosis foram selecionados. Análises in silico dos padrões de RD resultaram na exclusão de três genomas anotados equivocadamente como M. bovis virulentos. A análise de genes ortólogos sugere que M. bovis está sob processo de decay genômico. A quantificação de sítios polimórficos indica uma maior variabilidade genética em números totais (8.335 em M. tuberculosis, 3.448 em M. bovis virulentos, e 1.088 em M. bovis BCGs) e comparações par-a-par (p &le;0,05) de M. tuberculosis em relação a M. bovis virulentos e BCGs, indicando uma maior pressão evolutiva sob M. tuberculosis, contrastando com o fato de que M. bovis é capaz de infectar um maior número de espécies hospedeiras que M. tuberculosis. A maioria desses sítios polimórficos estão localizados em CDSs hipotéticos (31,7% - 51,3%), sendo associados a família gênica PE/PPE, e apresentam uma proporção de mutações não sinônimas crescentes pela ordem M. bovis BCG, M. bovis virulentos e M. tuberculosis (48,90%, 51,92% e 59,52%, respectivamente). Essa menor proporção de mutações não sinônimas e a categorização funcional dissimilar entre CDSs contendo sítios polimórficos, indica que M. bovis BCG está sujeito a diferentes pressões seletivas quando comparado a M. bovis virulentos e M. tuberculosis. Por fim, a análise filogenética baseada em sítios polimórficos indica agrupamentos filogenéticos de M. bovis suportados pela classificação dos Complexos Clonais (CCs) e não por hospedeiros de origem dos isolados, confirmando que sítios polimórficos podem ser utilizados para classificação filogenética de linhagens genéticas desta espécie bacteriana. Além do mais, 2/28 (7,14%) genomas de M. bovis não puderam ser classificados nos CCs atualmente descritos, sugerindo a existência de complexos ainda não determinados. Este estudo representa o primeiro genoma de uma estirpe nacional de M. bovis a ser completamente sequenciado e a primeira análise de genômica comparativa de genomas desta espécie bacteriana. / Tuberculosis is an infectious disease caused by bacteria of the Mycobacterium tuberculosisComplex (MTBC) that affects human beings and/or animals. Members of this complex clonally evolved and have high genomic similarity, differentiated by single nucleotide polymorphisms (SNPs) and regions of difference (RDs). Among the animal tuberculosis pathogens, Mycobacterium bovis, the causative agent of bovine tuberculosis, is the MTBC member of greatest global importance. Therefore, the aim of the present study is to sequence, assemble and annotate the genome of the Brazilian strain SP38 of M. bovis, followed by the comparative genomics with other M. bovis genomes available in GenBank. Mycobacterium bovis SP38 has a traditional mycobacteria genome. It has a single and circular chromosome with 4,347,646 bp, high GC content (65.6%), and 4,216 genes, including 154 pseudogenes, 3 rRNA genes (ribosomal RNA), 45 tRNA (transfer RNA), 2 ncRNA (non-coding RNA), 1 tmRNA (transfer-messenger RNA), and 4,011 coding DNA sequences (CDSs) (NZ_CP015773.1). The majority of CDSs (2,805 - 69,93%) was annotated with function and 1,206 (30,07%) are hypothetical. For the comparative genomics analyses, the 31 genomes (complete and drafts) of M. bovis available in GenBank, 32 Mycobacterium bovis BCG and, 23 of Mycobacterium tuberculosis were chosen. In silico analysis of the RDs patterns resulted in the exclusion of three genomes, mistakenly annotated as virulent M. bovis. Orthologous gene analysis suggests that strains of M. bovis are under genomic decay. The quantification of polymorphic sites indicates the greater variability in absolute numbers (8,335 in M. tuberculosis, 3,448 in virulent M. bovis, and 1,088 in M. bovis BCG) and in pairwise comparisons (p&le;0,05) of M. tuberculosis compared to virulent M. bovis and M. bovis BCG, suggesting that M. tuberculosis is under high evolutionary pressure. This is in contrast to the fact that M. bovis is capable of infecting a higher number of host species than M. tuberculosis. Most of these polymorphic sites are located in hypothetical CDSs (31.7% - 52.3%), being associated with PE/PPE family, and demonstrating a nonsynonymous mutations proportion of the following increasing order: M. bovis BCG, virulent M. bovis and M. tuberculosis (48.90%, 51.92% and 59.52%, respectively). This lower proportion of nonsynonymous mutations and the dissimilar functional categorization of CDSs with polymorphic sites indicates that M. bovis BCG is subjected to different selective pressure when compared to virulent M. bovis and M. tuberculosis. Finally, the phylogenetic analysis based on polymorphic sites indicates that the phylogenetic grouping of M. bovis is supported by Clonal Complexes (CCs), and not by the host of M. bovis isolates, confirming that polymorphic sites can be used for phylogenetic classification of genetic lineages of this bacterial species. Furthermore, 2/28 (7.14%) genomes of M. bovis could not be classified in the currently described CCs, suggesting the existence of complexes yet to be determined. This study represents the first genome of a Brazilian strain of M. bovis to be completely sequenced and the first comparative genomic analysis of the genomes of this bacterial species.

Acinetobacter baumannii é um importante agente de infecções relacionadas à assistência à saúde, principalmente nas unidades de terapia intensiva no Brasil, sua resistência a antimicrobianos vem aumentando nas últimas décadas e as opções para o tratamento são restritas. Em 2011, no HC-FMUSP, ocorreu um surto de infecção por A. baumannii resistente a todos os antibióticos e desde então isolados resistentes a todas as classes de antibióticos vêm sendo identificados no hospital. O estudo investigou o efeito de combinações antimicrobianas contra 20 isolados clínicos de A. baumannii, sendo sete isolados resistentes (2011 a 2012) e treze sensíveis a colistina (2002 a 2004), obtidas do banco de cepas do LIM-54 com diferentes mecanismos de resistência. Foram realizados, concentração inibitória mínima dos antibióticos, avaliação da clonalidade por Pulsedfield gel electrophoresis, detecção de mecanismos de resistência por reação de amplificação em cadeia da polimerase, análise de proteínas da membrana externa e baseado na clonalidade e o sequenciamento total do genoma de quinze isolados. Sinergismo foi investigado usando os métodos de checkerboard e time-kill. Para monitorização da expressão do sistema regulatório PmrCAB e dos genes responsáveis pela biossíntese do lipopolissacarídeo, foi realizada reação em cadeia da polimerase quantitativa. Todos os isolados foram resistentes ao meropenem e a rifampicina. OXA- 23 e OXA-143 foram as carbapenemases mais frequentes. Quatro isolados mostraram perda de uma proteína de membrana externa denominada OMP 43kDa. Os isolados sensíveis a colistina pertenciam a diferentes clones e Multilocus Sequence Types, também apresentaram o maior efeito sinérgico com fosfomicina-amicacina. A resistência a colistina foi associada com a superexpressão do gene pmrA. Seis isolados resistentes a colistina, pertenciam ao Complexo Clonal 113 e o maior efeito sinérgico foi observado com combinações de colistina-rifampicina seguido de colistina-vancomicina. Foram encontrados diferentes genes de virulência envolvidos com formação de biofilme, aderência, produção de enzimas e captação de ferro / Acinetobacter baumannii is an important agent of infections related to health care, especially in intensive care units in Brazil, its antimicrobial resistance has increased in recent decades and the options for treatment are restricted. In 2011, in the HC-FMUSP, there was an outbreak of A. baumannii infection resistant to all antibiotics and since then isolates resistant to all classes of antibiotics have been identified in the hospital. The study investigated the effect of antimicrobial combinations against 20 clinical isolates of A. baumannii, seven isolates colistin resistant (2011-2012) and thirteen colistin sensitive (2002-2004) from LIM-54 strains bench with different resistance mechanisms. Minimum inhibitory concentration of antibiotics, clonality evaluation by pulsed-field gel electrophoresis and detection of resistance mechanisms by polymerase chain reaction, outer membrane protein analysis and based on clonality, the whole genome sequencing of fifteen isolates were performed. Synergism was determined using checkerboard and time-kill methods. For expression monitoring of the regulatory system PmrCAB and the genes responsible for the biosynthesis of lipopolysaccharide, it was performed quantitative polymerase chain reaction. All isolates were resistant to meropenem and rifampicin. OXA-23 and OXA-143 were the most frequent carbapenems. Four isolates showed loss of one outer membrane protein called OMP 43kDa. Colistin susceptible isolates belonged to different clones and Multilocus Sequence Types; it also showed the greatest synergistic effect with fosfomycin-amikacin. The colistin resistance was involved in overexpression of the pmrA gene. Six colistin-resistant isolates belonged to Clonal Complex 113 and higher synergistic effect were observed with colistin-rifampicin followed by colistin-vancomycin combinations for these isolates. We found different virulence genes involved in biofilm formation, adhesion, enzyme production and iron uptake

Os Influenzavirus podem ser classificados de acordo com suas glicoproteínas externas hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA), ambas apresentando alta variabilidade genética e antigênica. No presente estudo foi realizada análise molecular do gene HA, do vírus influenza A (IA) em amostras colhidas de crianças e lactentes com sintomatologia respiratória atendidas no Hospital Universitário da Universidade de São Paulo (USP), durante os anos de 1995 a 2006. Um total de 3.009 amostras foram analisadas por duplex RT-PCR e 4,38% (n=132) foram positivas, sendo 12,1% (n=16) Influenza B e 87,9% (n=116) IA, das quais 9% (n=9) eram H1N1, 91% (n=91) eram H3N2 e 13,8% (n=16) não foram subtipadas. A região HA1 do gene HA de 39 amostras foi sequenciada e as sequências comparadas com as cepas vacinais e circulantes dos respectivos anos. A região de ligação ao receptor foi conservada em todas as amostras e foram verificadas alterações de aminoácidos principalmente nos sítios antigênicos e arredores. No geral, as cepas vacinais foram compatíveis com as circulantes em São Paulo. / The Influenzavirus can be classified according to their external glycoproteins hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA), both showing high genetic and antigenic variability. In the present study was carried out molecular analysis of the HA gene of influenza A (IA) in samples harvested from children and infants, with respiratory symptoms attended at University Hospital, University of Sao Paulo (USP), during the years 1995 to 2006. A total of 3,009 samples were analyzed by duplex RT-PCR and 4.38% (n = 132) were positive, being 12.1% (n = 16) Influenza B and 87.9% (n = 116) IA, where which 9% (n = 9) were H1N1 and 91% (n = 91) were H3N2 and 13.8% (n = 16) did not subtyped. The HA1 region of HA gene of 39 samples were sequenced and the sequences compared with vaccine strains and circulating strains in those years. The receptor-binding region was conserved in all samples and aminoacid changes were observed mainly in the antigenic sites and surroundings. Overall, the vaccine strains were consistent with those circulating in Sao Paulo.

O basidiomiceto Moniliophthora perniciosa é conhecido por causar a doença vassoura-debruxa no cacau (Theobroma cacao), responsável por grandes perdas de produção nessa cultura. A população de M. perniciosa apresenta variabilidade devido à sua capacidade de colonização de outras espécies de plantas, o que permite a identificação de biótipos e conseqüente agrupamento de isolados com base no hospedeiro. A caracterização de biotipos do fungo contribui para melhor conhecimento da estrutura populacional e sua dispersão, o que é importante para utilização em programas de melhoramento. Com esse objetivo foi avaliada a variabilidade genética e fisiológica de isolados do fungo correspondentes a três biotipos considerando a análise de taxas de crescimento pelo desenvolvimento micelial em diferentes meios e ambientes de cultivo in vitro, como a incorporação de cisteína, metionina e lisina e das fontes de nitrogênio tartarato de amônio e nitrato de potássio, iluminação, suscetibilidade a fungicidas, compatibilidade somática (SCG Grupo de Compatibilidade Somática), análise de perfis protéicos por SDS-PAGE e seqüenciamento parcial do 28S rDNA. A história evolutiva do patógeno não está registrada em seqüências de genes ribossomais e proteínas totais. Além disso, crescimento e produção de pigmentos são características compartilhadas pelos biótipos, não sendo fatores primários para adaptação do patógeno, porém com provável papel na colonização do hospedeiro. / The Basidiomycete Moniliophthora perniciosa is known as the pathogen for witches\' broom disease in cocoa (Theobroma cacao), responsible for large yield losts. Population of M. perniciosa presents variability due to its ability to colonize other plant species, which allows biotype identification and strains grouping, based upon the host specie. Fungi biotype characterization contributes to the knowledge of population and its dispersion and epidemiological methods, important for breeding programs. To aim the genetic and physiological variability of three strains, characteristics as growing rates, measured by the mycelia spreading at different culture media and different culture conditions in vitro, cysteine, methionine, lysine, nitrogen sources ammonium tartrate and potassium nitrate incorporation, light, fungicide susceptibility, somatic compatibility (SCG), protein patterns by SDS-PAGE and partial sequencing of rRNA 28S region were done. The evolutional history of it is pathogen is not printed into ribosomal genes sequences and total proteins. Besides that, growing and dye production are characteristics shared by the biotypes and can not be a primary adaptation factor but it can play a role in the host colonization process.

Os complexos Mycobacterium chelonae M.abscessus e Mycobacterium fortuitum - M. peregrinum são compostos por espécies bacterianas de crescimento rápido e potencialmente patogênicas. Sua distribuição é ubíqua no ambiente, são resistentes a cloração da água e a sua replicação ocorre mesmo em condições de escassez de nutrientes. Estão envolvidos em casos de infecção pulmonar e extrapulmonar, e causam infecções em pacientes imunocomprometidos ou submetidos a rocedimentos cirúrgicos invasivos. Os objetivos do presente trabalho foram: confirmar através de testes fenotípicos e com as técnicas de PRA hsp65 e seqüenciamento do fragmento do rpoB, a identificação de micobactérias de crescimento rápido, incluídas nos complexos M. chelonae-M.abscessus e M. fortuitum-M.peregrinum. Foram incluídos no estudo os isolados provenientes de pacientes com dois ou mais isolamentos provenientes de sítio não estéril ou um isolamento de sítio estéril. O estudo de 38 isolados demonstrou que as provas fenotípicas disponíveis atualmente não permitem a identificação de todas as espécies de micobactérias de crescimento rápido já descritas na literatura. O PRA hsp65 possibilitou a identificação rápida e precisa de 63% das espécies de micobactérias e demonstrou um perfil compartilhado pelas espécies M. abscessus 2; M. bolletii 1 e M. massiliense 1. O seqüenciamento do gene rpoB confirmou a identificação das espécies citadas. Nossos resultados demonstraram que o PRA-hsp65 e o seqüenciamento do gene rpoB são ferramentas úteis para fornecer a identificação das espécies de micobactérias com mais acurácia. O uso dessas técnicas poderiam ser consideradas em laboratórios de referência para identificar Micobactérias de crescimento rápido uma vez que elas são patógenos emergentes implicados em surtos e isolados de pacientes em centros de referência para tratamento de tuberculose multirresistente. / Mycobacterium chelonae-M. abscessus and Mycobacterium fortuitum-M. peregrinum complexes are composed by bacterial species characterized by rapid grow and considered as potential pathogens. These microorganisms are ubiquitous in the environment, resistant to water treatment such as standard chlorination and are able to replicate even at poor nutrient conditions. They are related to lung and extralung infections in immune-compromised patients or those submitted to invasive surgical procedures. The aim of this study was to confirm the identification of Mycobacterium chelonae - M. abscessus and Mycobacterium fortuitum - M. peregrinum complexes, isolated from biological samples considering one or two repetitions if samples are originated from sterile or non-sterile site respectively. Phenotypic tests and molecular methods, PRA-hsp65 and rpoB gene sequencing, were applied to identify 38 strains previously isolated. Results demonstrated that available phenotypic tests did not allow the identification of all described fast growing Mycobacterium. The PRA of hsp65 gene confirmed the identification of 63% of the Mycobacterium studied, and demonstrated the band pattern shared by M. abscessus 2, M. bolletii and M. massiliensis. The rpoB gene sequencing confirmed the identification of the species cited. Our results demonstrated that PRA-hsp65 and rpoB gene sequencing are useful tools to provide a more accurate species identification of mycobacteria. The use of such techniques would be considered in reference laboratories to identify fast growing Mycobacterium species since they are considered emerging pathogens implicated in outbreaks and isolated from a patient in reference centers for treatment of multidrug resistant tuberculosis.

A Síndrome Ablefaria Macrostomia (SAM) é uma condição rara, onde os pacientes apresentam características clínicas marcantes como o encurtamento ou ausência das pálpebras superiores e inferiores, ausência de sobrancelhas e cílios, macrostomia por defeitos na fusão dos lábios, entre outros. O padrão de herança da síndrome não está elucidado, tendo a herança autossômica dominante com expressividade variável sido sugerida. SAM possui sobreposição fenotípica com a Síndrome de Barber-Say e com a Síndrome de Fraser, porém nenhum gene já descrito apresentou mutação nos pacientes portadores da SAM. A abordagem genômica no estudo de doenças raras tem sido amplamente utilizada, devido principalmente ao surgimento da Nova Geração de Sequenciamento, que possui alto poder de descriminar as seqüencias nucleotídicas com grande cobertura, em um curto período de tempo. No presente estudo o sequenciamento completo do exoma foi realizado, com cinco indivíduos de uma mesma família, três membros afetados e dois não, e permitiu a análise das regiões codificantes nestes indivíduos. A base molecular da Síndrome Ablefaria Macrostomia é aqui sugerida como autossômica dominante, e decorrente da mutação nova não sinônima c.223G>A (p.E75K) no gene TWIST2. Essa mutação patogênica ocasiona a troca de um aminoácido pequeno de carga negativa, o ácido glutâmico, para um aminoácido de cadeia maior carregado positivamente, a lisina. A modelagem in silico da proteína Twist2 mostrou que a estrutura geral tridimensional da proteína não foi alterada, mas a troca do aminoácido ocorre na posição 75 dentro do domínio básico HLH, e pode impedir a formação de dímeros, ou a própria ligação ao DNA. Sugere-se ainda que a heterogeneidade de fenótipos associados a mutações no gene TWIST2, pode ser atribuída às interações que essa proteína é capaz de formar, e a ampla ação regulatória que ela desempenha em diversos genes do desenvolvimento. / Ablepharon-Macrostomia Syndrome (AMS) is a rare condition characterised by absent or hypoplastic eyelids, absent eyebrows and eyelashes, macrostomia caused by fusion defects of the mouth with unfused lateral commissures, as well as other clinical features. The inheritance pattern has not been confirmed and while autosomal dominant inheritance with variable expressivity has been suggested, recessive inheritance has not been ruled out. The phenotype of AMS overlaps that of Barber-Say and Fraser Syndrome, but any reported gene for these syndromes is mutated on AMS patients. The genomic approach for rare disease studies has been widely used mainly due to the emergence of Next Generation Sequencing, which is very effective at determining nucleotide sequences with large coverage in a short period of time. The whole exome sequencing of five family members was undertaken, with three affected and two unaffected, and the coding regions of the individuals were subsequently analysed. The molecular basis of AMS is suggested here as autosomal dominant, and due to a novel non-synonymous mutation c.223G>A (p.E75K), in TWIST2 gene. This pathogenic mutation causes glutamic acid, a small negatively charged amino acid, to be substituted for a larger and positively charged lysine. The in silico protein modeling of Twist2 shows that the general 3D-structure of the protein is not affected, but the amino acid change is located inside the basic Helix-Loop-Helix domain which could disrupt dimerization and DNA binding. It has also been suggested that the phenotype heterogeneity associated with mutations on TWIST2 gene can be attributed to the interactions that this protein is capable of, and the role that it plays in the regulation of several developmental genes.

Submitted by Sandra Pereira (srpereira@ufrrj.br) on 2016-08-03T15:45:32Z No. of bitstreams: 1 2010 - Raquel Silva Lisboa.pdf: 4230911 bytes, checksum: e7087ccd29d417f592ca09ec5f49c657 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-03T15:45:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010 - Raquel Silva Lisboa.pdf: 4230911 bytes, checksum: e7087ccd29d417f592ca09ec5f49c657 (MD5) Previous issue date: 2010-04-14 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico, CNPq. / Dogs can be infected with various hemoparasites, and the occurrence of co-infections between Ehrlichia canis, Babesia canis, Anaplasma platys, and Hepatozoon canis species is very common, since they have the same tick vector. The objectives of this study were to delineate a multiplex PCR technique for the simultaneous diagnostic of microorganisms of Babesia and Ehrlichia genera in canine blood samples, and to realize the partial characterization of fragments of the 16S rRNA gene of the family Anaplasmataceae agents and, of 18S rRNA gene of Babesia detected in some samples PCR-positive, comparing the sequences obtained with sequences of other strains previously deposited in GenBank. Total DNA of 119 blood samples was extracted, of these, 40 were selected by showing cytoplasmatic inclusions in leukocytes and/or platelets suggesting infection by agents of Anaplasmataceae family (1E to 40E), 37 by showing piroplasms (1B to 37B), and two by presenting structures of both agents (M1 and M2), and finally, 40 samples with negative parasitological diagnostic and hematological exam without alterations. All these samples were tested by PCR to confirm the absence or presence of these hemoparasites, and them utilized in the multiplex PCR delineation. In multiplex PCR reactions the primers A17/EC3 were used to amplify an approximately 600bp region of the 16S rRNA gene of Ehrlichia species and the primers PIRO-A1/PIRO-B were used to amplify an approximately 450bp region of the 18S rRNA gene of Babesia species. Validation of multiplex PCR was performed by real time multiplex PCR. The multiplex PCR was able to simultaneously detect both agents in a DNA sample of a dog naturally co-infected and all the single infections by Babesia, but does not detected all the Ehrlichia infections. The real-time multiplex PCR was more sensitive in detect both single and also co-infections, as well as positive DNA mixtures for the two agents. The sequencing results confirmed the isolates identity, and that the primers PIRO-A1/PIRO-B also amplified the DNA of Hepatozoon canis. Phylogenetic analysis indicated that E. canis, A. platys, B. canis and H. canis species found in this study showed close similarities with sequences previously deposited in GenBank, forming monophyletic groups. / Os c?es podem se infectar com diversos hemoparasitos, sendo muito comum a ocorr?ncia de coinfec??es entre as esp?cies Ehrlichia canis, Babesia canis, Anaplasma platys e Hepatozoon canis, visto que possuem o mesmo carrapato vetor. Este estudo teve como objetivos delinear uma t?cnica de PCR multiplex para diagnosticar simultaneamente microrganismos dos g?neros Ehrlichia e Babesia em amostras de sangue de c?es e realizar a caracteriza??o parcial de fragmentos do gene 16S rRNA de agentes da fam?lia Anaplasmataceae e do gene 18S rRNA de Babesia detectados em algumas amostras positivas pela PCR, comparando as sequ?ncias obtidas com as sequ?ncias de outras cepas depositadas previamente no GenBank. O DNA total de 119 amostras de sangue foi extra?do. Destas, 40 foram selecionadas por apresentar inclus?es citoplasm?ticas em leuc?citos e/ou plaquetas sugestivas de infec??o por agentes da fam?lia Anaplasmataceae (1E a 40E), 37 por apresentar formas parasit?rias de piroplasm?deos (1B a 37B), duas por apresentar estruturas de ambos os agentes (M1 e M2) e, finalmente, 40 amostras com diagn?stico parasitol?gico negativo e exame hematol?gico sem altera??es. Todas estas amostras foram testadas por PCR, para a confirma??o da aus?ncia ou presen?a destes hemoparasitos, e depois utilizadas no delineamento da PCR multiplex. Nas rea??es de PCR multiplex utilizou-se os oligonucleot?deos iniciadores A17/EC3 que amplificam um produto de aproximadamente 600pb de uma por??o do gene 16S rRNA de esp?cies de Ehrlichia e os oligonucleot?deos iniciadores PIRO-A1/PIRO-B que amplificam um produto de aproximadamente 450pb de uma por??o do gene 18Sr RNA de esp?cies de Babesia. A valida??o da PCR multiplex foi realizada por PCR multiplex em tempo-real. A PCR multiplex foi capaz de detectar simultaneamente os dois agentes em uma amostra de DNA de um c?o naturalmente coinfectado e todas as infec??es individuais por Babesia, mas n?o detectou todas as infec??es por Ehrlichia. A PCR multiplex em tempo real foi mais sens?vel em detectar tanto infec??es ?nicas quanto coinfec??es, al?m de misturas de DNA positivo para os dois agentes. Os resultados dos sequenciamentos confirmaram a identidade dos isolados, e que os oligonucleot?deos PIRO-A1/PIRO-B amplificaram tamb?m, o DNA de Hepatozoon canis. As an?lises filogen?ticas indicaram que as esp?cies de E. canis, A. platys, B. canis e H. canis encontradas neste estudo possuem similaridades pr?ximas com sequ?ncias previamente depositadas no GenBank, formando grupos monofil?ticos.